Summary
Le microglia sono considerate alcune delle cellule più versatili del corpo, capaci di adattamento morfologico e funzionale. La loro eterogeneità e multifunzionalità consente il mantenimento dell'omeostasi cerebrale, pur essendo legata a diverse patologie neurologiche. Qui viene descritta una tecnica per purificare la microglia del midollo spinale.
Abstract
La colonna vertebrale definisce un vertebrato e modella il canale spinale, una cavità che racchiude e protegge il midollo spinale. Il corretto sviluppo e la funzione del sistema nervoso centrale dei mammiferi dipendono in modo significativo dall'attività dei macrofagi residenti noti come microglia. Le microglia mostrano eterogeneità e multifunzionalità, consentendo un'espressione genica e un comportamento distinti all'interno del midollo spinale e del cervello. Numerosi studi hanno esplorato la funzione della microglia cerebrale, descrivendo in dettaglio i metodi di purificazione. Tuttavia, la purificazione della microglia dal midollo spinale nei topi manca di una descrizione completa. Al contrario, l'utilizzo di una collagenasi altamente purificata, al contrario di un estratto non raffinato, manca di segnalazione all'interno dei tessuti del sistema nervoso centrale. In questo studio, la colonna vertebrale e il midollo spinale sono stati asportati da topi C57BL/6 di 8-10 settimane. La successiva digestione ha impiegato una collagenasi altamente purificata e la purificazione della microglia ha utilizzato un gradiente di densità. Le cellule sono state sottoposte a colorazione per citometria a flusso, valutando la vitalità e la purezza attraverso la colorazione CD11b e CD45. I risultati hanno prodotto una vitalità media dell'80% e una purezza media del 95%. In conclusione, la manipolazione della microglia di topo ha comportato la digestione con una collagenasi altamente purificata, seguita da un gradiente di densità. Questo approccio ha effettivamente prodotto consistenti popolazioni di microglia del midollo spinale.
Introduction
La caratteristica distintiva dei vertebrati è la colonna vertebrale o colonna vertebrale, in cui la notocorda è stata sostituita da una sequenza di ossa segmentate chiamate vertebre, divise da dischi intervertebrali. Questa successione di materiale osseo modella il canale spinale, una cavità che racchiude e protegge il midollo spinale1. Nel genere Rodentia, la colonna vertebrale è solitamente formata da sette vertebre cervicali, tredici vertebre toraciche, sei vertebre lombari e un numero variabile di vertebre caudali 2,3. La lunghezza del midollo spinale è simile a quella della colonna vertebrale e il filum terminale è una struttura non nervosa che ancora il midollo spinale all'osso sacro. Inoltre, le fibre nervose escono attraverso il forame intervertebrale1.
Lo sviluppo e il corretto funzionamento del sistema nervoso centrale nei mammiferi dipendono in modo critico dall'attività dei macrofagi residenti nel sistema nervoso, chiamati microglia4. Sebbene le microglia siano state inizialmente descritte come fagociti residenti nel cervello, recenti ricerche hanno attribuito molte funzioni dinamiche a queste cellule 5,6. La dimensione della microglia varia da 7 a 10 μm in omeostasi; Sono considerate tra le cellule più versatili dell'organismo e possono adattarsi morfologicamente e funzionalmente al loro ambiente in continua evoluzione7. Queste cellule mostrano un'elevata eterogeneità sia durante la fase embrionale che adulta8,9, mentre nella fase adulta mostrano anche una complessa eterogeneità funzionale in base al loro contesto spazio-temporale10. L'eterogeneità e le molteplici funzioni della microglia consentono l'espressione genica differenziale e il comportamento nel midollo spinale e nel cervello. È stato dimostrato che l'espressione di CD11b, CD45, CD86 e CCR9 è maggiore nel midollo spinale rispetto al cervello 8,9.
Esistono diversi protocolli per l'isolamento della microglia cerebrale11,12; tuttavia, ne esistono solo pochi per la microglia del midollo spinale13,14. L'ottimizzazione di un metodo per la purificazione della microglia dal midollo spinale facilita lo sviluppo di molteplici studi incentrati sulla scoperta della fisiologia della microglia. Questo protocollo ha lo scopo di descrivere un'estrazione semplice e altamente riproducibile del midollo spinale di topo e la purificazione della microglia (Figura 1).
