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Neuroscience

माउस स्पाइनल कॉर्ड माइक्रोग्लिया का तेजी से और कुशल संवर्धन

Published: September 22, 2023 doi: 10.3791/65961
Automatic Translation
1,2, 2, 3, 4, 5, 1
1Epidemiology, Endocrinology & Nutrition, Mexico Children's Hospital, 2Pharmacy Department, National School of Biological Sciences, National Polytechnic Institute, 3Graduate Department, Dr. Eduardo Liceaga General Hospital of Mexico, 4Pain Clinic and Palliative Care, Dr. Eduardo Liceaga General Hospital of Mexico, 5General Surgery Service, Metropolitan Angeles Hospital

Summary

माइक्रोग्लिया को शरीर में सबसे बहुमुखी कोशिकाओं में से कुछ माना जाता है, जो रूपात्मक और कार्यात्मक अनुकूलन में सक्षम हैं। उनकी विषमता और बहुक्रियाशीलता मस्तिष्क होमियोस्टेसिस के रखरखाव को सक्षम करती है, जबकि विभिन्न न्यूरोलॉजिकल विकृति से भी जुड़ी हुई है। यहां, रीढ़ की हड्डी के माइक्रोग्लिया को शुद्ध करने की एक तकनीक का वर्णन किया गया है।

Abstract

कशेरुक स्तंभ एक कशेरुक को परिभाषित करता है और रीढ़ की हड्डी को आकार देता है, एक गुहा जो रीढ़ की हड्डी को घेरती है और उसकी सुरक्षा करती है। स्तनधारी केंद्रीय तंत्रिका तंत्र का उचित विकास और कार्य माइक्रोग्लिया नामक निवासी मैक्रोफेज की गतिविधि पर काफी निर्भर करता है। माइक्रोग्लिया विषमता और बहुक्रियाशीलता प्रदर्शित करता है, जो रीढ़ की हड्डी और मस्तिष्क के भीतर विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति और व्यवहार को सक्षम करता है। कई अध्ययनों ने सेरेब्रल माइक्रोग्लिया फ़ंक्शन का पता लगाया है, जिसमें बड़े पैमाने पर शुद्धिकरण विधियों का विवरण दिया गया है। हालांकि, चूहों में रीढ़ की हड्डी से माइक्रोग्लिया की शुद्धि में व्यापक विवरण का अभाव है। इसके विपरीत, एक अपरिष्कृत अर्क के विपरीत एक अत्यधिक शुद्ध कोलेजनेज का उपयोग, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के ऊतकों के भीतर रिपोर्टिंग का अभाव है। इस अध्ययन में, कशेरुक स्तंभ और रीढ़ की हड्डी को 8-10 सप्ताह पुराने C57BL/6 चूहों से निकाला गया था। बाद के पाचन ने एक अत्यधिक शुद्ध कोलेजनेज को नियोजित किया, और माइक्रोग्लिया शुद्धि ने घनत्व ढाल का उपयोग किया। कोशिकाओं को प्रवाह साइटोमेट्री के लिए धुंधला हो जाना, सीडी 11 बी और सीडी 45 धुंधला के माध्यम से व्यवहार्यता और शुद्धता का आकलन करना। परिणामों से 80% की औसत व्यवहार्यता और 95% की औसत शुद्धता प्राप्त हुई। अंत में, माउस माइक्रोग्लिया के हेरफेर में अत्यधिक शुद्ध कोलेजनेज के साथ पाचन शामिल था, इसके बाद घनत्व ढाल था। इस दृष्टिकोण ने प्रभावी रूप से पर्याप्त रीढ़ की हड्डी माइक्रोग्लिया आबादी का उत्पादन किया।

Introduction

कशेरुकियों की परिभाषित विशेषता कशेरुक स्तंभ या रीढ़ है, जिसमें नोटोकॉर्ड को खंडित हड्डियों के अनुक्रम द्वारा प्रतिस्थापित किया गया है जिसे कशेरुक कहा जाता है, जो इंटरवर्टेब्रल डिस्क द्वारा विभाजित होता है। अस्थि सामग्री का यह उत्तराधिकार रीढ़ की हड्डी की नहर को आकार देता है, एक गुहा जो रीढ़ की हड्डी को घेरती है और उसकी रक्षा करती है1. जीनस रोडेंटिया में, रीढ़ आमतौर पर सात ग्रीवा कशेरुक, तेरह वक्षीय कशेरुक, छह काठ का कशेरुक, और दुम कशेरुक 2,3 की एक चर संख्या द्वारा बनाई जाती है। रीढ़ की हड्डी की लंबाई रीढ़ की हड्डी के समान होती है, और टर्मिनल फिलम एक गैर-तंत्रिका संरचना होती है जो रीढ़ की हड्डी को त्रिकास्थि तक पहुंचाती है। इसके अतिरिक्त, तंत्रिका तंतु इंटरवर्टेब्रल फोरामेन1 के माध्यम से बाहर निकलते हैं।

