Summary
La microglía está considerada como una de las células más versátiles del cuerpo, capaz de adaptarse morfológica y funcionalmente. Su heterogeneidad y multifuncionalidad permiten el mantenimiento de la homeostasis cerebral, a la vez que se relacionan con diversas patologías neurológicas. Aquí se describe una técnica para purificar la microglía de la médula espinal.
Abstract
La columna vertebral define a un vertebrado y da forma al canal espinal, una cavidad que encierra y protege la médula espinal. El desarrollo y la función adecuados del sistema nervioso central de los mamíferos dependen en gran medida de la actividad de los macrófagos residentes conocidos como microglía. La microglía muestra heterogeneidad y multifuncionalidad, lo que permite una expresión génica y un comportamiento distintos dentro de la médula espinal y el cerebro. Numerosos estudios han explorado la función de la microglía cerebral, detallando ampliamente los métodos de purificación. Sin embargo, la purificación de la microglía de la médula espinal en ratones carece de una descripción completa. Por el contrario, la utilización de una colagenasa altamente purificada, a diferencia de un extracto sin refinar, carece de información dentro de los tejidos del sistema nervioso central. En este estudio, se extirpó la columna vertebral y la médula espinal de ratones C57BL/6 de 8-10 semanas de edad. La digestión posterior empleó una colagenasa altamente purificada, y la purificación de la microglía utilizó un gradiente de densidad. Las células se sometieron a tinción para citometría de flujo, evaluando la viabilidad y pureza a través de la tinción de CD11b y CD45. Los resultados arrojaron una viabilidad media del 80% y una pureza media del 95%. En conclusión, la manipulación de la microglía de ratón implicó la digestión con una colagenasa altamente purificada, seguida de un gradiente de densidad. Este enfoque produjo efectivamente poblaciones sustanciales de microglía de la médula espinal.
Introduction
La característica definitoria de los vertebrados es la columna vertebral o columna vertebral, en la que la notocorda ha sido reemplazada por una secuencia de huesos segmentados llamados vértebras, divididos por discos intervertebrales. Esta sucesión de material óseo da forma al canal espinal, una cavidad que encierra y protege la médula espinal1. En el género Rodentia, la columna vertebral suele estar formada por siete vértebras cervicales, trece vértebras torácicas, seis vértebras lumbares y un número variable de vértebras caudales 2,3. La longitud de la médula espinal es similar a la de la columna vertebral, y el filum terminal es una estructura no nerviosa que ancla la médula espinal al sacro. Además, las fibras nerviosas salen a través del agujero intervertebral1.
El desarrollo y el funcionamiento adecuado del sistema nervioso central en los mamíferos dependen críticamente de la actividad de los macrófagos residentes del sistema nervioso, llamados microglía4. A pesar de que las microglías fueron descritas inicialmente como fagocitos residentes en el cerebro, investigaciones recientes han atribuido muchas funciones dinámicas a estas células 5,6. El tamaño de la microglía varía de 7 a 10 μm en homeostasis; Se consideran entre las células más versátiles del cuerpo y pueden adaptarse morfológica y funcionalmente a su entorno en constante cambio7. Estas células exhiben una alta heterogeneidad tanto en la etapa embrionaria como en la adulta8,9, mientras que en la etapa adulta también presentan una heterogeneidad funcional compleja basada en su contexto espacio-temporal10. La heterogeneidad y las múltiples funciones de la microglía permiten la expresión génica diferencial y el comportamiento en la médula espinal y el cerebro. Se ha demostrado que la expresión de CD11b, CD45, CD86 y CCR9 es mayor en la médula espinal en comparación con el cerebro 8,9.
Existen múltiples protocolos para el aislamiento de microglía cerebral11,12; sin embargo, solo existen unos pocos para la microglía de la médula espinal13,14. La optimización de un método para purificar la microglía de la médula espinal facilita el desarrollo de múltiples estudios centrados en el descubrimiento de la fisiología de la microglía. Este protocolo tiene como objetivo describir una extracción simple y altamente reproducible de la médula espinal del ratón y la purificación de la microglía (Figura 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
El estudio se realizó de acuerdo con la norma oficial mexicana NOM-062-ZOO-1999 y la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio. El estudio fue aprobado por los Comités de Investigación, Ética y Bioseguridad del Hospital Infantil de México (HIM/2023/006) y por el Comité de Investigación y Bioética del Hospital General de México Eduardo Liceaga (DI/21/501/04/62). Se obtuvieron tres ratones C57BL/6 de 6 a 8 semanas de edad del Hospital Infantil de México, donde fueron criados en condiciones aisladas en racks ventilados, de acuerdo con las pautas institucionales de cuidado y uso de animales.