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Protocol
Lo studio è stato condotto in conformità con lo standard ufficiale messicano NOM-062-ZOO-1999 e la guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. L'approvazione per lo studio è stata ottenuta dai Comitati di Ricerca, Etica e Biosicurezza dell'Ospedale Pediatrico del Messico (HIM/2023/006) e dal Comitato di Ricerca e Bioetica dell'Ospedale Generale del Messico Eduardo Liceaga (DI/21/501/04/62). Tre topi C57BL/6 di età compresa tra 6 e 8 settimane sono stati ottenuti dall'Ospedale Pediatrico del Messico, dove sono stati allevati in condizioni isolate in rack ventilati, in conformità con le linee guida istituzionali per la cura e l'uso degli animali.
1. Preparazione dei materiali e dei reagenti
- Preriscaldare il PBS privo di Ca 2+ e Mg2+ e la soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) a 37 °C.
- Integrare la soluzione di HBSS con 100 μg/mL di Liberase e 4 μg/mL di DNasi (HBSS-LD). Assicurarsi che la soluzione mantenga un pH fisiologico di 7,4.
NOTA: Sarà necessario 1 mL di soluzione di lavoro per midollo spinale. - Preparare una soluzione isotonica al 90% per la centrifugazione in gradiente di densità (disponibile in commercio, vedere la tabella dei materiali) e preriscaldarla a 37 °C.
- Preparare il tampone colorante combinando il siero fetale bovino inattivato al 5% (FBS) con PBS e conservare la miscela su ghiaccio.
- Preriscaldare Dulbecco's Modified Eagle's Glucosio medio-alto (1 g/L) (DMEM) a 37 °C.
- Integrare il terreno DMEM con il 10% di FBS, 2 mM di L-glutammina, 200 U/mL di penicillina, 200 μg/mL di streptomicina e 500 pg/mL di amfotericina B (vedere la tabella dei materiali) per preparare DMEM-S.
2. Dissezione e preparazione del midollo spinale
- Sopprimere il topo con un sovradosaggio intraperitoneale di pentobarbital alla dose di 150 mg/kg. Sterilizza il torace e la schiena del topo usando etanolo al 70%.
NOTA: Verificare che l'eutanasia sia andata a buon fine prima di procedere con la dissezione del topo. - Radere la regione toracolombare e fissare le estremità alla tavola di dissezione con nastro adesivo.
- Usando un bisturi, praticare un'incisione accurata lungo la linea mediana dorsale dalla regione occipitale a quella sacrale (Figura 2).
- Con l'ausilio di un microscopio operatorio stereoscopico, sezionare a strati fino a raggiungere la colonna lombare e identificare l'ultima arcata costale.
NOTA: Le 13 arcate costali sono articolate nelle vertebre toraciche; una volta sezionati, diventano visibili superiormente alla vertebraL1 2. - Determinare l'ultima vertebra cervicale e l'osso sacro, quindi praticare un taglio per separare la colonna vertebrale (Figura 2).
- Utilizzando una pinza da dissezione, eseguire una laminectomia dorsale delle vertebre per estrarre il midollo spinale (Figura 3A-D).
NOTA: Ad eccezione delle prime due vertebre cervicali (atlante e asse), tutte le vertebre mobili condividono un disegno morfologico comune in varie regioni (cervicale, toracica o lombare). Ogni tipica vertebra mobile presenta un corpo vertebrale cilindrico alla sua estremità anteriore. Attaccato alla parte posteriore del corpo c'è un arco osseo noto come arco vertebrale (arco neurale), costituito da lamine e processi spinosi. Tra queste strutture si trova il forame vertebrale15. - Rimuovere i nervi che emergono attraverso i forami (radici dorsali e ventrali) che costituiscono il sistema nervoso periferico e possono contenere macrofagi infiltrati (Figura 3D).
NOTA: Non è necessario rimuovere la pia madre o le meningi poiché il mezzo a gradiente di densità elimina efficacemente gli astrociti contaminanti. Inoltre, il mantenimento delle meningi riduce il tempo di purificazione e migliora la vitalità.
