Summary
Deze studie beschrijft een snelle en effectieve methode voor de analyse van celcomponenten van cerebrale bloedstolsels door middel van stolseloplossing, celkleuring en routinematig bloedonderzoek.
Abstract
Cerebrale trombose, een bloedstolsel in een hersenslagader of ader, is het meest voorkomende type herseninfarct. De studie van de celcomponenten van cerebrale bloedstolsels is belangrijk voor diagnose, behandeling en prognose. De huidige benaderingen voor het bestuderen van de celcomponenten van de stolsels zijn echter voornamelijk gebaseerd op in situ kleuring, die ongeschikt is voor de uitgebreide studie van de celcomponenten omdat cellen strak in de stolsels zijn gewikkeld. Eerdere studies hebben met succes een fibrinolytisch enzym (sFE) geïsoleerd uit Sipunculus nudus, dat het verknoopte fibrine direct kan afbreken, waardoor de celcomponenten vrijkomen. Deze studie heeft een uitgebreide methode vastgesteld op basis van de sFE om de celcomponenten van cerebrale trombus te bestuderen. Dit protocol omvat het oplossen van stolsels, het vrijgeven van cellen, celkleuring en routinematig bloedonderzoek. Volgens deze methode konden de celcomponenten kwantitatief en kwalitatief worden bestudeerd. De representatieve resultaten van experimenten met deze methode worden getoond.
Introduction
Cerebrovasculaire ziekte is een van de drie belangrijkste ziekten die de menselijke gezondheid kunnen bedreigen, waaronder ischemische cerebrovasculaire ziekte meer dan 80%. Cerebrale trombose en cerebrale veneuze trombose zijn tegenwoordig de meest bezorgde ischemische cerebrovasculaire aandoeningen, voornamelijk veroorzaakt door cerebrale bloedstolsels 1,2. Als de behandeling niet goed wordt uitgevoerd, zal deze hoge invaliditeits- en sterftecijfers hebben en een hoog recidiefpercentage na ontslag3.
Onlangs heeft een groeiend aantal onderzoeken aangetoond dat de celcomponenten van cerebrale bloedstolsels nauw gecorreleerd zijn met de diagnose, behandeling en prognose van cerebrale trombose 4,5,6. Daarom is de beschikbaarheid van gegevens over de samenstelling van de trombus, met name de celcomponenten, belangrijk voor klinische diagnose en behandeling. Helaas kunnen de momenteel beschikbare methoden de bloedstolselcomponent niet kwantitatief en kwalitatief volledig analyseren. Op Martius Scarlett Blue gebaseerde in-situ kleuring kan bijvoorbeeld alleen de rood/witte bloedcellen van bepaalde plakjes van het stolsel7 bestuderen. Op immunohistochemie (IHC) gebaseerde in-situ kleuring kan slechts beperkte bloedcomponenten van bepaalde plakjes van het stolsel bestuderen met behulp van hun antilichamen8. De microscopische beeldgebaseerde methoden houden zich alleen bezig met de specifieke structuur van het stolsel9. Bovendien zijn al die methoden arbeidsintensief en tijdrovend10. Tot op heden zijn de procedures voor het kwantitatief en kwalitatief bestuderen van cerebrale trombicelcomponenten niet gerapporteerd. Het wordt algemeen erkend dat het verknoopte fibrine de bloedcellen stevig omhult in de stolsels11. Bijgevolg is de specifieke afbraak van het verknoopte fibrine en het vrijkomen van de intacte cellen van cruciaal belang voor de nauwkeurige analyse van celcomponenten.
Eerdere werken isoleerden een fibrinolytisch enzym uit Sipunculus nudus (sFE), dat het fibrine specifiek en snel kanafbreken12. Hierin werd een methode voorgesteld voor het analyseren van de celcomponenten van de cerebrale trombi op basis van de unieke activiteit van sFE. Dit protocol maakte gebruik van sFE om eerst het fibrine van stolsels af te breken en analyseerde vervolgens de celcomponenten door middel van Wright's kleuring en routinematig bloedonderzoek13,14. Volgens deze methode kunnen de celcomponenten van cerebrale trombi kwantitatief en kwalitatief worden bestudeerd. Dit eenvoudige en effectieve protocol kan worden toegepast voor de analyse van celcomponenten van andere bloedstolsels.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het onderzoek is uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen van de Commissie Medische Ethiek van de Huaqiao University. De cerebrale bloedstolsels werden operatief verwijderd en verzameld in het Quanzhou First Hospital, verbonden aan de Fujian Medical University, met geïnformeerde toestemming van de patiënten.
