Summary
Les microglies sont considérées comme l’une des cellules les plus polyvalentes de l’organisme, capables d’adaptation morphologique et fonctionnelle. Leur hétérogénéité et leur multifonctionnalité permettent le maintien de l’homéostasie cérébrale, tout en étant liées à diverses pathologies neurologiques. Ici, une technique de purification de la microglie de la moelle épinière est décrite.
Abstract
La colonne vertébrale définit un vertébré et façonne le canal rachidien, une cavité qui entoure et protège la moelle épinière. Le bon développement et le bon fonctionnement du système nerveux central des mammifères dépendent en grande partie de l’activité des macrophages résidents connus sous le nom de microglies. Les microglies présentent une hétérogénéité et une multifonctionnalité, permettant une expression et un comportement géniques distincts dans la moelle épinière et le cerveau. De nombreuses études ont exploré la fonction de la microglie cérébrale, détaillant abondamment les méthodes de purification. Cependant, la purification de la microglie de la moelle épinière chez la souris manque d’une description complète. En revanche, l’utilisation d’une collagénase hautement purifiée, par opposition à un extrait non raffiné, manque de rapports dans les tissus du système nerveux central. Dans cette étude, la colonne vertébrale et la moelle épinière ont été excisées chez des souris C57BL/6 âgées de 8 à 10 semaines. La digestion subséquente a utilisé une collagénase hautement purifiée, et la purification de la microglie a utilisé un gradient de densité. Les cellules ont subi une coloration pour la cytométrie en flux, évaluant la viabilité et la pureté par coloration CD11b et CD45. Les résultats ont donné une viabilité moyenne de 80 % et une pureté moyenne de 95 %. En conclusion, la manipulation de la microglie de souris a impliqué une digestion avec une collagénase hautement purifiée, suivie d’un gradient de densité. Cette approche a effectivement produit d’importantes populations de microglies de la moelle épinière.
Introduction
La caractéristique déterminante des vertébrés est la colonne vertébrale ou colonne vertébrale, dans laquelle la notochorde a été remplacée par une séquence d’os segmentés appelés vertèbres, divisés par des disques intervertébraux. Cette succession de matière osseuse façonne le canal rachidien, une cavité qui entoure et protège la moelle épinière1. Dans le genre Rodentia, la colonne vertébrale est généralement formée de sept vertèbres cervicales, treize vertèbres thoraciques, six vertèbres lombaires et un nombre variable de vertèbres caudales 2,3. La longueur de la moelle épinière est similaire à celle de la colonne vertébrale et le filum terminal est une structure non nerveuse qui ancre la moelle épinière au sacrum. De plus, les fibres nerveuses sortent par le foramen intervertébral1.
Le développement et le bon fonctionnement du système nerveux central chez les mammifères dépendent de manière critique de l’activité des macrophages résidents du système nerveux, appelés microglie4. Bien que les microglies aient été initialement décrites comme des phagocytes résidents du cerveau, des recherches récentes ont attribué de nombreuses fonctions dynamiques à ces cellules 5,6. La taille de la microglie varie de 7 à 10 μm en homéostasie ; Elles sont considérées comme l’une des cellules les plus polyvalentes de l’organisme et peuvent s’adapter morphologiquement et fonctionnellement à leur environnement en constante évolution7. Ces cellules présentent une forte hétérogénéité au stade embryonnaire et au stade adulte8,9, tandis qu’au stade adulte, elles présentent également une hétérogénéité fonctionnelle complexe en fonction de leur contexte spatio-temporel10. L’hétérogénéité et les multiples fonctions de la microglie permettent une expression et un comportement différentiels des gènes dans la moelle épinière et le cerveau. Il a été démontré que l’expression de CD11b, CD45, CD86 et CCR9 est plus élevée dans la moelle épinière que dans le cerveau 8,9.
Il existe plusieurs protocoles pour l’isolement de la microglie cérébrale11,12 ; cependant, il n’en existe que quelques-uns pour la microglie de la moelle épinière13,14. L’optimisation d’une méthode de purification de la microglie de la moelle épinière facilite le développement de multiples études axées sur la découverte de la physiologie de la microglie. Ce protocole vise à décrire une extraction simple et hautement reproductible de la moelle épinière de souris et la purification de la microglie (Figure 1).
