Summary
Cette étude décrit une méthode rapide et efficace pour l’analyse des composants cellulaires des caillots sanguins cérébraux par la dissolution des caillots, la coloration cellulaire et l’examen sanguin de routine.
Abstract
La thrombose cérébrale, un caillot sanguin dans une artère ou une veine cérébrale, est le type d’infarctus cérébral le plus courant. L’étude des composants cellulaires des caillots sanguins cérébraux est importante pour le diagnostic, le traitement et le pronostic. Cependant, les approches actuelles pour étudier les composants cellulaires des caillots sont principalement basées sur la coloration in situ , ce qui ne convient pas à l’étude complète des composants cellulaires car les cellules sont étroitement enveloppées dans les caillots. Des études antérieures ont réussi à isoler une enzyme fibrinolytique (sFE) de Sipunculus nudus, qui peut dégrader directement la fibrine réticulée, libérant les composants cellulaires. Cette étude a permis d’établir une méthode complète basée sur la sFE pour étudier les composants cellulaires du thrombus cérébral. Ce protocole comprend la dissolution du caillot, la libération des cellules, la coloration des cellules et l’examen sanguin de routine. Selon cette méthode, les composants cellulaires pourraient être étudiés quantitativement et qualitativement. Les résultats représentatifs des expériences utilisant cette méthode sont présentés.
Introduction
Les maladies cérébrovasculaires sont l’une des trois principales maladies qui peuvent menacer la santé humaine, parmi lesquelles les maladies cérébrovasculaires ischémiques représentent plus de 80%. La thrombose cérébrale et la thrombose veineuse cérébrale sont les maladies cérébrovasculaires ischémiques les plus concernées aujourd’hui, principalement causées par des caillots sanguins cérébraux 1,2. Si le traitement n’est pas effectué correctement, il aura des taux élevés d’invalidité et de mortalité et un taux de récidive élevé après la sortie3.
Récemment, un nombre croissant d’études ont montré que les composants cellulaires des caillots sanguins cérébraux sont étroitement corrélés au diagnostic, au traitement et au pronostic de la thrombose cérébrale 4,5,6. Par conséquent, la disponibilité de données sur la composition du thrombus, en particulier les composants cellulaires, est importante pour le diagnostic clinique et le traitement. Malheureusement, les méthodes actuellement disponibles ne permettent pas d’analyser de manière exhaustive le composant du caillot sanguin quantitativement et qualitativement. Par exemple, la coloration in situ basée sur Martius Scarlett Blue ne peut étudier que les globules rouges/blancs de certaines tranches du caillot7. La coloration in situ basée sur l’immunohistochimie (IHC) ne permet d’étudier que des composants sanguins limités de certaines tranches du caillot à l’aide de leurs anticorps8. Les méthodes basées sur l’imagerie microscopique ne s’intéressent qu’à la structure spécifique du caillot9. De plus, toutes ces méthodes sont laborieuses et chronophages10. À ce jour, les procédures permettant d’étudier quantitativement et qualitativement les composants des cellules des thrombus cérébraux n’ont pas été rapportées. Il est largement reconnu que la fibrine réticulée enveloppe étroitement les cellules sanguines dans les caillots11. Par conséquent, la dégradation spécifique de la fibrine réticulée et la libération des cellules intactes sont essentielles pour l’analyse précise des composants cellulaires.
Des travaux antérieurs ont isolé une enzyme fibrinolytique de Sipunculus nudus (sFE), qui peut dégrader la fibrine de manière spécifique et rapide12. Ici, une méthode d’analyse des composants cellulaires des thrombus cérébraux basée sur l’activité unique de la sFE a été proposée. Ce protocole a utilisé la sFE pour dégrader d’abord la fibrine des caillots, puis a analysé les composants cellulaires par coloration de Wright et examen sanguin de routine13,14. Selon cette méthode, les composants cellulaires des thrombus cérébraux peuvent être étudiés quantitativement et qualitativement. Ce protocole simple et efficace pourrait être appliqué pour l’analyse des composants cellulaires d’autres caillots sanguins.
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Protocol
La recherche a été réalisée conformément aux directives institutionnelles du Comité d’éthique médicale de l’Université Huaqiao. Les caillots sanguins cérébraux ont été retirés chirurgicalement et prélevés au premier hôpital de Quanzhou, affilié à l’Université médicale du Fujian, avec le consentement éclairé des patients.