1. Voorbehandeling van bloedstolsels
- Leg de stolsels op een schone schaal, voeg 5 ml fysiologische zoutoplossing toe met een pincet, schud de schaal voorzichtig en verwijder de zoutoplossing met een pipet.
NOTITIE: Herhaal de spoeling drie keer. - Snijd de stolsels met een schaar in kleinere stukken (kleiner dan 5 mm x 5 mm x 5 mm). Voeg 5 ml fysiologische zoutoplossing toe, schud het gerecht voorzichtig en verwijder de zoutoplossing met een pipet.
NOTITIE: Herhaal de spoeling drie keer. Zorg ervoor dat er tijdens het spoelen geen stolsels worden opgezogen. - Breng de stolsels over naar een andere schone U-plaat.
OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd (bewaar de plaat bij 2-8 °C) en later opnieuw worden gestart.
2. Trombolyse
- Bereid de sFE-werkoplossing voor door de concentratie van sFE aan te passen tot 2000 E/ml met fysiologische zoutoplossing.
OPMERKING: De sFE is opgesteld volgens de gevestigde protocollen van Tang Lab15. - Voeg 300 μL sFE-werkoplossing toe aan de voorbehandelde stolsels.
- Voer de eerste degradatieronde uit.
- Incubeer het mengsel van sFE en stolsels bij 37 °C gedurende 0,5 uur.
OPMERKING: De met fysiologische zoutoplossing behandelde vlek werd ingesteld als negatieve controle. Draai het monster niet op de shaker. - Meng het monster voorzichtig. Breng het vloeibare deel over naar een andere schone buis met een schone pipet.
OPMERKING: De resterende stolsels werden gebruikt voor een nieuwe afbraakronde. - Centrifugeer het vloeibare deel bij 200 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
- Breng het supernatans met een pipet over in een andere schone buis om de teruggewonnen sFE-oplossing te verkrijgen.
- Meng de celneerslag voorzichtig met 50 μL fysiologische zoutoplossing.
OPMERKING: Het celmengsel werd 2-8 °C bewaard voor later gebruik.
- Incubeer het mengsel van sFE en stolsels bij 37 °C gedurende 0,5 uur.
- Voer de daaropvolgende degradatie uit.
- Breek de resterende stolsels (stap 2.3.2) af met de teruggewonnen sFE-oplossing (stap 2.3.4) bij 37 °C gedurende 0,5 uur.
LET OP: De ruststappen waren hetzelfde als de eerste degradatieronde. Het afbraakproces werd voltooid totdat de hele stolsels waren afgebroken.
- Breek de resterende stolsels (stap 2.3.2) af met de teruggewonnen sFE-oplossing (stap 2.3.4) bij 37 °C gedurende 0,5 uur.
- Voer celverzameling uit.
- Bereid het bloedcelmonster voor door het celmengsel van elke afbraakronde te verzamelen.
3. De kleuring van Wright
- Voer een celuitstrijkje uit.
- Stel de cellen in op een dichtheid van 1 x 106 cellen/ml.
- Voeg 5 μL van de cellen toe aan het met poly-L lysine gecoate glasplaatje en smeer ze vervolgens in met het afdekglaasje.
- Verdamp de vloeistof bij kamertemperatuur.
- Voer de kleuring uit.
- Voeg voorzichtig 200 μL Wright's kleurstof (zie Materiaaltabel) toe aan het celuitstrijkje en voeg 600 μL Wright's kleurstof B toe om gelijkmatig te mengen. Vlek gedurende 10 minuten op kamertemperatuur.
- Spoel de kleurstof voorzichtig af met schoon water.
NOTITIE: Het uitstrijkje met gekleurde cellen kan bij kamertemperatuur worden bewaard voor later gebruik.
- Voer microscopische beeldvorming uit.
- Onderzoek de gekleurde cellen met een lichtmicroscoop (zie Tabel met materialen).
