Summary
본 연구는 혈전 용해, 세포 염색 및 정기 혈액 검사를 통한 뇌혈전의 세포 성분 분석을 위한 빠르고 효과적인 방법을 설명합니다.
Abstract
뇌동맥이나 정맥에 혈전이 생기는 뇌혈전증은 뇌경색의 가장 흔한 유형이다. 뇌혈전의 세포 성분에 대한 연구는 진단, 치료 및 예후에 중요합니다. 그러나 혈전의 세포 성분을 연구하는 현재의 접근 방식은 주로 in situ 염색을 기반으로 하며, 이는 세포가 혈전으로 단단히 싸여 있기 때문에 세포 성분에 대한 포괄적인 연구에는 적합하지 않습니다. 이전 연구에서는 Sipunculus nudus에서 섬유소 용해 효소(sFE)를 성공적으로 분리했는데, 이는 가교 결합된 피브린을 직접 분해하여 세포 성분을 방출할 수 있습니다. 이 연구는 뇌혈전의 세포 성분을 연구하기 위해 sFE를 기반으로 하는 포괄적인 방법을 확립했습니다. 이 프로토콜에는 혈전 용해, 세포 방출, 세포 염색 및 정기 혈액 검사가 포함됩니다. 이 방법에 따르면 세포 구성 요소를 정량적 및 정성적으로 연구할 수 있습니다. 이 방법을 사용한 실험의 대표적인 결과를 나타낸다.
Introduction
뇌혈관질환은 인간의 건강을 위협할 수 있는 3대 질환 중 하나로, 그 중 허혈성 뇌혈관질환이 80% 이상을 차지합니다. 뇌혈전증과 뇌정맥혈전증은 오늘날 가장 우려되는 허혈성 뇌혈관 질환으로, 주로 뇌혈전으로 인해 발생한다 1,2. 치료가 제대로 이루어지지 않으면 장애율과 사망률이 높고 퇴원 후 재발률이 높다3.
최근에는 뇌혈전의 세포 성분이 뇌혈전증의 진단, 치료 및 예후와 밀접한 상관관계가 있다는 연구 결과가 점점 더 많이 나오고 있다 4,5,6. 따라서 혈전 구성, 특히 세포 구성 요소에 대한 데이터의 가용성은 임상 진단 및 치료에 중요합니다. 안타깝게도, 현재 사용 가능한 방법으로는 혈전 성분을 정량적, 정성적으로 종합적으로 분석할 수 없습니다. 예를 들어, Martius Scarlett Blue 기반 in-situ 염색은 혈전7의 특정 절편의 적혈구/백혈구만 연구할 수 있습니다. 면역조직화학(IHC) 기반 in-situ 염색은 항체를 사용하여 혈전의 특정 절편의 제한된 혈액 성분만 연구할 수 있다8. 현미경적 이미지 기반 방법은 응고(9)의 특정 구조에만 관련된다. 더욱이 이러한 모든 방법은 힘들고 시간이 많이 걸립니다10. 현재까지 대뇌혈전세포 성분을 정량적, 정성적으로 연구하는 절차는 보고되지 않았다. 가교된 피브린이 혈전의 혈액 세포를 단단히 감싸는 것은 널리 알려져있다 11. 결과적으로, 가교된 피브린의 특이적 분해와 온전한 세포의 방출은 세포 성분의 정확한 분석에 매우 중요합니다.
이전 연구에서는 피브린을 특이적이고 빠르게 분해할 수 있는 Sipunculus nudus(sFE)에서 섬유소 용해 효소를 분리했습니다12. 본 연구에서는 sFE의 독특한 활성에 기초하여 뇌혈전의 세포 성분을 분석하는 방법을 제안하였다. 이 프로토콜은 sFE를 사용하여 먼저 혈전의 피브린을 분해한 다음 Wright의 염색 및 정기 혈액 검사13,14로 세포 성분을 분석했습니다. 이 방법에 따르면 뇌혈전의 세포 성분을 정량적, 정성적으로 연구할 수 있다. 이 간단하고 효과적인 프로토콜은 다른 혈전의 세포 성분 분석에 적용될 수 있습니다.
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Protocol
이 연구는 Huaqiao University 의료 윤리 위원회의 기관 지침에 따라 수행되었습니다. 뇌혈전은 푸젠 의과대학 부속 취안저우 제1병원에서 환자의 사전 동의를 얻어 외과적으로 제거해 채취했다.