1. Prétraitement des caillots sanguins
- Placez les caillots sur un plat propre, ajoutez 5 mL de sérum physiologique à l’aide d’une pince à épiler, secouez doucement le plat et retirez le sérum physiologique à l’aide d’une pipette.
REMARQUE : Répétez le rinçage trois fois. - Coupez les caillots en petits morceaux (moins de 5 mm x 5 mm x 5 mm) avec des ciseaux. Ajouter 5 mL de sérum physiologique, agiter doucement le plat et retirer le sérum physiologique à l’aide d’une pipette.
REMARQUE : Répétez le rinçage trois fois. Assurez-vous qu’aucun caillot n’est aspiré pendant le rinçage. - Transférez les caillots sur une autre plaque en U propre.
REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici (stocker la plaque entre 2 et 8 °C) et redémarré plus tard.
2. Thrombolyse
- Préparer la solution de travail de sFE en ajustant la concentration de sFE à 2000 U/mL avec une solution saline physiologique.
REMARQUE : Le sFE a été préparé selon les protocoles bien établis du Tang Lab15. - Ajouter 300 μL de solution de travail sFE dans les caillots prétraités.
- Effectuez le premier cycle de dégradation.
- Incuber le mélange de sFE et de caillots à 37 °C pendant 0,5 h.
REMARQUE : Le transfert traité avec une solution saline physiologique a été défini comme témoin négatif. Ne faites pas pivoter l’échantillon sur l’agitateur. - Mélangez délicatement l’échantillon. Transférez la partie liquide dans un autre tube propre à l’aide d’une pipette propre.
REMARQUE : Les caillots restants ont été utilisés pour une autre série de dégradations. - Centrifuger la partie liquide à 200 × g pendant 5 min à 4 °C.
- Transférez le surnageant dans un autre tube propre à l’aide d’une pipette pour obtenir la solution de sFE récupérée.
- Mélangez délicatement la précipitation cellulaire avec 50 μL de solution saline physiologique.
REMARQUE : Le mélange cellulaire a été stocké entre 2 et 8 °C pour une utilisation ultérieure.
- Incuber le mélange de sFE et de caillots à 37 °C pendant 0,5 h.
- Effectuez une dégradation ultérieure.
- Dégrader les caillots restants (étape 2.3.2) avec la solution de sFE récupérée (étape 2.3.4) à 37 °C pendant 0,5 h.
REMARQUE : Les étapes de repos étaient les mêmes que celles du premier cycle de dégradation. Le processus de dégradation a été terminé jusqu’à ce que l’ensemble des caillots soit dégradé.
- Dégrader les caillots restants (étape 2.3.2) avec la solution de sFE récupérée (étape 2.3.4) à 37 °C pendant 0,5 h.
- Effectuez la collecte de cellules.
- Préparez l’échantillon de cellules sanguines en recueillant le mélange cellulaire de chaque cycle de dégradation.
3. La coloration de Wright
- Effectuer un frottis cellulaire.
- Ajustez les cellules à une densité de 1 x 106 cellules/mL.
- Ajoutez 5 μL de cellules sur la lame de verre enduite de poly-L lysine, puis étalez-les à l’aide de la lamelle.
- Évaporez le liquide à température ambiante.
- Effectuez la coloration.
- Ajouter doucement 200 μL de colorant de Wright (voir le tableau des matériaux) au frottis cellulaire et ajouter 600 μL de colorant B de Wright pour mélanger uniformément. Colorer pendant 10 min à température ambiante.
- Rincez délicatement la teinture à l’eau claire.
REMARQUE : Le frottis cellulaire coloré peut être conservé à température ambiante pour une utilisation ultérieure.
- Effectuer de l’imagerie microscopique.
- Examinez les cellules colorées à l’aide d’un microscope optique (voir le tableau des matériaux).
4. Examen sanguin de routine
- Ajustez les cellules à une densité de 1 x 106 cellules/mL.
- Analysez les composants cellulaires tels que les plaquettes, les érythrocytes, les globules blancs, les lymphocytes, les neutrophiles, les monocytes, les éosinophiles, les basophiles et les granulocytes immatures à l’aide d’un analyseur d’autohématologie selon les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).
