Summary
As microglias são consideradas algumas das células mais versáteis do organismo, capazes de adaptação morfológica e funcional. Sua heterogeneidade e multifuncionalidade possibilitam a manutenção da homeostase cerebral, além de estarem ligadas a diversas patologias neurológicas. Aqui, uma técnica para purificar a microglia da medula espinhal é descrita.
Abstract
A coluna vertebral define um vertebrado e molda o canal vertebral, uma cavidade que encerra e protege a medula espinhal. O desenvolvimento e a função adequados do sistema nervoso central de mamíferos dependem significativamente da atividade de macrófagos residentes conhecidos como microglia. A microglia apresenta heterogeneidade e multifuncionalidade, permitindo expressão gênica e comportamento distintos dentro da medula espinhal e do cérebro. Numerosos estudos têm explorado a função da microglia cerebral, detalhando extensivamente os métodos de purificação. No entanto, a purificação da micróglia da medula espinhal em camundongos carece de uma descrição abrangente. Em contraste, a utilização de uma colagenase altamente purificada, em oposição a um extrato não refinado, carece de relatos nos tecidos do sistema nervoso central. Neste estudo, a coluna vertebral e a medula espinhal foram excisadas de camundongos C57BL/6 com 8-10 semanas de idade. A digestão subsequente empregou uma colagenase altamente purificada, e a purificação da micróglia utilizou um gradiente de densidade. As células foram submetidas à coloração por citometria de fluxo, avaliando-se viabilidade e pureza através das colorações CD11b e CD45. Os resultados mostraram viabilidade média de 80% e pureza média de 95%. Em conclusão, a manipulação da micróglia de camundongos envolveu digestão com colagenase altamente purificada, seguida de gradiente de densidade. Essa abordagem efetivamente produziu populações substanciais de microglia medular.
Introduction
A característica definidora dos vertebrados é a coluna vertebral ou coluna vertebral, na qual a notocorda foi substituída por uma sequência de ossos segmentados chamados vértebras, divididos por discos intervertebrais. Essa sucessão de material ósseo forma o canal vertebral, uma cavidade que envolve e protege a medula espinhal1. No gênero Rodentia, a coluna vertebral é geralmente formada por sete vértebras cervicais, treze vértebras torácicas, seis vértebras lombares e um número variável de vértebrascaudais2,3. O comprimento da medula espinhal é semelhante ao da coluna vertebral, e o filo terminal é uma estrutura não nervosa que ancora a medula espinhal ao sacro. Além disso, as fibras nervosas saem pelo forame intervertebral1.
O desenvolvimento e o funcionamento adequado do sistema nervoso central em mamíferos dependem criticamente da atividade dos macrófagos residentes no sistema nervoso, chamados de micróglia4. Embora as microglias tenham sido inicialmente descritas como fagócitos residentes no cérebro, pesquisas recentes têm atribuído muitas funções dinâmicas a essascélulas5,6. O tamanho da microglia varia de 7 a 10 μm na homeostase; São consideradas células mais versáteis do organismo e podem adaptar-se morfológica e funcionalmente ao seu ambiente em constantemudança7. Essas células exibem alta heterogeneidade tanto na fase embrionária quanto naadulta8,9, enquanto na fase adulta também apresentam complexa heterogeneidade funcional baseada em seu contexto espaço-temporal10. A heterogeneidade e as múltiplas funções da microglia permitem a expressão gênica e o comportamento diferenciais na medula espinhal e no cérebro. Foi demonstrado que a expressão de CD11b, CD45, CD86 e CCR9 é maior na medula espinhal em comparação com o cérebro 8,9.
Existem múltiplos protocolos para o isolamento da microglia cerebral11,12; entretanto, existem poucos para a microglia medular13,14. A otimização de um método para purificar a microglia da medula espinhal facilita o desenvolvimento de múltiplos estudos focados na descoberta da fisiologia da microglia. Este protocolo tem como objetivo descrever uma extração simples e altamente reprodutível da medula espinhal de camundongos e a purificação da micróglia (Figura 1).