4. Routinematig bloedonderzoek
- Stel de cellen in op een dichtheid van 1 x 106 cellen/ml.
- Analyseer de celcomponenten zoals bloedplaatjes, erytrocyten, witte bloedcellen, lymfocyten, neutrofielen, monocyten, eosinofielen, basofielen en onrijpe granulocyten met behulp van een autohematologieanalysator volgens de instructies van de fabrikant (zie Materiaaltabel).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In de beginfase van het afbraakproces bleek dat de bloedstolsels een rode compacte structuur hadden en dat de werkoplossing kleurloos was. Na 30 minuten incubatie werd de werkoplossing lichtrood, wat aangaf dat de gekruiste bloedcellen in de werkoplossing waren vrijgegeven. De meeste stolsels werden opgelost bij het verlengen van de incubatietijd tot 5 uur en de werkoplossing werd lichtrood. Integendeel, er was geen significante verandering in de fysiologische zoutoplossinggroep (NC), zelfs niet na 10 uur incubatie (figuur 1). Deze resultaten toonden aan dat de bloedcellen die in de stolsels waren ingesloten, met succes werden vrijgegeven door dit protocol.
Na de kleuring van Wright werden de celcomponenten duidelijk onderzocht onder een lichtmicroscoop (Figuur 2A). Onder de vrijgekomen bloedcellen kon een groot aantal rijpe rode bloedcellen met licht concave en schijfvormige oppervlakken worden waargenomen. Op het glasplaatje werd een grote hoeveelheid onregelmatig gevormde kleine paarsrode deeltjes waargenomen, dit waren de bloedplaatjes die vrijkwamen uit de bloedstolsels. De witte bloedcellen vertoonden groter plasma en gecondenseerd nucleair. Verschillende soorten granulocyten, zoals rijpe neutrofiele granulocyten, eosinofielen en monocyten, werden ook waargenomen.
Met behulp van een autohematologieanalysator werden de celcomponenten kwantitatief geanalyseerd. Van de gedetecteerde cellen waren bloedplaatjes en erytrocyten goed voor respectievelijk 51,25% en 45,24%. Deze gegevens komen overeen met de resultaten van de vlek van Wright. Andere bloedcellen, zoals witte bloedcellen, lymfocyten, neutrofielen, monocyten, eosinofielen, basofielen en onrijpe granulocyten, werden ook gedetecteerd (tabel 1). Volgens dit protocol kunnen de celcomponenten van een cerebrale trombus dus niet alleen kwalitatief, maar ook kwantitatief worden bestudeerd.
Figuur 1: Oplossingsproces. De cerebrale trombus werd opgelost in respectievelijk de zoutoplossing (NC) en de sFE. De foto's zijn gemaakt om 0 uur, 5 uur en 10 uur. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Microscopie en flowcytometrie van de vrijgekomen cellen. (A) De cellen onder de microscoop na de kleuring van Wright. Schaalbalk = 20 μm. (B) Flowcytometrie resultaten van de vrijgekomen cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Routinematige bloedtest | ||
| Parameters | Resultaten | Eenheid |
| Onrijp granulocyt absoluut aantal (IG#) | 1 | 109/L |
| Percentage onrijpe granulocyten (IG%) | 3.7 | % |
| Aantal erytrocyten (RBC) | 1.52 | 1012/L |
| Specifiek volume rode bloedcellen (HCT) | 13.7 | % |
| Gemiddeld corpusculair volume (MCV) | 90.1 | F1 |
| Aantal witte bloedcellen (WBC) | 26.98 | 109/L |
| Aantal lymfocyten (LYM) | 1.41 | 109/L |
| Percentage lymfocyten (LYM%) | 5.2 | % |
| Aantal neutrofielen (Neu#) | 24.08 | 109/L |
| Percentage neutrofielen (Neu%) | 89.2 | % |
| Aantal monocyten (Mon#) | 1.02 | 109/L |
| Percentage monocyten (Mon%) | 3.8 | % |
| Eosinofielen nummer (Eos#) | 0.34 | 109/L |
| Eosinofielen percentage (Eos%) | 1.3 | % |
| Basofielen aantal (Bas#) | 0.13 | 109/L |
| Basofielen percentage (Bas%) | 0.5 | % |
| aantal bloedplaatjes (PLT) | 1722 | 109/L |
| Gemiddeld bloedplaatjesvolume (MPV) | 11.6 | F1 |
Tabel 1: Routinematig bloedonderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
sFE is een fibrinolytisch middel dat het fibrine direct en effectief kan afbreken12,16. Hier werd sFE gebruikt om het verknoopte fibrine van de cerebrale bloedstolsels af te breken, de ingesloten cellen in de stolsels vrij te maken en de celcomponenten van de stolsels kwalitatief en kwantitatief te analyseren. De microscopiegegevens en routinematig bloedonderzoek gaven aan dat de ingesloten cellen uit de bloedstolsels waren vrijgekomen. Bovendien werden de celtypen en structuren van de vrijgekomen cellen niet significant beïnvloed na sFE-behandeling. Zo werd voor het eerst een unieke, eenvoudige en effectieve methode gecreëerd voor het analyseren van de celcomponenten van cerebrale bloedstolsels.