1. Preparación de materiales y reactivos
- Precalentar PBS libres de Ca 2+ y Mg2+, así como la solución salina equilibrada de Hank (HBSS) a 37 °C.
- Complementar la solución de HBSS con 100 μg/ml de liberasa y 4 μg/ml de DNasa (HBSS-LD). Asegúrese de que la solución mantenga un pH fisiológico de 7,4.
NOTA: Será necesario 1 ml de solución de trabajo por médula espinal. - Preparar una solución isotónica al 90% para centrifugación en gradiente de densidad (disponible comercialmente, ver Tabla de Materiales) y precalentarla a 37 °C.
- Prepare el tampón de tinción combinando suero fetal bovino (FBS) inactivado por calor al 5% con PBS y almacene la mezcla en hielo.
- Precalentar la glucosa media-alta (1 g/L) (DMEM) de Dulbecco Modified Eagle a 37 °C.
- Suplementar el medio DMEM con FBS al 10%, 2 mM de L-glutamina, 200 U/mL de penicilina, 200 μg/mL de estreptomicina y 500 pg/mL de anfotericina B (ver Tabla de materiales) para preparar DMEM-S.
2. Disección y preparación de la médula espinal
- Eutanasia del ratón con una sobredosis intraperitoneal de pentobarbital a una dosis de 150 mg/kg. Esterilizar el tórax y la espalda del ratón con etanol al 70%.
NOTA: Confirme que la eutanasia fue exitosa antes de proceder con la disección con ratón. - Afeitar la región toracolumbar y fijar las extremidades a la tabla de disección con cinta adhesiva.
- Con un bisturí, haga una incisión cuidadosa a lo largo de la línea media dorsal desde el occipital hasta la región sacra (Figura 2).
- Con la ayuda de un microscopio quirúrgico estereoscópico, diseccionar en capas hasta llegar a la columna lumbar e identificar el último arco costal.
NOTA: Los 13 arcos costales están articulados en las vértebras torácicas; cuando se disecan, se vuelven visibles superiores a la vértebra L12. - Determine la última vértebra cervical y el sacro, luego haga un corte para separar la columna vertebral (Figura 2).
- Utilizando pinzas de disección, realice una laminectomía dorsal de las vértebras para extraer la médula espinal (Figura 3A-D).
NOTA: A excepción de las dos primeras vértebras cervicales (atlas y axis), todas las vértebras móviles comparten un diseño morfológico común en varias regiones (cervical, torácica o lumbar). Cada vértebra móvil típica presenta un cuerpo vertebral cilíndrico en su extremo anterior. Unida a la parte posterior del cuerpo hay un arco óseo conocido como arco vertebral (arco neural), que consta de láminas y apófisis espinosas. Entre estas estructuras se encuentra el agujero vertebral15. - Extirpar los nervios que emergen a través de los forámenes (raíces dorsales y ventrales) que constituyen el sistema nervioso periférico y que pueden contener macrófagos infiltrados (Figura 3D).
NOTA: No es necesario eliminar la piamadre o las meninges, ya que el medio de gradiente de densidad elimina eficazmente los astrocitos contaminantes. Además, la retención de las meninges reduce el tiempo de purificación y mejora la viabilidad.
3. Digestión tisular y aislamiento de la microglía
- Coloque la médula espinal en la tabla de disección y, con unas tijeras Vannas, corte la médula espinal en trozos de 2 mm, obteniendo un promedio de 10 trozos.
- Transfiera las secciones de la médula espinal a un microtubo de fondo plano de 2 ml (Figura 3E, F).
- Añadir 1 ml de la solución de trabajo HBSS-LD (paso 1.2). Incubar a 37 °C durante 25 min, vórtice vigorosamente cada 5 min.
- Pasar el contenido de cada digestión por un colador de 40 μm, y luego añadir 7 mL de HBSS con 2% de FBS para neutralizar la digestión.