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Protocol
L’étude a été menée conformément à la norme officielle mexicaine NOM-062-ZOO-1999 et au guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. L’approbation de l’étude a été obtenue auprès des comités de recherche, d’éthique et de biosécurité de l’hôpital pour enfants de Mexico (HIM/2023/006) et du comité de recherche et de bioéthique de l’hôpital général de Mexico Eduardo Liceaga (DI/21/501/04/62). Trois souris C57BL/6 âgées de 6 à 8 semaines ont été obtenues de l’hôpital pour enfants de Mexico, où elles ont été élevées dans des conditions isolées dans des racks ventilés, conformément aux directives institutionnelles en matière de soins et d’utilisation des animaux.
1. Préparation des matériaux et des réactifs
- Préchauffer le PBS sans Ca 2+ et Mg2+ ainsi que la solution saline équilibrée de Hank (HBSS) à 37 °C.
- Compléter la solution HBSS avec 100 μg/mL de Liberase et 4 μg/mL de DNase (HBSS-LD). Assurez-vous que la solution maintient un pH physiologique de 7,4.
REMARQUE : 1 mL de solution de travail par moelle épinière sera nécessaire. - Préparez une solution isotonique à 90 % pour la centrifugation à gradient de densité (disponible dans le commerce, voir le tableau des matériaux) et préchauffez-la à 37 °C.
- Préparez le tampon de coloration en combinant du sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur (FBS) à 5 % avec du PBS et conservez le mélange sur de la glace.
- Préchauffer le Modified Eagle’s de Dulbecco à une glycémie moyennement élevée (1 g/L) (DMEM) à 37 °C.
- Complétez le milieu DMEM avec 10 % de FBS, 2 mM de L-glutamine, 200 U/mL de pénicilline, 200 μg/mL de streptomycine et 500 pg/mL d’amphotéricine B (voir le tableau des matériaux) pour préparer le DMEM-S.
2. Dissection et préparation de la moelle épinière
- Euthanasier la souris avec un surdosage intrapéritonéal de pentobarbital à une dose de 150 mg / kg. Stérilisez le thorax et le dos de la souris avec de l’éthanol à 70 %.
REMARQUE : Confirmer que l’euthanasie a réussi avant de procéder à la dissection chez la souris. - Rasez la région thoraco-lombaire et fixez les extrémités à la planche de dissection à l’aide de ruban adhésif.
- À l’aide d’un scalpel, faites une incision soigneuse le long de la ligne médiane dorsale, de la région occipitale à la région sacrée (figure 2).
- À l’aide d’un microscope chirurgical stéréoscopique, disséquer en couches jusqu’à atteindre la colonne lombaire et identifier la dernière arcade costale.
REMARQUE : Les 13 arcs costaux sont articulés dans les vertèbres thoraciques ; lorsqu’elles sont disséquées, elles deviennent visibles supérieures à la vertèbre L12. - Déterminez la dernière vertèbre cervicale et le sacrum, puis faites une incision pour séparer la colonne vertébrale (Figure 2).
- À l’aide d’une pince à disséquer, effectuer une laminectomie dorsale des vertèbres pour extraire la moelle épinière (figure 3A-D).
REMARQUE : À l’exception des deux premières vertèbres cervicales (atlas et axe), toutes les vertèbres mobiles partagent une conception morphologique commune dans diverses régions (cervicale, thoracique ou lombaire). Chaque vertèbre mobile typique présente un corps vertébral cylindrique à son extrémité antérieure. Attaché à l’arrière du corps se trouve un arc osseux connu sous le nom d’arc vertébral (arc neural), composé de lames et d’apophyses épineuses. Entre ces structures se trouve le foramen vertébral15. - Enlever les nerfs émergeant à travers les foramens (racines dorsale et ventrale) qui constituent le système nerveux périphérique et peuvent contenir des macrophages infiltrés (Figure 3D).
REMARQUE : Il n’est pas nécessaire d’enlever la pie-mère ou les méninges car le milieu de gradient de densité élimine efficacement les astrocytes contaminants. De plus, la conservation des méninges réduit le temps de purification et améliore la viabilité.
