Summary
Mikroglia regnes som noen av de mest allsidige cellene i kroppen, i stand til morfologisk og funksjonell tilpasning. Deres heterogenitet og multifunksjonalitet muliggjør vedlikehold av hjernens homeostase, samtidig som de er knyttet til ulike nevrologiske patologier. Her beskrives en teknikk for rensing av ryggmargsmikroglia.
Abstract
Virvelsøylen definerer et virveldyr og former ryggraden, et hulrom som omslutter og beskytter ryggmargen. Riktig utvikling og funksjon av pattedyrs sentralnervesystem er avhengig av aktiviteten til bosatt makrofager kjent som mikroglia. Mikroglia viser heterogenitet og multifunksjonalitet, noe som muliggjør distinkt genuttrykk og oppførsel i ryggmargen og hjernen. Tallrike studier har utforsket cerebral mikroglia-funksjon, og beskriver rensingsmetoder omfattende. Rensingen av mikroglia fra ryggmargen hos mus mangler imidlertid en omfattende beskrivelse. I motsetning til dette mangler bruken av en høyt renset kollagenase, i motsetning til et uraffinert ekstrakt, rapportering i vev i sentralnervesystemet. I denne studien ble virvelsøylen og ryggmargen skåret ut fra 8-10 uker gamle C57BL/6-mus. Påfølgende fordøyelse benyttet en svært renset kollagenase, og mikrogliarensing benyttet en tetthetsgradient. Cellene gjennomgikk farging for flowcytometri, og vurderte levedyktighet og renhet gjennom CD11b- og CD45-farging. Resultatene ga en gjennomsnittlig levedyktighet på 80% og en gjennomsnittlig renhet på 95%. Avslutningsvis involverte manipulering av musemikroglia fordøyelsen med en høyt renset kollagenase, etterfulgt av en tetthetsgradient. Denne tilnærmingen produserte effektivt betydelige ryggmargsmikrogliapopulasjoner.
Introduction
Den definerende egenskapen til vertebrater er vertebral kolonnen eller ryggraden, hvor notokordet er erstattet av en sekvens av segmenterte bein kalt ryggvirvler, delt med intervertebrale skiver. Denne rekkefølgen av osseous materiale former spinalkanalen, et hulrom som omslutter og beskytter ryggmargen1. I slekten Rodentia er ryggraden vanligvis dannet av syv nakkevirvler, tretten thoraxvirvler, seks lumbale ryggvirvler og et variabelt antall kaudale ryggvirvler 2,3. Lengden på ryggmargen er lik ryggraden, og det terminale filum er en ikke-nervøs struktur som forankrer ryggmargen til sakrummet. I tillegg går nervefibrene ut gjennom det intervertebrale foramen1.
Utviklingen og riktig funksjon av sentralnervesystemet hos pattedyr er kritisk avhengig av aktiviteten til nervesystemets fastboende makrofager, kalt mikroglia4. Selv om mikroglia opprinnelig ble beskrevet som hjernebosatte fagocytter, har nyere forskning tilskrevet mange dynamiske funksjoner til disse cellene 5,6. Microglias størrelse varierer fra 7 til 10 μm i homeostase; De regnes blant de mest allsidige cellene i kroppen og kan tilpasse seg morfologisk og funksjonelt til deres stadig skiftende miljø7. Disse cellene viser høy heterogenitet under både embryonale og voksne stadier8,9, mens de i voksenstadiet også viser kompleks funksjonell heterogenitet basert på deres spatiotemporale kontekst10. Heterogeniteten og flere funksjoner av mikroglia tillater differensielt genuttrykk og oppførsel i ryggmargen og hjernen. Det har vist seg at CD11b, CD45, CD86 og CCR9-uttrykk er høyere i ryggmargen sammenlignet med hjernen 8,9.
Det finnes flere protokoller for isolering av cerebral mikroglia11,12; Imidlertid finnes det bare noen få for ryggmargsmikroglia13,14. Optimalisering av en metode for rensing av mikroglia fra ryggmargen letter utviklingen av flere studier fokusert på å oppdage mikrogliafysiologi. Denne protokollen tar sikte på å beskrive en enkel og svært reproduserbar ekstraksjon av musens ryggmarg og rensing av mikroglia (figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studien ble utført i samsvar med den offisielle meksikanske standarden NOM-062-ZOO-1999 og veiledningen for omsorg og bruk av laboratoriedyr. Godkjenning for studien ble innhentet fra forsknings-, etikk- og biosikkerhetskomiteene ved Mexico Children's Hospital (HIM/2023/006) og forsknings- og bioetikkkomiteen ved General Hospital of Mexico Eduardo Liceaga (DI/21/501/04/62). Tre C57BL/6-mus i alderen 6 til 8 uker ble hentet fra Mexico Children's Hospital, hvor de ble oppdratt under isolerte forhold i ventilerte stativer, i samsvar med retningslinjer for dyrepleie og bruk av institusjoner.
