Summary
Microglia betragtes som nogle af de mest alsidige celler i kroppen, der er i stand til morfologisk og funktionel tilpasning. Deres heterogenitet og multifunktionalitet muliggør vedligeholdelse af hjernehomeostase, samtidig med at de er forbundet med forskellige neurologiske patologier. Her beskrives en teknik til rensning af rygmarvsmikroglia.
Abstract
Rygsøjlen definerer et hvirveldyr og former rygmarvskanalen, et hulrum, der omslutter og beskytter rygmarven. Korrekt udvikling og funktion af pattedyrs centralnervesystem er signifikant afhængig af aktiviteten af residente makrofager kendt som microglia. Microglia viser heterogenitet og multifunktionalitet, hvilket muliggør tydelig genekspression og adfærd i rygmarven og hjernen. Talrige undersøgelser har undersøgt cerebral mikroglia funktion, beskriver rensningsmetoder i vid udstrækning. Imidlertid mangler oprensningen af microglia fra rygmarven hos mus en omfattende beskrivelse. I modsætning hertil mangler udnyttelsen af en højt oprenset collagenase, i modsætning til et uraffineret ekstrakt, rapportering inden for centralnervesystemets væv. I denne undersøgelse blev rygsøjlen og rygmarven udskåret fra 8-10 uger gamle C57BL/6-mus. Efterfølgende fordøjelse anvendte en højt oprenset collagenase, og mikroglia-oprensning udnyttede en densitetsgradient. Celler gennemgik farvning for flowcytometri og vurderede levedygtighed og renhed gennem CD11b- og CD45-farvning. Resultaterne gav en gennemsnitlig levedygtighed på 80% og en gennemsnitlig renhed på 95%. Afslutningsvis involverede manipulation af musemikroglia fordøjelse med en højt oprenset collagenase, efterfulgt af en densitetsgradient. Denne tilgang producerede effektivt betydelige rygmarvsmikrogliapopulationer.
Introduction
Det definerende kendetegn ved hvirveldyr er rygsøjlen eller rygsøjlen, hvor notokordet er blevet erstattet af en sekvens af segmenterede knogler kaldet hvirvler, divideret med intervertebrale diske. Denne række af osseøst materiale former rygmarvskanalen, et hulrum, der omslutter og beskytter rygmarven1. I slægten Rodentia dannes rygsøjlen normalt af syv halshvirvler, tretten brysthvirvler, seks lændehvirvler og et variabelt antal kaudale hvirvler 2,3. Rygmarvens længde svarer til rygsøjlens, og den terminale filum er en ikke-nervøs struktur, der forankrer rygmarven til korsbenet. Derudover går nervefibre ud gennem de intervertebrale foramen1.
Udviklingen og den korrekte funktion af centralnervesystemet hos pattedyr afhænger kritisk af aktiviteten af nervesystemets residente makrofager, kaldet microglia4. Selvom mikroglia oprindeligt blev beskrevet som hjerneboende fagocytter, har nyere forskning tilskrevet disse cellermange dynamiske funktioner 5,6. Microglias størrelse varierer fra 7 til 10 μm i homeostase; De betragtes som blandt de mest alsidige celler i kroppen og kan tilpasse sig morfologisk og funktionelt til deres konstant skiftende miljø7. Disse celler udviser høj heterogenitet i både embryonale og voksne stadier8,9, mens de i voksenstadiet også viser kompleks funktionel heterogenitet baseret på deres rumlige tidsmæssige kontekst10. Heterogeniteten og flere funktioner i microglia giver mulighed for differentiel genekspression og adfærd i rygmarven og hjernen. Det har vist sig, at CD11b, CD45, CD86 og CCR9 ekspression er højere i rygmarven sammenlignet med hjernen 8,9.
Der findes flere protokoller for cerebral mikrogliaisolering11,12; Der findes dog kun få for rygmarvsmikroglia13,14. Optimering af en metode til rensning af mikroglia fra rygmarven letter udviklingen af flere undersøgelser med fokus på at opdage mikrogliafysiologi. Denne protokol har til formål at beskrive en enkel og meget reproducerbar ekstraktion af musens rygmarv og rensning af mikroglia (figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Undersøgelsen blev udført i overensstemmelse med den officielle mexicanske standard NOM-062-ZOO-1999 og vejledningen til pleje og brug af forsøgsdyr. Godkendelse af undersøgelsen blev opnået fra forsknings-, etik- og biosikkerhedsudvalgene på Mexico Children's Hospital (HIM/2023/006) og forsknings- og bioetikudvalget på General Hospital of Mexico Eduardo Liceaga (DI/21/501/04/62). Tre C57BL/6-mus i alderen 6 til 8 uger blev hentet fra Mexico Children's Hospital, hvor de blev opdrættet under isolerede forhold i ventilerede stativer i overensstemmelse med institutionelle retningslinjer for dyrepleje og brug.