स्तनधारियों में केंद्रीय तंत्रिका तंत्र का विकास और उचित कार्य गंभीर रूप से तंत्रिका तंत्र के निवासी मैक्रोफेज की गतिविधि पर निर्भर करता है, जिसे माइक्रोग्लिया4 कहा जाता है। हालांकि माइक्रोग्लिया को शुरू में मस्तिष्क निवासी फागोसाइट्स के रूप में वर्णित किया गया था, हाल के शोध ने इन कोशिकाओंको कई गतिशील कार्यों के लिए जिम्मेदार ठहराया है 5,6. माइक्रोग्लिया का आकार होमियोस्टेसिस में 7 से 10 माइक्रोन तक होता है; वे शरीर में सबसे बहुमुखी कोशिकाओं के बीच माना जाता है और उनके लगातारबदलते वातावरण 7 करने के लिए रूपात्मक और कार्यात्मक अनुकूलन कर सकते हैं. इन कोशिकाओं दोनों भ्रूण और वयस्क चरणों8,9 के दौरान उच्च विषमता का प्रदर्शन, जबकि वयस्क चरण में, वे भी उनके spatiotemporal संदर्भ10 के आधार पर जटिल कार्यात्मक विषमता प्रदर्शित. माइक्रोग्लिया की विषमता और कई कार्य रीढ़ की हड्डी और मस्तिष्क में अंतर जीन अभिव्यक्ति और व्यवहार की अनुमति देते हैं। यह दिखाया गया है कि CD11b, CD45, CD86, और CCR9 अभिव्यक्ति मस्तिष्क 8,9 की तुलना में रीढ़ की हड्डी में अधिक है.

एकाधिक प्रोटोकॉल मस्तिष्क microglia अलगाव11,12 के लिए मौजूद; हालांकि, रीढ़ की हड्डी माइक्रोग्लिया13,14 के लिए केवल कुछ ही मौजूद हैं। रीढ़ की हड्डी से माइक्रोग्लिया को शुद्ध करने के लिए एक विधि का अनुकूलन माइक्रोग्लिया फिजियोलॉजी की खोज पर केंद्रित कई अध्ययनों के विकास की सुविधा प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल माउस रीढ़ की हड्डी का एक सरल और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य निष्कर्षण और माइक्रोग्लिया(चित्रा 1)की शुद्धि का वर्णन करना है.

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Protocol

अध्ययन आधिकारिक मैक्सिकन मानक NOM-062-ZOO-1999 और प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड के अनुसार आयोजित किया गया था। अध्ययन के लिए स्वीकृति मेक्सिको चिल्ड्रन हॉस्पिटल (HIM/2023/006) की अनुसंधान, नैतिकता और जैव सुरक्षा समितियों और मेक्सिको एडुआर्डो लिसेगा के जनरल अस्पताल की अनुसंधान और बायोएथिक्स समिति (DI/21/501/04/62) से प्राप्त की गई थी। मेक्सिको चिल्ड्रन हॉस्पिटल से 6 से 8 सप्ताह की आयु के तीन C57BL/6 चूहों को प्राप्त किया गया था, जहां उन्हें संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग दिशानिर्देशों के अनुपालन में हवादार रैक में अलग-अलग परिस्थितियों में उठाया गया था।

