Summary
ミクログリアは、体内で最も用途の広い細胞の一部と見なされており、形態学的および機能的適応が可能です。それらの不均一性と多機能性は、脳の恒常性の維持を可能にすると同時に、さまざまな神経学的病態にも関連しています。ここでは、脊髄ミクログリアを浄化する技術について説明する。
Abstract
脊柱は脊椎動物を定義し、脊柱管、脊髄を囲んで保護する空洞を形作ります。哺乳類の中枢神経系の適切な発達と機能は、ミクログリアとして知られる常在マクロファージの活性に大きく依存しています。ミクログリアは不均一性と多機能性を示し、脊髄と脳内で異なる遺伝子発現と挙動を可能にします。多くの研究が大脳ミクログリアの機能を調査し、精製方法を広範囲に詳述しています。しかし、マウスの脊髄からのミクログリアの精製は包括的な説明を欠いています。対照的に、未精製の抽出物とは対照的に、高度に精製されたコラゲナーゼの利用は、中枢神経系組織内での報告を欠いています。この研究では、8〜10週齢のC57BL/6マウスから脊柱と脊髄を切除しました。その後の消化には高度に精製されたコラゲナーゼが用いられ、ミクログリアの精製には密度勾配が用いられました。細胞はフローサイトメトリーで染色し、CD11bおよびCD45染色により生存率と純度を評価しました。その結果、平均生存率は80%、平均純度は95%でした。結論として、マウスミクログリアのマニピュレーションには、高度に精製されたコラゲナーゼによる消化とそれに続く密度勾配が含まれていました。このアプローチは、かなりの脊髄ミクログリア集団を効果的に生み出しました。
Introduction
脊椎動物の決定的な特徴は脊柱または脊椎であり、脊索は椎骨と呼ばれる一連のセグメント化された骨に置き換えられ、椎間板によって分割されています。この骨質物質の連続は、脊柱管、脊髄1を囲んで保護する空洞を形作る。げっ歯類属では、脊椎は通常、7つの頸椎、13の胸椎、6つの腰椎、および可変数の尾椎によって形成されます2,3。脊髄の長さは脊椎の長さに似ており、末端糸は脊髄を仙骨に固定する非神経構造です。さらに、神経線維は椎間孔1から出ます。
哺乳類における中枢神経系の発達と適切な機能は、ミクログリアと呼ばれる神経系に常在するマクロファージの活性に決定的に依存しています4。ミクログリアは当初、脳に常在する食細胞として説明されていましたが、最近の研究では、これらの細胞に多くの動的機能が起因しています5,6。ミクログリアのサイズは、ホメオスタシスにおいて7〜10μmの範囲です。それらは体内で最も用途の広い細胞の一つと考えられており、絶えず変化する環境に形態学的および機能的に適応することができます7。これらの細胞は、胚期と成体期の両方で高い不均一性を示しますが8,9、成体期では、時空間的文脈に基づいて複雑な機能的不均一性も示します10。ミクログリアの不均一性と複数の機能は、脊髄と脳における遺伝子発現と挙動の違いを可能にします。CD11b、CD45、CD86、およびCCR9の発現は、脳と比較して脊髄で高いことが示されています8,9。
脳ミクログリアの分離には複数のプロトコルが存在します11,12;しかし、脊髄ミクログリアについてはごくわずかしか存在しない13,14。脊髄からミクログリアを精製する方法を最適化することで、ミクログリアの生理学の発見に焦点を当てた複数の研究の開発が容易になります。このプロトコルはマウス脊髄の簡単で、非常に再現性が高い抽出およびミクログリア(図1)の浄化を記述することを向ける。
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Protocol
この研究は、メキシコの公式規格NOM-062-ZOO-1999および実験動物のケアと使用に関するガイドに従って実施されました。本研究の承認は、メキシコ小児病院の研究・倫理・バイオセーフティ委員会(HIM/2023/006)およびメキシコ総合病院の研究・生命倫理委員会(DI/21/501/04/62)から得られました。生後6〜8週齢の3匹のC57BL/6マウスをメキシコ小児病院から入手し、施設の動物飼育および使用ガイドラインに従って、換気されたラック内で隔離された条件下で飼育しました。
1. 材料・試薬の調製
- Ca2+およびMg2+遊離PBSおよびハンク平衡塩溶液(HBSS)を37°Cに予熱します。
- HBSS溶液に100 μg/mLのリベラーゼと4 μg/mLのDNase(HBSS-LD)を添加します。溶液が生理学的pHを7.4に維持していることを確認してください。
注:脊髄ごとに1mLの作業溶液が必要になります。 - 密度勾配遠心分離用の等張 90% 溶液(市販品、 材料表を参照)を調製し、37°C に予熱します。
- 5%熱不活化ウシ胎児血清(FBS)とPBSを組み合わせて染色バッファーを調製し、氷上に保存します。