1. Fremstilling af materialer og reagenser
- Forvarm Ca 2+ og Mg2+ fri PBS samt Hanks afbalancerede saltopløsning (HBSS) til 37 °C.
- Suppler HBSS-opløsningen med 100 μg/ml Liberase og 4 μg/ml DNase (HBSS-LD). Sørg for, at opløsningen opretholder en fysiologisk pH-værdi på 7,4.
BEMÆRK: 1 ml arbejdsløsning pr. rygmarv vil være nødvendig. - Der fremstilles en isotonisk 90 % opløsning til densitetsgradientcentrifugering (fås i handelen, se materialetabellen), og den forvarmes til 37 °C.
- Forbered farvningsbufferen ved at kombinere 5% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS) med PBS, og opbevar blandingen på is.
- Forvarm Dulbeccos modificerede ørns mellemhøje glukose (1 g / L) (DMEM) til 37 ° C.
- Suppler DMEM-substratet med 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 200 E / ml penicillin, 200 μg / ml streptomycin og 500 pg / ml amphotericin B (se materialetabel) til fremstilling af DMEM-S.
2. Dissektion og forberedelse af rygmarven
- Aflive musen med en intraperitoneal overdosis pentobarbital i en dosis på 150 mg / kg. Steriliser musens thorax og ryg ved hjælp af 70% ethanol.
BEMÆRK: Bekræft, at eutanasi var vellykket, før du fortsætter med musedissektionen. - Barber thoracolumbalområdet og fastgør ekstremiteterne til dissektionspladen ved hjælp af tape.
- Brug en skalpel til at lave et omhyggeligt snit langs den dorsale midterlinje fra occipital til sakral region (figur 2).
- Ved hjælp af et stereoskopisk kirurgisk mikroskop dissekeres i lag, indtil det når lændehvirvelsøjlen og identificerer den sidste kystbue.
BEMÆRK: De 13 kystbuer er artikuleret i brysthvirvlerne; når de dissekeres, bliver de synlige bedre end L1-hvirvlen2. - Bestem den sidste livmoderhvirvel og korsbenet, og lav derefter et snit for at adskille rygsøjlen (figur 2).
- Brug dissekerende tang til at udføre en dorsal laminektomi af ryghvirvlerne for at ekstrahere rygmarven (figur 3A-D).
BEMÆRK: Bortset fra de to første halshvirvler (atlas og akse) deler alle bevægelige hvirvler et fælles morfologisk design i forskellige regioner (livmoderhals, thorax eller lændehvirvel). Hver typisk bevægelig hvirvel har en cylindrisk hvirvelkrop i den forreste ende. Fastgjort til bagsiden af kroppen er en knoglebue kendt som vertebralbuen (neural bue), der består af laminae og spinøse processer. Mellem disse strukturer ligger vertebrale foramen15. - Fjern nerverne, der kommer ud gennem foramina (dorsale og ventrale rødder), der udgør det perifere nervesystem og kan indeholde infiltrerede makrofager (figur 3D).
BEMÆRK: Det er unødvendigt at fjerne pia mater eller meninges, da densitetsgradientmediet effektivt eliminerer forurenende astrocytter. Derudover reducerer fastholdelse af meninges rensningstiden og forbedrer levedygtigheden.
3. Vævsfordøjelse og isolering af mikroglia
- Placer rygmarven på dissekeringsbrættet, og skær rygmarven i stykker i 2 mm stykker ved hjælp af Vannas-saks, hvilket giver et gennemsnit på 10 stykker.
- Overfør sektionerne af rygmarven til et 2 ml fladbundet mikrorør (figur 3E, F).
- Der tilsættes 1 ml HBSS-LD-arbejdsløsning (trin 1.2). Der inkuberes ved 37 °C i 25 minutter, hvirvler kraftigt hvert 5. minut.
- Før indholdet af hver fordøjelse gennem en 40 μm sil, og tilsæt derefter 7 ml HBSS med 2% FBS for at neutralisere fordøjelsen.