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Representative Results
Au stade initial du processus de dégradation, il a été constaté que les caillots sanguins avaient une structure compacte rouge et que la solution de travail était incolore. Après une incubation de 30 minutes, la solution de travail est devenue rouge clair, ce qui indique que les cellules sanguines croisées ont été libérées dans la solution de travail. La plupart des caillots ont été dissous lors de l’allongement du temps d’incubation à 5 h, et la solution de travail est devenue rouge clair. Au contraire, il n’y a pas eu de changement significatif dans le groupe physiologique salin (NC) même après 10 h d’incubation (Figure 1). Ces résultats ont montré que les cellules sanguines enfermées dans les caillots ont été libérées avec succès par ce protocole.
Après la coloration de Wright, les composants cellulaires ont été examinés clairement au microscope optique (Figure 2A). Parmi les globules sanguins libérés, un grand nombre de globules rouges matures avec des surfaces légèrement concaves et en forme de disque ont pu être observés. Une grande quantité de petites particules rouge-violet de forme irrégulière a été observée sur la lame de verre, qui étaient les plaquettes libérées par les caillots sanguins. Les globules blancs présentaient un plasma plus gros et du nucléaire condensé. Plusieurs types de granulocytes, tels que les granulocytes neutrophiles matures, les éosinophiles et les monocytes, ont également été observés.
À l’aide d’un analyseur d’auto-hématologie, les composants cellulaires ont été analysés quantitativement. Parmi les cellules détectées, les plaquettes et les érythrocytes représentaient respectivement 51,25 % et 45,24 %. Ces données sont cohérentes avec les résultats de la coloration de Wright. D’autres cellules sanguines, comme les globules blancs, les lymphocytes, les neutrophiles, les monocytes, les éosinophiles, les basophiles et les granulocytes immatures, ont également été détectées (tableau 1). Ainsi, en suivant ce protocole, les composants cellulaires d’un thrombus cérébral peuvent être étudiés non seulement qualitativement mais aussi quantitativement.
Figure 1 : Processus de dissolution. Le thrombus cérébral a été dissous dans la solution saline (NC) et la sFE, respectivement. La photographie a été prise à 0 h, 5 h et 10 h. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Microscopie et cytométrie en flux des cellules libérées. (A) Les cellules sous le microscope après la coloration de Wright. Barre d’échelle = 20 μm. (B) Résultats de cytométrie en flux des cellules libérées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Test sanguin de routine | ||
| Paramètres | Résultats | Unité |
| Nombre absolu de granulocytes immatures (IG#) | 1 | 109/L |
| Pourcentage de granulocytes immatures (IG%) | 3.7 | % |
| Numération érythrocytaire (GR) | 1.52 | 1012/L |
| Volume spécifique des globules rouges (HCT) | 13.7 | % |
| Volume corpusculaire moyen (MCV) | 90.1 | F1 (en anglais seulement) |
| Nombre de globules blancs (GB) | 26.98 | 109/L |
| Nombre de lymphocytes (LYM) | 1.41 | 109/L |
| Pourcentage de lymphocytes (LYM%) | 5.2 | % |
| Nombre de neutrophiles (Neu#) | 24.08 | 109/L |
| Pourcentage de neutrophiles (Neu%) | 89.2 | % |
| Nombre de monocytes (Mon#) | 1.02 | 109/L |
| Pourcentage de monocytes (Mon%) | 3.8 | % |
| Nombre d’éosinophiles (Eos#) | 0.34 | 109/L |
| Pourcentage d’éosinophiles (Eos%) | 1.3 | % |
| Nombre de basophiles (Bas#) | 0.13 | 109/L |
| Pourcentage de basophiles (Bas%) | 0.5 | % |
| numération plaquettaire (PLT) | 1722 | 109/L |
| Volume plaquettaire moyen (MPV) | 11.6 | F1 (en anglais seulement) |
Tableau 1 : Examen sanguin de routine.
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Discussion
La sFE est un agent fibrinolytique qui peut dégrader la fibrine directement et efficacement12,16. Ici, la sFE a été utilisée pour dégrader la fibrine réticulée des caillots sanguins cérébraux, libérer les cellules enfermées dans les caillots et analyser qualitativement et quantitativement les composants cellulaires des caillots. Les données microscopiques et l’examen sanguin de routine ont indiqué que les cellules enfermées avaient été libérées des caillots sanguins. De plus, les types cellulaires et les structures des cellules libérées n’ont pas été affectés de manière significative après le traitement par sFE. Ainsi, une méthode unique, simple et efficace a été créée pour la première fois pour analyser les composants cellulaires des caillots sanguins cérébraux.
