Summary
Denne undersøgelse beskriver en hurtig og effektiv metode til cellekomponentanalyse af cerebrale blodpropper gennem koagulationsopløsning, cellefarvning og rutinemæssig blodundersøgelse.
Abstract
Cerebral trombose, en blodprop i en cerebral arterie eller vene, er den mest almindelige type cerebral infarkt. Undersøgelsen af cellekomponenterne i cerebrale blodpropper er vigtig for diagnose, behandling og prognose. Imidlertid er de nuværende tilgange til at studere blodproppernes cellekomponenter hovedsageligt baseret på in situ-farvning , hvilket er uegnet til den omfattende undersøgelse af cellekomponenterne, fordi cellerne er tæt pakket ind i blodpropperne. Tidligere undersøgelser har med succes isoleret et fibrinolytisk enzym (sFE) fra Sipunculus nudus, som kan nedbryde det tværbundne fibrin direkte og frigive cellekomponenterne. Denne undersøgelse etablerede en omfattende metode baseret på sFE til at studere cellekomponenterne i cerebral trombose. Denne protokol omfatter koagulationsopløsning, cellefrigivelse, cellefarvning og rutinemæssig blodundersøgelse. Ifølge denne metode kunne cellekomponenterne undersøges kvantitativt og kvalitativt. De repræsentative resultater af eksperimenter ved hjælp af denne metode vises.
Introduction
Cerebrovaskulær sygdom er en af tre store sygdomme, der kan true menneskers sundhed, blandt hvilke iskæmisk cerebrovaskulær sygdom tegner sig for mere end 80%. Cerebral trombose og cerebral venetrombose er de mest bekymrede iskæmiske cerebrovaskulære sygdomme i dag, hovedsageligt forårsaget af cerebrale blodpropper 1,2. Hvis behandlingen ikke udføres korrekt, vil den have høje invaliditets- og dødelighedsrater og en høj tilbagefaldsrate efter udskrivning3.
For nylig har et stigende antal undersøgelser vist, at cellekomponenterne i cerebrale blodpropper er tæt korreleret med diagnosen, behandlingen og prognosen for cerebral trombose 4,5,6. Derfor er tilgængeligheden af data om trombosesammensætning, især cellekomponenterne, vigtig for klinisk diagnose og behandling. Desværre kan de aktuelt tilgængelige metoder ikke omfattende analysere blodpropkomponenten kvantitativt og kvalitativt. For eksempel kan Martius Scarlett Blue-baseret in situ-farvning kun studere de røde / hvide blodlegemer i visse skiver afblodproppen 7. Immunohistokemi (IHC) baseret in situ farvning kan kun studere begrænsede blodkomponenter i visse skiver af blodproppen ved hjælp af deres antistoffer8. De mikroskopiske billedbaserede metoder beskæftiger sig kun med den specifikke struktur afblodproppen 9. Desuden er alle disse metoder besværlige og tidskrævende10. Hidtil er procedurerne for kvantitativ og kvalitativ undersøgelse af cerebrale trombicellekomponenter ikke blevet rapporteret. Det er almindeligt anerkendt, at det tværbundne fibrin tæt omslutter blodcellerne i blodpropperne11. Derfor er den specifikke nedbrydning af det tværbundne fibrin og frigivelsen af de intakte celler afgørende for den nøjagtige analyse af cellekomponenter.
Tidligere værker isolerede et fibrinolytisk enzym fra Sipunculus nudus (sFE), som kan nedbryde fibrinet specifikt og hurtigt12. Heri blev der foreslået en metode til analyse af cellekomponenterne i cerebral trombi baseret på den unikke aktivitet af sFE. Denne protokol brugte sFE til først at nedbryde fibrin af blodpropper og analyserede derefter cellekomponenterne ved Wrights farvning og rutinemæssige blodundersøgelse13,14. Ifølge denne metode kan cellekomponenterne i cerebral thrombi undersøges kvantitativt og kvalitativt. Denne enkle og effektive protokol kan anvendes til cellekomponentanalyse af andre blodpropper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forskningen blev udført i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer fra den medicinske etiske komité ved Huaqiao University. De cerebrale blodpropper blev fjernet kirurgisk og indsamlet på Quanzhou First Hospital, tilknyttet Fujian Medical University, med informeret samtykke fra patienterne.