Omdat de vrijgekomen cellen niet zo stabiel zijn als in de stolsels, moeten de afbraakomstandigheden worden geoptimaliseerd om de gebroken verhouding van vrijgekomen cellen, zoals temperatuur, de dosis sFE, rotatiesnelheid en afbraaktijd, te verminderen. De kleuringsresultaten van Wright toonden aan dat de achtergrond van de 10 uur degradatie meer troebel was dan die van 5 uur. Deze verschillen zijn waarschijnlijk te wijten aan celresten en andere celfragmenten. Bovendien gaven de flowcytometriegegevens aan dat het celafval toenam met de afbraaktijd (Figuur 2B). De snelheid van celresten van 10 uur afbraak (32,5%) was significant hoger dan die van 5 uur afbraak (11,2%). Daarom was het van cruciaal belang om de vrijgekomen cellen zo snel mogelijk van de werkoplossing te scheiden. Dus in deze studie werden de cellen elke 0,5 uur verzameld. Een ander belangrijk punt was de rotatie, die de afbraak zou kunnen versnellen, maar slecht is voor het intact houden van de celstructuur van de vrijgekomen cellen.
Hoewel de afbraakomstandigheden zijn geoptimaliseerd, kunnen sommige cellen in dit proces worden gelyseerd. Celresten kunnen schadelijk zijn voor celmicroscopie en routinematig bloedonderzoek17. Daarom wordt aanbevolen om die celresten te scheiden van de intacte cellen. Een andere beperking van deze techniek is de mogelijkheid van besmetting met de microben. De onderliggende reden voor dit fenomeen is waarschijnlijk de lange afbraaktijd in combinatie met de niet-steriele operatie. In toekomstige studies moeten dus enkele geschikte antibiotica worden toegevoegd18. Het is bekend dat verschillende bloedstolsels vergelijkbare stolselstructuren hebben. Het hier gerapporteerde protocol zal dus geschikt zijn voor analyse van celcomponenten van andere bloedstolsels. Bovendien konden met behulp van deze techniek niet alleen de celcomponenten, maar ook het plasma met de stolsels kwalitatief en kwantitatief worden geanalyseerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gefinancierd door het Science and Technology Bureau van de stad Xiamen (3502Z20227197) en het Science and Technology Bureau van de provincie Fujian (nr. 2019J01070, nr. 2021Y0027).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agglutination Reaction Plate | ROTEST | RTB-4003 | |
| Auto Hematology Analyzer | SYSMEX | XNB2 | |
| Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer | SANYO | MLS-3750 | |
| Centrifuge Tube (1.5 mL) | Biosharp | BS-15-M | |
| Clean bench | AIRTECH | BLB-1600 | |
| Constant Temperature Incubator | JINGHONG | JHS-400 | |
| Culture Dish (100 mm) | NEST | 704001 | |
| DHG Series Heating and Drying Oven | SENXIN | DGG-9140AD | |
| Electronic Analytical Balance | DENVER | TP-213 | |
| Filter Membrane (0.22 µm) | Millex GP | SLGP033NK | |
| Micro Refrigerated Centrifuge | Cence | H1650-W | |
| Microscope Slides | CITOGLAS | 01-30253-50 | |
| Milli-Q Reference | Millipore | Z00QSV0CN | |
| Normal Saline | CISEN | H37022337 | |
| Optical Microscope | Nikon | ECLIPSE E100 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Beyotime | C0221A | |
| Pipette Tip (1 mL ) | Axygene | T-1000XT-C | |
| Pipette Tip (200 µL) | Axygene | T-200XT-C | |
| Pipettor (1 mL) | Thermo Fisher Scientific | ZY18723 | |
| Pipettor (200 µL) | Thermo Fisher Scientific | ZY20280 | |
| Scalpel | MARTOR | 23111 | |
| Small-sized Vortex Oscillator | Kylin-Bell | VORTEX KB3 | |
| Tweezer | Hystic | HKQS-180 | |
| Wright Staining Solution | Beyotime | C0135-500ml |
References
- Park, D. W., et al. Edoxaban versus dual antiplatelet therapy for leaflet thrombosis and cerebral thromboembolism after TAVR: The ADAPT-TAVR Randomized clinical trial. Circulation. 146 (6), 466-479 (2022).