Étant donné que les cellules libérées ne sont pas aussi stables que dans les caillots, les conditions de dégradation doivent être optimisées pour diminuer le taux de rupture des cellules libérées, telles que la température, la dose de sFE, la vitesse de rotation et le temps de dégradation. Les résultats de coloration de Wright ont montré que le bruit de fond de la dégradation de 10 h était plus nuageux que celui de 5 h. Ces différences sont probablement dues à des débris cellulaires et à d’autres fragments cellulaires. De plus, les données de cytométrie en flux ont indiqué que les débris cellulaires augmentaient avec le temps de dégradation (Figure 2B). Le taux de dégradation des débris cellulaires après 10 h (32,5 %) était significativement plus élevé que celui de la dégradation après 5 h (11,2 %). Par conséquent, il était essentiel de séparer les cellules libérées de la solution de travail dès que possible. Ainsi, dans cette étude, les cellules ont été collectées toutes les 0,5 h. Un autre point clé était la rotation, qui pourrait accélérer la dégradation mais est mauvaise pour garder la structure cellulaire intacte des cellules libérées.
Bien que les conditions de dégradation aient été optimisées, certaines cellules peuvent être lysées au cours de ce processus. Les débris cellulaires peuvent être nocifs pour la microscopie cellulaire et l’examen sanguin de routine17. Par conséquent, il est recommandé de séparer ces débris cellulaires des cellules intactes. Une autre limite de cette technique est la possibilité d’une contamination microbienne. La raison sous-jacente de ce phénomène est probablement le long temps de dégradation en couple avec le fonctionnement non stérile. Ainsi, certains antibiotiques appropriés devraient être ajoutés dans de futures études18. Il est bien connu que différents caillots sanguins partagent des structures de caillots similaires. Ainsi, le protocole rapporté ici conviendra à l’analyse des composants cellulaires d’autres caillots sanguins. De plus, à l’aide de cette technique, non seulement les composants cellulaires, mais aussi le plasma avec les caillots ont pu être analysés qualitativement et quantitativement.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Cette recherche a été financée par le Bureau des sciences et de la technologie de la ville de Xiamen (3502Z20227197) et le Bureau des sciences et de la technologie de la province du Fujian (n° 2019J01070, n° 2021Y0027).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agglutination Reaction Plate | ROTEST | RTB-4003 | |
| Auto Hematology Analyzer | SYSMEX | XNB2 | |
| Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer | SANYO | MLS-3750 | |
| Centrifuge Tube (1.5 mL) | Biosharp | BS-15-M | |
| Clean bench | AIRTECH | BLB-1600 | |
| Constant Temperature Incubator | JINGHONG | JHS-400 | |
| Culture Dish (100 mm) | NEST | 704001 | |
| DHG Series Heating and Drying Oven | SENXIN | DGG-9140AD | |
| Electronic Analytical Balance | DENVER | TP-213 | |
| Filter Membrane (0.22 µm) | Millex GP | SLGP033NK | |
| Micro Refrigerated Centrifuge | Cence | H1650-W | |
| Microscope Slides | CITOGLAS | 01-30253-50 | |
| Milli-Q Reference | Millipore | Z00QSV0CN | |
| Normal Saline | CISEN | H37022337 | |
| Optical Microscope | Nikon | ECLIPSE E100 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Beyotime | C0221A | |
| Pipette Tip (1 mL ) | Axygene | T-1000XT-C | |
| Pipette Tip (200 µL) | Axygene | T-200XT-C | |
| Pipettor (1 mL) | Thermo Fisher Scientific | ZY18723 | |
| Pipettor (200 µL) | Thermo Fisher Scientific | ZY20280 | |
| Scalpel | MARTOR | 23111 | |
| Small-sized Vortex Oscillator | Kylin-Bell | VORTEX KB3 | |
| Tweezer | Hystic | HKQS-180 | |
| Wright Staining Solution | Beyotime | C0135-500ml |
References
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