1. Forbehandling af blodpropper
- Placer blodpropperne på en ren skål, tilsæt 5 ml fysiologisk saltvand med en pincet, ryst skålen forsigtigt og fjern saltvand med en pipette.
BEMÆRK: Gentag skylningen tre gange. - Skær blodpropperne i mindre stykker (mindre end 5 mm x 5 mm x 5 mm) med en saks. Tilsæt 5 ml fysiologisk saltvand, ryst skålen forsigtigt, og fjern saltvand med en pipette.
BEMÆRK: Gentag skylningen tre gange. Sørg for, at der ikke suges koagulationsstykker under skylningen. - Overfør blodpropperne til en anden ren U-plade.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her (opbevar pladen ved 2-8 °C) og genstartes senere.
2. Trombolyse
- Forbered sFE-arbejdsløsningen ved at justere koncentrationen af sFE til 2000 E/ml med fysiologisk saltvand.
BEMÆRK: sFE blev udarbejdet i henhold til de veletablerede protokoller fra Tang Lab15. - Tilsæt 300 μL sFE-arbejdsløsning i de forbehandlede blodpropper.
- Udfør den første runde af nedbrydning.
- Blandingen af sFE og blodpropper inkuberes ved 37 °C i 0,5 timer.
BEMÆRK: Blottet behandlet med fysiologisk saltvand blev indstillet som negativ kontrol. Drej ikke prøven på rysteapparatet. - Bland prøven forsigtigt. Overfør væskedelen til et andet rent rør med en ren pipette.
BEMÆRK: De resterende blodpropper blev brugt til en anden nedbrydningsrunde. - Den flydende del centrifugeres ved 200 × g i 5 minutter ved 4 °C.
- Supernatanten overføres til et andet rent glas med en pipette for at opnå den genvundne sFE-opløsning.
- Bland celleudfældningen forsigtigt med 50 μL fysiologisk saltvand.
BEMÆRK: Celleblandingen blev opbevaret 2-8 °C til senere brug.
- Blandingen af sFE og blodpropper inkuberes ved 37 °C i 0,5 timer.
- Udfør efterfølgende nedbrydning.
- De resterende blodpropper (trin 2.3.2) nedbrydes med den genvundne sFE-opløsning (trin 2.3.4) ved 37 °C i 0,5 timer.
BEMÆRK: Hviletrinnene var de samme som den første nedbrydningsrunde. Nedbrydningsprocessen var afsluttet, indtil hele blodpropperne var nedbrudt.
- De resterende blodpropper (trin 2.3.2) nedbrydes med den genvundne sFE-opløsning (trin 2.3.4) ved 37 °C i 0,5 timer.
- Udfør celleindsamling.
- Forbered blodcelleprøven ved at opsamle celleblandingen af hver nedbrydningsrunde.
3. Wrights farvning
- Udfør celleudtværing.
- Juster celler til en tæthed på 1 x 106 celler / ml.
- Tilsæt 5 μL af cellerne til poly-L lysinbelagt glasglas, og smør dem derefter ved hjælp af dækselsedlen.
- Fordamp væsken ved stuetemperatur.
- Udfør farvningen.
- Tilsæt 200 μL Wrights farvestof (se materialetabel) forsigtigt til celleudtværingen, og tilsæt 600 μL Wrights farvestof B for at blande jævnt. Plet i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Skyl farvestoffet forsigtigt med rent vand.
BEMÆRK: Det farvede celleudstrygning kan opbevares ved stuetemperatur til senere brug.
- Udfør mikroskopisk billeddannelse.
- Undersøg de farvede celler ved hjælp af et lysmikroskop (se materialetabel).
4. Rutinemæssig blodprøve
- Juster celler til en tæthed på 1 x 106 celler / ml.