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Protocol
O estudo foi conduzido de acordo com a norma oficial mexicana NOM-062-ZOO-1999 e o guia para o cuidado e uso de animais de laboratório. O estudo foi aprovado pelos Comitês de Pesquisa, Ética e Biossegurança do Hospital Infantil do México (HIM/2023/006) e do Comitê de Pesquisa e Bioética do Hospital Geral do México Eduardo Liceaga (DI/21/501/04/62). Três camundongos C57BL/6 com idades entre 6 e 8 semanas foram obtidos do Hospital Infantil do México, onde foram criados em condições isoladas em racks ventilados, de acordo com as diretrizes institucionais de cuidados e uso de animais.
1. Preparação de materiais e reagentes
- Pré-aquecer Ca 2+ e Mg2+ PBS livre, bem como solução salina balanceada de Hank (HBSS) a 37 °C.
- Completar a solução de HBSS com 100 μg/mL de Liberase e 4 μg/mL de DNase (HBSS-LD). Certifique-se de que a solução mantém um pH fisiológico de 7,4.
NOTA: Será necessário 1 ml de solução de trabalho por medula espinhal. - Preparar uma solução isotónica a 90% para centrifugação por gradiente de densidade (comercialmente disponível, ver Tabela de Materiais) e pré-aquecer a 37 °C.
- Prepare o tampão de coloração combinando soro fetal bovino (FBS) inativado pelo calor a 5% com PBS e armazene a mistura no gelo.
- Pré-aquecer Dulbecco's Modified Eagle's Medium-high glucose (1g/L) (DMEM) a 37 °C.
- Complementar o meio DMEM com FBS a 10%, L-glutamina 2 mM, penicilina 200 U/mL, estreptomicina 200 μg/mL e 500 pg/mL de anfotericina B (ver Tabela de Materiais) para preparar DMEM-S.
2. Dissecção e preparo da medula espinhal
- Eutanásia do rato com uma sobredosagem intraperitoneal de pentobarbital na dose de 150 mg/kg. Esterilizar o tórax e as costas do rato com etanol a 70%.
NOTA: Confirme se a eutanásia foi bem-sucedida antes de prosseguir com a dissecção do rato. - Raspar a região toracolombar e fixar as extremidades na placa de dissecção com fita adesiva.
- Com o bisturi, realizar incisão cuidadosa ao longo da linha média dorsal, desde a região occipital até a região sacral (Figura 2).
- Com o auxílio de um microscópio cirúrgico estereoscópico, dissecar por planos até atingir a coluna lombar e identificar o último arco costal.
OBS: Os 13 arcos costais são articulados nas vértebras torácicas; quando dissecadas, tornam-se visíveis superiores à vértebra L12. - Determinar a última vértebra cervical e o sacro, em seguida, fazer um corte para separar a coluna vertebral (Figura 2).
- Utilizando pinça dissecante, realizar laminectomia dorsal das vértebras para extração medular (Figura 3A-D).
NOTA: Com exceção das duas primeiras vértebras cervicais (atlas e eixo), todas as vértebras móveis compartilham um desenho morfológico comum em várias regiões (cervical, torácica ou lombar). Cada vértebra móvel típica apresenta um corpo vertebral cilíndrico em sua extremidade anterior. Ligado à parte de trás do corpo está um arco ósseo conhecido como arco vertebral (arco neural), consistindo de lâminas e processos espinhosos. Entre essas estruturas encontra-se o forame vertebral15. - Remover os nervos que emergem através dos forames (raízes dorsais e ventrais) que constituem o sistema nervoso periférico e podem conter macrófagos infiltrados (Figura 3D).