- Triture el tejido restante con un émbolo de jeringa de 1 ml. Centrifugar la suspensión en un tubo cónico de 50 ml durante 5 min a 220 x g, 4 °C.
- Deseche el sobrenadante con una micropipeta de 1 mL y vuelva a suspender el gránulo en 2 mL de HBSS con FBS al 2% en un tubo cónico de 15 mL. Combinar con 2 mL de medio de gradiente de densidad isotónica al 90%. Centrifugar durante 25 min a 160 x g, 18 °C.
NOTA: Utilice una aceleración lenta y evite usar el freno. - Utilice una pipeta de transferencia para recuperar la interfaz y transferirla a un tubo cónico de 15 ml. Lavar las células con 10 ml de PBS y centrifugar durante 5 min a 220 x g, 4 °C.
- Vuelva a suspender las células en DMEM-S (paso 1.6) y manténgalas almacenadas en hielo.
4. Determinación de la pureza/viabilidad
- Para cuantificar las células viables utilizando una cámara de hemocitómetro, emplee una tinción de azul de tripano al 0,4% (consulte la tabla de materiales).
NOTA: En promedio, un solo ratón proporciona de 4 a 6 millones de células. - Para cuantificar las células viables a través de un citómetro de flujo, emplee la tinción con colorante fluorescente reactivo a las aminas disponible en el mercado (consulte la tabla de materiales).
- Transfiera 1 millón de células a un tubo de poliestireno de fondo redondo (FACS) de 5 ml. Diluir el colorante fluorescente con PBS en una proporción de 1:1000 (creando la solución de trabajo de viabilidad).
- Incubar las muestras con la solución de viabilidad en la oscuridad a 4 °C durante 30 min. Lave las celdas con PBS helado dos veces. Vuelva a suspender las células en 400 μL de tampón de tinción (paso 1.4).
- Bloquear las células con 2.4G2 anti-FcRIII/I (ver Tabla de Materiales) en el tampón de tinción helado durante 15 min a 4 °C.
- Formule el cóctel de tinción de anticuerpos añadiendo los anticuerpos monoclonales marcados con fluorescencia CD45-PerCP y CD11b-eFluor 450 al tampón de tinción (a una dilución de 1:300) (consulte la Tabla de materiales).
NOTA: Si bien ambas técnicas están disponibles, elija la que mejor se alinee con el protocolo posterior. - Incubar las muestras con el cóctel de tinción de anticuerpos en la oscuridad a 4 °C durante 30 min. Lave las células con tampón de tinción helado dos veces. Resuspender las células en 400 μL de tampón de tinción.
- Adquiera 250.000 eventos en un citómetro de flujo, como se describe en la estrategia de compuerta en el paso 6 (Figura 4).
5. Tinción inmunofluorescente
- Coloque un cubreobjetos pretratado en un pocillo de una placa de 6 pocillos.
NOTA: Para tratar los cubreobjetos, colóquelos en una placa de Petri con 500 μL de solución de L-polilisina (0,01 mg/mL, consulte la Tabla de Materiales) e incube durante 1 h. Después, lávalos tres veces con agua destilada y déjalos secar. - Siembre 200.000 células en el cubreobjetos tratado utilizando 500 μL de solución de DMEM-S. Incubar durante 24 h.
- Retire los cubreobjetos y fije las celdas con paraformaldehído (PFA) al 3,7% durante 20 minutos a temperatura ambiente. Lave los cubreobjetos tres veces con PBS helado.
- Permeabilizar las células con Triton X-100 al 0,2% en PBS durante 15 min a temperatura ambiente. Posteriormente, lave los cubreobjetos tres veces con PBS frío. Bloquee las células con 0,2% de BSA en PBS durante 1 h a temperatura ambiente.
- Diluir los anticuerpos monoclonales marcados con fluorescencia (con una dilución de 1:300, ver Tabla de Materiales) en la solución de bloqueo e incubar durante 1 h a temperatura ambiente. Lave los cubreobjetos tres veces con PBS helado.
- Aplique un medio de montaje que contenga DAPI en la guía y luego séllela con un cubreobjetos.
NOTA: Los portaobjetos pueden analizarse inmediatamente con un microscopio de fluorescencia o confocal, o pueden almacenarse hasta 3 meses a -20 °C.
