Summary
Mikroglia gelten als einige der vielseitigsten Zellen des Körpers, die zur morphologischen und funktionellen Anpassung fähig sind. Ihre Heterogenität und Multifunktionalität ermöglicht die Aufrechterhaltung der Homöostase des Gehirns und ist gleichzeitig mit verschiedenen neurologischen Pathologien verbunden. Hier wird eine Technik zur Reinigung von Rückenmarksmikroglia beschrieben.
Abstract
Die Wirbelsäule definiert ein Wirbeltier und formt den Wirbelkanal, einen Hohlraum, der das Rückenmark umschließt und schützt. Die richtige Entwicklung und Funktion des zentralen Nervensystems von Säugetieren hängt maßgeblich von der Aktivität der ansässigen Makrophagen ab, die als Mikroglia bekannt sind. Mikroglia weisen Heterogenität und Multifunktionalität auf, was eine unterschiedliche Genexpression und ein unterschiedliches Verhalten im Rückenmark und im Gehirn ermöglicht. Zahlreiche Studien haben die Funktion der zerebralen Mikroglia untersucht und die Reinigungsmethoden ausführlich beschrieben. Für die Reinigung von Mikroglia aus dem Rückenmark bei Mäusen fehlt jedoch eine umfassende Beschreibung. Im Gegensatz dazu fehlt der Verwendung einer hochgereinigten Kollagenase im Gegensatz zu einem unraffinierten Extrakt die Berichterstattung im Gewebe des zentralen Nervensystems. In dieser Studie wurden die Wirbelsäule und das Rückenmark von 8-10 Wochen alten C57BL/6-Mäusen herausgeschnitten. Bei der anschließenden Verdauung wurde eine hochgereinigte Kollagenase verwendet, und bei der Mikrogliareinigung wurde ein Dichtegradient verwendet. Die Zellen wurden für die Durchflusszytometrie gefärbt, wobei die Lebensfähigkeit und Reinheit durch CD11b- und CD45-Färbung beurteilt wurde. Die Ergebnisse ergaben eine durchschnittliche Viabilität von 80 % und eine mittlere Reinheit von 95 %. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Manipulation der Mikroglia der Maus eine Verdauung mit einer hochgereinigten Kollagenase beinhaltete, gefolgt von einem Dichtegradienten. Dieser Ansatz erzeugte effektiv beträchtliche Populationen von Rückenmark-Mikroglia.
Introduction
Das bestimmende Merkmal von Wirbeltieren ist die Wirbelsäule oder Wirbelsäule, in der der Notochord durch eine Abfolge segmentierter Knochen ersetzt wurde, die als Wirbel bezeichnet werden und durch Bandscheiben getrennt sind. Diese Abfolge von knöchernem Material formt den Spinalkanal, einen Hohlraum, der das Rückenmark umschließt und schützt1. Bei der Gattung Rodentia besteht die Wirbelsäule in der Regel aus sieben Halswirbeln, dreizehn Brustwirbeln, sechs Lendenwirbeln und einer variablen Anzahl von Schwanzwirbeln 2,3. Die Länge des Rückenmarks ähnelt der der Wirbelsäule, und das terminale Filumum ist eine nicht-nervöse Struktur, die das Rückenmark im Kreuzbein verankert. Zusätzlich treten Nervenfasern durch das Foramen intervertebralisaus 1.
Die Entwicklung und ordnungsgemäße Funktion des zentralen Nervensystems bei Säugetieren hängt entscheidend von der Aktivität der im Nervensystem ansässigen Makrophagen, den sogenannten Mikroglia4, ab. Obwohl Mikroglia ursprünglich als hirnresidente Phagozyten beschrieben wurden, haben neuere Forschungen diesen Zellen viele dynamische Funktionen zugeschrieben 5,6. Die Größe von Mikroglia reicht von 7 bis 10 μm in der Homöostase; Sie gelten als eine der vielseitigsten Zellen des Körpers und können sich morphologisch und funktionell an ihre sich ständig verändernde Umgebung anpassen7. Diese Zellen weisen sowohl im embryonalen als auch im adulten Stadium eine hohe Heterogenität auf8,9, während sie im adulten Stadium auch eine komplexe funktionelle Heterogenität aufweisen, die auf ihrem raumzeitlichen Kontext beruht10. Die Heterogenität und die vielfältigen Funktionen von Mikroglia ermöglichen eine unterschiedliche Genexpression und ein unterschiedliches Verhalten im Rückenmark und im Gehirn. Es konnte gezeigt werden, dass die Expression von CD11b, CD45, CD86 und CCR9 im Rückenmark höher ist als im Gehirn 8,9.