3. Digestione tissutale e isolamento della microglia
- Posizionare il midollo spinale sulla tavola da dissezione e, usando le forbici Vannas, tagliare il midollo spinale in pezzi di 2 mm, ottenendo una media di 10 pezzi.
- Trasferire le sezioni del midollo spinale in una microprovetta a fondo piatto da 2 mL (Figura 3E,F).
- Aggiungere 1 mL della soluzione di lavoro HBSS-LD (passaggio 1.2). Incubare a 37 °C per 25 min, vostrando energicamente ogni 5 min.
- Passare il contenuto di ogni digestione attraverso un colino da 40 μm, quindi aggiungere 7 mL di HBSS con FBS al 2% per neutralizzare la digestione.
- Frantumare il tessuto rimanente utilizzando uno stantuffo per siringa da 1 ml. Centrifugare la sospensione in una provetta conica da 50 mL per 5 minuti a 220 x g, 4 °C.
- Scartare il surnatante utilizzando una micropipetta da 1 mL e risospendere il pellet in 2 mL di HBSS con FBS al 2% in una provetta conica da 15 mL. Combinare con 2 mL di terreno a gradiente di densità isotonica al 90%. Centrifugare per 25 minuti a 160 x g, 18 °C.
NOTA: Utilizzare un'accelerazione lenta ed evitare di utilizzare il freno. - Utilizzare una pipetta di trasferimento per recuperare l'interfaccia e trasferirla in una provetta conica da 15 mL. Lavare le cellule con 10 mL di PBS e centrifugare per 5 minuti a 220 x g, 4 °C.
- Risospendere le cellule in DMEM-S (passaggio 1.6) e conservarle sul ghiaccio.
4. Determinazione della purezza/vitalità
- Per quantificare le cellule vitali utilizzando una camera emocitometrica, utilizzare un colorante blu di tripano allo 0,4% (vedi Tabella dei materiali).
NOTA: In media, un singolo topo fornisce 4-6 milioni di cellule. - Per quantificare le cellule vitali tramite un citometro a flusso, utilizzare la colorazione fluorescente reattiva alle ammine disponibile in commercio (vedere la tabella dei materiali).
- Trasferire 1 milione di cellule in una provetta a fondo tondo in polistirene da 5 mL (FACS). Diluire il colorante fluorescente con PBS in un rapporto di 1:1000 (creando la soluzione di lavoro di vitalità).
- Incubare i campioni con la soluzione vitale al buio a 4 °C per 30 minuti. Lavare le celle con PBS ghiacciato due volte. Risospendere le cellule in 400 μL di tampone colorante (passaggio 1.4).
- Bloccare le cellule con 2.4G2 anti-FcRIII/I (vedere la tabella dei materiali) nel tampone di colorazione ghiacciato per 15 minuti a 4 °C.
- Formulare il cocktail di colorazione degli anticorpi aggiungendo gli anticorpi monoclonali marcati con fluorescenza CD45-PerCP e CD11b-eFluor 450 al tampone colorante (a una diluizione di 1:300) (vedere Tabella dei materiali).
NOTA: Sebbene siano disponibili entrambe le tecniche, scegliere quella che meglio si allinea con il protocollo successivo. - Incubare i campioni con il cocktail colorante anticorpale al buio a 4 °C per 30 minuti. Lavare due volte le cellule con tampone colorante ghiacciato. Risospendere le cellule in 400 μL di tampone colorante.
- Acquisire 250.000 eventi su un citometro a flusso, come descritto dalla strategia di gating nel passaggio 6 (Figura 4).
5. Colorazione immunofluorescente
- Posizionare un vetrino coprioggetto pretrattato in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti.
NOTA: Per trattare i vetrini coprioggetti, metterli in una capsula di Petri con 500 μL di soluzione di L-polilisina (0,01 mg/mL, vedere la tabella dei materiali) e incubare per 1 ora. Successivamente, lavali tre volte con acqua distillata e lasciali asciugare. - Seminare 200.000 cellule sul vetrino coprioggetto trattato utilizzando 500 μL di soluzione DMEM-S. Incubare per 24 ore.