6. Estrategia de activación de la microglía de la médula espinal
- Genere un diagrama de puntos y establezca una puerta para aislar células viables en función de la tinción de viabilidad y un canal fluorescente vacío16. Excluir las células no viables.
- Produzca otro gráfico utilizando parámetros de dispersión frontal y lateral para eliminar los escombros16.
- Desarrollar un diagrama de puntos adicional y analizar la expresión de CD11b y CD45 para diferenciar la microglía.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utilizando tejido de la médula espinal de ratón, la digestión enzimática se realizó utilizando una mezcla altamente enriquecida con colagenasa y termolisina. El tejido digerido resultante se sometió a un paso a través de un filtro de 40 μm para eliminar el material no digerido. Las células colectadas se enriquecieron a través de un gradiente de densidad de Percoll, con un 90% en la parte inferior y un 45% en la parte superior. A continuación, las células enriquecidas con microglía dentro de la interfaz se tiñeron con anticuerpos CD45 y CD11b y se sometieron a un análisis citométrico de flujo (Figura 1).
La disección de la columna vertebral que se extiende desde la región occipital hasta el sacro, implica la exposición y disección de la musculatura paravertebral. Para liberar la columna vertebral, se expusieron los arcos costales, y se realizó su medición desde la vértebra T13 hasta la T1. La columna vertebral, articulada con el cráneo y el sacro, se hizo visible, y se realizó un corte a cada lado para liberarla por completo (Figura 2).
La extracción de la médula espinal se realizó a través de una incisión lateral en los cuerpos vertebrales, formando un canal. Durante la extirpación de la médula espinal, los nervios periféricos se cortaron para evitar la contaminación de los macrófagos periféricos. Posteriormente, la médula espinal obtenida se extendió a través de la mesa de disección y se seccionó en trozos de 2 mm, que se agregaron a la solución de digestión (Figura 3). Se informa por primera vez del uso de liberasa para la digestión de la médula espinal, produciendo de 4 a 6 millones de células microgliales altamente viables por ratón adulto. La viabilidad óptima que se consigue a través de este proceso oscila entre el 80% y el 99%.
Para confirmar el proceso de purificación, se realizó la tinción FACS de la microglía utilizando anticuerpos CD45 y CD11b. El proceso de purificación demostró eficiencia, produciendo hasta un 99% de células microgliales (Figura 4). Además, se realizó una tinción de inmunofluorescencia en la microglía obtenida utilizando los mismos anticuerpos, observándose células doblemente positivas con un tamaño promedio de 10 μm, lo que coincide con el tamaño informado de la microglía no activada. Esto sugiere que estas células son adecuadas para estudios de activación (Figura 4E). Es plausible que otras células inmunitarias puedan estar presentes durante los procesos inflamatorios o que la microglía pueda sufrir cambios morfológicos bajo diferentes estímulos. En estos casos, se recomienda la incorporación de marcadores específicos para la identificación de cada población celular.
Figura 1: Resumen esquemático del protocolo de purificación de la microglía de la médula espinal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Procedimiento de disección de la médula espinal. Después de la eutanasia, la columna vertebral del ratón fue aislada y diseccionada. (A) Disección escalonada de la piel que se extiende desde la región occipital hasta la caudal, revelando la musculatura paravertebral. (B) Disección secuencial a través de las capas de los músculos paravertebrales. (C) Extirpación de la columna vertebral después del corte de costillas. (D) Visualización de una médula espinal intacta dentro del canal vertebral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Proceso de extracción y digestión de la médula espinal . (A) Laminectomía espinal secuencial con dos cortes de aproximadamente 2 mm. (B) Médula espinal expuesta. (C) Extirpación de la médula espinal. (D) Sección de nervios periféricos. (E) La médula espinal se dividió en secciones de 2 mm y se colocó en el medio de digestión. (F) Incubación estándar a 37 °C para la digestión de tejidos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Evaluación de la pureza y viabilidad celular. Inmunotinción de células purificadas mediante marcadores específicos de microglía. (A) Identificación de células vivas (células fluorescentes negativas de colorante). (B) Selección basada en el tamaño de la célula. (C) Células CD45low y CD11b+, que demuestran una pureza superior al 99%. (D) Viabilidad media (87,46 ± DE 1,468) y pureza media (88,51 ± DE 3,948; n = 5). (E) Inmunofluorescencia que representa la tinción de CD45+ y CD11b+ en células purificadas. Las imágenes se capturaron utilizando un microscopio confocal con un láser de luz blanca a un aumento de 60x (barra de escala = 5 μm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Se han desarrollado numerosos protocolos para el estudio de la microglía debido a su importancia en la homeostasis cerebral. En estos métodos, la microglía se obtiene típicamente de los hemisferios cerebrales de ratas y ratones embrionarios o neonatos17. Un número limitado de estudios han abordado la purificación de la microglía de la médula espinal de ratones adultos13,14. Estas técnicas implican la digestión enzimática utilizando colagenasa y/o papaína junto con ADNasa, a menudo combinada con separación de gradientes utilizando Percoll u OptiPrep. Sin embargo, el empleo de la digestión de la médula espinal a base de papaína sin separación de gradientes puede conducir a la contaminación de los astrocitos, incluso después de la eliminación de la piamadre14,17.