- Det resterende væv knuses med et 1 ml sprøjtestempel. Centrifuger suspensionen i et 50 ml konisk rør i 5 minutter ved 220 x g, 4 °C.
- Supernatanten kasseres med en 1 ml mikropipette, og pelletpen resuspenderes i 2 ml HBSS med 2 % FBS i et 15 ml konisk rør. Kombiner med 2 ml 90% isotonisk densitetsgradientmedium. Der centrifugeres i 25 minutter ved 160 x g, 18 °C.
BEMÆRK: Brug langsom acceleration og undgå at bruge bremsen. - Brug en overførselspipette til at hente grænsefladen og overføre den til et 15 ml konisk rør. Cellerne vaskes med 10 ml PBS og centrifugeres i 5 minutter ved 220 x g, 4 °C.
- Resuspender cellerne i DMEM-S (trin 1.6) og opbevar dem på is.
4. Bestemmelse af renhed/levedygtighed
- Til kvantificering af levedygtige celler ved hjælp af et hæmocytometerkammer skal du anvende en 0,4% trypanblå plet (se materialetabel).
BEMÆRK: I gennemsnit giver en enkelt mus 4-6 millioner celler. - For at kvantificere levedygtige celler via et flowcytometer skal du anvende kommercielt tilgængelig amin-reaktiv fluorescerende farvestoffarvning (se materialetabel).
- Overfør 1 million celler til et 5 ml polystyren rundbundet (FACS) rør. Fortynd det fluorescerende farvestof med PBS i et forhold på 1:1000 (hvilket skaber levedygtighedsløsningen).
- Prøverne inkuberes med levedygtighedsopløsningen i mørke ved 4 °C i 30 minutter. Vask cellerne med iskold PBS to gange. Cellerne resuspenderes i 400 μL farvningsbuffer (trin 1.4).
- Bloker cellerne med 2,4G2 anti-FcRIII/I (se materialetabel) i den iskolde farvningsbuffer i 15 minutter ved 4 °C.
- Formuler antistoffarvningscocktailen ved at tilsætte de fluorescerende mærkede monoklonale antistoffer CD45-PerCP og CD11b-eFluor 450 til farvningsbufferen (ved en fortynding på 1:300) (se materialetabel).
BEMÆRK: Mens begge teknikker er tilgængelige, skal du vælge den, der bedst stemmer overens med den efterfølgende protokol. - Prøverne inkuberes med antistoffarvningscocktailen i mørke ved 4 °C i 30 minutter. Vask cellerne med iskold farvningsbuffer to gange. Resuspender cellerne i 400 μL farvningsbuffer.
- Få 250.000 hændelser på et flowcytometer, som beskrevet af gating-strategien i trin 6 (figur 4).
5. Immunofluorescerende farvning
- Anbring et forbehandlet dæksel i en brønd på en 6-brøndplade.
BEMÆRK: For at behandle dæksedler anbringes de i en petriskål med 500 μL L-polylysin (0,01 mg/ml, se materialetabel) opløsning og inkuberes i 1 time. Derefter vaskes de tre gange med destilleret vand og lad dem tørre. - Frø 200.000 celler på det behandlede dæksel ved hjælp af 500 μL DMEM-S-opløsning. Inkuber i 24 timer.
- Fjern dækslerne, og fastgør cellerne med 3,7% paraformaldehyd (PFA) i 20 minutter ved stuetemperatur. Vask dækslerne tre gange med iskold PBS.
- Permeabiliser cellerne med 0,2% Triton X-100 i PBS i 15 minutter ved stuetemperatur. Derefter vaskes dækslerne tre gange med kold PBS. Bloker cellerne med 0,2% BSA i PBS i 1 time ved stuetemperatur.
- De fluorescensmærkede monoklonale antistoffer fortyndes (ved 1:300 fortynding, se materialetabel) i blokeringsopløsningen og inkuberes i 1 time ved stuetemperatur. Vask dækslerne tre gange med iskold PBS.
- Påfør monteringsmediet, der indeholder DAPI, på diaset, og forsegl det derefter med en dæksel.
BEMÆRK: Objektglassene kan straks analyseres ved hjælp af et fluorescens- eller konfokalmikroskop, eller de kan opbevares i op til 3 måneder ved -20 °C.
