Summary
미세아교세포는 신체에서 가장 다재다능한 세포 중 하나로 간주되며, 형태학적, 기능적 적응이 가능합니다. 이들의 이질성과 다기능성은 뇌의 항상성을 유지하는 동시에 다양한 신경학적 병리와 관련이 있습니다. 여기에서는 척수 미세아교세포를 정제하는 기술에 대해 설명한다.
Abstract
척추는 척추동물을 정의하고 척수를 둘러싸고 보호하는 구멍인 척추관을 형성합니다. 포유류 중추신경계의 적절한 발달과 기능은 미세아교세포(microglia)로 알려진 상주 대식세포의 활동에 크게 의존합니다. 미세아교세포는 이질성과 다기능성을 나타내어 척수와 뇌 내에서 뚜렷한 유전자 발현과 행동을 가능하게 합니다. 수많은 연구에서 대뇌 미세아교세포의 기능을 탐구하여 정화 방법을 광범위하게 설명했습니다. 그러나 생쥐의 척수에서 미세아교세포를 정제하는 것은 포괄적인 설명이 부족합니다. 대조적으로, 정제되지 않은 추출물과 달리 고도로 정제된 콜라겐분해효소의 활용은 중추 신경계 조직 내에서보고가 부족합니다. 이 연구에서는 8-10주 된 C57BL/6 마우스에서 척추와 척수를 절제했습니다. 후속 분해는 고도로 정제된 콜라겐분해효소를 사용했고, 미세아교세포 정제는 밀도 구배를 이용했습니다. 세포는 유세포 분석을 위해 염색을 거쳐 CD11b 및 CD45 염색을 통해 생존율과 순도를 평가했습니다. 그 결과 평균 생존율은 80%, 평균 순도는 95%였습니다. 결론적으로, 마우스 미세아교세포의 조작은 고도로 정제된 콜라겐분해효소를 사용한 분해와 밀도 구배를 수반했습니다. 이 접근법은 상당한 척수 미세아교세포 개체군을 효과적으로 생산했습니다.
Introduction
척추 동물의 특징은 척추 기둥 또는 척추이며, 척추 뼈는 척추 디스크로 나뉘어 진 척추 뼈라고 불리는 일련의 분절 된 뼈로 대체되었습니다. 이러한 골성 물질의 연속은 척수를 둘러싸고 보호하는 구멍인 척추관(spinal canal)을 형성한다1. Rodentia 속의 척추는 일반적으로 7 개의 경추, 13 개의 흉추, 6 개의 요추 및 다양한 수의 꼬리 척추 2,3에 의해 형성됩니다. 척수의 길이는 척추의 길이와 비슷하며, 말단 종사는 척수를 천골에 고정하는 비신경 구조입니다. 또한, 신경 섬유는 추간공(intervertebral foramen)을 통해 빠져나간다 1.
포유류에서 중추신경계의 발달과 적절한 기능은 미세아교세포(microglia4)라고 불리는 신경계의 상주 대식세포의 활동에 결정적으로 의존한다. 미세아교세포는 처음에 뇌 상주 식세포로 기술되었지만, 최근 연구는 이러한 세포에 많은 동적 기능을 부여했습니다 5,6. 미세아교세포의 크기는 항상성에서 7-10μm입니다. 그들은 신체에서 가장 다재다능한 세포 중 하나로 간주되며 끊임없이 변화하는 환경에 형태학적으로나 기능적으로 적응할 수 있습니다7. 이들 세포는 배아 단계와 성체 단계 모두에서 높은 이질성을 나타내며8,9 성체 단계에서는 시공간 맥락에 따라 복잡한 기능적 이질성을 나타낸다10. 미세아교세포의 이질성과 다양한 기능은 척수와 뇌에서 유전자 발현과 행동을 다르게 합니다. CD11b, CD45, CD86 및 CCR9 발현은 뇌에 비해 척수에서 더 높은 것으로 나타났습니다 8,9.