Es existieren mehrere Protokolle für die Isolierung zerebraler Mikroglia11,12; Für Rückenmarksmikroglia existieren jedoch nur wenige13,14. Die Optimierung einer Methode zur Reinigung von Mikroglia aus dem Rückenmark erleichtert die Entwicklung mehrerer Studien, die sich auf die Entdeckung der Mikroglia-Physiologie konzentrieren. Dieses Protokoll zielt darauf ab, eine einfache und hochgradig reproduzierbare Extraktion des Rückenmarks der Maus und die Reinigung von Mikroglia zu beschreiben (Abbildung 1).
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Protocol
Die Studie wurde in Übereinstimmung mit der offiziellen mexikanischen Norm NOM-062-ZOO-1999 und dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren durchgeführt. Die Genehmigung für die Studie wurde von den Ausschüssen für Forschung, Ethik und Biosicherheit des mexikanischen Kinderkrankenhauses (HIM/2023/006) und der Kommission für Forschung und Bioethik des Allgemeinen Krankenhauses von Mexiko Eduardo Liceaga (DI/21/501/04/62) erteilt. Drei C57BL/6-Mäuse im Alter von 6 bis 8 Wochen wurden aus dem Mexico Children's Hospital bezogen, wo sie unter isolierten Bedingungen in belüfteten Racks in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Tieren aufgezogen wurden.
1. Vorbereitung von Materialien und Reagenzien
- Ca2+ und Mg2+ freies PBS sowie Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) auf 37 °C vorwärmen.
- Ergänzen Sie die HBSS-Lösung mit 100 μg/ml Liberase und 4 μg/ml DNase (HBSS-LD). Stellen Sie sicher, dass die Lösung einen physiologischen pH-Wert von 7,4 beibehält.
HINWEIS: 1 ml Arbeitslösung pro Rückenmark ist erforderlich. - Bereiten Sie eine isotonische 90%ige Lösung für die Dichtegradientenzentrifugation vor (handelsüblich, siehe Materialtabelle) und wärmen Sie sie auf 37 °C vor.
- Bereiten Sie den Färbepuffer vor, indem Sie 5 % hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum (FBS) mit PBS kombinieren, und lagern Sie die Mischung auf Eis.
- Dulbecco's Modified Eagle's Medium-High Glucose (1g/L) (DMEM) auf 37 °C vorwärmen.
- Ergänzen Sie das DMEM-Medium mit 10 % FBS, 2 mM L-Glutamin, 200 U/ml Penicillin, 200 μg/ml Streptomycin und 500 pg/ml Amphotericin B (siehe Materialtabelle), um DMEM-S herzustellen.
2. Dissektion und Präparation des Rückenmarks
- Euthanasieren Sie die Maus mit einer intraperitonealen Überdosis Pentobarbital in einer Dosis von 150 mg/kg. Sterilisieren Sie den Thorax und den Rücken der Maus mit 70%igem Ethanol.
HINWEIS: Vergewissern Sie sich, dass die Euthanasie erfolgreich war, bevor Sie mit der Sektion der Maus fortfahren. - Rasieren Sie den thorakolumbalen Bereich und befestigen Sie die Extremitäten mit Klebeband am Sezierbrett.
- Machen Sie mit einem Skalpell einen vorsichtigen Schnitt entlang der dorsalen Mittellinie vom Hinterhaupt bis zum Sakralbereich (Abbildung 2).
- Mit Hilfe eines stereoskopischen Operationsmikroskops wird in Schichten präpariert, bis die Lendenwirbelsäule erreicht ist und der letzte Rippenbogen identifiziert wird.