1. Fremstilling av materialer og reagenser
- Forvarm Ca 2+ og Mg2+ fri PBS samt Hanks balanserte saltløsning (HBSS) til 37 °C.
- Suppler HBSS-løsningen med 100 μg/ml liberase og 4 μg/ml DNase (HBSS-LD). Sørg for at oppløsningen opprettholder en fysiologisk pH på 7,4.
MERK: 1 ml arbeidsløsning per ryggmarg vil være nødvendig. - Klargjør en isoton 90 % løsning for sentrifugering av tetthetsgradient (kommersielt tilgjengelig, se materialliste) og forvarm den til 37 °C.
- Forbered fargebufferen ved å kombinere 5% varmeinaktivert fosterbovint serum (FBS) med PBS, og oppbevar blandingen på is.
- Forvarm Dulbecco's Modified Eagle's Middels høy glukose (1g / L) (DMEM) til 37 ° C.
- Suppler DMEM-mediet med 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 200 U / ml penicillin, 200 μg / ml streptomycin og 500 pg / ml amfotericin B (se materialtabell) for å forberede DMEM-S.
2. Disseksjon og forberedelse av ryggmargen
- Avlive musen med en intraperitoneal overdose av pentobarbital i en dose på 150 mg/kg. Steriliser musens thorax og tilbake med 70% etanol.
MERK: Bekreft at eutanasi var vellykket før du fortsetter med musedisseksjonen. - Barber thoracolumbar-regionen og fest ekstremitetene til disseksjonstavlen ved hjelp av tape.
- Bruk en skalpell til å lage et forsiktig snitt langs dorsalens midtlinje fra oksipitalt til sakralområdet (figur 2).
- Ved hjelp av et stereoskopisk kirurgisk mikroskop, dissekere i lag til du når lumbale ryggraden og identifiserer den siste kulebuen.
MERK: De 13 kystbuene er artikulert i brystvirvlene; når de dissekeres, blir de synlige bedre enn L1-vertebraen2. - Bestem den siste nakkevirvelen og korsbenet, og lag deretter et kutt for å skille ryggraden (figur 2).
- Bruk dissekerende tang, utfør en dorsal laminektomi av ryggvirvlene for å trekke ut ryggmargen (figur 3A-D).
MERK: Bortsett fra de to første nakkevirvlene (atlas og akse), deler alle bevegelige ryggvirvler en felles morfologisk design i forskjellige regioner (livmorhalskreft, thorax eller lumbal). Hver typisk bevegelig ryggvirvel har en sylindrisk vertebral kropp i den fremre enden. Festet til baksiden av kroppen er en benbue kjent som vertebral bue (nevralbue), bestående av laminae og spinøse prosesser. Mellom disse strukturene ligger vertebral foramen15. - Fjern nervene som kommer ut gjennom foramina (dorsale og ventrale røtter) som utgjør det perifere nervesystemet og kan inneholde infiltrerte makrofager (figur 3D).
MERK: Det er unødvendig å fjerne pia mater eller meninges da tetthetsgradientmediet effektivt eliminerer forurensende astrocytter. I tillegg reduserer beholdning av hjernehinnene rensetiden og forbedrer levedyktigheten.
3. Vevsfordøyelse og isolering av mikroglia
- Plasser ryggmargen på disseksjonsbrettet, og bruk Vannas saks, klipp ryggmargen i 2 mm stykker, noe som gir et gjennomsnitt på 10 stykker.
- Overfør delene av ryggmargen til et 2 ml flatbunns mikrorør (figur 3E,F).
- Legg til 1 ml av HBSS-LD-arbeidsløsningen (trinn 1.2). Inkuber ved 37 °C i 25 minutter, virvler kraftig hvert 5. minutt.
- Pass innholdet i hver fordøyelse gjennom en 40 μm sil, og tilsett deretter 7 ml HBSS med 2% FBS for å nøytralisere fordøyelsen.