1. सामग्री और अभिकर्मकों की तैयारी

  1. पूर्व गर्म सीए 2 + और मिलीग्राम2 + मुक्त पीबीएस के साथ ही हांक के संतुलित नमक समाधान (HBSS) 37 डिग्री सेल्सियस करने के लिए.
  2. HBSS समाधान को लिब्रेज़ के 100 μg/mL और DNase (HBSS-LD) के 4 μg/mL के साथ पूरक करें। सुनिश्चित करें कि समाधान 7.4 के शारीरिक पीएच को बनाए रखता है।
    नोट: रीढ़ की हड्डी प्रति काम समाधान के 1 एमएल आवश्यक होगा।
  3. घनत्व ढाल centrifugation (व्यावसायिक रूप से उपलब्ध, सामग्री की तालिकादेखें) के लिए एक isotonic 90% समाधान तैयार करें और यह 37 डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व वार्म.
  4. पीबीएस के साथ 5% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के संयोजन से धुंधला बफर तैयार करें, और बर्फ पर मिश्रण की दुकान.
  5. प्री-वार्म Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम-उच्च ग्लूकोज (1g/L) (DMEM) से 37 डिग्री सेल्सियस।
  6. डीएमईएम-एस तैयार करने के लिए 10% एफबीएस, 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन, 200 यू/एमएल पेनिसिलिन, स्ट्रेप्टोमाइसिन के 200 माइक्रोग्राम/एमएल, और एम्फोटेरिसिन बी के 500 पीजी/एमएल ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ डीएमईएम माध्यम को पूरक करें।

2. रीढ़ की हड्डी का विच्छेदन और तैयारी

  1. 150 मिलीग्राम / किग्रा की खुराक पर पेंटोबार्बिटल के इंट्रापेरिटोनियल ओवरडोज के साथ माउस को इच्छामृत्यु दें। माउस के वक्ष और वापस 70% इथेनॉल का उपयोग बाँझ.
    नोट: माउस विच्छेदन के साथ आगे बढ़ने से पहले इच्छामृत्यु की पुष्टि सफल रहा।
  2. थोरैकोलम्बर क्षेत्र को दाढ़ी दें और चिपकने वाली टेप का उपयोग करके विच्छेदन बोर्ड को छोरों को सुरक्षित करें।
  3. एक स्केलपेल का प्रयोग, पश्चकपाल से त्रिक क्षेत्र (चित्रा 2) के लिए पृष्ठीय midline के साथ एक सावधान चीरा बनाने.
  4. एक त्रिविम सर्जिकल माइक्रोस्कोप की सहायता से, काठ का रीढ़ तक पहुंचने और अंतिम कॉस्टल आर्क की पहचान करने तक परतों में विच्छेदन करें।
    नोट: 13 कॉस्टल मेहराब वक्षीय कशेरुकाओं में व्यक्त किए गए हैं; जब विच्छेदित किया जाता है, तो वे L1 कशेरुका2 से बेहतर दिखाई देते हैं।
  5. अंतिम ग्रीवा कशेरुका और त्रिकास्थि का निर्धारण करें, फिर रीढ़ (चित्रा 2) को अलग करने के लिए एक कट बनाएं।
  6. विदारक संदंश का उपयोग, रीढ़ की हड्डी (चित्रा 3 ए डी) निकालने के लिए कशेरुकाओं के एक पृष्ठीय लैमिनेक्टॉमी प्रदर्शन.
    नोट: पहले दो ग्रीवा कशेरुकाओं (एटलस और अक्ष) को छोड़कर, सभी जंगम कशेरुक विभिन्न क्षेत्रों (ग्रीवा, वक्ष, या काठ) में एक सामान्य रूपात्मक डिजाइन साझा करते हैं। प्रत्येक विशिष्ट जंगम कशेरुका में इसके पूर्वकाल के अंत में एक बेलनाकार कशेरुक शरीर होता है। शरीर के पीछे से जुड़ा एक बोनी आर्क है जिसे कशेरुक चाप (तंत्रिका चाप) के रूप में जाना जाता है, जिसमें लैमिना और स्पिनस प्रक्रियाएं शामिल हैं। इन संरचनाओं के बीच कशेरुक फोरामेन15 निहित है।
  7. फोरामिना (पृष्ठीय और उदर जड़ों) के माध्यम से उभरने वाली नसों को हटा दें जो परिधीय तंत्रिका तंत्र का गठन करते हैं और इसमें घुसपैठ मैक्रोफेज(चित्रा 3डी)शामिल हो सकते हैं।
    नोट: पिया मेटर या मेनिन्जेस को हटाने के लिए अनावश्यक है क्योंकि घनत्व ढाल माध्यम प्रभावी रूप से दूषित एस्ट्रोसाइट्स को समाप्त करता है। इसके अतिरिक्त, मेनिन्जेस को बनाए रखने से शुद्धिकरण का समय कम हो जाता है और व्यवहार्यता बढ़ जाती है।