HINWEIS: Die 13 Rippenbögen sind in den Brustwirbeln artikuliert; wenn sie präpariert werden, werden sie oberhalb des L1-Wirbelssichtbar 2. - Bestimmen Sie den letzten Halswirbel und das Kreuzbein und machen Sie dann einen Schnitt, um die Wirbelsäule zu trennen (Abbildung 2).
- Führen Sie mit einer Präparierzange eine dorsale Laminektomie der Wirbel durch, um das Rückenmark zu extrahieren (Abbildung 3A-D).
HINWEIS: Mit Ausnahme der ersten beiden Halswirbel (Atlas und Achse) haben alle beweglichen Wirbel ein gemeinsames morphologisches Design in verschiedenen Regionen (Hals-, Brust- oder Lendenwirbelsäule). Jeder typische bewegliche Wirbel weist an seinem vorderen Ende einen zylindrischen Wirbelkörper auf. An der Rückseite des Körpers ist ein knöcherner Bogen befestigt, der als Wirbelbogen (Neuralbogen) bezeichnet wird und aus Laminae und Dornfortsätzen besteht. Zwischen diesen Strukturen liegt das Foramen vertebralis15. - Entfernen Sie die Nerven, die durch die Foramina (dorsale und ventrale Wurzeln) austreten, die das periphere Nervensystem bilden und infiltrierte Makrophagen enthalten können (Abbildung 3D).
HINWEIS: Es ist nicht notwendig, die Pia mater oder die Hirnhäute zu entfernen, da das Dichtegradientenmedium kontaminierende Astrozyten effektiv eliminiert. Darüber hinaus verkürzt die Retention der Hirnhäute die Reinigungszeit und verbessert die Lebensfähigkeit.
3. Gewebeverdauung und Isolierung von Mikroglia
- Legen Sie das Rückenmark auf das Präparierbrett und schneiden Sie das Rückenmark mit einer Vannas-Schere in 2 mm große Stücke, was durchschnittlich 10 Stücke ergibt.
- Die Abschnitte des Rückenmarks werden in ein 2-ml-Mikroröhrchen mit flachem Boden überführt (Abbildung 3E,F).
- 1 ml der HBSS-LD-Arbeitslösung zugeben (Schritt 1.2). Bei 37 °C 25 min inkubieren, alle 5 min kräftig vortexieren.
- Den Inhalt jedes Aufschlusses durch ein 40-μm-Sieb passieren und dann 7 ml HBSS mit 2 % FBS hinzufügen, um den Aufschluss zu neutralisieren.
- Zerkleinern Sie das verbleibende Gewebe mit einem 1-ml-Spritzenkolben. Die Suspension wird in einem konischen 50-ml-Röhrchen 5 min bei 220 x g, 4 °C zentrifugiert.
- Verwerfen Sie den Überstand mit einer 1-ml-Mikropipette und resuspendieren Sie das Pellet in 2 ml HBSS mit 2 % FBS in einem konischen 15-ml-Röhrchen. Mit 2 ml isotonischem Dichtegradientenmedium mit 90 % kombinieren. 25 min bei 160 x g, 18 °C zentrifugieren.
HINWEIS: Verwenden Sie langsames Beschleunigen und vermeiden Sie es, die Bremse zu benutzen. - Verwenden Sie eine Transferpipette, um die Schnittstelle zu entnehmen und in ein konisches 15-ml-Röhrchen zu überführen. Die Zellen werden mit 10 ml PBS gewaschen und 5 Minuten lang bei 220 x g und 4 °C zentrifugiert.
- Resuspendieren Sie die Zellen in DMEM-S (Schritt 1.6) und lagern Sie sie auf Eis.
4. Bestimmung der Reinheit/Lebensfähigkeit
- Für die Quantifizierung lebensfähiger Zellen mit einer Hämozytometerkammer wird eine 0,4%ige Trypanblaufärbung verwendet (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Im Durchschnitt liefert eine einzelne Maus 4-6 Millionen Zellen. - Um lebensfähige Zellen mit einem Durchflusszytometer zu quantifizieren, verwenden Sie die kommerziell erhältliche aminreaktive Fluoreszenzfarbstofffärbung (siehe Materialtabelle).