Este estudio presenta un protocolo para purificar la microglía de la médula espinal del ratón adulto. El protocolo utiliza una mezcla precisa de colagenasa I y II junto con termolisina, una combinación conocida por digerir eficientemente diversos tejidos con degradación controlada18, reduciendo así la apoptosis debido a su bajo contenido de proteasas neutras. Las meninges o la piamadre, a menudo fuentes de contaminación de astrocitos, pueden eliminarse mediante el uso de un gradiente de Percoll en este procedimiento, lo que elimina la necesidad de eliminar estas capas (Figura 1).
La heterogeneidad microglial surge de distintas morfologías en la médula espinal y el cerebro8. Sin embargo, este protocolo también se aplicó a hemisferios cerebrales con resultados similares (datos no presentados), destacando su robustez para analizar tanto la médula espinal como la microglía cerebral.
Con este protocolo se pueden alcanzar altos niveles de pureza (que oscilan entre el 80% y el 99%) y viabilidad (entre el 85% y el 98%). El procesamiento de las células del sistema nervioso es complejo, principalmente porque la viabilidad celular se ve sustancialmente afectada por la duración del procesamiento; La hipoxia superior a 20 min puede ser letal. Para una viabilidad óptima, se recomienda limitar el tiempo de procesamiento desde la extracción de la médula espinal hasta la digestión a no más de 10 minutos. Esta descripción está adaptada a ratones sanos de 8 a 10 semanas de edad, lo que requiere una mayor estandarización para ratones más jóvenes o mayores. La viabilidad subóptima implica una digestión excesiva de los tejidos, lo que obliga a la repetición. Alternativamente, la clasificación FACS puede salvar células de muestras sobredigeridas.
La aplicación de la liberasa para digerir y purificar la microglía de la médula espinal es novedosa. Su uso limitado en los tejidos del sistema nervioso se ha debido históricamente a problemas de viabilidad18,19. Este estudio, sin embargo, demuestra una mayor viabilidad cuando se utiliza esta colagenasa meticulosamente purificada. Alternativamente, se podrían explorar otras colagenasas con menor potencia.
Deben tenerse en cuenta varias consideraciones cruciales, como la presencia de neuroinflamación, el compromiso de la barrera hematoencefálica y la edad del ratón. Estos factores alteran tanto la morfología como la frecuencia microglial. En casos de neuroinflamación o alteración de la barrera hematoencefálica, las células inmunitarias que expresan CD45 y CD11b pueden infiltrarse, disminuyendo la pureza microglial. Dado que la microglía se explora ampliamente en diversas afecciones neuroinflamatorias, este protocolo tiene potencial para investigaciones patológicas y neurofisiológicas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por las becas otorgadas por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) (702361). Los autores reconocen el programa de doctorado en Ciencias Químicas Biológicas de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto Politécnico Nacional.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL collection tubes | Corning, USA | 430790 | |
| 2 mL microtubes | Axygen, USA | MCT-200-G | |
| 2.4G2 anti-FcR | BioLegend, USA | 101302 | |
| 50 mL collection tubes | Corning, USA | 430829 | |
| 70% ethanol | |||
| Antibiotic-Antimycotic (penicillin, streptomycin, amphotericin b) | Gibco, USA | 15240062 | |
| Antibody CD11b eFluor 450 anti-mouse | eBioscience, USA | 48-0112 | |
| Antibody CD45 PerCP anti-mouse | BioLegend, USA | 103130 | |
| Balanced salt solution (PBS) calcium- magnesium-free | Corning, USA | 46-013-CM | |