대뇌 미세아교세포(cerebral microglia) 분리를 위한 여러 프로토콜이 존재한다11,12; 그러나 척수 미세아교세포(spinal cord microglia)에 대해서는 소수만이 존재한다13,14. 척수에서 미세아교세포를 정제하는 방법을 최적화하면 미세아교세포의 생리학을 발견하는 데 중점을 둔 여러 연구의 개발을 촉진할 수 있습니다. 이 프로토콜은 간단하고 재현성이 높은 쥐 척수 추출과 미세아교세포의 정제를 설명하는 것을 목표로 합니다(그림 1).
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Protocol
이 연구는 공식 멕시코 표준 NOM-062-ZOO-1999 및 실험실 동물의 관리 및 사용 가이드에 따라 수행되었습니다. 이 연구에 대한 승인은 멕시코 아동 병원의 연구, 윤리 및 생물 안전 위원회(HIM/2023/006)와 멕시코 종합 병원 에두아르도 리체아가의 연구 및 생명 윤리 위원회(DI/21/501/04/62)로부터 획득되었습니다. 생후 6주에서 8주령의 C57BL/6 마우스 3마리를 멕시코 아동 병원에서 입수하여 기관 동물 관리 및 사용 지침에 따라 환기 랙에서 격리된 조건에서 사육했습니다.
1. 재료 및 시약의 준비
- Ca 2+ 및 Mg2+가 없는 PBS와 Hank의 균형 소금 용액(HBSS)을 37°C로 예열합니다.
- HBSS 용액에 리베라아제 100μg/mL와 DNase(HBSS-LD) 4μg/mL를 보충합니다. 용액이 7.4의 생리학적 pH를 유지하는지 확인하십시오.
참고: 척수당 1mL의 작업 용액이 필요합니다. - 밀도 구배 원심분리를 위한 등장성 90% 용액(상업적으로 이용 가능, 재료 표 참조)을 준비하고 37°C로 예열합니다.
- 5% 열 비활성화 소 태아 혈청(FBS)과 PBS를 결합하여 염색 완충액을 준비하고 혼합물을 얼음 위에 보관합니다.
- Dulbecco's Modified Eagle's Medium-high glucose (1g/L) (DMEM)를 37°C로 예열합니다.
- DMEM 배지에 10% FBS, 2mM L-글루타민, 200U/mL 페니실린, 스트렙토마이신 200μg/mL, 암포테리신 B 500pg/mL( 재료 표 참조)를 보충하여 DMEM-S를 제조합니다.
2. 척수의 해부와 준비
- 펜토바르비탈을 복강내 과다 투여한 쥐를 150mg/kg으로 안락사시킨다. 70% 에탄올을 사용하여 쥐의 흉부와 등을 소독합니다.
알림: 마우스 해부를 진행하기 전에 안락사가 성공했는지 확인하십시오. - 흉요추 부위를 면도하고 접착 테이프를 사용하여 사지를 해부판에 고정합니다.
- 메스를 사용하여 후두부에서 천골 부위까지 등쪽 정중선을 따라 조심스럽게 절개합니다(그림 2).
- 입체 수술 현미경의 도움을 받아 요추에 도달하고 마지막 늑골 아치를 식별할 때까지 층으로 절개합니다.
참고: 13개의 늑골 아치는 흉추에서 관절이 있습니다. 해부하면 L1 척추2보다 우월하게 보입니다. - 마지막 경추와 천골을 결정한 다음 척추를 분리하기 위해 절개합니다(그림 2).
- 해부 겸자를 사용하여 척추뼈의 등쪽 후궁 절제술을 수행하여 척수를 추출합니다(그림 3A-D).
참고: 처음 두 개의 경추(아틀라스 및 축)를 제외하고 모든 가동 가능한 척추는 다양한 영역(경추, 흉추 또는 요추)에서 공통된 형태학적 디자인을 공유합니다. 각각의 전형적인 움직일 수 있는 척추뼈는 앞쪽 끝에 원통형 척추체를 가지고 있습니다. 몸의 뒤쪽에는 척추궁(신경궁)으로 알려진 뼈 아치가 붙어 있으며, 판과 가시 돌기로 구성되어 있습니다. 이 구조들 사이에는 척추공(vertebral foramen)15이 있다. - 말초 신경계를 구성하고 침윤된 대식세포를 포함할 수 있는 구멍(등쪽 및 배쪽 뿌리)을 통해 나오는 신경을 제거합니다(그림 3D).
