Summary
Микроглия считается одной из самых универсальных клеток в организме, способных к морфологической и функциональной адаптации. Их гетерогенность и многофункциональность позволяют поддерживать гомеостаз мозга, а также связаны с различными неврологическими патологиями. Здесь описана методика очищения микроглии спинного мозга.
Abstract
Позвоночный столб определяет позвоночное животное и формирует спинномозговой канал, полость, которая окружает и защищает спинной мозг. Правильное развитие и функционирование центральной нервной системы млекопитающих в значительной степени зависят от активности резидентных макрофагов, известных как микроглия. Микроглия проявляет гетерогенность и многофункциональность, обеспечивая различную экспрессию и поведение генов в спинном и головном мозге. В многочисленных исследованиях изучалась функция церебральной микроглии, подробно описывались методы очистки. Однако очищение микроглии от спинного мозга у мышей не имеет исчерпывающего описания. В отличие от этого, использование высокоочищенной коллагеназы, в отличие от нерафинированного экстракта, не находит отклика в тканях центральной нервной системы. В этом исследовании позвоночный столб и спинной мозг были вырезаны у 8-10-недельных мышей C57BL/6. В последующем расщеплении использовалась высокоочищенная коллагеназа, а в очистке микроглии использовался градиент плотности. Клетки подвергались окрашиванию для проточной цитометрии, оценивая жизнеспособность и чистоту с помощью окрашивания CD11b и CD45. Результаты показали среднюю жизнеспособность 80% и среднюю чистоту 95%. В заключение, манипуляции с микроглией мыши включали в себя пищеварение высокоочищенной коллагеназой с последующим градиентом плотности. Этот подход эффективно привел к созданию значительных популяций микроглии спинного мозга.
Introduction
Определяющей характеристикой позвоночных является позвоночный столб или позвоночник, в котором хорда заменена последовательностью сегментированных костей, называемых позвонками, разделенных межпозвоночными дисками. Эта последовательность костного материала формирует спинномозговой канал, полость, которая окружает и защищает спинной мозг1. У рода Rodentia позвоночник обычно образован семью шейными позвонками, тринадцатью грудными позвонками, шестью поясничными позвонками и переменным числом хвостовых позвонков 2,3. Длина спинного мозга аналогична длине позвоночника, а концевая нить является ненервной структурой, которая прикрепляет спинной мозг к крестцу. Кроме того, нервные волокна выходят через межпозвонковое отверстие1.
Развитие и правильное функционирование центральной нервной системы у млекопитающих в решающей степени зависит от активности резидентных макрофагов нервной системы, называемых микроглией4. Хотя микроглия первоначально описывалась как резидентные фагоциты мозга, недавние исследования приписывают этим клеткам множество динамических функций 5,6. Размер микроглии колеблется от 7 до 10 мкм в гомеостазе; Они считаются одними из самых универсальных клеток в организме и могут морфологически и функционально адаптироваться к постоянно меняющейся окружающей среде7. Эти клетки демонстрируют высокую гетерогенность как на эмбриональной, так и на взрослой стадиях8,9, в то время как на взрослой стадии они также демонстрируют сложную функциональную гетерогенность, основанную на их пространственно-временном контексте10. Гетерогенность и множественность функций микроглии обеспечивают дифференцированную экспрессию и поведение генов в спинном и головном мозге. Показано, что экспрессия CD11b, CD45, CD86 и CCR9 выше в спинном мозгепо сравнению с головным мозгом 8,9.
Существует несколько протоколов для выделения церебральной микроглии11,12; Однако для микроглии спинного мозга13,14 существует лишь несколько. Оптимизация метода очистки микроглии от спинного мозга способствует развитию многочисленных исследований, направленных на изучение физиологии микроглии. Этот протокол направлен на описание простого и высоковоспроизводимого извлечения спинного мозга мыши и очистки микроглии (рис. 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Исследование проводилось в соответствии с официальным мексиканским стандартом NOM-062-ZOO-1999 и руководством по уходу и использованию лабораторных животных. Одобрение на проведение исследования было получено от комитетов по исследованиям, этике и биобезопасности Детской больницы Мексики (HIM/2023/006) и Комитета по исследованиям и биоэтике Больницы общего профиля Мексики имени Эдуардо Лисеаги (DI/21/501/04/62). Три мыши C57BL/6 в возрасте от 6 до 8 недель были получены из Детской больницы Мексики, где они выращивались в изолированных условиях в вентилируемых стойках в соответствии с рекомендациями по уходу за животными и их использованию.
1. Подготовка материалов и реагентов
- Предварительно прогрейте до 37 °C свободный от Ca 2+ и Mg2+ PBS, а также сбалансированный солевой раствор Хэнка (HBSS).
- Дополните раствор HBSS 100 мкг/мл либеразы и 4 мкг/мл ДНКазы (HBSS-LD). Следите за тем, чтобы раствор поддерживал физиологический рН 7,4.
ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо 1 мл рабочего раствора на спинной мозг. - Приготовьте изотонический 90%-ный раствор для центрифугирования с градиентом плотности (имеется в продаже, см. Таблицу материалов) и подогрейте его до 37 °C.