| Blue Cell Strainer 40 μm | Corning, USA | 352340 | |
| Costar 6-well Clear Not Treated | Corning, USA | CLS3736 | |
| Coverslips | |||
| Digital Heating Shaking Drybath | Thermo Scientific Digital HS Drybath, USA | 88870001 | |
| Dissecting forceps for microsurgery | FT by DUMONT | ||
| DNase | Roche, USA | 4536282001 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium-high glucose (DMEM) | Merck, USA | D6429 | |
| Electric shaver | |||
| FACS tube | Thermo, USA | 352058 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAN Biotech, Alemania | P30-3306 | |
| Flow cytometer Cytoflex | Beckman Coulter | ||
| Hank’s balanced salt solution | Merck, USA | H2387 | |
| L-glutamine | Corning, USA | 15393631 | |
| Liberase TM | Roche, USA | 5401119001 | |
| Neubauer chamber Counting Chambers | China | 1103 | |
| Pentobarbital | |||
| Percoll | Merck, USA | 17089101 | density gradient centrifugation |
| Poly-L-lysine solution | Merck, USA | P8920 | |
| Scalpel No. 25 | HERGOM, Mexico | H23 | |
| Snaplock Microcentrifuge Tubes 2 mL | Axygen, USA | 10011-680 | |
| Stereoscopic microscope | Velab, Mexico | HG927831 | |
| Straight surgical scissors (10 cm) | HERGOM, Mexico | ||
| Straight Vannas scissors | HERGOM, Mexico | ||
| Triton X100 | Merck, USA | X100 | |
| Trypan blue Stain 0.4% | Merck, USA | 15250-061 | |
| Vortex mixer | DLAB, China | 8031102000 | |
| Zombie Aqua Fixable Viability Kit | BioLegend, USA | 423102 | amine-reactive fluorescent dye staining |
References
- Schröder,, Moser,, Huggenberger, Neuroanatomy of the Mouse. , Springer, Switzerland. 59-78 (2020).
- Sengul, G., et al. Cytoarchitecture of the spinal cord of the postnatal (P4) mouse. Anat Rec. 295, 837-845 (2012).
- Bab, I., et al. Microtomographic atlas of the mouse skeleton. VIII, First ed, Springer. 205 (2007).
- Nayak, D., et al.
- Martinez, F. O., et al.
- Masuda, T., et al.
- Prinz, M. Microglia biology: one century of evolving concepts. Cell. 179 (2), 292-311 (2019).
- de Haas, A. H., et al. Region-specific expression of immunoregulatory proteins on microglia in the healthy CNS. Glia. 56 (8), 888-894 (2008).
- Xuan, F. L., et al. Differences of microglia in the brain and the spinal cord. Front Cell Neurosci. 13, 504 (2019).
- Paolicelli, R. Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads. Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).
- Li, Q., et al. Spinal IL-36γ/IL-36R participates in the maintenance of chronic inflammatory pain through astroglial JNK pathway. Glia. 67 (3), 438-451 (2019).
- Prinz, M., et al. Microglia and central nervous system-associated macrophages-from origin to disease modulation. Annu Rev Immunol. 39, 251-277 (2021).
- Yip, P. K., et al. Rapid isolation and culture of primary microglia from adult mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 183 (2), 223-237 (2009).
- Akhmetzyanova, E. R., et al. Severity- and time-dependent activation of microglia in spinal cord injury. Int J Mo. Sci. 24 (9), 1-16 (2023).
- Mahadevan, V.
- Krukowski, K., et al. Temporary microglia-depletion after cosmic radiation modifies phagocytic activity and prevents cognitive deficits. Sci Rep. 8 (1), 1-13 (2018).
- Cardona, A., et al. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
- Schmidt, V. M., et al. Comparison of the enzymatic efficiency of Liberase TM and tumor dissociation enzyme: effect on the viability of cells digested from fresh and cryopreserved human ovarian cortex. Reprod Biol Endocrinol. 16 (57), 1-14 (2018).
- Kusminski, C. M., et al. MitoNEET-parkin effects in pancreatic α- and β-cells, cellular survival, and intrainsular cross talk. Diabetes. 65 (6), 1534-1555 (2016).