1. 혈전 전처리
- 깨끗한 접시에 혈전을 놓고 핀셋으로 생리식염수 5mL를 넣고 접시를 부드럽게 흔든 다음 피펫으로 식염수를 제거합니다.
알림: 헹굼을 세 번 반복합니다. - 가위로 혈전을 더 작은 조각(5mm x 5mm x 5mm 미만)으로 자릅니다. 생리식염수 5mL를 넣고 접시를 부드럽게 흔든 후 피펫으로 식염수를 제거합니다.
알림: 헹굼을 세 번 반복합니다. 헹구는 동안 응고 조각이 흡입되지 않도록 하십시오. - 혈전을 다른 깨끗한 U-플레이트로 옮깁니다.
알림: 프로토콜은 여기에서 일시 중지하고(플레이트를 2-8°C에 보관) 나중에 다시 시작할 수 있습니다.
2. 혈전용해
- 생리식염수로 sFE의 농도를 2000U/mL로 조정하여 sFE 작업 용액을 준비합니다.
알림: sFE는 Tang Lab15의 잘 정립된 프로토콜에 따라 준비되었습니다. - 300μL의 sFE 작업 용액을 전처리된 혈전에 추가합니다.
- 첫 번째 성능 저하 라운드를 수행합니다.
- sFE와 응고의 혼합물을 37°C에서 0.5시간 동안 배양합니다.
참고: 생리식염수로 처리한 블롯은 음성 대조군으로 설정되었습니다. s를 회전하지 마십시오amp셰이커에서. - 샘플을 부드럽게 섞는다. 깨끗한 피펫으로 액체 부분을 다른 깨끗한 튜브로 옮깁니다.
참고: 남은 혈전은 또 다른 분해에 사용되었습니다. - 액체 부분을 200× g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
- 피펫을 사용하여 상층액을 다른 깨끗한 튜브로 옮겨 회수된 sFE 용액을 얻습니다.
- 세포 침전물을 50μL의 생리식염수와 부드럽게 혼합합니다.
참고: 셀 혼합물은 나중에 사용하기 위해 2-8°C에 보관했습니다.
- sFE와 응고의 혼합물을 37°C에서 0.5시간 동안 배양합니다.
- 후속 성능 저하를 수행합니다.
- 회수된 sFE 용액(단계 2.3.4)으로 나머지 응고(단계 2.3.2)를 37°C에서 0.5시간 동안 분해합니다.
참고: 나머지 단계는 첫 번째 성능 저하 라운드와 동일했습니다. 전체 혈전이 분해될 때까지 분해 과정이 완료되었습니다.
- 회수된 sFE 용액(단계 2.3.4)으로 나머지 응고(단계 2.3.2)를 37°C에서 0.5시간 동안 분해합니다.
- 셀 수집을 수행합니다.
- 각 분해 라운드의 세포 혼합물을 수집하여 혈액 세포 샘플을 준비합니다.
3. 라이트의 염색
- 세포 도미를 수행합니다.
- 세포를 1 x 106 cells/mL의 밀도로 조정합니다.
- 폴리-L 라이신 코팅 유리 슬라이드에 세포 5μL를 추가한 다음 커버 슬립을 사용하여 도포합니다.
- 실온에서 액체를 증발시킵니다.
- 염색을 수행합니다.
- Wright의 염료 200μL( 재료 표 참조)를 세포 도말에 부드럽게 첨가하고 Wright의 염료 B 600μL를 첨가하여 고르게 혼합합니다. 실온에서 10분 동안 염색합니다.
- 깨끗한 물로 염료를 부드럽게 헹굽니다.
알림: 염색된 세포 도말은 나중에 사용할 수 있도록 실온에 보관할 수 있습니다.
- 현미경 이미징을 수행합니다.
- 광학 현미경을 사용하여 염색된 세포를 검사합니다( 재료 표 참조).
4. 정기 혈액 검사
- 세포를 1 x 106 cells/mL의 밀도로 조정합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 자가혈액학 분석기를 사용하여 혈소판, 적혈구, 백혈구, 림프구, 호중구, 단핵구, 호산구, 호염기구 및 미성숙 과립구와 같은 세포 구성 요소를 분석합니다( 재료 표 참조).