3. Digestion tissulaire et isolement de la microglie
- Placez la moelle épinière sur la planche à disséquer et, à l’aide de ciseaux Vannas, coupez la moelle épinière en morceaux de 2 mm, ce qui donne une moyenne de 10 morceaux.
- Transférez les sections de la moelle épinière dans un microtube à fond plat de 2 ml (figures 3E et F).
- Ajouter 1 mL de la solution de travail HBSS-LD (étape 1.2). Incuber à 37 °C pendant 25 min, en vortex vigoureusement toutes les 5 min.
- Passer le contenu de chaque digestion dans une passoire de 40 μm, puis ajouter 7 mL d’HBSS avec 2 % de FBS pour neutraliser la digestion.
- Écraser le reste du tissu à l’aide d’un piston de seringue de 1 ml. Centrifuger la suspension dans un tube conique de 50 mL pendant 5 min à 220 x g, 4 °C.
- Jeter le surnageant à l’aide d’une micropipette de 1 mL et remettre le pastille en suspension dans 2 mL d’HBSS avec 2 % de FBS dans un tube conique de 15 mL. Mélanger avec 2 mL de milieu à gradient de densité isotonique à 90 %. Centrifuger pendant 25 min à 160 x g, 18 °C.
REMARQUE : Utilisez une accélération lente et évitez d’utiliser le frein. - À l’aide d’une pipette de transfert, récupérer l’interface et la transférer dans un tube conique de 15 mL. Laver les cellules avec 10 mL de PBS et centrifuger pendant 5 min à 220 x g, 4 °C.
- Remettre les cellules en suspension dans DMEM-S (étape 1.6) et les conserver sur de la glace.
4. Détermination de la pureté et de la viabilité
- Pour quantifier les cellules viables à l’aide d’une chambre d’hémocytomètre, utilisez une coloration au bleu trypan à 0,4 % (voir le tableau des matériaux).
REMARQUE : En moyenne, une seule souris fournit 4 à 6 millions de cellules. - Pour quantifier les cellules viables à l’aide d’un cytomètre en flux, utilisez un colorant fluorescent réactif aux amines disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux).
- Transférez 1 million de cellules dans un tube de 5 ml en polystyrène à fond rond (FACS). Diluer le colorant fluorescent avec du PBS dans un rapport de 1 :1000 (pour créer la solution de travail de viabilité).
- Incuber les échantillons avec la solution de viabilité dans l’obscurité à 4 °C pendant 30 min. Lavez les cellules avec du PBS glacé deux fois. Remettre les cellules en suspension dans 400 μL de tampon de coloration (étape 1.4).
- Bloquer les cellules avec de l’anti-FcRIII/I 2.4G2 (voir tableau des matériaux) dans le tampon de coloration glacé pendant 15 min à 4 °C.
- Formuler le cocktail de coloration des anticorps en ajoutant les anticorps monoclonaux marqués par fluorescence CD45-PerCP et CD11b-eFluor 450 au tampon de coloration (à une dilution de 1 :300) (voir tableau des matériaux).
REMARQUE : Bien que les deux techniques soient disponibles, choisissez celle qui correspond le mieux au protocole suivant. - Incuber les échantillons avec le cocktail de coloration d’anticorps dans l’obscurité à 4 °C pendant 30 min. Lavez deux fois les cellules avec un tampon de coloration glacé. Remettre les cellules en suspension dans 400 μL de tampon de coloration.
- Acquérir 250 000 événements sur un cytomètre en flux, comme indiqué dans la stratégie de déclenchement à l’étape 6 (Figure 4).
5. Coloration immunofluorescente
- Placez une lamelle prétraitée dans un puits d’une plaque à 6 puits.
REMARQUE : Pour traiter les lamelles, les placer dans une boîte de Pétri avec 500 μL de solution de L-polylysine (0,01 mg/mL, voir le tableau des matériaux) et incuber pendant 1 h. Ensuite, lavez-les trois fois avec de l’eau distillée et laissez-les sécher. - Ensemencer 200 000 cellules sur la lamelle traitée à l’aide de 500 μL de solution DMEM-S. Incuber pendant 24 h.