6. Gating strategi for rygmarv microglia
- Generer et prikplot, og etabler en port til isolering af levedygtige celler baseret på levedygtighed, farvning og en tom fluorescerende kanal16. Ekskluder ikke-levedygtige celler.
- Fremstil et andet plot ved hjælp af fremad- og sidespredningsparametre for at fjerne snavs16.
- Udvikl et ekstra prikplot og analyser ekspressionen af CD11b og CD45 for at differentiere mikroglia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af rygmarvsvæv fra mus blev enzymatisk fordøjelse udført under anvendelse af en blanding højt beriget med kollagenase og termolysin. Det resulterende fordøjede væv gennemgik passage gennem et 40 μm filter for at eliminere ufordøjet materiale. De indsamlede celler blev beriget gennem en Percoll-densitetsgradient med 90% i den nedre del og 45% i den øvre del. De mikroglia-berigede celler i grænsefladen blev derefter farvet med CD45- og CD11b-antistoffer og udsat for flowcytometrisk analyse (figur 1).
Dissektionen af rygsøjlen, der strækker sig fra den occipitale region til korsbenet, involverer eksponering og dissektion af den paravertebrale muskulatur. For at frigive rygsøjlen blev kystbuerne eksponeret, og deres måling blev udført fra hvirvel T13 til T1. Rygsøjlen, der artikulerede med kraniet og korsbenet, blev synlig, og et snit blev udført på hver side for at frigøre det fuldstændigt (figur 2).
Udvindingen af rygmarven blev opnået gennem et lateralt snit i hvirveldyrene, der dannede en kanal. Under fjernelsen af rygmarven blev de perifere nerver afskåret for at forhindre forurening fra perifere makrofager. Derefter blev den opnåede rygmarv spredt over dissektionsbordet og skåret i 2 mm stykker, som blev tilsat til fordøjelsesopløsningen (figur 3). Brugen af liberase til fordøjelse af rygmarv rapporteres for første gang, hvilket giver 4 til 6 millioner meget levedygtige mikrogliaceller pr. voksen mus. Den optimale levedygtighed opnået gennem denne proces varierer fra 80% til 99%.
For at bekræfte rensningsprocessen blev FACS-farvning af microglia udført under anvendelse af CD45- og CD11b-antistoffer. Oprensningsprocessen viste effektivitet og gav op til 99% mikrogliaceller (figur 4). Desuden blev immunofluorescensfarvning udført på den opnåede mikroglia under anvendelse af de samme antistoffer, idet der blev observeret dobbeltpositive celler med en gennemsnitlig størrelse på 10 μm - i overensstemmelse med den rapporterede størrelse af ikke-aktiveret mikroglia. Dette tyder på, at disse celler er egnede til aktiveringsundersøgelser (figur 4E). Det er plausibelt, at andre immunceller kan være til stede under inflammatoriske processer, eller at mikroglia kan gennemgå morfologiske ændringer under forskellige stimuli. I sådanne tilfælde anbefales inkorporering af specifikke markører til identifikation af hver cellepopulation.
Figur 1: Skematisk oversigt over protokollen for rensning af rygmarvsmikroglia. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Procedure for marvsdissektion. Efter eutanasi blev musens rygsøjle isoleret og dissekeret. (A) Trinvis huddissektion, der strækker sig fra de occipitale til kaudale regioner og afslører den paravertebrale muskulatur. (B) Sekventiel dissektion gennem lagene af paravertebrale muskler. (C) Fjernelse af rygsøjlen efter ribbensskæring. (D) Visualisering af en intakt rygmarv i rygmarven. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Rygmarvsekstraktion og fordøjelsesproces . A) Sekventiel spinal laminektomi med to snit på ca. 2 mm. (B) Blotlagt rygmarv. (C) Fjernelse af rygmarven. (D) Perifer nervesektion. (E) Rygmarven blev opdelt i 2 mm sektioner og anbragt i fordøjelsesmediet. F) Standard 37 °C inkubation til nedbrydning af væv. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Vurdering af cellerens renhed og levedygtighed. Immunfarvning af oprensede celler ved hjælp af mikroglia-specifikke markører. A) Identifikation af levende celler (fluorescerende farvestofnegative celler). (B) Valg af cellestørrelse. (C) CD45low- og CD11b+-celler, der udviser renhed på over 99%. (D) Gennemsnitlig levedygtighed (87,46 SD ± 1,468) og gennemsnitlig renhed (88,51 ± SD 3,948; n = 5). (E) Immunofluorescens, der viser CD45+ og CD11b+ farvning i oprensede celler. Billeder blev taget ved hjælp af et konfokalmikroskop med en hvid lyslaser ved 60x forstørrelse (skalabjælke = 5 μm). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Talrige protokoller er blevet udviklet til undersøgelse af microglia på grund af deres betydning i hjernens homeostase. I disse metoder kommer mikroglia typisk fra hjernehalvkuglerne hos embryonale eller neonatale rotter og mus17. Et begrænset antal undersøgelser har behandlet oprensning af mikroglia fra rygmarven hos voksne mus13,14. Disse teknikker involverer enzymatisk fordøjelse ved hjælp af kollagenase og / eller papain sammen med DNAse, ofte kombineret med gradientseparation ved hjælp af Percoll eller OptiPrep. Imidlertid kan anvendelse af papain-baseret rygmarvsfordøjelse uden gradientseparation føre til astrocytkontaminering, selv efter fjernelse af pia mater14,17.