- Analyser cellekomponenterne såsom blodplader, erythrocytter, hvide blodlegemer, lymfocytter, neutrofiler, monocytter, eosinofiler, basofiler og umodne granulocytter ved hjælp af en autohematologianalysator i henhold til producentens anvisninger (se materialetabel).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I den indledende fase af nedbrydningsprocessen blev det konstateret, at blodpropperne havde en rød kompakt struktur, og arbejdsløsningen var farveløs. Efter inkubation i 30 minutter blev arbejdsløsningen lys rød, hvilket indikerede, at de krydsede blodlegemer blev frigivet til arbejdsløsningen. De fleste blodpropper blev opløst ved forlængelse af inkubationstiden til 5 timer, og arbejdsløsningen blev lys rød. Tværtimod var der ingen signifikant ændring i den fysiologiske saltvandsgruppe (NC) selv efter 10 timers inkubation (figur 1). Disse resultater viste, at blodcellerne indesluttet i blodpropperne blev frigivet med succes ved denne protokol.
Efter Wrights plet blev cellekomponenterne undersøgt tydeligt under et lysmikroskop (figur 2A). Blandt de frigivne blodlegemer kunne der observeres et stort antal modne røde blodlegemer med let konkave og skiveformede overflader. En stor mængde uregelmæssigt formede små lilla-røde partikler blev observeret på glasrutschebanen, som var blodpladerne frigivet fra blodpropperne. De hvide blodlegemer udviste større plasma og kondenseret kernekraft. Flere typer granulocytter, såsom moden neutrofil granulocyt, eosinofil og monocyt, blev også observeret.
Ved hjælp af autohæmatologianalysator blev cellekomponenterne analyseret kvantitativt. Blandt de påviste celler udgjorde blodplader og erytrocytter henholdsvis 51,25% og 45,24%. Disse data er i overensstemmelse med resultaterne af Wrights plet. Andre blodlegemer, såsom hvide blodlegemer, lymfocytter, neutrofiler, monocytter, eosinofiler, basofiler og umodne granulocytter, blev også påvist (tabel 1). Efter denne protokol kan cellekomponenterne i en cerebral trombose således studeres ikke kun kvalitativt, men også kvantitativt.
Figur 1: Opløsningsproces. Den cerebrale trombe blev opløst i henholdsvis saltvand (NC) og sFE. Fotografering blev taget på 0 t, 5 h og 10 h. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Mikroskopi og flowcytometri af de frigivne celler . (A) Cellerne under mikroskopet efter Wrights farvning. Skalabjælke = 20 μm. (B) Flowcytometriresultater af de frigivne celler. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Rutinemæssig blodprøve | ||
| Parametre | Resultater | Enhed |
| Umodne granulocyt absolutte tal (IG#) | 1 | 109/L |
| Umodne granulocyt procent (IG%) | 3.7 | % |
| Erytrocyttal (RBC) | 1.52 | 1012/L |
| Røde blodlegemer specifikt volumen (HCT) | 13.7 | % |
| Gennemsnitlig korpuskulær volumen (MCV) | 90.1 | F1 |
| Antal hvide blodlegemer (WBC) | 26.98 | 109/L |
| Antal lymfocytter (LYM) | 1.41 | 109/L |
| Lymfocytter procent (LYM%) | 5.2 | % |
| Neutrofiler nummer (Neu#) | 24.08 | 109/L |
| Neutrofiler procent (Neu%) | 89.2 | % |
| Monocyttal (man#) | 1.02 | 109/L |
| Monocytter procent (Mon%) | 3.8 | % |
| Eosinofiler nummer (Eos #) | 0.34 | 109/L |
| Eosinofiler procent (Eos%) | 1.3 | % |
| Basofiler nummer (Bas#) | 0.13 | 109/L |
| Basofiler procent (Bas%) | 0.5 | % |
| blodpladetal (PLT) | 1722 | 109/L |
| Gennemsnitlig trombocytvolumen (MPV) | 11.6 | F1 |
Tabel 1: Rutinemæssig blodprøve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
sFE er et fibrinolytisk middel, der kan nedbryde fibrinet direkte og effektivt12,16. Her blev sFE anvendt til at nedbryde den tværbundne fibrin i cerebrale blodpropper, frigive de lukkede celler i blodpropperne og analysere blodproppernes cellekomponenter kvalitativt og kvantitativt. Mikroskopidataene og rutinemæssig blodprøve indikerede, at de lukkede celler blev frigivet fra blodpropperne. Desuden blev celletyperne og strukturerne i de frigivne celler ikke påvirket signifikant efter sFE-behandling. Således blev der for første gang skabt en unik, enkel og effektiv metode til analyse af cellekomponenterne i cerebrale blodpropper.