- Retirez les lamelles et fixez les cellules à l’aide de paraformaldéhyde (PFA) à 3,7 % pendant 20 min à température ambiante. Lavez les lamelles trois fois avec du PBS glacé.
- Perméabiliser les cellules avec 0,2 % de Triton X-100 dans du PBS pendant 15 min à température ambiante. Ensuite, lavez les lamelles trois fois avec du PBS froid. Bloquer les cellules avec 0,2 % de BSA dans du PBS pendant 1 h à température ambiante.
- Diluer les anticorps monoclonaux marqués par fluorescence (à une dilution de 1 :300, voir tableau des matériaux) dans la solution bloquante et incuber pendant 1 h à température ambiante. Lavez les lamelles trois fois avec du PBS glacé.
- Appliquez un support de montage contenant du DAPI sur la lame, puis scellez-la avec une lamelle.
REMARQUE : Les lames peuvent être immédiatement analysées à l’aide d’un microscope à fluorescence ou confocal, ou elles peuvent être stockées jusqu’à 3 mois à -20°C.
6. Stratégie de déclenchement pour la microglie de la moelle épinière
- Générez un diagramme à points et établissez une porte pour isoler les cellules viables en fonction de la coloration de la viabilité et d’un canal fluorescent vide16. Exclure les cellules non viables.
- Produire un autre tracé en utilisant les paramètres de diffusion vers l’avant et sur les côtés pour éliminer les débris16.
- Développer un diagramme à points supplémentaire et analyser l’expression de CD11b et CD45 pour différencier la microglie.
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Representative Results
En utilisant du tissu de moelle épinière de souris, la digestion enzymatique a été réalisée à l’aide d’un mélange hautement enrichi en collagénase et en thermolysine. Le tissu digéré qui en résulte passe à travers un filtre de 40 μm pour éliminer les matières non digérées. Les cellules collectées ont été enrichies par un gradient de densité de Percoll, avec 90 % dans la partie inférieure et 45 % dans la partie supérieure. Les cellules enrichies en microglie à l’intérieur de l’interface ont ensuite été colorées avec des anticorps CD45 et CD11b et soumises à une analyse par cytométrie en flux (Figure 1).
La dissection de la colonne vertébrale s’étendant de la région occipitale au sacrum, implique l’exposition et la dissection de la musculature paravertébrale. Pour libérer la colonne vertébrale, les arcs costaux ont été exposés, et leur mesure a été effectuée de la vertèbre T13 à T1. La colonne vertébrale, s’articulant avec le crâne et le sacrum, est devenue visible, et une incision a été pratiquée de chaque côté pour la libérer complètement (Figure 2).
L’extraction de la moelle épinière a été réalisée par une incision latérale dans les corps vertébraux, formant un canal. Lors de l’ablation de la moelle épinière, les nerfs périphériques ont été sectionnés pour éviter la contamination par les macrophages périphériques. Par la suite, la moelle épinière obtenue a été étalée sur la table de dissection et sectionnée en morceaux de 2 mm, qui ont été ajoutés à la solution de digestion (Figure 3). L’utilisation de la libérase pour la digestion de la moelle épinière est rapportée pour la première fois, produisant 4 à 6 millions de cellules microgliales hautement viables par souris adulte. La viabilité optimale obtenue grâce à ce processus varie de 80 % à 99 %.
Pour confirmer le processus de purification, la coloration FACS de la microglie a été réalisée à l’aide d’anticorps CD45 et CD11b. Le processus de purification a démontré son efficacité, produisant jusqu’à 99 % de cellules microgliales (Figure 4). De plus, une coloration par immunofluorescence a été réalisée sur la microglie obtenue en utilisant les mêmes anticorps, en observant des cellules doublement positives d’une taille moyenne de 10 μm - ce qui correspond à la taille rapportée de la microglie non activée. Cela suggère que ces cellules sont adaptées aux études d’activation (Figure 4E). Il est plausible que d’autres cellules immunitaires puissent être présentes au cours des processus inflammatoires ou que la microglie subisse des changements morphologiques sous différents stimuli. Dans de tels cas, l’incorporation de marqueurs spécifiques pour l’identification de chaque population cellulaire est recommandée.