Denne undersøgelse præsenterer en protokol til rensning af mikroglia fra rygmarven hos voksne mus. Protokollen anvender en præcis blanding af kollagenase I og II sammen med termolysin, en kombination kendt for effektivt at fordøje forskellige væv med kontrolleret nedbrydning18, hvilket reducerer apoptose på grund af dets lave indhold af neutrale proteaser. Meninges eller pia mater, ofte kilder til astrocytkontaminering, kan elimineres ved brug af en Percoll-gradient i denne procedure, hvilket negerer nødvendigheden af at fjerne disse lag (figur 1).
Mikroglial heterogenitet stammer fra forskellige morfologier i rygmarven og hjernen8. Denne protokol blev imidlertid også anvendt på cerebrale halvkugler med lignende resultater (data ikke præsenteret), hvilket fremhæver dens robusthed til analyse af både rygmarv og cerebral mikroglia.
Høje niveauer af renhed (fra 80% til 99%) og levedygtighed (85% til 98%) kan konsekvent opnås med denne protokol. Behandling af celler fra nervesystemet er indviklet, primært fordi cellelevedygtigheden påvirkes væsentligt af behandlingsvarigheden; Hypoxi på over 20 minutter kan være dødelig. For optimal levedygtighed anbefales det at begrænse behandlingstiden fra rygmarvsekstraktion til fordøjelse til højst 10 min. Denne beskrivelse er skræddersyet til raske mus i alderen 8 til 10 uger, hvilket kræver yderligere standardisering for yngre eller ældre mus. Suboptimal levedygtighed indebærer overfordøjelse af væv, der kræver gentagelse. Alternativt kan FACS-sortering redde celler fra overfordøjede prøver.
Anvendelsen af liberase til fordøjelse og rensning af rygmarvsmikroglia er ny. Dens begrænsede anvendelse i nervesystemvæv har historisk været på grund af levedygtighedsudfordringer18,19. Denne undersøgelse viser imidlertid øget levedygtighed ved anvendelse af denne omhyggeligt oprensede collagenase. Alternativt kan andre collagenaser med lavere styrke udforskes.