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Representative Results
분해 과정의 초기 단계에서 혈전은 적색 조밀 구조를 가지고 있으며 작업 용액은 무색이라는 것이 밝혀졌습니다. 30분 동안 배양한 후, 작업 용액은 밝은 빨간색으로 변했으며, 이는 교차된 혈액 세포가 작업 용액으로 방출되었음을 나타냅니다. 배양 시간을 5시간으로 늘리면 대부분의 혈전이 용해되었고, 작업 용액은 연한 붉은색이 되었습니다. 반대로, 10시간 배양 후에도 생리식염수군(NC)에는 큰 변화가 없었습니다(그림 1). 이러한 결과는 혈전으로 둘러싸인 혈액 세포가 이 프로토콜에 의해 성공적으로 방출되었음을 보여주었습니다.
Wright의 염색 후 세포 성분을 광학 현미경으로 명확하게 검사했습니다(그림 2A). 방출된 혈액 세포 중에는 표면이 약간 오목하고 원반 모양인 성숙한 적혈구가 많이 관찰될 수 있었습니다. 유리 슬라이드에서 불규칙한 모양의 작은 자주색-적색 입자가 다량 관찰되었는데, 이는 혈전에서 분비되는 혈소판이었습니다. 백혈구는 더 큰 혈장과 응축된 핵을 나타냈다. 성숙한 호중구 과립구, 호산구 및 단핵구와 같은 여러 유형의 과립구도 관찰되었습니다.
자동 혈액학 분석기의 도움으로 세포 성분을 정량적으로 분석했습니다. 검출된 세포 중 혈소판과 적혈구는 각각 51.25%와 45.24%를 차지했다. 이 데이터는 Wright의 염색 결과와 일치합니다. 백혈구, 림프구, 호중구, 단핵구, 호산구, 호염기구 및 미성숙 과립구와 같은 다른 혈액 세포도 검출되었습니다(표 1). 따라서 이 프로토콜에 따라 뇌 혈전의 세포 구성 요소를 정성적으로뿐만 아니라 정량적으로도 연구할 수 있습니다.
그림 1: 용해 과정. 뇌혈전은 각각 식염수(NC)와 sFE에 용해되었습니다. 사진은 0시간, 5시간, 10시간에 촬영되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 방출된 세포의 현미경 검사 및 유세포 분석 . (A) Wright의 염색 후 현미경 아래의 세포. 척도 막대 = 20 μm. (B) 방출된 세포의 유세포 분석 결과. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 정기 혈액 검사 | ||
| 매개 변수 | 결과 | 단위 |
| 미성숙 과립구 절대수(IG#) | 1 | 109/엘 |
| 미성숙 과립구 비율(IG%) | 3.7 | % |
| 적혈구 수(RBC) | 1.52 | 1012/엘 |
| 적혈구 특이량(HCT) | 13.7 | % |
| 평균 체적(MCV) | 90.1 | F1 키 |
| 백혈구 번호(WBC) | 26.98 | 109/엘 |
| 림프구 수(LYM) | 1.41 | 109/엘 |
| 림프구 비율(LYM%) | 5.2 | % |
| 호중구 수(Neu#) | 24.08 | 109/엘 |
| 호중구 비율(Neu%) | 89.2 | % |
| 단핵구 수(Mon#) | 1.02 | 109/엘 |
| 단핵구 비율(Mon%) | 3.8 | % |
| 호산구 수(Eos#) | 0.34 | 109/엘 |
| 호산구 비율(Eos%) | 1.3 | % |
| 호염기구 수(Bas#) | 0.13 | 109/엘 |
| 호염기구 비율(Bas%) | 0.5 | % |
| 혈소판 수(PLT) | 1722 | 109/엘 |
| 평균 혈소판 용적(MPV) | 11.6 | F1 키 |
표 1: 정기 혈액 검사.
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Discussion
sFE는 피브린을 직접적이고 효과적으로 분해할 수 있는 섬유소 용해제입니다12,16. 여기서 sFE를 사용하여 대뇌 혈전의 가교 피브린을 분해하고, 혈전 내에 밀폐된 세포를 방출하고, 혈전의 세포 성분을 정성적, 정량적으로 분석했습니다. 현미경 검사 데이터와 정기 혈액 검사는 밀폐된 세포가 혈전에서 방출되었음을 나타냈습니다. 또한, 방출된 세포의 세포 유형 및 구조는 sFE 처리 후 크게 영향을 받지 않았습니다. 따라서 대뇌 혈전의 세포 성분을 분석하기 위한 독특하고 간단하며 효과적인 방법이 처음으로 만들어졌습니다.