참고: 밀도 구배 배지가 오염된 성상교세포를 효과적으로 제거하므로 pia mater 또는 수막을 제거할 필요가 없습니다. 또한 수막을 유지하면 정제 시간이 단축되고 생존력이 향상됩니다.
3. 미세아교세포의 조직 소화 및 분리
- 척수를 해부판에 놓고 Vannas 가위를 사용하여 척수를 2mm 조각으로 자르면 평균 10개가 됩니다.
- 척수 절편을 2mL 바닥이 평평한 마이크로튜브로 옮깁니다(그림 3E,F).
- HBSS-LD 작업 용액 1mL를 추가합니다(1.2단계). 37°C에서 25분 동안 배양하고 5분마다 격렬하게 소용돌이칩니다.
- 각 분해액의 내용물을 40μm 스트레이너에 통과시킨 다음 2% FBS가 포함된 HBSS 7mL를 추가하여 분해를 중화합니다.
- 1mL 주사기 플런저를 사용하여 남은 조직을 분쇄합니다. 현탁액을 50mL 코니컬 튜브에 넣고 220 x g, 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
- 1mL 마이크로피펫을 사용하여 상층액을 버리고 15mL 원뿔형 튜브에 2% FBS가 있는 2mL의 HBSS에 펠릿을 재현탁시킵니다. 2mL의 90% 등장 밀도 그래디언트 배지와 결합합니다. 160 x g, 18°C에서 25분 동안 원심분리합니다.
알림: 느린 가속을 사용하고 브레이크를 사용하지 마십시오. - 이송 피펫을 사용하여 인터페이스를 회수하고 15mL 코니컬 튜브로 이송합니다. PBS 10mL로 세포를 세척하고 220 x g, 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
- DMEM-S(1.6단계)에서 세포를 재현탁하고 얼음 위에 보관합니다.
4. 순도/생존력 결정
- 혈구계 챔버를 사용하여 생존 가능한 세포를 정량화하려면 0.4% Trypan blue 염색을 사용합니다( 재료 표 참조).
참고: 평균적으로 마우스 한 대는 4-6백만 개의 세포를 제공합니다. - 유세포 분석기를 통해 생존 가능한 세포를 정량화하려면 시중에서 판매되는 아민 반응성 형광 염료 염색을 사용하십시오( 재료 표 참조).
- 100만 개의 세포를 5mL 폴리스티렌 둥근 바닥(FACS) 튜브에 이식합니다. 형광 염료를 PBS로 1:1000의 비율로 희석합니다(생존력 작업 용액 생성).
- 생존도 용액과 함께 4°C의 어두운 곳에서 30분 동안 샘플을 배양합니다. 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 두 번 씻습니다. 400μL의 염색 완충액에 세포를 재현탁시킵니다(단계 1.4).
- 4°C에서 15분 동안 얼음처럼 차가운 염색 완충액에서 2.4G2 anti-FcRIII/I( 재료 표 참조)로 세포를 차단합니다.
- 형광 표지 단클론 항체 CD45-PerCP 및 CD11b-eFluor 450을 염색 완충액에 첨가하여(1:300 희석) 항체 염색 칵테일을 제형화합니다( 재료 표 참조).
참고: 두 기술을 모두 사용할 수 있지만 후속 프로토콜에 가장 적합한 기술을 선택합니다. - 항체 염색 칵테일과 함께 샘플을 어두운 4°C에서 30분 동안 배양합니다. 얼음처럼 차가운 염색 완충액으로 세포를 두 번 씻습니다. 400μL의 염색 완충액에 세포를 재현탁시킵니다.
- 6단계의 게이팅 전략에 설명된 대로 유세포 분석기에서 250,000개의 이벤트를 수집합니다(그림 4).
5. 면역형광 염색
- 전처리된 커버슬립을 6웰 플레이트의 웰에 넣습니다.
참고: 커버슬립을 처리하려면 500μL의 L-폴리리신(0.01mg/mL, 재료 표 참조) 용액이 있는 페트리 접시에 넣고 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 증류수로 세 번 씻고 말리십시오. - 500μL의 DMEM-S 용액을 사용하여 처리된 커버슬립에 200,000개의 세포를 파종합니다. 24 시간 동안 배양하십시오.