Figure 1 : Vue d’ensemble schématique du protocole de purification de la microglie de la moelle épinière. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Procédure de dissection de la moelle épinière. Après l’euthanasie, la colonne vertébrale de la souris a été isolée et disséquée. (A) Dissection cutanée par étapes s’étendant de la région occipitale à la région caudale, révélant la musculature para-vertébrale. (B) Dissection séquentielle à travers les couches des muscles paravertébraux. (C) Ablation de la colonne vertébrale après la coupe des côtes. (D) Visualisation d’une moelle épinière intacte dans le canal vertébral. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Processus d’extraction et de digestion de la moelle épinière. (A) Laminectomie spinale séquentielle impliquant deux incisions d’environ 2 mm. (B) Moelle épinière exposée. (C) Ablation de la moelle épinière. (D) Section des nerfs périphériques. (E) La moelle épinière a été divisée en sections de 2 mm et placée dans le milieu digestif. (F) Incubation standard à 37 °C pour la digestion des tissus. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Évaluation de la pureté et de la viabilité des cellules. Immunomarquage de cellules purifiées à l’aide de marqueurs spécifiques à la microglie. (A) Identification de cellules vivantes (cellules fluorescentes à colorant négatif). (B) Sélection basée sur la taille des cellules. (C) cellules CD45low et CD11b+, d’une pureté supérieure à 99 %. (D) Viabilité moyenne (87,46 ± écart-type 1,468) et pureté moyenne (88,51 ± écart-type 3,948 ; n = 5). (E) Immunofluorescence représentant la coloration CD45+ et CD11b+ dans les cellules purifiées. Les images ont été capturées à l’aide d’un microscope confocal avec un laser à lumière blanche à un grossissement de 60x (barre d’échelle = 5 μm). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
De nombreux protocoles ont été développés pour l’étude de la microglie en raison de leur importance dans l’homéostasie cérébrale. Dans ces méthodes, les microglies proviennent généralement des hémisphères cérébraux de rats et de souris embryonnaires ou néonatals17. Un nombre limité d’études ont porté sur la purification de la microglie de la moelle épinière de souris adultes13,14. Ces techniques impliquent une digestion enzymatique à l’aide de collagénase et/ou de papaïne avec de l’ADNase, souvent combinée à une séparation par gradient à l’aide de Percoll ou d’OptiPrep. Cependant, l’utilisation d’une digestion de la moelle épinière à base de papaïne sans séparation de gradient peut entraîner une contamination par les astrocytes, même après l’ablation de la pie-mère14,17.
Cette étude présente un protocole de purification de la microglie de la moelle épinière de souris adulte. Le protocole utilise un mélange précis de collagénase I et II avec de la thermolysine, une combinaison connue pour digérer efficacement divers tissus avec une dégradation contrôlée18, réduisant ainsi l’apoptose en raison de sa faible teneur en protéases neutres. Les méninges ou la pie-mère, souvent sources de contamination par les astrocytes, peuvent être éliminées par l’utilisation d’un gradient de Percoll dans cette procédure, ce qui élimine la nécessité d’éliminer ces couches (Figure 1).
L’hétérogénéité microgliale résulte de morphologies distinctes de la moelle épinière et du cerveau8. Cependant, ce protocole a également été appliqué à des hémisphères cérébraux avec des résultats similaires (données non présentées), soulignant sa robustesse pour l’analyse de la moelle épinière et de la microglie cérébrale.
Des niveaux élevés de pureté (allant de 80 % à 99 %) et de viabilité (85 % à 98 %) peuvent être atteints de manière constante avec ce protocole. Le traitement des cellules du système nerveux est complexe, principalement parce que la viabilité cellulaire est considérablement affectée par la durée du traitement ; Une hypoxie supérieure à 20 min peut être mortelle. Pour une viabilité optimale, il est recommandé de limiter le temps de traitement de l’extraction de la moelle épinière à la digestion à 10 minutes maximum. Cette description est adaptée aux souris en bonne santé âgées de 8 à 10 semaines, ce qui nécessite une standardisation plus poussée pour les souris plus jeunes ou plus âgées. Une viabilité sous-optimale implique une digestion excessive des tissus, ce qui oblige à la répétition. Alternativement, le tri FACS peut récupérer des cellules d’échantillons trop digérés.