- ダルベッコのモディファイドイーグルの中高グルコース(1g / L)(DMEM)を37°Cに予熱します。
- DMEM-Sを調製するために、DMEM培地に10%FBS、2 mM L-グルタミン、200 U/mLペニシリン、200 μg/mLのストレプトマイシン、および500 pg/mLのアムホテリシンB( 材料表を参照)を添加します。
2.脊髄の解剖と準備
- 150 mg / kgの用量でペントバルビタールの腹腔内過剰摂取でマウスを安楽死させます。.マウスの胸部と背部を70%エタノールで滅菌します。
注:マウスの解剖に進む前に、安楽死が成功したことを確認してください。 - 胸腰部を剃り、粘着テープで四肢を解剖ボードに固定します。
- メスを使用して、後頭部から仙骨領域までの背側正中線に沿って慎重に切開します(図2)。
- 実体手術用顕微鏡の助けを借りて、腰椎に到達し、最後の肋骨弓を特定するまで層状に解剖します。
注:13の肋骨弓は胸椎に関節で連結されています。解剖すると、それらはL1椎骨2よりも上に見えるようになります。 - 最後の頸椎と仙骨を決定し、脊椎を分離するための切り込みを入れます(図2)。
- 解剖鉗子を利用して、椎骨の背側椎弓切除術を行い、脊髄を摘出します(図3A-D)。
注:最初の2つの頸椎(アトラスと軸)を除いて、すべての可動椎骨は、さまざまな領域(頸椎、胸椎、または腰椎)で共通の形態学的デザインを共有しています。典型的な可動椎骨は、その前端に円筒形の椎体を特徴としています。体の後ろに付着しているのは、椎弓(神経弓)として知られる骨弓で、椎弓突起と棘突起で構成されています。これらの構造の間には、椎孔15がある。 - 末梢神経系を構成し、浸潤したマクロファージを含む可能性のある孔(背側および腹側根)から出現する神経を取り除きます(図3D)。
注:密度勾配培地は汚染されたアストロサイトを効果的に除去するため、軟膜や髄膜を除去する必要はありません。さらに、髄膜を保持することで、精製時間が短縮され、生存率が向上します。
3. ミクログリアの組織消化と単離
- 脊髄を解剖板の上に置き、バンナハサミを使用して脊髄を2mmに切断し、平均10個にします。
- 脊髄の切片を2 mLの平底マイクロチューブに移します(図3E、F)。
- HBSS-LDワーキング溶液1 mLを加えます(ステップ1.2)。37°Cで25分間インキュベートし、5分ごとに激しくボルテックスします。
- 各消化液の内容物を40 μmのストレーナーに通し、7 mLのHBSSと2%FBSを加えて消化物を中和します。
- 1 mLのシリンジプランジャーを使用して残りの組織を粉砕します。懸濁液を50 mLのコニカルチューブに入れ、220 x g、4°Cで5分間遠心分離します。
- 1 mLのマイクロピペットを使用して上清を廃棄し、15 mLのコニカルチューブに2% FBSを含む2 mLのHBSSでペレットを再懸濁します。2 mLの90%等張密度グラジエント培地と組み合わせます。160 x g、18°Cで25分間遠心分離します。
注意: 低速加速を利用し、ブレーキの使用は避けてください。 - トランスファーピペットを使用してインターフェースを回収し、15 mLのコニカルチューブに移します。細胞を10 mLのPBSで洗浄し、220 x g、4°Cで5分間遠心分離します。
- 細胞をDMEM-Sに再懸濁し(ステップ1.6)、氷上に保管します。
4. 純度/生存率の判断
- 血球計算盤チャンバーを使用して生細胞を定量するには、0.4%トリパンブルー染色剤を使用します( 材料表を参照)。
注:平均して、1匹のマウスは400万〜600万個の細胞を提供します。 - フローサイトメーター で 生細胞を定量するには、市販のアミン反応性蛍光色素染色を使用します( 材料表を参照)。
- 100万個の細胞を5 mLのポリスチレン丸底(FACS)チューブに移します。蛍光色素をPBSで1:1000の比率で希釈します(生存率作動溶液を作成します)。
- サンプルを生存率溶液とともに暗所で4°C、30分間インキュベートします。細胞を氷冷PBSで2回洗浄します。細胞を400 μLの染色バッファーに再懸濁します(ステップ1.4)。
- 2.4G2抗FcRIII/I( 材料表参照)で細胞を氷冷染色バッファー中で4°Cで15分間ブロックします。
- 蛍光標識モノクローナル抗体CD45-PerCPおよびCD11b-eFluor 450を染色バッファー(希釈率1:300)に添加して、抗体染色カクテルを調製します( 材料表を参照)。
メモ: どちらの方法も使用できますが、後続のプロトコルに最も適した方法を選択してください。 - サンプルを抗体染色カクテルとともに暗所で4°C、30分間インキュベートします。細胞を氷冷染色バッファーで2回洗浄します。細胞を400μLの染色バッファーに再懸濁します。