방출된 세포는 혈전 내만큼 안정적이지 않기 때문에 온도, sFE 선량, 회전 속도 및 분해 시간과 같은 방출된 세포의 파괴 비율을 줄이기 위해 분해 조건을 최적화해야 합니다. Wright의 염색 결과는 10시간 열화의 배경이 5시간의 배경보다 더 흐릿하다는 것을 보여주었습니다. 이러한 차이는 아마도 세포 파편과 다른 세포 조각 때문일 것입니다. 또한, 유세포 분석 데이터는 세포 파편이 분해 시간에 따라 증가한다는 것을 나타냈습니다(그림 2B). 10시간 분해의 세포 파편 비율(32.5%)은 5시간 분해(11.2%)보다 훨씬 높았습니다. 따라서 가능한 한 빨리 작업 용액에서 방출된 세포를 분리하는 것이 중요했습니다. 따라서 이 연구에서는 0.5시간마다 세포를 수집했습니다. 또 다른 핵심 포인트는 회전이었는데, 이는 분해를 가속화할 수 있지만 방출된 세포의 온전한 세포 구조를 유지하는 데 좋지 않습니다.
분해 조건이 최적화되었지만, 일부 세포는 이 과정에서 용해될 수 있습니다. 세포 파편은 세포 현미경 검사와 정기 혈액 검사에 불리할 수 있다17. 따라서 온전한 세포에서 이러한 세포 파편을 분리하는 것이 좋습니다. 이 기술의 또 다른 한계는 미생물 오염 가능성입니다. 이 현상의 근본적인 이유는 아마도 비멸균 수술과 함께 긴 분해 시간 때문일 것입니다. 따라서 향후 연구에서 적절한 항생제를 추가해야 한다18. 서로 다른 혈전이 유사한 혈전 구조를 공유한다는 것은 잘 알려져 있습니다. 따라서, 여기에 보고된 프로토콜은 다른 혈전의 세포 성분 분석에 적합할 것이다. 또한, 이 기술의 도움으로 세포 구성 요소뿐만 아니라 혈전이 있는 혈장도 정성적 및 정량적으로 분석할 수 있었습니다.
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Disclosures
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 샤먼시 과학기술국(3502Z20227197)과 푸젠성 과학기술국(No. 2019J01070, No.2021Y0027)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agglutination Reaction Plate | ROTEST | RTB-4003 | |
| Auto Hematology Analyzer | SYSMEX | XNB2 | |
| Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer | SANYO | MLS-3750 | |
| Centrifuge Tube (1.5 mL) | Biosharp | BS-15-M | |
| Clean bench | AIRTECH | BLB-1600 | |
| Constant Temperature Incubator | JINGHONG | JHS-400 | |
| Culture Dish (100 mm) | NEST | 704001 | |
| DHG Series Heating and Drying Oven | SENXIN | DGG-9140AD | |
| Electronic Analytical Balance | DENVER | TP-213 | |
| Filter Membrane (0.22 µm) | Millex GP | SLGP033NK | |
| Micro Refrigerated Centrifuge | Cence | H1650-W | |
| Microscope Slides | CITOGLAS | 01-30253-50 | |
| Milli-Q Reference | Millipore | Z00QSV0CN | |
| Normal Saline | CISEN | H37022337 | |
| Optical Microscope | Nikon | ECLIPSE E100 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Beyotime | C0221A | |
| Pipette Tip (1 mL ) | Axygene | T-1000XT-C | |
| Pipette Tip (200 µL) | Axygene | T-200XT-C | |
| Pipettor (1 mL) | Thermo Fisher Scientific | ZY18723 | |
| Pipettor (200 µL) | Thermo Fisher Scientific | ZY20280 | |
| Scalpel | MARTOR | 23111 | |
| Small-sized Vortex Oscillator | Kylin-Bell | VORTEX KB3 | |
| Tweezer | Hystic | HKQS-180 | |
| Wright Staining Solution | Beyotime | C0135-500ml |
References
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