- Knus det gjenværende vevet med et sprøytestempel på 1 ml. Sentrifuger suspensjonen i et 50 ml konisk rør i 5 minutter ved 220 x g, 4 °C.
- Kast supernatanten med en 1 ml mikropipette, og resuspender pelleten i 2 ml HBSS med 2 % FBS i et 15 ml konisk rør. Kombiner med 2 ml 90% isotont tetthetsgradientmedium. Sentrifuge i 25 min ved 160 x g, 18 °C.
MERK: Bruk langsom akselerasjon og unngå å bruke bremsen. - Bruk en overføringspipette til å hente grensesnittet og overføre det til et 15 ml konisk rør. Vask cellene med 10 ml PBS og sentrifuge i 5 minutter ved 220 x g, 4 °C.
- Resuspender cellene i DMEM-S (trinn 1.6) og hold dem lagret på is.
4. Bestemme renhet/levedyktighet
- For å kvantifisere levedyktige celler ved hjelp av et hemocytometerkammer, bruk en 0,4% Trypan blå flekk (se materialtabell).
MERK: I gjennomsnitt gir en enkelt mus 4-6 millioner celler. - For å kvantifisere levedyktige celler via et flowcytometer, bruk kommersielt tilgjengelig aminreaktiv fluorescerende fargestofffarging (se materialtabell).
- Overfør 1 million celler til et 5 ml polystyren rundbunns (FACS) rør. Fortynn fluorescerende fargestoff med PBS i forholdet 1:1000 (skape levedyktighetsarbeidsløsningen).
- Inkuber prøvene med levedyktighetsoppløsningen i mørket ved 4 °C i 30 minutter. Vask cellene med iskald PBS to ganger. Resuspender cellene i 400 μL fargebuffer (trinn 1,4).
- Blokker cellene med 2.4G2 anti-FcRIII/I (se materialfortegnelse) i den iskalde fargebufferen i 15 minutter ved 4 °C.
- Formuler antistofffargingscocktailen ved å tilsette de fluorescerende merkede monoklonale antistoffene CD45-PerCP og CD11b-eFluor 450 til fargebufferen (ved en fortynning på 1:300) (se materialtabell).
MERK: Mens begge teknikkene er tilgjengelige, velg den som passer best med den påfølgende protokollen. - Inkuber prøvene med antistofffargingscocktailen i mørket ved 4 °C i 30 minutter. Vask cellene med iskald fargebuffer to ganger. Resuspender cellene i 400 μL fargebuffer.
- Hent 250 000 hendelser på et flowcytometer, som beskrevet av gating-strategien i trinn 6 (figur 4).
5. Immunfluorescerende farging
- Plasser et forbehandlet deksel i en brønn på en 6-brønnsplate.
MERK: For å behandle dekklapper, legg dem i en petriskål med 500 μL L-polylysin (0,01 mg / ml, se materialfortegnelse) løsning og inkuber i 1 time. Etterpå vasker du dem tre ganger med destillert vann og lar dem tørke. - Frø 200 000 celler på det behandlede dekselet ved hjelp av 500 μL DMEM-S-løsning. Inkubere i 24 timer.
- Fjern dekslene og fest cellene med 3,7% paraformaldehyd (PFA) i 20 minutter ved romtemperatur. Vask dekslene tre ganger med iskald PBS.
- Permeabiliser cellene med 0,2% Triton X-100 i PBS i 15 minutter ved romtemperatur. Deretter vasker du dekslene tre ganger med kald PBS. Blokker cellene med 0,2% BSA i PBS i 1 time ved romtemperatur.
- Fortynn de fluorescensmerkede monoklonale antistoffene (ved en fortynning på 1:300, se materialfortegnelse) i blokkeringsløsningen og inkuber i 1 time ved romtemperatur. Vask dekslene tre ganger med iskald PBS.
- Påfør monteringsmedium som inneholder DAPI på lysbildet, og forsegl det deretter med et deksel.
MERK: Lysbildene kan umiddelbart analyseres ved hjelp av et fluorescens eller konfokalmikroskop, eller de kan lagres i opptil 3 måneder ved -20 ° C.
6. Gating strategi for ryggmargen microglia
- Generer et punktplott og etabler en port for å isolere levedyktige celler basert på levedyktighetsfarging og en tom fluorescerende kanal16. Ekskluder ikke-levedyktige celler.