- 1 Million Zellen in ein 5-ml-Polystyrol-Rundbodenröhrchen (FACS) überführen. Verdünnen Sie den Fluoreszenzfarbstoff mit PBS in einem Verhältnis von 1:1000 (wodurch die Arbeitslösung für die Lebensfähigkeit entsteht).
- Die Proben werden mit der Viabilitätslösung im Dunkeln bei 4 °C für 30 min inkubiert. Waschen Sie die Zellen zweimal mit eiskaltem PBS. Resuspendieren Sie die Zellen in 400 μl Färbepuffer (Schritt 1.4).
- Blockieren Sie die Zellen mit 2,4G2 Anti-FcRIII/I (siehe Materialtabelle) im eiskalten Färbepuffer für 15 min bei 4 °C.
- Formulieren Sie den Antikörper-Färbecocktail durch Zugabe der fluoreszenzmarkierten monoklonalen Antikörper CD45-PerCP und CD11b-eFluor 450 zum Färbepuffer (in einer Verdünnung von 1:300) (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Obwohl beide Techniken verfügbar sind, wählen Sie diejenige aus, die am besten zum nachfolgenden Protokoll passt. - Die Proben mit dem Antikörper-Färbecocktail werden im Dunkeln bei 4 °C für 30 min inkubiert. Waschen Sie die Zellen zweimal mit eiskaltem Färbepuffer. Resuspendieren Sie die Zellen in 400 μl Färbepuffer.
- Erfassen Sie 250.000 Ereignisse auf einem Durchflusszytometer, wie durch die Gating-Strategie in Schritt 6 beschrieben (Abbildung 4).
5. Immunfluoreszenz-Färbung
- Legen Sie ein vorbehandeltes Deckglas in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte.
HINWEIS: Um Deckgläser zu behandeln, geben Sie sie in eine Petrischale mit 500 μl L-Polylysin-Lösung (0,01 mg/ml, siehe Materialtabelle) und inkubieren Sie sie 1 Stunde lang. Waschen Sie sie anschließend dreimal mit destilliertem Wasser und lassen Sie sie trocknen. - Säen Sie 200.000 Zellen mit 500 μl DMEM-S-Lösung auf das behandelte Deckglas. 24 Stunden inkubieren.
- Entfernen Sie die Deckgläser und fixieren Sie die Zellen mit 3,7 % Paraformaldehyd (PFA) für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Deckgläser dreimal mit eiskaltem PBS.
- Permeabilisieren Sie die Zellen mit 0,2% Triton X-100 in PBS für 15 min bei Raumtemperatur. Anschließend die Deckgläser dreimal mit kaltem PBS waschen. Blockieren Sie die Zellen mit 0,2% BSA in PBS für 1 h bei Raumtemperatur.
- Die fluoreszenzmarkierten monoklonalen Antikörper (in einer Verdünnung von 1:300, siehe Materialtabelle) werden in der Blockierungslösung verdünnt und 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Waschen Sie die Deckgläser dreimal mit eiskaltem PBS.
- Tragen Sie DAPI-haltiges Eindeckmedium auf den Objektträger auf und versiegeln Sie es dann mit einem Deckglas.
HINWEIS: Die Objektträger können sofort mit einem Fluoreszenz- oder Konfokalmikroskop analysiert oder bis zu 3 Monate bei -20 °C gelagert werden.
6. Gating-Strategie für Rückenmarksmikroglia
- Generieren Sie ein Punktdiagramm und richten Sie ein Gate ein, um lebensfähige Zellen auf der Grundlage der Viabilitätsfärbung und eines leeren Fluoreszenzkanalszu isolieren 16. Schließen Sie nicht lebensfähige Zellen aus.
- Erstellen Sie ein weiteres Diagramm unter Verwendung von Vorwärts- und Seitenstreuparametern, um Trümmerzu eliminieren 16.
- Entwicklung eines zusätzlichen Punktdiagramms und Analyse der Expression von CD11b und CD45 zur Differenzierung von Mikroglia.