- 커버슬립을 제거하고 실온에서 3.7% 파라포름알데히드(PFA)를 사용하여 20분 동안 셀을 고정합니다. 얼음처럼 차가운 PBS로 커버슬립을 세 번 세탁합니다.
- PBS에서 0.2% Triton X-100으로 실온에서 15분 동안 세포를 투과시킵니다. 그런 다음 차가운 PBS로 커버 슬립을 세 번 씻습니다. 실온에서 1시간 동안 PBS에서 0.2% BSA로 세포를 차단합니다.
- 형광 표지 단클론 항체(1:300 희석, 재료 표 참조)를 차단 용액에 희석하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 얼음처럼 차가운 PBS로 커버슬립을 세 번 세탁합니다.
- DAPI가 들어 있는 장착 매체를 슬라이드에 부착한 다음 커버슬립으로 밀봉합니다.
참고: 슬라이드는 형광 또는 컨포칼 현미경을 사용하여 즉시 분석하거나 -20°C에서 최대 3개월 동안 보관할 수 있습니다.
6. 척수 미세아교세포에 대한 게이팅 전략
- 점도표를 생성하고, 생존도 염색 및 빈 형광 채널(16)에 기초하여 생존 가능한 세포를 분리하기 위한 게이트를 설정한다. 생존할 수 없는 세포를 제외합니다.
- 파편을 제거하기 위해 전방 및 측면 산란 매개변수를 사용하여 다른 플롯을 생성합니다16.
- 추가 점도를 개발하고 CD11b 및 CD45의 발현을 분석하여 미세아교세포를 구별합니다.
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Representative Results
쥐의 척수 조직을 이용하여, 콜라겐분해효소와 써모리진이 고도로 농축된 혼합물을 사용하여 효소 소화를 수행하였다. 그 결과 소화된 조직은 40μm 필터를 통과하여 소화되지 않은 물질을 제거했습니다. 수집된 세포는 퍼콜 밀도 구배를 통해 농축되었으며, 하부는 90%, 상부는 45%였습니다. 그런 다음 계면 내의 미세아교세포가 풍부한 세포를 CD45 및 CD11b 항체로 염색하고 유세포 분석을 실시했습니다(그림 1).
후두부에서 천골까지 뻗어 있는 척추의 해부는 척추 주위 근육의 노출과 해부를 포함합니다. 척추를 풀어주기 위해 늑골 아치를 노출시키고 척추 T13에서 T1까지 측정을 수행했습니다. 두개골 및 천골과 관절을 이루는 척추가 보이기 시작했고, 이를 완전히 해방시키기 위해 양쪽을 절개했습니다(그림 2).
척수의 발치는 척추체에 대한 측면 절개를 통해 이루어 졌으며 운하를 형성했습니다. 척수를 제거하는 동안 말초 대식세포의 오염을 방지하기 위해 말초 신경을 절단했습니다. 이어서, 얻어진 척수를 해부 테이블에 걸쳐 펴고 2mm 조각으로 절단하여 소화액에 첨가하였다(도 3). 척수 소화를 위한 리베라아제의 사용은 성인 쥐 당 4-6백만개의 생존력이 높은 미세아교세포를 산출하는 것으로 처음으로 보고되었습니다. 이 과정을 통해 달성되는 최적의 생존율은 80%에서 99% 사이입니다.
정제 과정을 확인하기 위해 CD45 및 CD11b 항체를 사용하여 미세아교세포의 FACS 염색을 수행했습니다. 정제 공정은 최대 99%의 미세아교세포를 수득하는 효율성을 입증했습니다(그림 4). 또한, 동일한 항체를 사용하여 얻은 미세아교세포에 대해 면역형광 염색을 수행하여 평균 크기가 10μm인 이중 양성 세포를 관찰했으며, 이는 보고된 비활성화 미세아교세포의 크기와 일치합니다. 이는 이러한 세포가 활성화 연구에 적합하다는 것을 시사합니다(그림 4E). 염증 과정 중에 다른 면역 세포가 존재할 수 있거나 미세아교세포가 다른 자극 하에서 형태학적 변화를 겪을 수 있다는 것은 그럴듯합니다. 이러한 경우, 각 세포 집단의 식별을 위해 특정 마커를 통합하는 것이 좋습니다.