- Produser et annet plott ved å bruke spredningsparametere forover og på siden for å eliminere rusk16.
- Utvikle et ekstra punktplott og analysere uttrykket av CD11b og CD45 for å skille mikroglia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved bruk av musryggmargsvev ble enzymatisk fordøyelse utført ved bruk av en blanding som var sterkt beriket med kollagenase og termolysin. Det resulterende fordøyde vevet gjennomgikk passasje gjennom et 40 μm filter for å eliminere ufordøyd materiale. De oppsamlede cellene ble anriket gjennom en Percoll-tetthetsgradient, med 90% i den nedre delen og 45% i den øvre delen. De mikrogliaberikede cellene i grenseflaten ble deretter farget med CD45- og CD11b-antistoffer og utsatt for flowcytometrisk analyse (figur 1).
Disseksjonen av vertebral kolonnen som strekker seg fra oksipitalt område til sakrummet, involverer eksponering og disseksjon av paravertebral muskulatur. For å frigjøre vertebral kolonnen ble kystbuene eksponert, og deres måling ble utført fra vertebra T13 til T1. Virvelsøylen, artikulert med hodeskallen og korsbenet, ble synlig, og et kutt ble utført på hver side for å frigjøre den helt (figur 2).
Ekstraksjonen av ryggmargen ble oppnådd gjennom et lateralt snitt i vertebrale legemer, som danner en kanal. Under fjerning av ryggmargen ble perifere nerver kuttet for å hindre forurensning fra perifere makrofager. Deretter ble den oppnådde ryggmargen spredt over disseksjonsbordet og snittet i 2 mm stykker, som ble tilsatt fordøyelsesløsningen (figur 3). Bruk av liberase for ryggmargsfordøyelse er rapportert for første gang, noe som gir 4 til 6 millioner svært levedyktige mikrogliaceller per voksen mus. Den optimale levedyktigheten oppnådd gjennom denne prosessen varierer fra 80% til 99%.
For å bekrefte renseprosessen ble FACS-farging av mikroglia utført ved bruk av CD45- og CD11b-antistoffer. Renseprosessen demonstrerte effektivitet og ga opptil 99 % mikrogliaceller (figur 4). Videre ble immunfluorescensfarging utført på den oppnådde mikroglia ved bruk av de samme antistoffene, og observerte dobbeltpositive celler med en gjennomsnittlig størrelse på 10 μm - i samsvar med den rapporterte størrelsen på ikke-aktivert mikroglia. Dette antyder at disse cellene er egnet for aktiveringsstudier (figur 4E). Det er sannsynlig at andre immunceller kan være tilstede under inflammatoriske prosesser eller at mikroglia kan gjennomgå morfologiske endringer under forskjellige stimuli. I slike tilfeller anbefales det å inkorporere spesifikke markører for identifisering av hver cellepopulasjon.
Figur 1 Skjematisk oversikt over renseprotokollen for mikroglia i ryggmargen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Ryggmargsdisseksjonsprosedyre. Etter eutanasi ble musens ryggsøyle isolert og dissekert. (A) Trinnvis huddisseksjon som strekker seg fra oksipitale til kaudale regioner, og avslører paravertebral muskulatur. (B) Sekvensiell disseksjon gjennom lagene av paravertebrale muskler. (C) Fjerning av ryggraden etter ribbeskjæring. (D) Visualisering av en intakt ryggmarg i vertebralkanalen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Ryggmargsekstraksjon og fordøyelsesprosess . (A) Sekvensiell spinal laminektomi som involverer to ca. 2 mm kutt. (B) Eksponert ryggmarg. (C) Fjerning av ryggmargen. (D) Perifer nerveseksjonering. (E) Ryggmargen ble delt inn i 2 mm seksjoner og plassert i fordøyelsesmediet. (F) Standard 37 °C inkubasjon for vevsfordøyelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Vurdering av cellerenhet og levedyktighet. Immunfarging av rensede celler ved bruk av mikroglia-spesifikke markører. (A) Identifisering av levende celler (fluorescerende fargestoff-negative celler). (B) Cellestørrelsesbasert valg. (C) CD45low- og CD11b+-celler, som viser renhet over 99 %. (D) Gjennomsnittlig levedyktighet (87,46 ± SD 1,468) og gjennomsnittlig renhet (88,51 ± SD 3,948; n = 5). (E) Immunfluorescens som viser CD45+ og CD11b+-farging i rensede celler. Bildene ble tatt med et konfokalmikroskop med en hvit lyslaser ved 60x forstørrelse (skala bar = 5 μm). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tallrike protokoller er utviklet for studier av mikroglia på grunn av deres betydning i hjernens homeostase. I disse metodene kommer mikroglia vanligvis fra hjernehalvdelene hos embryonale eller neonatale rotter og mus17. Et begrenset antall studier har adressert rensing av mikroglia fra ryggmargen hos voksne mus13,14. Disse teknikkene involverer enzymatisk fordøyelse ved bruk av kollagenase og/eller papain sammen med DNAse, ofte kombinert med gradientseparasjon ved bruk av Percoll eller OptiPrep. Imidlertid kan bruk av papainbasert ryggmargsfordøyelse uten gradientseparasjon føre til astrocyttforurensning, selv etter fjerning av pia mater14,17.