NOTA: É desnecessário remover a pia-máter ou meninges, pois o meio de gradiente de densidade efetivamente elimina os astrócitos contaminantes. Além disso, reter as meninges reduz o tempo de purificação e aumenta a viabilidade.
3. Digestão tecidual e isolamento da microglia
- Coloque a medula espinhal na placa dissecante e, usando uma tesoura de Vannas, corte a medula espinhal em pedaços de 2 mm, obtendo-se uma média de 10 pedaços.
- Transfira os cortes da medula espinhal para um microtubo de fundo plano de 2 mL (Figura 3E,F).
- Adicionar 1 ml da solução de trabalho HBSS-LD (passo 1.2). Incubar a 37 °C durante 25 minutos, agitando vigorosamente a cada 5 minutos.
- Passe o conteúdo de cada digestão através de um filtro de 40 μm e, em seguida, adicione 7 mL de HBSS com 2% de FBS para neutralizar a digestão.
- Esmagar o tecido restante com um êmbolo de seringa de 1 mL. Centrifugar a suspensão num tubo cónico de 50 ml durante 5 minutos a 220 x g, 4 °C.
- Eliminar o sobrenadante com uma micropipeta de 1 mL e ressuspender o pellet em 2 mL de HBSS com SFB a 2% em um tubo cônico de 15 mL. Combinar com 2 mL de meio com gradiente de densidade isotônico a 90%. Centrifugar durante 25 min a 160 x g, 18 °C.
NOTA: Utilize aceleração lenta e evite usar o freio. - Use uma pipeta de transferência para recuperar a interface e transferi-la para um tubo cônico de 15 mL. Lavar as células com 10 mL de PBS e centrifugar por 5 min a 220 x g, 4 °C.
- Ressuspenda as células no DMEM-S (etapa 1.6) e mantenha-as armazenadas no gelo.
4. Determinação da pureza/viabilidade
- Para quantificar células viáveis usando uma câmara de hemocitômetro, empregar uma coloração de azul de Tripano a 0,4% (ver Tabela de Materiais).
NOTA: Em média, um único rato fornece 4-6 milhões de células. - Para quantificar células viáveis por meio de um citômetro de fluxo, use a coloração fluorescente reativa à amina disponível comercialmente (ver Tabela de Materiais).
- Transfira 1 milhão de células para um tubo de fundo redondo de poliestireno (FACS) de 5 mL. Diluir o corante fluorescente com PBS na proporção de 1:1000 (criando a solução de trabalho viável).
- Incubar as amostras com a solução de viabilidade no escuro a 4 °C durante 30 min. Lave as células com PBS gelado duas vezes. Ressuspender as células em 400 μL de tampão corante (passo 1.4).
- Bloquear as células com 2,4G2 anti-FcRIII/I (ver Tabela de Materiais) no tampão de coloração gelada durante 15 minutos a 4 °C.
- Formular o cocktail de coloração de anticorpos adicionando os anticorpos monoclonais marcados com fluorescência CD45-PerCP e CD11b-eFluor 450 ao tampão de coloração (a uma diluição de 1:300) (ver Tabela de Materiais).
Observação : enquanto ambas as técnicas estão disponíveis, escolha a que melhor se alinha com o protocolo subsequente. - Incubar as amostras com o cocktail de coloração de anticorpos no escuro a 4 °C durante 30 minutos. Lave as células com tampão de coloração gelado duas vezes. Ressuspender as células em 400 μL de tampão corante.
- Adquira 250.000 eventos em um citômetro de fluxo, conforme delineado pela estratégia de gating na etapa 6 (Figura 4).
5. Coloração por imunofluorescência
- Coloque uma tampa pré-tratada em um poço de uma placa de 6 poços.
NOTA: Para tratar as lamínulas, coloque-as numa placa de Petri com 500 μL de solução de L-polilisina (0,01 mg/ml, ver Tabela de Materiais) e incube durante 1 h. Depois, lave-os três vezes com água destilada e deixe-os secar. - Seme 200.000 células na lamínula tratada usando 500 μL de solução de DMEM-S. Incubar por 24 h.