Flere afgørende overvejelser skal anerkendes, såsom tilstedeværelsen af neuroinflammation, blod-hjerne-barrierekompromis og musealder. Disse faktorer ændrer både mikroglial morfologi og frekvens. I tilfælde af neuroinflammation eller forstyrrelse af blod-hjerne-barrieren kan immunceller, der udtrykker CD45 og CD11b, infiltrere, hvilket mindsker mikroglial renhed. Da mikroglia udforskes grundigt i forskellige neuroinflammatoriske tilstande, har denne protokol potentiale for patologiske og neurofysiologiske undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra stipendiet fra National Council of Science and Technology (CONACYT) (702361). Forfatterne anerkender ph.d. program i biologiske kemiske videnskaber fra National School of Biological Sciences af National Polytechnic Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL collection tubes | Corning, USA | 430790 | |
| 2 mL microtubes | Axygen, USA | MCT-200-G | |
| 2.4G2 anti-FcR | BioLegend, USA | 101302 | |
| 50 mL collection tubes | Corning, USA | 430829 | |
| 70% ethanol | |||
| Antibiotic-Antimycotic (penicillin, streptomycin, amphotericin b) | Gibco, USA | 15240062 | |
| Antibody CD11b eFluor 450 anti-mouse | eBioscience, USA | 48-0112 | |
| Antibody CD45 PerCP anti-mouse | BioLegend, USA | 103130 | |
| Balanced salt solution (PBS) calcium- magnesium-free | Corning, USA | 46-013-CM | |
| Blue Cell Strainer 40 μm | Corning, USA | 352340 | |
| Costar 6-well Clear Not Treated | Corning, USA | CLS3736 | |
| Coverslips | |||
| Digital Heating Shaking Drybath | Thermo Scientific Digital HS Drybath, USA | 88870001 | |
| Dissecting forceps for microsurgery | FT by DUMONT | ||
| DNase | Roche, USA | 4536282001 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium-high glucose (DMEM) | Merck, USA | D6429 | |
| Electric shaver | |||
| FACS tube | Thermo, USA | 352058 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAN Biotech, Alemania | P30-3306 | |
| Flow cytometer Cytoflex | Beckman Coulter | ||
| Hank’s balanced salt solution | Merck, USA | H2387 | |
| L-glutamine | Corning, USA | 15393631 | |
| Liberase TM | Roche, USA | 5401119001 | |
| Neubauer chamber Counting Chambers | China | 1103 | |
| Pentobarbital | |||
| Percoll | Merck, USA | 17089101 | density gradient centrifugation |
| Poly-L-lysine solution | Merck, USA | P8920 | |
| Scalpel No. 25 | HERGOM, Mexico | H23 | |
| Snaplock Microcentrifuge Tubes 2 mL | Axygen, USA | 10011-680 | |
| Stereoscopic microscope | Velab, Mexico | HG927831 | |
| Straight surgical scissors (10 cm) | HERGOM, Mexico | ||
| Straight Vannas scissors | HERGOM, Mexico | ||
| Triton X100 | Merck, USA | X100 | |
| Trypan blue Stain 0.4% | Merck, USA | 15250-061 | |
| Vortex mixer | DLAB, China | 8031102000 | |
| Zombie Aqua Fixable Viability Kit | BioLegend, USA | 423102 | amine-reactive fluorescent dye staining |
References
- Schröder,, Moser,, Huggenberger, Neuroanatomy of the Mouse. , Springer, Switzerland. 59-78 (2020).
- Sengul, G., et al. Cytoarchitecture of the spinal cord of the postnatal (P4) mouse. Anat Rec. 295, 837-845 (2012).
- Bab, I., et al. Microtomographic atlas of the mouse skeleton. VIII, First ed, Springer. 205 (2007).
- Nayak, D., et al.
- Martinez, F. O., et al.
- Masuda, T., et al.
- Prinz, M. Microglia biology: one century of evolving concepts. Cell. 179 (2), 292-311 (2019).
- de Haas, A. H., et al. Region-specific expression of immunoregulatory proteins on microglia in the healthy CNS. Glia. 56 (8), 888-894 (2008).
- Xuan, F. L., et al. Differences of microglia in the brain and the spinal cord. Front Cell Neurosci. 13, 504 (2019).
- Paolicelli, R. Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads. Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).
- Li, Q., et al. Spinal IL-36γ/IL-36R participates in the maintenance of chronic inflammatory pain through astroglial JNK pathway. Glia. 67 (3), 438-451 (2019).
- Prinz, M., et al. Microglia and central nervous system-associated macrophages-from origin to disease modulation. Annu Rev Immunol. 39, 251-277 (2021).
- Yip, P. K., et al. Rapid isolation and culture of primary microglia from adult mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 183 (2), 223-237 (2009).
- Akhmetzyanova, E. R., et al. Severity- and time-dependent activation of microglia in spinal cord injury. Int J Mo. Sci. 24 (9), 1-16 (2023).
- Mahadevan, V.
- Krukowski, K., et al. Temporary microglia-depletion after cosmic radiation modifies phagocytic activity and prevents cognitive deficits. Sci Rep. 8 (1), 1-13 (2018).
- Cardona, A., et al. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
- Schmidt, V. M., et al. Comparison of the enzymatic efficiency of Liberase TM and tumor dissociation enzyme: effect on the viability of cells digested from fresh and cryopreserved human ovarian cortex. Reprod Biol Endocrinol. 16 (57), 1-14 (2018).
- Kusminski, C. M., et al. MitoNEET-parkin effects in pancreatic α- and β-cells, cellular survival, and intrainsular cross talk. Diabetes. 65 (6), 1534-1555 (2016).