3. ऊतक पाचन और माइक्रोग्लिया का अलगाव

  1. रीढ़ की हड्डी को विदारक बोर्ड पर रखें, और वन्नास कैंची का उपयोग करके, रीढ़ की हड्डी को 2 मिमी टुकड़ों में काट लें, जिससे औसतन 10 टुकड़े हो सकें।
  2. रीढ़ की हड्डी के वर्गों को 2 एमएल फ्लैट-नीचे माइक्रोट्यूब (चित्रा 3ई, एफ) में स्थानांतरित करें।
  3. HBSS-LD काम कर रहे समाधान (चरण 1.2) के 1 एमएल जोड़ें. 25 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं, सख्ती हर 5 मिनट भंवर.
  4. एक 40 माइक्रोन झरनी के माध्यम से प्रत्येक पाचन की सामग्री को पास करें, और फिर पाचन को बेअसर करने के लिए 2% एफबीएस के साथ एचबीएसएस के 7 एमएल जोड़ें।
  5. एक 1 एमएल सिरिंज सवार का उपयोग कर शेष ऊतक क्रश. 220 x ग्राम, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में निलंबन को अपकेंद्रित्र करें।
  6. एक 1 एमएल माइक्रोपिपेट का उपयोग सतह पर तैरनेवाला त्यागें, और एक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 2% एफबीएस के साथ एचबीएसएस के 2 एमएल में गोली फिर से निलंबित करें। 90% आइसोटोनिक घनत्व ढाल माध्यम के 2 एमएल के साथ मिलाएं। 160 x ग्राम, 18 डिग्री सेल्सियस पर 25 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
    नोट: धीमी गति से त्वरण का उपयोग करें और ब्रेक का उपयोग करने से बचें।
  7. इंटरफ़ेस को पुनः प्राप्त करने और इसे 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए एक स्थानांतरण विंदुक का उपयोग करें। पीबीएस के 10 एमएल और 220 x ग्राम, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए अपकेंद्रित्र के साथ कोशिकाओं को धो लें।
  8. DMEM-एस (1.6 कदम) में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और उन्हें बर्फ पर संग्रहीत रखें.

4. शुद्धता/व्यवहार्यता का निर्धारण

  1. एक हेमोसाइटोमीटर कक्ष का उपयोग कर व्यवहार्य कोशिकाओं यों के लिए, एक 0.4% trypan नीले दाग रोजगार ( सामग्री की तालिकादेखें).
    नोट: औसतन, एक माउस 4-6 मिलियन कोशिकाएं प्रदान करता है।
  2. एक प्रवाह साइटोमीटर के माध्यम से व्यवहार्य कोशिकाओं की मात्रा निर्धारित करने के लिए, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अमाइन-प्रतिक्रियाशील फ्लोरोसेंट डाई धुंधला ( सामग्री की तालिकादेखें) को नियोजित करें।
    1. 1 मिलियन कोशिकाओं को 5 एमएल पॉलीस्टायर्न राउंड-बॉटम (एफएसीएस) ट्यूब में स्थानांतरित करें। 1:1000 के अनुपात में पीबीएस के साथ फ्लोरोसेंट डाई को पतला करें (व्यवहार्यता कार्य समाधान बनाना)।
    2. 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में व्यवहार्यता समाधान के साथ नमूने सेते हैं. कोशिकाओं को बर्फ-ठंडे पीबीएस से दो बार धोएं। धुंधला बफर (चरण 1.4) के 400 माइक्रोन में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए बर्फ ठंड धुंधला बफर में 2.4G2 विरोधी FcRIII/मैं ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ कोशिकाओं को ब्लॉक.
    4. फ्लोरोसेंट-लेबल मोनोक्लोनल एंटीबॉडी CD45-PerCP और CD11b-eFluor 450 को धुंधला बफर में जोड़कर एंटीबॉडी धुंधला कॉकटेल तैयार करें (1:300 के कमजोर पड़ने पर) ( सामग्री की तालिकादेखें)।
      नोट: जबकि दोनों तकनीकें उपलब्ध हैं, वह चुनें जो बाद के प्रोटोकॉल के साथ सबसे अच्छा संरेखित हो।
    5. 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में एंटीबॉडी धुंधला कॉकटेल के साथ नमूने सेते हैं. कोशिकाओं को बर्फ-ठंडा धुंधला बफर के साथ दो बार धोएं। धुंधला बफर के 400 माइक्रोन में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
    6. एक प्रवाह साइटोमीटर पर 250,000 घटनाओं का अधिग्रहण करें, जैसा कि चरण 6 (चित्रा 4) में गेटिंग रणनीति द्वारा उल्लिखित है।

5. इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला हो जाना

  1. एक 6 अच्छी तरह से थाली के एक कुएं में एक इलाज coverslip प्लेस.
    नोट: कवरस्लिप का इलाज करने के लिए, उन्हें एल-पॉलीसिलिसिन (0.01 मिलीग्राम/एमएल, सामग्री की तालिकादेखें) समाधान के 500 माइक्रोन के साथ पेट्री डिश में रखें और 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। बाद में, उन्हें आसुत जल से तीन बार धो लें और उन्हें सूखने दें।
  2. डीएमईएम-एस समाधान के 500 माइक्रोन का उपयोग करके उपचारित कवरस्लिप पर बीज 200,000 कोशिकाएं। 24 घंटे के लिए सेते हैं।
  3. coverslips निकालें और कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए 3.7% paraformaldehyde (पीएफए) का उपयोग कर कोशिकाओं को ठीक. बर्फ ठंडा पीबीएस के साथ coverslips तीन बार धो लें.
  4. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए पीबीएस में 0.2% ट्राइटन एक्स -100 के साथ कोशिकाओं permeabilize. इसके बाद, ठंड पीबीएस के साथ कवरस्लिप को तीन बार धो लें। कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए पीबीएस में 0.2% बीएसए के साथ कोशिकाओं को ब्लॉक करें।
  5. अवरुद्ध समाधान में प्रतिदीप्ति लेबल मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (1:300 कमजोर पड़ने पर, सामग्री की तालिका देखें) को पतला करें और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। बर्फ ठंडा पीबीएस के साथ coverslips तीन बार धो लें.
  6. स्लाइड पर DAPI युक्त बढ़ते माध्यम लागू करें, और फिर इसे एक कवरस्लिप के साथ सील करें।
    नोट: स्लाइड्स तुरंत एक प्रतिदीप्ति या confocal खुर्दबीन का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है, या वे -20 डिग्री सेल्सियस पर 3 महीने के लिए के लिए संग्रहीत किया जा सकता है.

6. रीढ़ की हड्डी माइक्रोग्लिया के लिए गेटिंग रणनीति

  1. एक डॉट साजिश उत्पन्न और व्यवहार्यता धुंधला और एक खाली फ्लोरोसेंट चैनल16 के आधार पर व्यवहार्य कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक गेट की स्थापना. गैर-व्यवहार्य कोशिकाओं को छोड़ दें।
  2. मलबे16 को खत्म करने के लिए आगे और पक्ष तितर बितर मापदंडों का उपयोग कर एक और साजिश का उत्पादन.
  3. एक अतिरिक्त डॉट प्लॉट विकसित करें और माइक्रोग्लिया को अलग करने के लिए सीडी 11 बी और सीडी 45 की अभिव्यक्ति का विश्लेषण करें।

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Representative Results

माउस रीढ़ की हड्डी के ऊतकों का उपयोग, एंजाइमी पाचन एक अत्यधिक collagenase और thermolysin के साथ समृद्ध मिश्रण का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया था. परिणामस्वरूप पचा ऊतक अपचित सामग्री को खत्म करने के लिए 40 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से पारित हुआ। एकत्रित कोशिकाओं को एक पेर्कोल घनत्व ढाल के माध्यम से समृद्ध किया गया था, जिसमें निचले हिस्से में 90% और ऊपरी हिस्से में 45% था। इंटरफ़ेस के भीतर माइक्रोग्लिया-समृद्ध कोशिकाओं को तब सीडी 45 और सीडी 11 बी एंटीबॉडी के साथ दाग दिया गया था और प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण(चित्रा 1)के अधीन किया गया था।

पश्चकपाल क्षेत्र से त्रिकास्थि तक फैले कशेरुक स्तंभ के विच्छेदन में पैरावर्टेब्रल मांसलता का जोखिम और विच्छेदन शामिल है। कशेरुक स्तंभ को छोड़ने के लिए, कॉस्टल मेहराब को उजागर किया गया था, और उनका माप कशेरुका टी 13 से टी 1 तक किया गया था। कशेरुक स्तंभ, खोपड़ी और त्रिकास्थि के साथ articulating, दिखाई दे रहा है, और एक कटौती प्रत्येक पक्ष पर निष्पादित किया गया था यह पूरी तरह से मुक्त करने के लिए (चित्रा 2).