Denne studien presenterer en protokoll for rensing av mikroglia fra ryggmargen til den voksne musen. Protokollen benytter en presis blanding av kollagenase I og II sammen med termolysin, en kombinasjon kjent for effektivt å fordøye forskjellige vev med kontrollert nedbrytning18, og reduserer dermed apoptose på grunn av det lave innholdet av nøytrale proteaser. Meninger eller pia mater, ofte kilder til astrocyttforurensning, kan elimineres ved bruk av en Percoll-gradient i denne prosedyren, noe som eliminerer nødvendigheten av å fjerne disse lagene (figur 1).
Mikroglial heterogenitet oppstår fra forskjellige morfologier i ryggmargen og hjernen8. Imidlertid ble denne protokollen også brukt på cerebrale hemisfærer med lignende utfall (data ikke presentert), og fremhevet dens robusthet for å analysere både ryggmargen og cerebral mikroglia.
Høye renhetsnivåer (varierer fra 80% til 99%) og levedyktighet (85% til 98%) kan oppnås konsekvent med denne protokollen. Behandling av celler fra nervesystemet er intrikat, først og fremst fordi cellens levedyktighet er vesentlig påvirket av behandlingsvarigheten; Hypoksi over 20 minutter kan være dødelig. For optimal levedyktighet anbefales det å begrense behandlingstiden fra ryggmargsekstraksjon til fordøyelsen til ikke mer enn 10 minutter. Denne beskrivelsen er skreddersydd for friske mus i alderen 8 til 10 uker, noe som nødvendiggjør ytterligere standardisering for yngre eller eldre mus. Suboptimal levedyktighet innebærer overfordøyelse av vev, som krever repetisjon. Alternativt kan FACS-sortering redde celler fra overfordøyde prøver.
Anvendelsen av liberase for å fordøye og rense ryggmargsmikroglia er ny. Den begrensede bruken i nervesystemet vev har historisk vært på grunn av levedyktighetsutfordringer18,19. Denne studien viser imidlertid økt levedyktighet ved bruk av denne omhyggelig rensede kollagenasen. Alternativt kan andre kollagenaser med lavere styrke utforskes.
Flere viktige hensyn må anerkjennes, for eksempel tilstedeværelse av nevroinflammasjon, blod-hjernebarrierekompromiss og musealder. Disse faktorene endrer både mikroglialmorfologi og frekvens. I tilfeller av nevroinflammasjon eller forstyrrelse av blod-hjernebarrieren, kan immunceller som uttrykker CD45 og CD11b infiltrere og redusere mikroglial renhet. Siden mikroglia er grundig utforsket ved ulike nevroinflammatoriske tilstander, har denne protokollen potensial for patologiske og nevrofysiologiske undersøkelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av stipend gitt av National Council of Science and Technology (CONACYT) (702361). Forfatterne anerkjenner Ph.D. program i biologiske kjemiske vitenskaper ved National School of Biological Sciences ved National Polytechnic Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL collection tubes | Corning, USA | 430790 | |
| 2 mL microtubes | Axygen, USA | MCT-200-G | |
| 2.4G2 anti-FcR | BioLegend, USA | 101302 | |
| 50 mL collection tubes | Corning, USA | 430829 | |
| 70% ethanol | |||
| Antibiotic-Antimycotic (penicillin, streptomycin, amphotericin b) | Gibco, USA | 15240062 | |
| Antibody CD11b eFluor 450 anti-mouse | eBioscience, USA | 48-0112 | |
| Antibody CD45 PerCP anti-mouse | BioLegend, USA | 103130 | |
| Balanced salt solution (PBS) calcium- magnesium-free | Corning, USA | 46-013-CM | |
| Blue Cell Strainer 40 μm | Corning, USA | 352340 | |
| Costar 6-well Clear Not Treated | Corning, USA | CLS3736 | |
| Coverslips | |||