- Remova as lamínulas e fixe as células com paraformaldeído (PFA) a 3,7% por 20 min à temperatura ambiente. Lave as tampas três vezes com PBS gelado.
- Permeabilizar as células com Triton X-100 a 0,2% em PBS por 15 min à temperatura ambiente. Em seguida, lave as tampas três vezes com PBS frio. Bloquear as células com BSA 0,2% em PBS por 1 h à temperatura ambiente.
- Diluir os anticorpos monoclonais marcados com fluorescência (numa diluição de 1:300, ver Tabela de Materiais) na solução de bloqueio e incubar durante 1 h à temperatura ambiente. Lave as tampas três vezes com PBS gelado.
- Aplique o meio de montagem contendo DAPI sobre a lâmina e, em seguida, sela-a com uma lamínula.
NOTA: As lâminas podem ser imediatamente analisadas usando um microscópio de fluorescência ou confocal, ou podem ser armazenadas por até 3 meses a -20°C.
6. Estratégia de gating para microglia medular
- Gere um dot plot e estabeleça uma porta para isolar células viáveis com base na coloração de viabilidade e um canal fluorescente vazio16. Excluir células não viáveis.
- Produza outra parcela utilizando parâmetros de dispersão frontal e lateral para eliminar detritos16.
- Desenvolver um dot plot adicional e analisar a expressão de CD11b e CD45 para diferenciar a micróglia.
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Representative Results
Utilizando tecido medular de camundongos, a digestão enzimática foi realizada utilizando uma mistura altamente enriquecida com colagenase e termolisina. O tecido digerido resultante foi submetido à passagem por um filtro de 40 μm para eliminar o material não digerido. As células coletadas foram enriquecidas através de um gradiente de densidade de Percoll, com 90% na porção inferior e 45% na porção superior. As células enriquecidas com microglia dentro da interface foram então coradas com anticorpos CD45 e CD11b e submetidas à análise por citometria de fluxo (Figura 1).
A dissecção da coluna vertebral, estendendo-se da região occipital até o sacro, envolve a exposição e dissecção da musculatura paravertebral. Para liberação da coluna vertebral, os arcos costais foram expostos, e sua mensuração foi realizada da vértebra T13 a T1. A coluna vertebral, articulando-se com o crânio e o sacro, tornou-se visível, e um corte foi realizado de cada lado para liberá-la completamente (Figura 2).
A extração da medula espinhal foi realizada através de uma incisão lateral nos corpos vertebrais, formando um canal. Durante a remoção da medula espinhal, os nervos periféricos foram seccionados para evitar a contaminação dos macrófagos periféricos. Em seguida, a medula obtida foi espalhada pela mesa de dissecção e seccionada em pedaços de 2 mm, que foram adicionados à solução de digestão (Figura 3). O uso de liberase para digestão da medula espinhal é relatado pela primeira vez, produzindo 4 a 6 milhões de células microgliais altamente viáveis por camundongo adulto. A viabilidade ótima alcançada através deste processo varia de 80% a 99%.
Para confirmar o processo de purificação, a coloração FACS da micróglia foi realizada usando anticorpos CD45 e CD11b. O processo de purificação demonstrou eficiência, produzindo até 99% de células microgliais (Figura 4). Além disso, a coloração de imunofluorescência foi realizada na micróglia obtida usando os mesmos anticorpos, observando-se células duplamente positivas com tamanho médio de 10 μm - consistente com o tamanho relatado de micróglia não ativada. Isso sugere que essas células são adequadas para estudos de ativação (Figura 4E). É plausível que outras células imunes possam estar presentes durante processos inflamatórios ou que a micróglia possa sofrer alterações morfológicas sob diferentes estímulos. Nesses casos, recomenda-se a incorporação de marcadores específicos para a identificação de cada população celular.