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Representative Results
Unter Verwendung von Rückenmarksgewebe von Mäusen wurde die enzymatische Verdauung mit einer Mischung durchgeführt, die stark mit Kollagenase und Thermolysin angereichert war. Das resultierende verdaute Gewebe wurde durch einen 40-μm-Filter geleitet, um unverdautes Material zu eliminieren. Die gesammelten Zellen wurden durch einen Percoll-Dichtegradienten angereichert, wobei 90 % im unteren und 45 % im oberen Teil lagen. Die mit Mikroglia angereicherten Zellen innerhalb der Grenzfläche wurden dann mit CD45- und CD11b-Antikörpern gefärbt und einer durchflusszytometrischen Analyse unterzogen (Abbildung 1).
Bei der Dissektion der Wirbelsäule, die sich von der Hinterhauptsregion bis zum Kreuzbein erstreckt, wird die paravertebrale Muskulatur freigelegt und dissektioniert. Um die Wirbelsäule zu entlasten, wurden die Rippenbögen freigelegt und von Wirbel T13 bis T1 vermessen. Die Wirbelsäule, die mit dem Schädel und dem Kreuzbein artikuliert, wurde sichtbar und auf jeder Seite wurde ein Schnitt durchgeführt, um sie vollständig zu befreien (Abbildung 2).
Die Extraktion des Rückenmarks erfolgte durch einen seitlichen Schnitt in die Wirbelkörper, wodurch ein Kanal gebildet wurde. Bei der Entfernung des Rückenmarks wurden die peripheren Nerven durchtrennt, um eine Kontamination durch periphere Makrophagen zu verhindern. Anschließend wurde das gewonnene Rückenmark über den Seziertisch verteilt und in 2 mm große Stücke geschnitten, die der Aufschlusslösung zugesetzt wurden (Abbildung 3). Zum ersten Mal wird über die Verwendung von Liberase für die Verdauung des Rückenmarks berichtet, was zu 4 bis 6 Millionen hochlebensfähigen Mikrogliazellen pro erwachsener Maus führt. Die optimale Lebensfähigkeit, die durch diesen Prozess erreicht wird, liegt zwischen 80 % und 99 %.
Um den Reinigungsprozess zu bestätigen, wurde eine FACS-Färbung der Mikroglia mit CD45- und CD11b-Antikörpern durchgeführt. Der Reinigungsprozess erwies sich als effizient und lieferte bis zu 99 % Mikrogliazellen (Abbildung 4). Darüber hinaus wurde eine Immunfluoreszenzfärbung an den erhaltenen Mikroglia mit den gleichen Antikörpern durchgeführt, wobei doppelt positive Zellen mit einer durchschnittlichen Größe von 10 μm beobachtet wurden - was mit der berichteten Größe der nicht aktivierten Mikroglia übereinstimmt. Dies deutet darauf hin, dass diese Zellen für Aktivierungsstudien geeignet sind (Abbildung 4E). Es ist plausibel, dass bei Entzündungsprozessen andere Immunzellen vorhanden sind oder dass Mikroglia unter verschiedenen Reizen morphologische Veränderungen erfahren. In solchen Fällen wird der Einbau spezifischer Marker zur Identifizierung jeder Zellpopulation empfohlen.