रीढ़ की हड्डी का निष्कर्षण कशेरुक निकायों में एक पार्श्व चीरा के माध्यम से प्राप्त किया गया था, जिससे एक नहर बन गई। रीढ़ की हड्डी को हटाने के दौरान, परिधीय मैक्रोफेज से संदूषण को रोकने के लिए परिधीय नसों को अलग कर दिया गया था। इसके बाद, प्राप्त रीढ़ की हड्डी विच्छेदन तालिका भर में फैल गया था और 2 मिमी टुकड़े, जो पाचन समाधान(चित्रा 3)में जोड़ा गया में खंडित किया गया था. रीढ़ की हड्डी के पाचन के लिए लिब्रेज़ का उपयोग पहली बार रिपोर्ट किया गया है, जिससे प्रति वयस्क माउस 4 से 6 मिलियन अत्यधिक व्यवहार्य माइक्रोग्लियल कोशिकाएं पैदा होती हैं। इस प्रक्रिया के माध्यम से प्राप्त इष्टतम व्यवहार्यता 80% से 99% तक होती है।

शुद्धिकरण प्रक्रिया की पुष्टि करने के लिए, सीडी 45 और सीडी 11 बी एंटीबॉडी का उपयोग करके माइक्रोग्लिया का एफएसीएस धुंधला हो जाना था। शुद्धिकरण प्रक्रिया ने दक्षता का प्रदर्शन किया, 99% माइक्रोग्लियल कोशिकाओं (चित्रा 4) तक उपज। इसके अलावा, इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला एक ही एंटीबॉडी का उपयोग करके प्राप्त माइक्रोग्लिया पर आयोजित किया गया था, 10 माइक्रोन के औसत आकार के साथ डबल-पॉजिटिव कोशिकाओं का अवलोकन - गैर-सक्रिय माइक्रोग्लिया के रिपोर्ट किए गए आकार के अनुरूप। इससे पता चलता है कि ये कोशिकाएं सक्रियण अध्ययन(चित्रा 4ई)के लिए उपयुक्त हैं। यह प्रशंसनीय है कि भड़काऊ प्रक्रियाओं के दौरान अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाएं मौजूद हो सकती हैं या माइक्रोग्लिया विभिन्न उत्तेजनाओं के तहत रूपात्मक परिवर्तनों से गुजर सकती हैं। ऐसे मामलों में, प्रत्येक सेल आबादी की पहचान के लिए विशिष्ट मार्करों को शामिल करने की सिफारिश की जाती है।

Figure 1
चित्रा 1: रीढ़ की हड्डी माइक्रोग्लिया शुद्धि प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध अवलोकन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: रीढ़ की हड्डी विच्छेदन प्रक्रिया। इच्छामृत्यु के बाद, माउस के रीढ़ की हड्डी के स्तंभ को अलग और विच्छेदित किया गया था। (ए) ओसीसीपटल से दुम क्षेत्रों तक फैली चरणबद्ध त्वचा विच्छेदन, पैरा-कशेरुक मांसलता का खुलासा। (बी) पैरावर्टेब्रल मांसपेशियों की परतों के माध्यम से अनुक्रमिक विच्छेदन। (सी) पसली काटने के बाद रीढ़ को हटाना। (डी) कशेरुक नहर के भीतर एक बरकरार रीढ़ की हड्डी का दृश्य। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: रीढ़ की हड्डी निष्कर्षण और पाचन प्रक्रिया। (ए) अनुक्रमिक रीढ़ की हड्डी में लैमिनेक्टॉमी जिसमें दो लगभग 2 मिमी कटौती शामिल हैं। (बी) उजागर रीढ़ की हड्डी। (सी) रीढ़ की हड्डी को हटाने। (डी) परिधीय तंत्रिका सेक्शनिंग। (ई) रीढ़ की हड्डी को 2 मिमी वर्गों में विभाजित किया गया था और पाचन माध्यम में रखा गया था। (एफ) ऊतक पाचन के लिए मानक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेशन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: सेल शुद्धता और व्यवहार्यता का आकलन। "माइक्रोग्लिया-विशिष्ट मार्करों का उपयोग करके शुद्ध कोशिकाओं की इम्यूनोस्टेनिंग"। (ए) जीवित कोशिकाओं (फ्लोरोसेंट डाई-नकारात्मक कोशिकाओं) की पहचान। (बी) सेल आकार-आधारित चयन। (सी) सीडी 45 लो और सीडी 11 बी + सेल, 99% से अधिक शुद्धता का प्रदर्शन करते हैं। (डी) औसत व्यवहार्यता (एसडी 1.468 ± 87.46) और औसत शुद्धता (एसडी 3.948 ± 88.51; एन = 5)। (ई) शुद्ध कोशिकाओं में सीडी 45 + और सीडी 11 बी + धुंधला का चित्रण इम्यूनोफ्लोरेसेंस। छवियाँ 60x बढ़ाई (पैमाने पट्टी = 5 माइक्रोन) पर एक सफेद प्रकाश लेजर के साथ एक confocal खुर्दबीन का उपयोग कर कब्जा कर लिया गया. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

