Les microglies sont considérées comme l’une des cellules les plus polyvalentes de l’organisme, capables d’adaptation morphologique et fonctionnelle. Leur hétérogénéité et leur multifonctionnalité permettent le maintien de l’homéostasie cérébrale, tout en étant liées à diverses pathologies neurologiques. Ici, une technique de purification de la microglie de la moelle épinière est décrite.
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Article de méthode
Enrichissement rapide et efficace de la microglie de la moelle épinière de souris
Dans cet article
Résumé
Résumé
La colonne vertébrale définit un vertébré et façonne le canal rachidien, une cavité qui entoure et protège la moelle épinière. Le bon développement et le bon fonctionnement du système nerveux central des mammifères dépendent en grande partie de l’activité des macrophages résidents connus sous le nom de microglies. Les microglies présentent une hétérogénéité et une multifonctionnalité, permettant une expression et un comportement géniques distincts dans la moelle épinière et le cerveau. De nombreuses études ont exploré la fonction de la microglie cérébrale, détaillant abondamment les méthodes de purification. Cependant, la purification de la microglie de la moelle épinière chez la souris manque d’une description complète. En revanche, l’utilisation d’une collagénase hautement purifiée, par opposition à un extrait non raffiné, manque de rapports dans les tissus du système nerveux central. Dans cette étude, la colonne vertébrale et la moelle épinière ont été excisées chez des souris C57BL/6 âgées de 8 à 10 semaines. La digestion subséquente a utilisé une collagénase hautement purifiée, et la purification de la microglie a utilisé un gradient de densité. Les cellules ont subi une coloration pour la cytométrie en flux, évaluant la viabilité et la pureté par coloration CD11b et CD45. Les résultats ont donné une viabilité moyenne de 80 % et une pureté moyenne de 95 %. En conclusion, la manipulation de la microglie de souris a impliqué une digestion avec une collagénase hautement purifiée, suivie d’un gradient de densité. Cette approche a effectivement produit d’importantes populations de microglies de la moelle épinière.
Introduction
La caractéristique déterminante des vertébrés est la colonne vertébrale ou colonne vertébrale, dans laquelle la notochorde a été remplacée par une séquence d’os segmentés appelés vertèbres, divisés par des disques intervertébraux. Cette succession de matière osseuse façonne le canal rachidien, une cavité qui entoure et protège la moelle épinière1. Dans le genre Rodentia, la colonne vertébrale est généralement formée de sept vertèbres cervicales, treize vertèbres thoraciques, six vertèbres lombaires et un nombre variable de vertèbres caudales 2,3. La longueur de la moelle épiniè....
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Protocole
L’étude a été menée conformément à la norme officielle mexicaine NOM-062-ZOO-1999 et au guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. L’approbation de l’étude a été obtenue auprès des comités de recherche, d’éthique et de biosécurité de l’hôpital pour enfants de Mexico (HIM/2023/006) et du comité de recherche et de bioéthique de l’hôpital général de Mexico Eduardo Liceaga (DI/21/501/04/62). Trois souris C57BL/6 âgées de 6 à 8 semaines ont été obtenues de l’hôpital pour enfants de Mexico, où elles ont été élevées dans des conditions isolées dans des racks ventilés, conformément aux directives institutionnelles en matière de soins et d’utilisation des ....
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Résultats
En utilisant du tissu de moelle épinière de souris, la digestion enzymatique a été réalisée à l’aide d’un mélange hautement enrichi en collagénase et en thermolysine. Le tissu digéré qui en résulte passe à travers un filtre de 40 μm pour éliminer les matières non digérées. Les cellules collectées ont été enrichies par un gradient de densité de Percoll, avec 90 % dans la partie inférieure et 45 % dans la partie supérieure. Les cellules enrichies en microglie à l’intérieur de l’interface ont ensuite été colorées avec des a.......