Abbildung 1: Schematische Übersicht des Protokolls zur Reinigung von Mikroglia im Rückenmark. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Verfahren zur Rückenmarksdissektion. Nach der Euthanasie wurde die Wirbelsäule der Maus isoliert und präpariert. (A) Schrittweise Hautdissektion, die sich vom Okzipital- bis zum Schwanzbereich erstreckt und die paravertebrale Muskulatur freilegt. (B) Sequentielle Dissektion durch die Schichten der paravertebralen Muskeln. (C) Entfernung der Wirbelsäule nach dem Rippenschnitt. (D) Darstellung eines intakten Rückenmarks innerhalb des Wirbelkanals. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Rückenmarksextraktion und Verdauungsprozess . (A) Sequentielle spinale Laminektomie mit zwei ca. 2 mm großen Schnitten. (B) Freiliegendes Rückenmark. (C) Entfernung des Rückenmarks. (D) Periphere Nervendurchtrennung. (E) Das Rückenmark wurde in 2 mm große Abschnitte geteilt und in das Verdauungsmedium gegeben. (F) Standard-Inkubation bei 37 °C für den Gewebeaufschluss. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Bewertung der Zellreinheit und Lebensfähigkeit. Immunfärbung von gereinigten Zellen mit Hilfe von Mikroglia-spezifischen Markern. (A) Identifizierung lebender Zellen (fluoreszierende farbstoffnegative Zellen). (B) Auswahl auf Basis der Zellengröße. (C) CD45low- und CD11b+-Zellen, die eine Reinheit von mehr als 99 % aufweisen. (D) Durchschnittliche Lebensfähigkeit (87,46 ± SD 1,468) und durchschnittliche Reinheit (88,51 ± SD 3,948; n = 5). (E) Immunfluoreszenz zur Darstellung der CD45+- und CD11b+-Färbung in gereinigten Zellen. Die Bilder wurden mit einem konfokalen Mikroskop mit einem Weißlichtlaser bei 60-facher Vergrößerung (Maßstabsbalken = 5 μm) aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Für die Untersuchung von Mikroglia wurden aufgrund ihrer Bedeutung für die Homöostase des Gehirns zahlreiche Protokolle entwickelt. Bei diesen Methoden werden Mikroglia typischerweise aus den Großhirnhemisphären von embryonalen oder neonatalen Ratten und Mäusen gewonnen17. Eine begrenzte Anzahl von Studien befasste sich mit der Reinigung von Mikroglia aus dem Rückenmark erwachsener Mäuse13,14. Diese Techniken beinhalten eine enzymatische Verdauung unter Verwendung von Kollagenase und/oder Papain zusammen mit DNAse, oft in Kombination mit einer Gradiententrennung mit Percoll oder OptiPrep. Der Einsatz eines Papain-basierten Rückenmarksaufschlusses ohne Gradiententrennung kann jedoch auch nach Entfernung der Pia mater zu einer Astrozytenkontamination führen14,17.
In dieser Studie wird ein Protokoll zur Reinigung von Mikroglia aus dem Rückenmark erwachsener Mäuse vorgestellt. Das Protokoll verwendet eine präzise Mischung aus Kollagenase I und II zusammen mit Thermolysin, einer Kombination, die dafür bekannt ist, verschiedene Gewebe mit kontrolliertem Abbau effizient zu verdauen18 und so die Apoptose aufgrund ihres geringen Gehalts an neutralen Proteasen zu reduzieren. Hirnhäute oder die Pia mater, häufig Quellen der Astrozytenkontamination, können durch die Verwendung eines Percoll-Gradienten in diesem Verfahren eliminiert werden, wodurch die Notwendigkeit entfällt, diese Schichten zu entfernen (Abbildung 1).
Die Heterogenität der Mikroglia entsteht durch unterschiedliche Morphologien im Rückenmark und im Gehirn8. Dieses Protokoll wurde jedoch auch auf Großhirnhemisphären mit ähnlichen Ergebnissen angewendet (Daten nicht präsentiert), was seine Robustheit für die Analyse von Rückenmark und zerebralen Mikroglia unterstreicht.
Mit diesem Protokoll können hohe Reinheitsgrade (von 80 % bis 99 %) und Viabilität (85 % bis 98 %) erreicht werden. Die Verarbeitung von Zellen aus dem Nervensystem ist kompliziert, vor allem, weil die Lebensfähigkeit der Zellen wesentlich von der Verarbeitungsdauer beeinflusst wird. Eine Hypoxie von mehr als 20 Minuten kann tödlich sein. Für eine optimale Lebensfähigkeit wird empfohlen, die Verarbeitungszeit von der Rückenmarksextraktion bis zum Aufschluss auf nicht mehr als 10 Minuten zu begrenzen. Diese Beschreibung ist auf gesunde Mäuse im Alter von 8 bis 10 Wochen zugeschnitten, was eine weitere Standardisierung für jüngere oder ältere Mäuse erforderlich macht. Eine suboptimale Lebensfähigkeit impliziert eine Überverdauung des Gewebes, was eine Wiederholung erfordert. Alternativ kann die FACS-Sortierung Zellen aus überverdauten Proben retten.