L’application de la libérase pour la digestion et la purification de la microglie de la moelle épinière est nouvelle. Son utilisation limitée dans les tissus du système nerveux a toujours été due à des problèmes de viabilité18,19. Cette étude, cependant, démontre une viabilité accrue lors de l’utilisation de cette collagénase méticuleusement purifiée. Alternativement, d’autres collagénases plus faibles pourraient être explorées.
Plusieurs considérations cruciales doivent être reconnues, telles que la présence d’une neuroinflammation, l’atteinte de la barrière hémato-encéphalique et l’âge de la souris. Ces facteurs modifient à la fois la morphologie microgliale et la fréquence. En cas de neuroinflammation ou de perturbation de la barrière hémato-encéphalique, les cellules immunitaires exprimant CD45 et CD11b peuvent s’infiltrer, diminuant ainsi la pureté microgliale. Comme les microglies sont largement explorées dans diverses affections neuro-inflammatoires, ce protocole a un potentiel pour des investigations pathologiques et neurophysiologiques.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions de la bourse accordée par le Conseil national de la science et de la technologie (CONACYT) (702361). Les auteurs reconnaissent le programme de doctorat en sciences biologiques et chimiques de l’École nationale des sciences biologiques de l’Institut national polytechnique.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL collection tubes | Corning, USA | 430790 | |
| 2 mL microtubes | Axygen, USA | MCT-200-G | |
| 2.4G2 anti-FcR | BioLegend, USA | 101302 | |
| 50 mL collection tubes | Corning, USA | 430829 | |
| 70% ethanol | |||
| Antibiotic-Antimycotic (penicillin, streptomycin, amphotericin b) | Gibco, USA | 15240062 | |
| Antibody CD11b eFluor 450 anti-mouse | eBioscience, USA | 48-0112 | |
| Antibody CD45 PerCP anti-mouse | BioLegend, USA | 103130 | |
| Balanced salt solution (PBS) calcium- magnesium-free | Corning, USA | 46-013-CM | |
| Blue Cell Strainer 40 μm | Corning, USA | 352340 | |
| Costar 6-well Clear Not Treated | Corning, USA | CLS3736 | |
| Coverslips | |||
| Digital Heating Shaking Drybath | Thermo Scientific Digital HS Drybath, USA | 88870001 | |
| Dissecting forceps for microsurgery | FT by DUMONT | ||
| DNase | Roche, USA | 4536282001 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium-high glucose (DMEM) | Merck, USA | D6429 | |
| Electric shaver | |||
| FACS tube | Thermo, USA | 352058 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAN Biotech, Alemania | P30-3306 | |
| Flow cytometer Cytoflex | Beckman Coulter | ||
| Hank’s balanced salt solution | Merck, USA | H2387 | |
| L-glutamine | Corning, USA | 15393631 | |
| Liberase TM | Roche, USA | 5401119001 | |
| Neubauer chamber Counting Chambers | China | 1103 | |
| Pentobarbital | |||
| Percoll | Merck, USA | 17089101 | density gradient centrifugation |
| Poly-L-lysine solution | Merck, USA | P8920 | |
| Scalpel No. 25 | HERGOM, Mexico | H23 | |
| Snaplock Microcentrifuge Tubes 2 mL | Axygen, USA | 10011-680 | |
| Stereoscopic microscope | Velab, Mexico | HG927831 | |
| Straight surgical scissors (10 cm) | HERGOM, Mexico | ||
| Straight Vannas scissors | HERGOM, Mexico | ||
| Triton X100 | Merck, USA | X100 | |
| Trypan blue Stain 0.4% | Merck, USA | 15250-061 | |
| Vortex mixer | DLAB, China | 8031102000 | |
| Zombie Aqua Fixable Viability Kit | BioLegend, USA | 423102 | amine-reactive fluorescent dye staining |
References
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