- Rimuovere i vetrini coprioggetti e fissare le celle con paraformaldeide (PFA) al 3,7% per 20 minuti a temperatura ambiente. Lavare i vetrini coprioggetti tre volte con PBS ghiacciato.
- Permeabilizzare le cellule con Triton X-100 allo 0,2% in PBS per 15 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, lavare i vetrini coprioggetti tre volte con PBS freddo. Bloccare le celle con BSA allo 0,2% in PBS per 1 ora a temperatura ambiente.
- Diluire gli anticorpi monoclonali marcati con fluorescenza (a una diluizione di 1:300, vedere la tabella dei materiali) nella soluzione bloccante e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare i vetrini coprioggetti tre volte con PBS ghiacciato.
- Applicare il mezzo di montaggio contenente DAPI sul vetrino, quindi sigillarlo con un vetrino coprioggetti.
NOTA: I vetrini possono essere immediatamente analizzati utilizzando un microscopio a fluorescenza o confocale, oppure possono essere conservati per un massimo di 3 mesi a -20°C.
6. Strategia di gating per la microglia del midollo spinale
- Generare un dot plot e stabilire un gate per isolare le cellule vitali in base alla colorazione di vitalità e a un canale fluorescente vuoto16. Escludi le cellule non vitali.
- Produrre un altro grafico utilizzando i parametri di dispersione in avanti e laterale per eliminare i detriti16.
- Sviluppare un ulteriore dot plot e analizzare l'espressione di CD11b e CD45 per differenziare la microglia.
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Representative Results
Utilizzando il tessuto del midollo spinale di topo, la digestione enzimatica è stata eseguita utilizzando una miscela altamente arricchita con collagenasi e termolisina. Il tessuto digerito risultante è stato sottoposto a passaggio attraverso un filtro da 40 μm per eliminare il materiale non digerito. Le cellule raccolte sono state arricchite attraverso un gradiente di densità Percoll, con il 90% nella porzione inferiore e il 45% nella porzione superiore. Le cellule arricchite di microglia all'interno dell'interfaccia sono state quindi colorate con anticorpi CD45 e CD11b e sottoposte ad analisi citofluorimetrica (Figura 1).
La dissezione della colonna vertebrale che si estende dalla regione occipitale all'osso sacro, comporta l'esposizione e la dissezione della muscolatura paravertebrale. Per rilasciare la colonna vertebrale, gli archi costali sono stati esposti e la loro misurazione è stata eseguita dalla vertebra T13 a T1. La colonna vertebrale, che si articola con il cranio e l'osso sacro, è diventata visibile ed è stato eseguito un taglio su ciascun lato per liberarla completamente (Figura 2).
L'estrazione del midollo spinale è stata ottenuta attraverso un'incisione laterale nei corpi vertebrali, formando un canale. Durante la rimozione del midollo spinale, i nervi periferici sono stati recisi per prevenire la contaminazione da parte dei macrofagi periferici. Successivamente, il midollo spinale ottenuto è stato distribuito sul tavolo di dissezione e sezionato in pezzi di 2 mm, che sono stati aggiunti alla soluzione di digestione (Figura 3). L'uso di liberasi per la digestione del midollo spinale è stato segnalato per la prima volta, producendo da 4 a 6 milioni di cellule microgliali altamente vitali per topo adulto. La redditività ottimale ottenuta attraverso questo processo varia dall'80% al 99%.
Per confermare il processo di purificazione, è stata eseguita la colorazione FACS della microglia utilizzando gli anticorpi CD45 e CD11b. Il processo di purificazione ha dimostrato efficienza, producendo fino al 99% di cellule microgliali (Figura 4). Inoltre, la colorazione in immunofluorescenza è stata condotta sulla microglia ottenuta utilizzando gli stessi anticorpi, osservando cellule doppie positive con una dimensione media di 10 μm, coerente con la dimensione riportata della microglia non attivata. Ciò suggerisce che queste cellule sono adatte per studi di attivazione (Figura 4E). È plausibile che altre cellule immunitarie possano essere presenti durante i processi infiammatori o che la microglia possa subire cambiamenti morfologici sotto stimoli diversi. In questi casi, si raccomanda l'incorporazione di marcatori specifici per l'identificazione di ciascuna popolazione cellulare.
