マウス脊髄ミクログリアの迅速かつ効率的な濃縮

サマリー

ミクログリアは、体内で最も用途の広い細胞の一部と見なされており、形態学的および機能的適応が可能です。それらの不均一性と多機能性は、脳の恒常性の維持を可能にすると同時に、さまざまな神経学的病態にも関連しています。ここでは、脊髄ミクログリアを浄化する技術について説明する。

要約

脊柱は脊椎動物を定義し、脊柱管、脊髄を囲んで保護する空洞を形作ります。哺乳類の中枢神経系の適切な発達と機能は、ミクログリアとして知られる常在マクロファージの活性に大きく依存しています。ミクログリアは不均一性と多機能性を示し、脊髄と脳内で異なる遺伝子発現と挙動を可能にします。多くの研究が大脳ミクログリアの機能を調査し、精製方法を広範囲に詳述しています。しかし、マウスの脊髄からのミクログリアの精製は包括的な説明を欠いています。対照的に、未精製の抽出物とは対照的に、高度に精製されたコラゲナーゼの利用は、中枢神経系組織内での報告を欠いています。この研究では、8〜10週齢のC57BL/6マウスから脊柱と脊髄を切除しました。その後の消化には高度に精製されたコラゲナーゼが用いられ、ミクログリアの精製には密度勾配が用いられました。細胞はフローサイトメトリーで染色し、CD11bおよびCD45染色により生存率と純度を評価しました。その結果、平均生存率は80%、平均純度は95%でした。結論として、マウスミクログリアのマニピュレーションには、高度に精製されたコラゲナーゼによる消化とそれに続く密度勾配が含まれていました。このアプローチは、かなりの脊髄ミクログリア集団を効果的に生み出しました。

概要

脊椎動物の決定的な特徴は脊柱または脊椎であり、脊索は椎骨と呼ばれる一連のセグメント化された骨に置き換えられ、椎間板によって分割されています。この骨質物質の連続は、脊柱管、^脊髄1を囲んで保護する空洞を形作る。げっ歯類属では、脊椎は通常、7つの頸椎、13の胸椎、6つの腰椎、および可変数の尾椎によって形成されます^2,3。脊髄の長さは脊椎の長さに似ており、末端糸は脊髄を仙骨に固定する非神経構造です。さらに、神経線維は椎間孔¹から出ます。

哺乳類における中枢神経系の発達と適切な機能は、ミクログリアと呼ばれる神経系に常在するマクロファージの活性に決定的に依存し^{ています4。}ミクログリアは当初、脳に常在する食細胞として説明されていましたが、最近の研究では、これらの細胞に多くの動的機能が起因しています^5,6。ミクログリアのサイズは、ホメオスタシスにおいて7〜10μmの範囲です。それらは体内で最も用途の広い細胞の一つと考えられており、絶えず変化する環境に形態学的および機能的に適応することができます

プロトコル

この研究は、メキシコの公式規格NOM-062-ZOO-1999および実験動物のケアと使用に関するガイドに従って実施されました。本研究の承認は、メキシコ小児病院の研究・倫理・バイオセーフティ委員会(HIM/2023/006)およびメキシコ総合病院の研究・生命倫理委員会(DI/21/501/04/62)から得られました。生後6〜8週齢の3匹のC57BL/6マウスをメキシコ小児病院から入手し、施設の動物飼育および使用ガイドラインに従って、換気されたラック内で隔離された条件下で飼育しました。

1. 材料・試薬の調製

1. ^Ca2+および^Mg2+遊離PBSおよびハンク平衡塩溶液(HBSS)を37°Cに予熱します。
2. HBSS溶液に100 μg/mLのリベラーゼと4 μg/mLのDNase(HBSS-LD)を添加します。溶液が生理学的pHを7.4に維持していることを確認してください。
   注:脊髄ごとに1mLの作業溶液が必要になります。
3. 密度勾配遠心分離用の等張 90% 溶液(市販品、 材料表を参照)を調製し、37°C に予熱します。
4. 5%熱不活化ウシ胎児血清(FBS)とPBSを組み合わせて染色バッファーを調製し、氷上に保存します。
5. ダルベッコのモディファイドイーグルの中高グルコース(....