मस्तिष्क होमियोस्टेसिस में उनके महत्व के कारण माइक्रोग्लिया के अध्ययन के लिए कई प्रोटोकॉल विकसित किए गए हैं। इन तरीकों में, माइक्रोग्लिया आमतौर पर भ्रूण या नवजात चूहों औरचूहों 17 के मस्तिष्क गोलार्द्धों से sourced हैं. अध्ययन की एक सीमित संख्या वयस्क चूहों13,14 की रीढ़ की हड्डी से माइक्रोग्लिया की शुद्धि को संबोधित किया है. इन तकनीकों में डीएनए के साथ कोलेजनेज और / या पपैन का उपयोग करके एंजाइमेटिक पाचन शामिल होता है, जिसे अक्सर पेर्कोल या ऑप्टिप्रेप का उपयोग करके ढाल पृथक्करण के साथ जोड़ा जाता है। हालांकि, ढाल जुदाई के बिना पपैन आधारित रीढ़ की हड्डी पाचन को रोजगार एस्ट्रोसाइट संदूषण के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, यहां तक कि पिया मेटर14,17 को हटाने के बाद भी.

यह अध्ययन वयस्क माउस रीढ़ की हड्डी से माइक्रोग्लिया को शुद्ध करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। प्रोटोकॉल थर्मोलिसिन के साथ कोलेजन I और II के सटीक मिश्रण का उपयोग करता है, एक संयोजन जो नियंत्रित गिरावट18 के साथ विविध ऊतकों को कुशलतापूर्वक पचाने के लिए जाना जाता है, इस प्रकार तटस्थ प्रोटीज की कम सामग्री के कारण एपोप्टोसिस को कम करता है। मेनिन्जेस या पिया मेटर, अक्सर एस्ट्रोसाइट संदूषण के स्रोत, इस प्रक्रिया में एक पेर्कोल ढाल के उपयोग के माध्यम से समाप्त किए जा सकते हैं, इन परतों को हटाने की आवश्यकता को नकारते हैं (चित्र 1)।

माइक्रोग्लियल विषमता रीढ़ की हड्डी और मस्तिष्क8 में अलग-अलग आकृति विज्ञान से उत्पन्न होती है। हालांकि, इस प्रोटोकॉल को समान परिणामों (डेटा प्रस्तुत नहीं) के साथ सेरेब्रल गोलार्द्धों पर भी लागू किया गया था, रीढ़ की हड्डी और सेरेब्रल माइक्रोग्लिया दोनों का विश्लेषण करने के लिए इसकी मजबूती को उजागर किया गया था।

शुद्धता के उच्च स्तर (80% से 99% तक) और व्यवहार्यता (85% से 98%) लगातार इस प्रोटोकॉल के साथ हासिल किया जा सकता है. तंत्रिका तंत्र से प्रसंस्करण कोशिकाएं जटिल हैं, मुख्य रूप से क्योंकि सेल व्यवहार्यता प्रसंस्करण अवधि से काफी प्रभावित होती है; 20 मिनट से अधिक हाइपोक्सिया घातक हो सकता है। इष्टतम व्यवहार्यता के लिए, रीढ़ की हड्डी के निष्कर्षण से पाचन तक प्रसंस्करण समय को 10 मिनट से अधिक नहीं करने की सिफारिश की जाती है। यह विवरण 8 से 10 सप्ताह की आयु के स्वस्थ चूहों के अनुरूप है, जिससे छोटे या पुराने चूहों के लिए और मानकीकरण की आवश्यकता होती है। उप-इष्टतम व्यवहार्यता का अर्थ है ऊतक का अति-पाचन, पुनरावृत्ति को अनिवार्य करना। वैकल्पिक रूप से, एफएसीएस छँटाई अधिक पचा नमूनों से कोशिकाओं को उबार कर सकते हैं.