Figura 1: Panoramica schematica del protocollo di purificazione della microglia del midollo spinale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Procedura di dissezione del midollo spinale. Dopo l'eutanasia, la colonna vertebrale del topo è stata isolata e sezionata. (A) Dissezione cutanea graduale che si estende dalle regioni occipitali a quelle caudali, rivelando la muscolatura paravertebrale. (B) Dissezione sequenziale attraverso gli strati dei muscoli paravertebrali. (C) Rimozione della colonna vertebrale dopo il taglio delle costole. (D) Visualizzazione di un midollo spinale intatto all'interno del canale vertebrale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Processo di estrazione e digestione del midollo spinale . (A) Laminectomia spinale sequenziale con due tagli di circa 2 mm. (B) Midollo spinale esposto. (C) Rimozione del midollo spinale. (D) Sezione dei nervi periferici. (E) Il midollo spinale è stato diviso in sezioni di 2 mm e posto nel mezzo di digestione. (F) Incubazione standard a 37 °C per la digestione dei tessuti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Valutazione della purezza e della vitalità cellulare. Immunocolorazione di cellule purificate utilizzando marcatori specifici per la microglia. (A) Identificazione di cellule vive (cellule fluorescenti coloranti negativi). (B) Selezione basata sulla dimensione delle celle. (C) Cellule CD45low e CD11b+, che dimostrano una purezza superiore al 99%. (D) Vitalità media (87,46 ± DS 1,468) e purezza media (88,51 ± DS 3,948; n = 5). (E) Immunofluorescenza che raffigura la colorazione di CD45+ e CD11b+ in cellule purificate. Le immagini sono state catturate utilizzando un microscopio confocale con un laser a luce bianca con un ingrandimento di 60x (barra della scala = 5 μm). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Numerosi protocolli sono stati sviluppati per lo studio della microglia a causa della loro importanza nell'omeostasi cerebrale. In questi metodi, le microglia provengono tipicamente dagli emisferi cerebrali di ratti e topi embrionali o neonatali17. Un numero limitato di studi ha affrontato la purificazione della microglia dal midollo spinale di topi adulti13,14. Queste tecniche prevedono la digestione enzimatica utilizzando collagenasi e/o papaina insieme alla DNAsi, spesso combinata con la separazione del gradiente utilizzando Percoll o OptiPrep. Tuttavia, l'impiego della digestione del midollo spinale a base di papaina senza separazione del gradiente può portare alla contaminazione degli astrociti, anche dopo la rimozione della pia madre14,17.
Questo studio presenta un protocollo per la purificazione della microglia dal midollo spinale del topo adulto. Il protocollo utilizza una precisa miscela di collagenasi I e II insieme a termolisina, una combinazione nota per digerire in modo efficiente diversi tessuti con degradazione controllata18, riducendo così l'apoptosi grazie al suo basso contenuto di proteasi neutre. Le meningi o la pia madre, spesso fonti di contaminazione da astrociti, possono essere eliminate attraverso l'uso di un gradiente di Percoll in questa procedura, annullando la necessità di rimuovere questi strati (Figura 1).
L'eterogeneità microgliale deriva da morfologie distinte nel midollo spinale e nel cervello8. Tuttavia, questo protocollo è stato applicato anche a emisferi cerebrali con esiti simili (dati non presentati), evidenziando la sua robustezza per l'analisi sia del midollo spinale che della microglia cerebrale.
Con questo protocollo è possibile ottenere costantemente elevati livelli di purezza (dall'80% al 99%) e di vitalità (dall'85% al 98%). L'elaborazione delle cellule del sistema nervoso è complessa, principalmente perché la vitalità cellulare è sostanzialmente influenzata dalla durata dell'elaborazione; L'ipossia superiore a 20 minuti può essere letale. Per una vitalità ottimale, si consiglia di limitare il tempo di lavorazione dall'estrazione del midollo spinale alla digestione a non più di 10 minuti. Questa descrizione è adattata a topi sani di età compresa tra 8 e 10 settimane, richiedendo un'ulteriore standardizzazione per topi più giovani o più anziani. Una vitalità non ottimale implica un'eccessiva digestione dei tessuti, che ne richiede la ripetizione. In alternativa, la selezione FACS può salvare le cellule da campioni troppo digeriti.