| Digital Heating Shaking Drybath | Thermo Scientific Digital HS Drybath, USA | 88870001 | |
| Dissecting forceps for microsurgery | FT by DUMONT | ||
| DNase | Roche, USA | 4536282001 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium-high glucose (DMEM) | Merck, USA | D6429 | |
| Electric shaver | |||
| FACS tube | Thermo, USA | 352058 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAN Biotech, Alemania | P30-3306 | |
| Flow cytometer Cytoflex | Beckman Coulter | ||
| Hank’s balanced salt solution | Merck, USA | H2387 | |
| L-glutamine | Corning, USA | 15393631 | |
| Liberase TM | Roche, USA | 5401119001 | |
| Neubauer chamber Counting Chambers | China | 1103 | |
| Pentobarbital | |||
| Percoll | Merck, USA | 17089101 | density gradient centrifugation |
| Poly-L-lysine solution | Merck, USA | P8920 | |
| Scalpel No. 25 | HERGOM, Mexico | H23 | |
| Snaplock Microcentrifuge Tubes 2 mL | Axygen, USA | 10011-680 | |
| Stereoscopic microscope | Velab, Mexico | HG927831 | |
| Straight surgical scissors (10 cm) | HERGOM, Mexico | ||
| Straight Vannas scissors | HERGOM, Mexico | ||
| Triton X100 | Merck, USA | X100 | |
| Trypan blue Stain 0.4% | Merck, USA | 15250-061 | |
| Vortex mixer | DLAB, China | 8031102000 | |
| Zombie Aqua Fixable Viability Kit | BioLegend, USA | 423102 | amine-reactive fluorescent dye staining |
References
- Schröder,, Moser,, Huggenberger, Neuroanatomy of the Mouse. , Springer, Switzerland. 59-78 (2020).
- Sengul, G., et al. Cytoarchitecture of the spinal cord of the postnatal (P4) mouse. Anat Rec. 295, 837-845 (2012).
- Bab, I., et al. Microtomographic atlas of the mouse skeleton. VIII, First ed, Springer. 205 (2007).
- Nayak, D., et al.
- Martinez, F. O., et al.
- Masuda, T., et al.
- Prinz, M. Microglia biology: one century of evolving concepts. Cell. 179 (2), 292-311 (2019).
- de Haas, A. H., et al. Region-specific expression of immunoregulatory proteins on microglia in the healthy CNS. Glia. 56 (8), 888-894 (2008).
- Xuan, F. L., et al. Differences of microglia in the brain and the spinal cord. Front Cell Neurosci. 13, 504 (2019).
- Paolicelli, R. Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads. Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).
- Li, Q., et al. Spinal IL-36γ/IL-36R participates in the maintenance of chronic inflammatory pain through astroglial JNK pathway. Glia. 67 (3), 438-451 (2019).
- Prinz, M., et al. Microglia and central nervous system-associated macrophages-from origin to disease modulation. Annu Rev Immunol. 39, 251-277 (2021).
- Yip, P. K., et al. Rapid isolation and culture of primary microglia from adult mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 183 (2), 223-237 (2009).
- Akhmetzyanova, E. R., et al. Severity- and time-dependent activation of microglia in spinal cord injury. Int J Mo. Sci. 24 (9), 1-16 (2023).
- Mahadevan, V.
- Krukowski, K., et al. Temporary microglia-depletion after cosmic radiation modifies phagocytic activity and prevents cognitive deficits. Sci Rep. 8 (1), 1-13 (2018).
- Cardona, A., et al. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
- Schmidt, V. M., et al. Comparison of the enzymatic efficiency of Liberase TM and tumor dissociation enzyme: effect on the viability of cells digested from fresh and cryopreserved human ovarian cortex. Reprod Biol Endocrinol. 16 (57), 1-14 (2018).
- Kusminski, C. M., et al. MitoNEET-parkin effects in pancreatic α- and β-cells, cellular survival, and intrainsular cross talk. Diabetes. 65 (6), 1534-1555 (2016).