- フローサイトメーターで 250,000 のイベントを取得し、ステップ 6 のゲーティング戦略で概説します(図 4)。
5. 免疫蛍光染色
- 前処理したカバーガラスを6ウェルプレートのウェルに入れます。
注:カバーガラスを処理するには、500 μLのL-ポリリジン(0.01 mg/mL、 材料表を参照)溶液を入れたペトリ皿に入れ、1時間インキュベートします。その後、蒸留水で3回洗い、乾かします。 - 500 μL の DMEM-S 溶液を使用して、処理したカバーガラスに 200,000 個の細胞を播種します。24時間インキュベートします。
- カバーガラスを取り外し、3.7%パラホルムアルデヒド(PFA)を使用して室温で20分間セルを固定します。カバーガラスを氷冷PBSで3回洗います。
- 0.2% Triton X-100 in PBS で室温で 15 分間、細胞を透過処理します。続いて、カバーガラスを冷たいPBSで3回洗います。0.2% BSA含有PBSで細胞を室温で1時間ブロッキングします。
- 蛍光標識モノクローナル抗体をブロッキング溶液中で希釈し(希釈率1:300、 材料表を参照)、室温で1時間インキュベートします。カバーガラスを氷冷PBSで3回洗います。
- DAPIを含む封入剤をスライドに塗布し、カバーガラスで密封します。
注:スライドは、蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡を使用してすぐに分析するか、-20°Cで最大3か月間保存できます。
6. 脊髄ミクログリアのゲーティング戦略
- ドットプロットを生成し、生存率染色および空の蛍光チャネル16に基づいて生細胞を単離するためのゲートを確立する。非生細胞を除外します。
- 前方散乱パラメータと側方散乱パラメータを利用して別のプロットを作成し、破片16を除去します。
- 追加のドットプロットを作成し、CD11bとCD45の発現を解析してミクログリアを鑑別します。
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Representative Results
マウスの脊髄組織を利用し、コラゲナーゼとサーモリシンを高度に濃縮した混合物を用いて酵素消化を行いました。得られた消化された組織は、未消化物質を除去するために40μmフィルターを通過しました。収集した細胞は、下部に90%、上部に45%のパーコール密度勾配で濃縮しました。次に、界面内のミクログリア濃縮細胞をCD45およびCD11b抗体で染色し、フローサイトメトリー解析を行いました(図1)。
後頭部から仙骨まで伸びる脊柱の解剖は、傍脊椎筋組織の露出および解剖を含む。脊柱を解放するために、肋骨弓を露出させ、それらの測定を椎骨T13からT1まで行った。頭蓋骨と仙骨と関節を結ぶ脊柱が見え、両側に切り込みを入れて完全に解放しました(図2)。
脊髄の抜歯は、椎体への横方向の切開によって達成され、運河を形成した。脊髄の摘出の際、末梢マクロファージの汚染を防ぐために末梢神経を切断しました。続いて、得られた脊髄を解剖台に広げて2mmの小片に切片化し、消化液に添加した(図3)。脊髄消化のためのリベラーゼの使用が初めて報告され、成体マウス1匹あたり400万〜600万個の生存率の高いミクログリア細胞が得られました。このプロセスによって達成される最適な実行率は、80%から99%の範囲です。
精製プロセスを確認するために、CD45およびCD11b抗体を用いてミクログリアのFACS染色を実施しました。精製プロセスでは効率が実証され、最大99%のミクログリア細胞が得られました(図4)。さらに、得られたミクログリアについて、同じ抗体を用いて免疫蛍光染色を行い、平均サイズ10μmの二重陽性細胞を観察した。これは、これらの細胞が活性化研究に適していることを示唆しています(図4E)。炎症過程中に他の免疫細胞が存在する可能性や、ミクログリアが異なる刺激の下で形態学的変化を起こす可能性は十分にあります。そのような場合、各細胞集団の同定のための特定のマーカーの組み込みが推奨されます。