L'applicazione di liberase per la digestione e la purificazione della microglia del midollo spinale è nuova. Il suo uso limitato nei tessuti del sistema nervoso è stato storicamente dovuto a problemi di vitalità18,19. Questo studio, tuttavia, dimostra una maggiore vitalità quando si utilizza questa collagenasi meticolosamente purificata. In alternativa, potrebbero essere esplorate altre collagenasi con potenza inferiore.
Diverse considerazioni cruciali devono essere riconosciute, come la presenza di neuroinfiammazione, la compromissione della barriera emato-encefalica e l'età del topo. Questi fattori alterano sia la morfologia che la frequenza della microglia. Nei casi di neuroinfiammazione o di rottura della barriera emato-encefalica, le cellule immunitarie che esprimono CD45 e CD11b possono infiltrarsi, diminuendo la purezza della microglia. Poiché le microglia sono ampiamente esplorate in varie condizioni neuroinfiammatorie, questo protocollo ha il potenziale per indagini patologiche e neurofisiologiche.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della borsa di studio concessa dal Consiglio Nazionale della Scienza e della Tecnologia (CONACYT) (702361). Gli autori riconoscono il programma di dottorato di ricerca in Scienze Chimiche Biologiche della Scuola Nazionale di Scienze Biologiche del National Polytechnic Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL collection tubes | Corning, USA | 430790 | |
| 2 mL microtubes | Axygen, USA | MCT-200-G | |
| 2.4G2 anti-FcR | BioLegend, USA | 101302 | |
| 50 mL collection tubes | Corning, USA | 430829 | |
| 70% ethanol | |||
| Antibiotic-Antimycotic (penicillin, streptomycin, amphotericin b) | Gibco, USA | 15240062 | |
| Antibody CD11b eFluor 450 anti-mouse | eBioscience, USA | 48-0112 | |
| Antibody CD45 PerCP anti-mouse | BioLegend, USA | 103130 | |
| Balanced salt solution (PBS) calcium- magnesium-free | Corning, USA | 46-013-CM | |
| Blue Cell Strainer 40 μm | Corning, USA | 352340 | |
| Costar 6-well Clear Not Treated | Corning, USA | CLS3736 | |
| Coverslips | |||
| Digital Heating Shaking Drybath | Thermo Scientific Digital HS Drybath, USA | 88870001 | |
| Dissecting forceps for microsurgery | FT by DUMONT | ||
| DNase | Roche, USA | 4536282001 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium-high glucose (DMEM) | Merck, USA | D6429 | |
| Electric shaver | |||
| FACS tube | Thermo, USA | 352058 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAN Biotech, Alemania | P30-3306 | |
| Flow cytometer Cytoflex | Beckman Coulter | ||
| Hank’s balanced salt solution | Merck, USA | H2387 | |
| L-glutamine | Corning, USA | 15393631 | |
| Liberase TM | Roche, USA | 5401119001 | |
| Neubauer chamber Counting Chambers | China | 1103 | |
| Pentobarbital | |||
| Percoll | Merck, USA | 17089101 | density gradient centrifugation |
| Poly-L-lysine solution | Merck, USA | P8920 | |
| Scalpel No. 25 | HERGOM, Mexico | H23 | |
| Snaplock Microcentrifuge Tubes 2 mL | Axygen, USA | 10011-680 | |
| Stereoscopic microscope | Velab, Mexico | HG927831 | |
| Straight surgical scissors (10 cm) | HERGOM, Mexico | ||
| Straight Vannas scissors | HERGOM, Mexico | ||
| Triton X100 | Merck, USA | X100 | |
| Trypan blue Stain 0.4% | Merck, USA | 15250-061 | |
| Vortex mixer | DLAB, China | 8031102000 | |
| Zombie Aqua Fixable Viability Kit | BioLegend, USA | 423102 | amine-reactive fluorescent dye staining |
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