- Devasagayam, S., Wyatt, B., Leyden, J., Kleinig, T. Cerebral venous sinus thrombosis incidence is higher than previously thought: a retrospective population-based study. Stroke. 47 (9), 2180-2182 (2016).
- Sacco, R. L., et al. An updated definition of stroke for the 21st century: a statement for healthcare professionals from the American Heart Association/American Stroke Association. Stroke. 44 (7), 2064-2089 (2013).
- Thalin, C., Hisada, Y., Lundstrom, S., Mackman, N., Wallen, H. Neutrophil extracellular traps: villains and targets in arterial, venous, and cancer-associated thrombosis. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 39 (9), 1724-1738 (2019).
- Mocsai, A. Diverse novel functions of neutrophils in immunity, inflammation, and beyond. Journal of Experimental Medicine. 210 (7), 1283-1299 (2013).
- Dhanesha, N., et al. PKM2 promotes neutrophil activation and cerebral thromboinflammation: therapeutic implications for ischemic stroke. Blood. 139 (8), 1234-1245 (2022).
- Ducroux, C., et al. Thrombus neutrophil extracellular traps content impair tpa-induced thrombolysis in acute ischemic stroke. Stroke. 49 (3), 754-757 (2018).
- Solomon, C., Ranucci, M., Hochleitner, G., Schochl, H., Schlimp, C. J. Assessing the methodology for calculating platelet contribution to clot strength (platelet component) in thromboelastometry and thrombelastography. Anesthesia and Analgesia. 121 (4), 868-878 (2015).
- Daraei, A., et al. Automated fiber diameter and porosity measurements of plasma clots in scanning electron microscopy images. Biomolecules. 11 (10), 1536 (2021).
- Abbasi, M., et al. Diverse thrombus composition in thrombectomy stroke patients with longer time to recanalization. Thrombosis Research. 209, 99-104 (2022).
- C W Francis, a, Marder, V. J.
- Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm. Xu, R., Ma, G., Chen, L., Cui, X. , https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en (2019).
- Fotso Fotso, A., Drancourt, M. Laboratory Diagnosis of tick-borne african relapsing fevers: latest developments. Front Public Health. 3, 254 (2015).
- Liou, G. Y., Byrd, C. J. Diagnostic bioliquid markers for pancreatic cancer: What we have vs. what we need. Cancers (Basel). 15 (9), 2446 (2023).
- Tang, M., Lin, H., Hu, C., Yan, H. Affinity purification of a fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus. Journal of Visualized Experiments. 196, e65631 (2023).
- Ge, Y. H., et al. A Novel antithrombotic protease from marine worm Sipunculus Nudus. International Journal Of Molecular Sciences. 19 (10), 3023 (2018).
- Talukder, M. A., Menyuk, C. R., Kostov, Y. Distinguishing between whole cells and cell debris using surface plasmon coupled emission. Biomedical Optics Express. 9 (4), 1977-1991 (2018).
- Shapiro, D. J., Hicks, L. A., Pavia, A. T., Hersh, A. L. Antibiotic prescribing for adults in ambulatory care in the USA, 2007-09. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 69 (1), 234-240 (2014).