結果

マウスの脊髄組織を利用し、コラゲナーゼとサーモリシンを高度に濃縮した混合物を用いて酵素消化を行いました。得られた消化された組織は、未消化物質を除去するために40μmフィルターを通過しました。収集した細胞は、下部に90%、上部に45%のパーコール密度勾配で濃縮しました。次に、界面内のミクログリア濃縮細胞をCD45およびCD11b抗体で染色し、フローサイトメトリー解析を行いました(図1)。

後頭部から仙骨まで伸びる脊柱の解剖は、傍脊椎筋組織の露出および解剖を含む。脊柱を解放するために、肋骨弓を露出させ、それらの測定を椎骨T13からT1まで行った。頭蓋骨と仙骨と関節を結ぶ脊柱が見え、両側に切り込みを入れて完全に解放しました(図2)。

脊髄の抜歯は、椎体への横方向の切開によって達成され、運河を形成した。脊髄の摘出の際、末梢マクロファージの汚染を防ぐために末梢神経を切断しました。続いて、得られた脊髄を解剖台に広げて2m.......

ディスカッション

ミクログリアの研究のために、脳の恒常性におけるミクログリアの重要性から、数多くのプロトコルが開発されてきました。これらの方法では、ミクログリアは典型的には、胎児または新生仔のラットおよびマウスの大脳半球に由来する¹⁷。成体マウスの脊髄からのミクログリアの精製を扱った研究は限られている^13,14。これらの技術には、コラゲナーゼおよび/またはパパインとDNAseを使用した酵素消化が含まれ、多くの場合、PercollまたはOptiPrepを使用したグラジエント分離と組み合わされます。しかし、勾配分離を伴わないパパインベースの脊髄消化を採用すると、軟膜を除去した後でも、アストロサイトの汚染につながる可能性があります^14,17。

この研究は、成体マウス脊髄からミクログリアを精製するためのプロトコルを提示します。従.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
15 mL コレクションチューブ	コーニング、米国	430790
2 mL マイクロチューブ	Axygen、米国	MCT-200-G
2.4G2 抗 FcR	BioLegend、米国	101302
50 mL コレクションチューブ	コーニング、米国	430829
70% エタノール
抗生物質-抗真菌薬 (ペニシリン、ストレプトマイシン、アムホテリシン b)	Gibco, USA	15240062
抗体 CD11b eFluor 450 anti-mouse	eBioscience, USA	48-0112
抗体 CD45 PerCP anti-mouse	BioLegend、米国	103130
平衡塩溶液(PBS)カルシウムマグネシウムフリー	コーニング、米国	46-013-CM
ブルーセルストレーナー40μm	コーニング、米国	352340
Costar 6-well クリア未処理	コーニング、アメリカ	CLS3736
カバースリップ
デジタル暖房 振とう ドライバス	Thermo Scientific Digital HS Drybath, USA	88870001
Dissecting nseps for microsurgery	FT by DUMONT
DNase	Roche, USA	4536282001
Dulbecco´s モディファイドイーグル´中高グルコース(DMEM)	メルク、米国	D6429
電気シェーバー
FACS チューブ	サーモ、米国	352058
ウシ胎児血清 (FBS)	PAN Biotech, Alemania	P30-3306
フローサイトメーター Cytoflex	ベックマン・コールター
・ハンクの平衡塩溶液	メルク、米国	H2387
L-グルタミン	コーニング、米国
Liberase TM	ロシュ、米国	5401119001
ノイバウアーチャンバー 計数室	中国	1103
ペントバルビタール
Percoll	Merck, USA	17089101	密度勾配遠心分離
ポリ-L-リジン溶液	メルク、米国	P8920
メスNo.25	HERGOM, Mexico	H23
Snaplock Microcentrifuge Tubes 2 mL	Axygen, USA	10011-680
立体顕微鏡	Velab, Mexico	HG927831
ストレート手術用ハサミ (10 cm)	HERGOM, Mexico
Straight Vannas はさみ	HERGOM, Mexico
Triton X100	Merck, USA	X100
トリパンブルーステイン 0.4%	Merck, USA	15250-061
Vortex mixer	DLAB, China	8031102000
Zombie Aqua Fixable Viability Kit	BioLegend, USA	423102	アミン反応性蛍光色素染色

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