図1:脊髄ミクログリア精製プロトコルの概略図。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:脊髄解剖手順。 安楽死後、マウスの脊柱を単離し、解剖した。(A)後頭部から尾部にかけて段階的に皮膚を解剖し、傍椎の筋肉組織を明らかにする。(B)傍脊椎筋の層を通る逐次解剖。(C)肋骨切断後の脊椎の除去。(D)脊柱管内の無傷の脊髄の視覚化。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:脊髄の抽出と消化のプロセス 。 (A)約2mmの切開を2回行う逐次椎椎弓切除術。(B)露出した脊髄。(C)脊髄の除去。(D)末梢神経切片化。(E)脊髄を2mmの切片に分割し、消化培地に入れた。(F)組織消化のための標準的な37°Cインキュベーション。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:細胞の純度と生存率の評価。 ミクログリア特異的マーカーを用いた精製細胞の免疫染色。(A)生細胞(蛍光色素陰性細胞)の同定。(B) セル サイズに基づく選択。(C)CD45lowおよびCD11b+細胞、99%を超える純度を示す。(D)平均生存率(87.46 ± SD 1.468)および平均純度(88.51 ± SD 3.948; n = 5)。(E)精製細胞におけるCD45+およびCD11b+染色を示す免疫蛍光法。画像は、共焦点顕微鏡と60倍の倍率(スケールバー=5μm)の白色光レーザーを使用して撮影しました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ミクログリアの研究のために、脳の恒常性におけるミクログリアの重要性から、数多くのプロトコルが開発されてきました。これらの方法では、ミクログリアは典型的には、胎児または新生仔のラットおよびマウスの大脳半球に由来する17。成体マウスの脊髄からのミクログリアの精製を扱った研究は限られている13,14。これらの技術には、コラゲナーゼおよび/またはパパインとDNAseを使用した酵素消化が含まれ、多くの場合、PercollまたはOptiPrepを使用したグラジエント分離と組み合わされます。しかし、勾配分離を伴わないパパインベースの脊髄消化を採用すると、軟膜を除去した後でも、アストロサイトの汚染につながる可能性があります14,17。
この研究は、成体マウス脊髄からミクログリアを精製するためのプロトコルを提示します。従ってプロトコルはthermolysinと共にコラゲナーゼIおよびIIの精密な混合物、制御された低下18の多様なティッシュを効率的に消化するために知られている組合せを、中立プロテアーゼの低内容によるapoptosisを減らす利用する。アストロサイトの汚染源となることが多い髄膜や軟膜は、この手順でパーコールグラジエントを使用することで除去できるため、これらの層を除去する必要がなくなります(図1)。
ミクログリアの不均一性は、脊髄と脳の異なる形態から生じる8。しかし、このプロトコルは大脳半球にも適用され、同様の結果(データは提示されていません)が得られ、脊髄と脳ミクログリアの両方を分析するための堅牢性が強調されています。
このプロトコルでは、高レベルの純度(80%から99%の範囲)と生存率(85%から98%)を一貫して達成できます。神経系からの細胞のプロセシングは複雑であり、これは主に細胞の生存率がプロセシング期間に大きく影響されるためです。20分を超える低酸素症は致命的となる可能性があります。最適な生存率を得るには、脊髄の抽出から消化までの処理時間を10分以内に制限することをお勧めします。この記述は、8〜10週齢の健康なマウスに合わせて調整されており、若齢または高齢のマウスに対してさらなる標準化が必要です。生存率が最適でないということは、組織の過剰消化を意味し、繰り返しを余儀なくされます。また、FACSソーティングでは、過剰消化されたサンプルから細胞を回収することもできます。
脊髄ミクログリアの消化と精製のためのリベラーゼの応用は斬新です。神経系組織でのその限られた使用は、歴史的に生存率の課題によるものです18,19。しかし、この研究は、この細心の注意を払って精製されたコラゲナーゼを使用した場合の生存率の向上を示しています。あるいは、力価の低い他のコラゲナーゼを検討することもできます。
神経炎症の存在、血液脳関門の障害、マウスの年齢など、いくつかの重要な考慮事項を認識する必要があります。これらの要因は、ミクログリアの形態と頻度の両方を変化させます。神経炎症や血液脳関門の破壊の場合、CD45とCD11bを発現する免疫細胞が浸潤し、ミクログリアの純度が低下する可能性があります。ミクログリアはさまざまな神経炎症状態で広く研究されているため、このプロトコルは病理学的および神経生理学的研究の可能性を秘めています。
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Disclosures
著者は利益相反がないことを宣言します。
Acknowledgments
この研究は、全米科学技術評議会(CONACYT)(702361)から授与された奨学金からの助成金によって支援されました。著者らは、国立工科大学の国立生物科学部の生物化学科学の博士課程プログラムを認めています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL collection tubes | Corning, USA | 430790 | |