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Discussion
De nombreux protocoles ont été développés pour l’étude de la microglie en raison de leur importance dans l’homéostasie cérébrale. Dans ces méthodes, les microglies proviennent généralement des hémisphères cérébraux de rats et de souris embryonnaires ou néonatals17. Un nombre limité d’études ont porté sur la purification de la microglie de la moelle épinière de souris adultes13,14. Ces techniques impliquent une digestion enzymatique à l’aid.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par des subventions de la bourse accordée par le Conseil national de la science et de la technologie (CONACYT) (702361). Les auteurs reconnaissent le programme de doctorat en sciences biologiques et chimiques de l’École nationale des sciences biologiques de l’Institut national polytechnique.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Tubes de collecte de 15 mL | Corning, États-Unis | 430790 | |
| Microtubes de 2 mL | Axygen, | États-Unis MCT-200-G | |
| 2.4G2 anti-FcR | BioLegend, États-Unis | 101302 | |
| Tubes de collecte de 50 mL | Corning, États-Unis | 430829 d’éthanol | |
| à 70 % | |||
| Antibiotique-antimycosique (pénicilline, streptomycine, amphotéricine b) | Gibco, États-Unis | 15240062 | |
| Anticorps CD11b eFluor 450 anti-souris | eBioscience, | États-Unis 48-0112 | |
| Anticorps CD45 PerCP anti-souris ; ; | BioLegend, USA | 103130 | |
| Solution saline équilibrée (PBS) sans calcium et sans magnésium | Corning, USA | 46-013-CM | |
| Cell Strainer 40 &mu ; m | Corning, États-Unis | 352340 | |
| Costar 6 puits clair non traité ; | Corning, États-Unis | CLS3736 | |
| lamelles | |||
| numérique Chauffage Secouant Drybath ; | Thermo Scientific Digital HS Drybath, États-Unis | 88870001 | |
| Pince à dissection pour la microchirurgie | FT de DUMONT | ||
| DNase | Roche, États-Unis | 4536282001 | |
| Dulbecco´ ; s Aigle modifié´ ; s Glycémie moyenne-élevée (DMEM) ; | Merck, USA | D6429 | |
| Rasoir | |||
| Tube FACS | Thermo, USA | 352058 | |
| Sérum fœtal bovin (FBS) | PAN Biotech, Alemania | P30-3306 | |
| Cytomètre en flux Cytoflex ; | Beckman Coulter | ||
| Hank' solution saline équilibrée | Merck, États-Unis | H2387 | |
| L-glutamine | Corning, États-Unis ; | ||
| Liberase TM ; | Roche, États-Unis | 5401119001 | |
| Chambre Neubauer Chambres de comptage Chine | 1103 | ||
| Pentobarbital | |||
| Percoll ; | Merck, États-Unis | 17089101 | centrifugation par gradient de densité ; |
| Solution de poly-L-lysine ; | Scalpel Merck, USA | P8920 | |
| n° 25 | HERGOM, Mexique | H23 | |
| Snaplock Microcentrifugeuse Tubes 2 mL | Axygen, USA | 10011-680 | |
| Microscope stéréoscopique | Velab, Mexique | HG927831 | |
| Ciseaux chirurgicaux droits (10 cm) | HERGOM, Mexique | ||
| Ciseaux Vannas droits | HERGOM, Mexique | ||
| Triton X100 | Merck, USA | X100 | |
| Bleu trypan Tache 0,4 % ; | Merck, États-Unis | 15250-061 | |
| Mélangeur vortex | DLAB, Chine | 8031102000 | |
| Zombie Aqua Fixable Viability Kit | BioLegend, États-Unis | 423102 | coloration par colorant fluorescent réactif aux amines ; |
Références
- Schröder,, Moser,, Huggenberger, Neuroanatomy of the Mouse. , Springer, Switzerland. 59-78 (2020).
- Sengul, G., et al. Cytoarchitecture of the spinal cord of the postnatal (P4) mouse. Anat Rec. 295, 837-845 (2012).
- Bab, I., et al.
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Réimpressions et autorisations