Fordi de frigivne celler ikke er så stabile som i blodpropperne, skal nedbrydningsbetingelserne optimeres for at reducere det brudte forhold mellem frigivne celler, såsom temperatur, dosis af sFE, rotationshastighed og nedbrydningstid. Wrights farvningsresultater viste, at baggrunden for 10 timers nedbrydning var mere overskyet end 5 timer. Disse forskelle skyldes sandsynligvis cellerester og andre cellefragmenter. Desuden indikerede flowcytometridataene, at celleaffaldet steg med nedbrydningstiden (figur 2B). Celleaffaldshastigheden ved 10 timers nedbrydning (32,5%) var signifikant højere end ved 5 timers nedbrydning (11,2%). Derfor var det afgørende at adskille de frigivne celler fra arbejdsløsningen så hurtigt som muligt. Så i denne undersøgelse blev cellerne indsamlet hver 0,5 time. Et andet vigtigt punkt var rotationen, som kunne fremskynde nedbrydningen, men er dårlig til at holde den intakte cellestruktur af de frigivne celler.
Selvom nedbrydningsbetingelserne er blevet optimeret, kan nogle celler lyseres i denne proces. Cellerester kan være skadelige for cellemikroskopi og rutinemæssig blodundersøgelse17. Derfor anbefales det at adskille disse cellerester fra de intakte celler. En anden begrænsning af denne teknik er muligheden for mikrobekontaminering. Den underliggende årsag til dette fænomen er sandsynligvis den lange nedbrydningstid i forbindelse med den ikke-sterile operation. Så nogle egnede antibiotika bør tilføjes i fremtidige undersøgelser18. Det er velkendt, at forskellige blodpropper deler lignende blodpropstrukturer. Således vil protokollen, der rapporteres her, være egnet til cellekomponentanalyse af andre blodpropper. Desuden kunne ikke kun cellekomponenterne, men også plasmaet med blodpropperne ved hjælp af denne teknik analyseres kvalitativt og kvantitativt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Denne forskning blev finansieret af Science and Technology Bureau of Xiamen City (3502Z20227197) og Science and Technology Bureau of Fujian-provinsen (nr. 2019J01070, nr. 2021Y0027).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agglutination Reaction Plate | ROTEST | RTB-4003 | |
| Auto Hematology Analyzer | SYSMEX | XNB2 | |
| Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer | SANYO | MLS-3750 | |
| Centrifuge Tube (1.5 mL) | Biosharp | BS-15-M | |
| Clean bench | AIRTECH | BLB-1600 | |
| Constant Temperature Incubator | JINGHONG | JHS-400 | |
| Culture Dish (100 mm) | NEST | 704001 | |
| DHG Series Heating and Drying Oven | SENXIN | DGG-9140AD | |
| Electronic Analytical Balance | DENVER | TP-213 | |
| Filter Membrane (0.22 µm) | Millex GP | SLGP033NK | |
| Micro Refrigerated Centrifuge | Cence | H1650-W | |
| Microscope Slides | CITOGLAS | 01-30253-50 | |
| Milli-Q Reference | Millipore | Z00QSV0CN | |
| Normal Saline | CISEN | H37022337 | |
| Optical Microscope | Nikon | ECLIPSE E100 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Beyotime | C0221A | |
| Pipette Tip (1 mL ) | Axygene | T-1000XT-C | |
| Pipette Tip (200 µL) | Axygene | T-200XT-C | |
| Pipettor (1 mL) | Thermo Fisher Scientific | ZY18723 | |
| Pipettor (200 µL) | Thermo Fisher Scientific | ZY20280 | |
| Scalpel | MARTOR | 23111 | |
| Small-sized Vortex Oscillator | Kylin-Bell | VORTEX KB3 | |
| Tweezer | Hystic | HKQS-180 | |
| Wright Staining Solution | Beyotime | C0135-500ml |
References
- Park, D. W., et al. Edoxaban versus dual antiplatelet therapy for leaflet thrombosis and cerebral thromboembolism after TAVR: The ADAPT-TAVR Randomized clinical trial. Circulation. 146 (6), 466-479 (2022).