| 2 mL microtubes | Axygen, USA | MCT-200-G | |
| 2.4G2 anti-FcR | BioLegend, USA | 101302 | |
| 50 mL collection tubes | Corning, USA | 430829 | |
| 70% ethanol | |||
| Antibiotic-Antimycotic (penicillin, streptomycin, amphotericin b) | Gibco, USA | 15240062 | |
| Antibody CD11b eFluor 450 anti-mouse | eBioscience, USA | 48-0112 | |
| Antibody CD45 PerCP anti-mouse | BioLegend, USA | 103130 | |
| Balanced salt solution (PBS) calcium- magnesium-free | Corning, USA | 46-013-CM | |
| Blue Cell Strainer 40 μm | Corning, USA | 352340 | |
| Costar 6-well Clear Not Treated | Corning, USA | CLS3736 | |
| Coverslips | |||
| Digital Heating Shaking Drybath | Thermo Scientific Digital HS Drybath, USA | 88870001 | |
| Dissecting forceps for microsurgery | FT by DUMONT | ||
| DNase | Roche, USA | 4536282001 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium-high glucose (DMEM) | Merck, USA | D6429 | |
| Electric shaver | |||
| FACS tube | Thermo, USA | 352058 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAN Biotech, Alemania | P30-3306 | |
| Flow cytometer Cytoflex | Beckman Coulter | ||
| Hank’s balanced salt solution | Merck, USA | H2387 | |
| L-glutamine | Corning, USA | 15393631 | |
| Liberase TM | Roche, USA | 5401119001 | |
| Neubauer chamber Counting Chambers | China | 1103 | |
| Pentobarbital | |||
| Percoll | Merck, USA | 17089101 | density gradient centrifugation |
| Poly-L-lysine solution | Merck, USA | P8920 | |
| Scalpel No. 25 | HERGOM, Mexico | H23 | |
| Snaplock Microcentrifuge Tubes 2 mL | Axygen, USA | 10011-680 | |
| Stereoscopic microscope | Velab, Mexico | HG927831 | |
| Straight surgical scissors (10 cm) | HERGOM, Mexico | ||
| Straight Vannas scissors | HERGOM, Mexico | ||
| Triton X100 | Merck, USA | X100 | |
| Trypan blue Stain 0.4% | Merck, USA | 15250-061 | |
| Vortex mixer | DLAB, China | 8031102000 | |
| Zombie Aqua Fixable Viability Kit | BioLegend, USA | 423102 | amine-reactive fluorescent dye staining |
References
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