그림 1: 척수 미세아교세포 정제 프로토콜의 개략도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 척수 절제 절차. 안락사 후, 쥐의 척추를 분리하고 절개했다. (A) 후두부에서 꼬리 부위까지 이어지는 단계적 피부 절개로 척추 주위 근육 조직을 드러냅니다. (B) 척추 주위 근육 층을 통한 순차적 해부. (C) 갈비뼈 절단 후 척추 제거. (D) 척추관 내 온전한 척수의 시각화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 척수 적출 및 소화 과정 . (A) 약 2mm의 절개 2개를 포함하는 순차적 척추 후궁 절제술. (B) 노출된 척수. (C) 척수 제거. (D) 말초 신경 절제술. (E) 척수를 2mm 절편으로 나누어 소화 배지에 넣었다. (F) 조직 분해를 위한 표준 37°C 배양. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 세포 순도 및 생존력 평가. 미세아교세포 특이적 마커를 사용한 정제된 세포의 면역염색. (A) 살아있는 세포(형광 염료 음성 세포)의 식별. (B) 셀 크기 기반 선택. (C) CD45low 및 CD11b+ 세포, 99% 이상의 순도를 보여줍니다. (D) 평균 생존도(87.46 ± SD 1.468) 및 평균 순도(88.51 ± SD 3.948; n = 5). (E) 정제된 세포에서 CD45+ 및 CD11b+ 염색을 묘사하는 면역형광. 이미지는 60x 배율(눈금 막대 = 5μm)에서 백색광 레이저가 있는 컨포칼 현미경을 사용하여 캡처되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
뇌 항상성에서의 중요성 때문에 미세아교세포 연구를 위해 수많은 프로토콜이 개발되었습니다. 이러한 방법에서, 미세아교세포는 전형적으로 배아 또는 신생아 쥐 및 마우스의 대뇌 반구에서 공급된다17. 제한된 수의 연구가 성체 마우스의 척수에서 미세아교세포의 정제를 다루었다13,14. 이러한 기술에는 DNAse와 함께 콜라겐분해효소 및/또는 파파인을 사용한 효소 분해가 포함되며, 종종 Percoll 또는 OptiPrep을 사용한 그래디언트 분리와 결합됩니다. 그러나, 그래디언트 분리 없이 파파인 기반 척수 소화를 사용하면 pia mater14,17을 제거한 후에도 성상교세포 오염이 발생할 수 있습니다.
이 연구는 성체 쥐 척수에서 미세아교세포를 정제하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 콜라겐분해효소 I과 II의 정밀한 혼합물을 사용하며, 템모리진은 분해가 제어된 다양한 조직을 효율적으로 소화하는 것으로 알려져 있으며,18 따라서 중성 프로테아제의 함량이 낮아 세포사멸을 감소시킨다. 종종 성상교세포 오염의 원인인 수막(meninges) 또는 피아 마터(pia mater)는 이 절차에서 Percoll 그래디언트를 사용하여 제거할 수 있으므로 이러한 층을 제거할 필요가 없습니다(그림 1).
미세아교세포의 이질성(microglial heterogeneity)은 척수와 뇌의 뚜렷한 형태에서 발생한다8. 그러나 이 프로토콜은 유사한 결과(데이터 제시되지 않음)를 가진 대뇌 반구에도 적용되어 척수와 대뇌 미세아교세포를 모두 분석하기 위한 견고성을 강조했습니다.
높은 수준의 순도(80%에서 99%에 이르는 범위)와 생존력(85%에서 98%에 이르기까지)은 이 프로토콜로 일관되게 달성할 수 있습니다. 신경계에서 세포를 처리하는 것은 주로 세포 생존력이 처리 기간에 의해 실질적으로 영향을 받기 때문에 복잡합니다. 20분을 초과하는 저산소증은 치명적일 수 있습니다. 최적의 생존을 위해 척수 추출에서 소화까지의 처리 시간을 10분 이하로 제한하는 것이 좋습니다. 이 설명은 8 내지 10주 된 건강한 마우스에 맞춰져 있으며, 더 어리거나 나이가 많은 마우스에 대한 추가 표준화가 필요합니다. 차선의 생존력은 조직의 과잉 소화를 의미하며, 반복을 요구합니다. 또는 FACS 분류를 통해 과도하게 분해된 샘플에서 세포를 회수할 수 있습니다.