- Devasagayam, S., Wyatt, B., Leyden, J., Kleinig, T. Cerebral venous sinus thrombosis incidence is higher than previously thought: a retrospective population-based study. Stroke. 47 (9), 2180-2182 (2016).
- Sacco, R. L., et al. An updated definition of stroke for the 21st century: a statement for healthcare professionals from the American Heart Association/American Stroke Association. Stroke. 44 (7), 2064-2089 (2013).
- Thalin, C., Hisada, Y., Lundstrom, S., Mackman, N., Wallen, H. Neutrophil extracellular traps: villains and targets in arterial, venous, and cancer-associated thrombosis. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 39 (9), 1724-1738 (2019).
- Mocsai, A. Diverse novel functions of neutrophils in immunity, inflammation, and beyond. Journal of Experimental Medicine. 210 (7), 1283-1299 (2013).
- Dhanesha, N., et al. PKM2 promotes neutrophil activation and cerebral thromboinflammation: therapeutic implications for ischemic stroke. Blood. 139 (8), 1234-1245 (2022).
- Ducroux, C., et al. Thrombus neutrophil extracellular traps content impair tpa-induced thrombolysis in acute ischemic stroke. Stroke. 49 (3), 754-757 (2018).
- Solomon, C., Ranucci, M., Hochleitner, G., Schochl, H., Schlimp, C. J. Assessing the methodology for calculating platelet contribution to clot strength (platelet component) in thromboelastometry and thrombelastography. Anesthesia and Analgesia. 121 (4), 868-878 (2015).
- Daraei, A., et al. Automated fiber diameter and porosity measurements of plasma clots in scanning electron microscopy images. Biomolecules. 11 (10), 1536 (2021).
- Abbasi, M., et al. Diverse thrombus composition in thrombectomy stroke patients with longer time to recanalization. Thrombosis Research. 209, 99-104 (2022).
- C W Francis, a, Marder, V. J.
- Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm. Xu, R., Ma, G., Chen, L., Cui, X. , https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en (2019).
- Fotso Fotso, A., Drancourt, M. Laboratory Diagnosis of tick-borne african relapsing fevers: latest developments. Front Public Health. 3, 254 (2015).
- Liou, G. Y., Byrd, C. J. Diagnostic bioliquid markers for pancreatic cancer: What we have vs. what we need. Cancers (Basel). 15 (9), 2446 (2023).
- Tang, M., Lin, H., Hu, C., Yan, H. Affinity purification of a fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus. Journal of Visualized Experiments. 196, e65631 (2023).
- Ge, Y. H., et al. A Novel antithrombotic protease from marine worm Sipunculus Nudus. International Journal Of Molecular Sciences. 19 (10), 3023 (2018).
- Talukder, M. A., Menyuk, C. R., Kostov, Y. Distinguishing between whole cells and cell debris using surface plasmon coupled emission. Biomedical Optics Express. 9 (4), 1977-1991 (2018).
- Shapiro, D. J., Hicks, L. A., Pavia, A. T., Hersh, A. L. Antibiotic prescribing for adults in ambulatory care in the USA, 2007-09. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 69 (1), 234-240 (2014).