Figura 1: Visão geral esquemática do protocolo de purificação da microglia medular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Procedimento de dissecção medular. Após a eutanásia, a coluna vertebral do camundongo foi isolada e dissecada. (A) Dissecção de pele stepwise estendendo-se da região occipital à caudal, revelando a musculatura paravertebral. (B) Dissecção sequencial através das camadas dos músculos paravertebrais. (C) Remoção da coluna vertebral após corte das costelas. (D) Visualização de uma medula espinhal íntegra dentro do canal vertebral. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Processo de extração e digestão da medula espinhal. (A) Laminectomia espinhal sequencial envolvendo dois cortes de aproximadamente 2 mm. (B) Medula espinhal exposta. (C) Remoção da medula espinhal. (D) Secção de nervos periféricos. (E) A medula espinhal foi dividida em cortes de 2 mm e colocada no meio de digestão. (F) Incubação padrão de 37 °C para digestão dos tecidos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Avaliação da pureza e viabilidade celular. Imunomarcação de células purificadas utilizando marcadores específicos da microglia. (A) Identificação de células vivas (células fluorescentes negativas para corantes). (B) Seleção baseada no tamanho da célula. (C) células CD45low e CD11b+, demonstrando pureza superior a 99%. (D) Viabilidade média (87,46 ± DP 1,468) e pureza média (88,51 ± DP 3,948; n = 5). (E) Imunofluorescência mostrando coloração CD45+ e CD11b+ em células purificadas. As imagens foram capturadas em microscópio confocal com laser de luz branca em aumento de 60x (barra de escala = 5 μm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Inúmeros protocolos têm sido desenvolvidos para o estudo da micróglia devido à sua importância na homeostase cerebral. Nesses métodos, as microglias são tipicamente originadas dos hemisférios cerebrais de ratos embrionários ou neonatais e camundongos17. Um número limitado de estudos abordou a purificação da micróglia da medula espinhal de camundongos adultos13,14. Essas técnicas envolvem digestão enzimática usando colagenase e/ou papaína juntamente com DNAse, muitas vezes combinada com separação de gradiente usando Percoll ou OptiPrep. Entretanto, o emprego da digestão medular à base de papaína sem separação do gradiente pode levar à contaminação dos astrócitos, mesmo após a remoção da pia-máter14,17.
Este estudo apresenta um protocolo para purificação da microglia da medula espinhal de camundongos adultos. O protocolo utiliza uma mistura precisa de colagenase I e II juntamente com termolisina, uma combinação conhecida por digerir eficientemente diversos tecidos com degradação controlada18, reduzindo assim a apoptose devido ao seu baixo conteúdo de proteases neutras. As meninges ou pia-máter, muitas vezes fontes de contaminação dos astrócitos, podem ser eliminadas com o uso do gradiente de Percoll nesse procedimento, negando a necessidade de remoção dessas camadas (Figura 1).
A heterogeneidade microglial decorre de morfologias distintas na medula espinhal e nocérebro8. No entanto, esse protocolo também foi aplicado em hemisférios cerebrais com resultados semelhantes (dados não apresentados), destacando sua robustez para analisar tanto a medula espinhal quanto a microglia cerebral.
Altos níveis de pureza (variando de 80% a 99%) e viabilidade (85% a 98%) podem ser consistentemente alcançados com este protocolo. O processamento de células do sistema nervoso é intrincado, principalmente porque a viabilidade celular é substancialmente afetada pela duração do processamento; A hipóxia superior a 20 minutos pode ser letal. Para uma viabilidade ideal, recomenda-se limitar o tempo de processamento desde a extração da medula espinhal até a digestão a não mais do que 10 minutos. Esta descrição é adaptada a ratinhos saudáveis com idades compreendidas entre 8 e 10 semanas, necessitando de uma maior padronização para ratinhos mais jovens ou mais velhos. A viabilidade subótima implica em digestão excessiva do tecido, obrigando à repetição. Alternativamente, a classificação FACS pode salvar células de amostras superdigeridas.