척수 미세아교세포를 소화하고 정화하기 위한 리라아제의 적용은 참신합니다. 신경계 조직에 있는 그것의 한정된 사용법은 역사적으로 생존 가능성 도전때문이었다 18,19. 그러나 이 연구는 이 꼼꼼하게 정제된 콜라겐 분해 효소를 사용할 때 생존력이 높아진다는 것을 보여줍니다. 양자택일로, 더 낮은 효능을 가진 다른 collagenases는 탐구될 수 있었습니다.
신경 염증의 존재, 혈액-뇌 장벽 손상 및 마우스 나이와 같은 몇 가지 중요한 고려 사항을 인정해야 합니다. 이러한 요인은 미세아교세포의 형태와 빈도를 모두 변화시킵니다. 신경염증 또는 혈액뇌장벽 파괴의 경우, CD45 및 CD11b를 발현하는 면역세포가 침투하여 미세아교세포의 순도를 감소시킬 수 있습니다. 미세아교세포는 다양한 신경염증성 질환에서 광범위하게 연구되기 때문에 이 프로토콜은 병리학 및 신경생리학적 조사를 위한 잠재력을 가지고 있습니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 702361(National Council of Science and Technology)에서 수여하는 장학금의 지원으로 이루어졌습니다. 저자는 국립 폴리테크닉 연구소(National Polytechnic Institute)의 국립 생물 과학 학교(National School of Biological Sciences)의 생물 화학 과학 박사 과정을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL collection tubes | Corning, USA | 430790 | |
| 2 mL microtubes | Axygen, USA | MCT-200-G | |
| 2.4G2 anti-FcR | BioLegend, USA | 101302 | |
| 50 mL collection tubes | Corning, USA | 430829 | |
| 70% ethanol | |||
| Antibiotic-Antimycotic (penicillin, streptomycin, amphotericin b) | Gibco, USA | 15240062 | |
| Antibody CD11b eFluor 450 anti-mouse | eBioscience, USA | 48-0112 | |
| Antibody CD45 PerCP anti-mouse | BioLegend, USA | 103130 | |
| Balanced salt solution (PBS) calcium- magnesium-free | Corning, USA | 46-013-CM | |
| Blue Cell Strainer 40 μm | Corning, USA | 352340 | |
| Costar 6-well Clear Not Treated | Corning, USA | CLS3736 | |
| Coverslips | |||
| Digital Heating Shaking Drybath | Thermo Scientific Digital HS Drybath, USA | 88870001 | |
| Dissecting forceps for microsurgery | FT by DUMONT | ||
| DNase | Roche, USA | 4536282001 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium-high glucose (DMEM) | Merck, USA | D6429 | |
| Electric shaver | |||
| FACS tube | Thermo, USA | 352058 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAN Biotech, Alemania | P30-3306 | |
| Flow cytometer Cytoflex | Beckman Coulter | ||
| Hank’s balanced salt solution | Merck, USA | H2387 | |
| L-glutamine | Corning, USA | 15393631 | |
| Liberase TM | Roche, USA | 5401119001 | |
| Neubauer chamber Counting Chambers | China | 1103 | |
| Pentobarbital | |||
| Percoll | Merck, USA | 17089101 | density gradient centrifugation |
| Poly-L-lysine solution | Merck, USA | P8920 | |
| Scalpel No. 25 | HERGOM, Mexico | H23 | |
| Snaplock Microcentrifuge Tubes 2 mL | Axygen, USA | 10011-680 | |
| Stereoscopic microscope | Velab, Mexico | HG927831 | |
| Straight surgical scissors (10 cm) | HERGOM, Mexico | ||
| Straight Vannas scissors | HERGOM, Mexico | ||
| Triton X100 | Merck, USA | X100 | |
| Trypan blue Stain 0.4% | Merck, USA | 15250-061 | |
| Vortex mixer | DLAB, China | 8031102000 | |
| Zombie Aqua Fixable Viability Kit | BioLegend, USA | 423102 | amine-reactive fluorescent dye staining |
References
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