रीढ़ की हड्डी माइक्रोग्लिया को पचाने और शुद्ध करने के लिए लिब्रेज़ का अनुप्रयोग उपन्यास है। तंत्रिका तंत्र के ऊतकों में इसका सीमित उपयोग ऐतिहासिक रूप से व्यवहार्यता चुनौतियों18,19 के कारण किया गया है. हालांकि, यह अध्ययन इस सावधानीपूर्वक शुद्ध कोलेजनेज का उपयोग करते समय बढ़ी हुई व्यवहार्यता को प्रदर्शित करता है। वैकल्पिक रूप से, कम शक्ति वाले अन्य कोलेजेनेस का पता लगाया जा सकता है।

कई महत्वपूर्ण विचारों को स्वीकार किया जाना चाहिए, जैसे कि न्यूरोइन्फ्लेमेशन, रक्त-मस्तिष्क बाधा समझौता और माउस उम्र की उपस्थिति। ये कारक माइक्रोग्लियल आकृति विज्ञान और आवृत्ति दोनों को बदलते हैं। न्यूरोइन्फ्लेमेशन या रक्त-मस्तिष्क बाधा व्यवधान के उदाहरणों में, सीडी 45 और सीडी 11 बी व्यक्त करने वाली प्रतिरक्षा कोशिकाएं घुसपैठ कर सकती हैं, जिससे माइक्रोग्लियल शुद्धता कम हो सकती है। चूंकि माइक्रोग्लिया को विभिन्न न्यूरोइन्फ्लेमेटरी स्थितियों में बड़े पैमाने पर खोजा जाता है, इसलिए यह प्रोटोकॉल पैथोलॉजिकल और न्यूरोफिज़ियोलॉजिकल जांच के लिए संभावित है।

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Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

इस काम को राष्ट्रीय विज्ञान और प्रौद्योगिकी परिषद (CONACYT) (702361) द्वारा दी गई छात्रवृत्ति से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। लेखक नेशनल पॉलिटेक्निक इंस्टीट्यूट के नेशनल स्कूल ऑफ बायोलॉजिकल साइंसेज के जैविक रासायनिक विज्ञान में पीएचडी कार्यक्रम को स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL collection tubes Corning, USA 430790
2 mL microtubes Axygen, USA MCT-200-G
2.4G2 anti-FcR BioLegend, USA 101302
50 mL collection tubes Corning, USA 430829
70% ethanol
Antibiotic-Antimycotic (penicillin, streptomycin, amphotericin b) Gibco, USA 15240062
Antibody CD11b eFluor 450 anti-mouse eBioscience, USA 48-0112
Antibody CD45 PerCP anti-mouse   BioLegend, USA 103130
Balanced salt solution (PBS) calcium- magnesium-free Corning, USA 46-013-CM
Blue Cell Strainer 40 μm Corning, USA 352340
Costar 6-well Clear Not Treated  Corning, USA CLS3736
Coverslips
Digital Heating Shaking Drybath  Thermo Scientific Digital HS Drybath, USA 88870001
Dissecting forceps for microsurgery FT by DUMONT
DNase Roche, USA 4536282001
Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium-high glucose (DMEM)  Merck, USA D6429
Electric shaver
FACS tube Thermo, USA 352058
Fetal bovine serum (FBS) PAN Biotech, Alemania P30-3306
Flow cytometer Cytoflex  Beckman Coulter
Hank’s balanced salt solution  Merck, USA H2387
L-glutamine Corning, USA  15393631
Liberase TM  Roche, USA 5401119001
Neubauer chamber Counting Chambers China 1103
Pentobarbital
Percoll  Merck, USA 17089101 density gradient centrifugation 
Poly-L-lysine solution  Merck, USA P8920
Scalpel No. 25  HERGOM, Mexico H23
Snaplock Microcentrifuge Tubes 2 mL Axygen, USA 10011-680
Stereoscopic microscope Velab, Mexico HG927831
Straight surgical scissors (10 cm) HERGOM, Mexico
Straight Vannas scissors HERGOM, Mexico
Triton X100 Merck, USA X100
Trypan blue Stain 0.4%  Merck, USA 15250-061
Vortex mixer DLAB, China 8031102000
Zombie Aqua Fixable Viability Kit BioLegend, USA 423102 amine-reactive fluorescent dye staining 

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References

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Gutiérrez-Román, C. I., Meléndez Camargo, M. E., García Rojas, C. C., Jimenez Olvera, M., Gutiérrez Román, S. H., Medina-Contreras, O. Rapid and Efficient Enrichment of Mouse Spinal Cord Microglia. J. Vis. Exp. (199), e65961, doi:10.3791/65961 (2023).

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