A aplicação da liberase para digerir e purificar a microglia medular é nova. Seu uso limitado nos tecidos do sistema nervoso tem sido historicamente devido a desafios de viabilidade18,19. Este estudo, no entanto, demonstra maior viabilidade ao usar essa colagenase meticulosamente purificada. Alternativamente, outras colagenases com menor potência poderiam ser exploradas.
Várias considerações cruciais devem ser reconhecidas, como a presença de neuroinflamação, comprometimento da barreira hematoencefálica e idade do camundongo. Esses fatores alteram tanto a morfologia quanto a frequência microglial. Em casos de neuroinflamação ou ruptura da barreira hematoencefálica, as células imunes que expressam CD45 e CD11b podem se infiltrar, diminuindo a pureza microglial. Como as micróglias são extensivamente exploradas em várias condições neuroinflamatórias, este protocolo tem potencial para investigações patológicas e neurofisiológicas.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por bolsas do Conselho Nacional de Ciência e Tecnologia (CONACYT) (702361). Os autores agradecem o programa de Doutoramento em Ciências Químicas Biológicas da Escola Nacional de Ciências Biológicas do Instituto Politécnico Nacional.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL collection tubes | Corning, USA | 430790 | |
| 2 mL microtubes | Axygen, USA | MCT-200-G | |
| 2.4G2 anti-FcR | BioLegend, USA | 101302 | |
| 50 mL collection tubes | Corning, USA | 430829 | |
| 70% ethanol | |||
| Antibiotic-Antimycotic (penicillin, streptomycin, amphotericin b) | Gibco, USA | 15240062 | |
| Antibody CD11b eFluor 450 anti-mouse | eBioscience, USA | 48-0112 | |
| Antibody CD45 PerCP anti-mouse | BioLegend, USA | 103130 | |
| Balanced salt solution (PBS) calcium- magnesium-free | Corning, USA | 46-013-CM | |
| Blue Cell Strainer 40 μm | Corning, USA | 352340 | |
| Costar 6-well Clear Not Treated | Corning, USA | CLS3736 | |
| Coverslips | |||
| Digital Heating Shaking Drybath | Thermo Scientific Digital HS Drybath, USA | 88870001 | |
| Dissecting forceps for microsurgery | FT by DUMONT | ||
| DNase | Roche, USA | 4536282001 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium-high glucose (DMEM) | Merck, USA | D6429 | |
| Electric shaver | |||
| FACS tube | Thermo, USA | 352058 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAN Biotech, Alemania | P30-3306 | |
| Flow cytometer Cytoflex | Beckman Coulter | ||
| Hank’s balanced salt solution | Merck, USA | H2387 | |
| L-glutamine | Corning, USA | 15393631 | |
| Liberase TM | Roche, USA | 5401119001 | |
| Neubauer chamber Counting Chambers | China | 1103 | |
| Pentobarbital | |||
| Percoll | Merck, USA | 17089101 | density gradient centrifugation |
| Poly-L-lysine solution | Merck, USA | P8920 | |
| Scalpel No. 25 | HERGOM, Mexico | H23 | |
| Snaplock Microcentrifuge Tubes 2 mL | Axygen, USA | 10011-680 | |
| Stereoscopic microscope | Velab, Mexico | HG927831 | |
| Straight surgical scissors (10 cm) | HERGOM, Mexico | ||
| Straight Vannas scissors | HERGOM, Mexico | ||
| Triton X100 | Merck, USA | X100 | |
| Trypan blue Stain 0.4% | Merck, USA | 15250-061 | |
| Vortex mixer | DLAB, China | 8031102000 | |
| Zombie Aqua Fixable Viability Kit | BioLegend, USA | 423102 | amine-reactive fluorescent dye staining |
References
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