Die Anwendung von Liberase zur Verdauung und Reinigung von Rückenmarksmikroglia ist neuartig. Seine begrenzte Verwendung in Geweben des Nervensystems war in der Vergangenheit auf Probleme mit der Lebensfähigkeit zurückzuführen18,19. Diese Studie zeigt jedoch eine erhöhte Lebensfähigkeit bei Verwendung dieser sorgfältig gereinigten Kollagenase. Alternativ könnten auch andere Kollagenasen mit geringerer Potenz erforscht werden.
Mehrere wichtige Überlegungen müssen berücksichtigt werden, wie z. B. das Vorhandensein von Neuroinflammation, eine Beeinträchtigung der Blut-Hirn-Schranke und das Alter der Mäuse. Diese Faktoren verändern sowohl die Morphologie als auch die Häufigkeit der Mikroglia. Bei Neuroinflammation oder Störung der Blut-Hirn-Schranke können Immunzellen, die CD45 und CD11b exprimieren, infiltrieren und die Reinheit der Mikroglia verringern. Da Mikroglia bei verschiedenen neuroinflammatorischen Erkrankungen umfassend erforscht werden, birgt dieses Protokoll Potenzial für pathologische und neurophysiologische Untersuchungen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Stipendien des National Council of Science and Technology (CONACYT) unterstützt (702361). Die Autoren würdigen das Ph.D.-Programm in Biological Chemical Sciences der National School of Biological Sciences des National Polytechnic Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL collection tubes | Corning, USA | 430790 | |
| 2 mL microtubes | Axygen, USA | MCT-200-G | |
| 2.4G2 anti-FcR | BioLegend, USA | 101302 | |
| 50 mL collection tubes | Corning, USA | 430829 | |
| 70% ethanol | |||
| Antibiotic-Antimycotic (penicillin, streptomycin, amphotericin b) | Gibco, USA | 15240062 | |
| Antibody CD11b eFluor 450 anti-mouse | eBioscience, USA | 48-0112 | |
| Antibody CD45 PerCP anti-mouse | BioLegend, USA | 103130 | |
| Balanced salt solution (PBS) calcium- magnesium-free | Corning, USA | 46-013-CM | |
| Blue Cell Strainer 40 μm | Corning, USA | 352340 | |
| Costar 6-well Clear Not Treated | Corning, USA | CLS3736 | |
| Coverslips | |||
| Digital Heating Shaking Drybath | Thermo Scientific Digital HS Drybath, USA | 88870001 | |
| Dissecting forceps for microsurgery | FT by DUMONT | ||
| DNase | Roche, USA | 4536282001 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium-high glucose (DMEM) | Merck, USA | D6429 | |
| Electric shaver | |||
| FACS tube | Thermo, USA | 352058 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAN Biotech, Alemania | P30-3306 | |
| Flow cytometer Cytoflex | Beckman Coulter | ||
| Hank’s balanced salt solution | Merck, USA | H2387 | |
| L-glutamine | Corning, USA | 15393631 | |
| Liberase TM | Roche, USA | 5401119001 | |
| Neubauer chamber Counting Chambers | China | 1103 | |
| Pentobarbital | |||
| Percoll | Merck, USA | 17089101 | density gradient centrifugation |
| Poly-L-lysine solution | Merck, USA | P8920 | |
| Scalpel No. 25 | HERGOM, Mexico | H23 | |
| Snaplock Microcentrifuge Tubes 2 mL | Axygen, USA | 10011-680 | |
| Stereoscopic microscope | Velab, Mexico | HG927831 | |
| Straight surgical scissors (10 cm) | HERGOM, Mexico | ||
| Straight Vannas scissors | HERGOM, Mexico | ||
| Triton X100 | Merck, USA | X100 | |
| Trypan blue Stain 0.4% | Merck, USA | 15250-061 | |
| Vortex mixer | DLAB, China | 8031102000 | |
| Zombie Aqua Fixable Viability Kit | BioLegend, USA | 423102 | amine-reactive fluorescent dye staining |
References
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