- Приготовьте буфер для окрашивания, смешав 5% инактивированную при нагревании фетальную бычью сыворотку (FBS) с PBS, и храните смесь на льду.
- Предварительно нагрейте Modified Eagle's Medium-high глюкозы Dulbecco (1 г/л) (DMEM) до 37 °C.
- Для получения DMEM-S добавляют в среду DMEM 10% FBS, 2 мМ L-глютамина, 200 ЕД/мл пенициллина, 200 мкг/мл стрептомицина и 500 пг/мл амфотерицина B (см. таблицу материалов).
2. Рассечение и препарирование спинного мозга
- Усыпляют мышь внутрибрюшинной передозировкой пентобарбитала в дозе 150 мг/кг. Стерилизуйте грудную клетку и спину мыши, используя 70% этанол.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что эвтаназия прошла успешно, прежде чем приступать к вскрытию мыши. - Побрейте грудопоясничную область и закрепите конечности на доске для препарирования с помощью клейкой ленты.
- С помощью скальпеля сделайте аккуратный надрез вдоль дорсальной средней линии от затылочной до крестцовой области (рисунок 2).
- С помощью стереоскопического хирургического микроскопа рассекают послойно, пока не дойдете до поясничного отдела позвоночника и не определите последнюю реберную дугу.
ПРИМЕЧАНИЕ: 13 реберных дуг сочленяются в грудных позвонках; при рассечении они становятся видимыми выше L1 позвонка2. - Определите последний шейный позвонок и крестец, затем сделайте надрез для отделения позвоночника (рисунок 2).
- С помощью рассекающих щипцов выполняют дорсальную ламинэктомию позвонков для извлечения спинного мозга (рис. 3A-D).
ПРИМЕЧАНИЕ: За исключением первых двух шейных позвонков (атланта и оси), все подвижные позвонки имеют общий морфологический дизайн в различных областях (шейном, грудном или поясничном). Каждый типичный подвижный позвонок имеет цилиндрическое тело позвонка на переднем конце. К задней части тела прикреплена костная дуга, известная как дуга позвонка (невральная дуга), состоящая из пластинок и остистых отростков. Между этими структурами лежит позвоночное отверстие15. - Удаляют нервы, выходящие через отверстия (дорсальные и вентральные корешки), которые составляют периферическую нервную систему и могут содержать инфильтрированные макрофаги (рис. 3D).
ПРИМЕЧАНИЕ: Нет необходимости удалять pia mater или мозговые оболочки, так как среда градиента плотности эффективно устраняет загрязнение астроцитов. Кроме того, сохранение мозговых оболочек сокращает время очистки и повышает жизнеспособность.
3. Расщепление тканей и выделение микроглии
- Поместите спинной мозг на препарирующую доску и ножницами Vannas разрежьте спинной мозг на кусочки по 2 мм, в среднем получится 10 кусочков.
- Перенесите участки спинного мозга в плоскодонную микропробирку объемом 2 мл (рис. 3E, F).
- Добавьте 1 мл рабочего раствора HBSS-LD (шаг 1.2). Инкубируйте при температуре 37 °C в течение 25 минут, энергично взбалтывая каждые 5 минут.
- Пропускайте содержимое каждого разложения через ситечко 40 мкм, а затем добавляйте 7 мл HBSS с 2% FBS, чтобы нейтрализовать разложение.
- Измельчите оставшуюся ткань с помощью поршня шприца объемом 1 мл. Центрифугу суспензии в конической пробирке объемом 50 мл в течение 5 мин при 220 x g, 4 °C.
- Выбросьте надосадочную жидкость с помощью микропипетки объемом 1 мл и повторно суспендируйте гранулу в 2 мл HBSS с 2% FBS в конической пробирке объемом 15 мл. Смешайте с 2 мл среды с градиентом изотонической плотности 90%. Центрифуга в течение 25 мин при 160 x g, 18 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте медленное ускорение и избегайте использования тормоза. - Используйте пипетку для переноса, чтобы извлечь границу раздела и перенести ее в коническую пробирку объемом 15 мл. Промойте клетки 10 мл PBS и центрифугируйте в течение 5 минут при 220 x g, 4 °C.
- Ресуспендируйте клетки в DMEM-S (шаг 1.6) и храните их на льду.
4. Определение чистоты/жизнеспособности
- Для количественного определения жизнеспособных клеток с помощью камеры гемоцитометра используют 0,4%-ный краситель трипанового синего (см. таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: В среднем, одна мышь обеспечивает 4-6 миллионов клеток. - Для количественного определения жизнеспособных клеток с помощью проточного цитометра используют коммерчески доступное амино-реактивное окрашивание флуоресцентными красителями (см. таблицу материалов).
- Перенесите 1 миллион клеток в полистирольную пробирку с круглым дном (FACS) объемом 5 мл. Флуоресцентный краситель разбавляют ПБС в соотношении 1:1000 (создавая рабочий раствор жизнеспособности).
- Инкубируют образцы с раствором жизнеспособности в темноте при 4 °С в течение 30 мин. Промойте клетки ледяным ПБС дважды. Ресуспендируйте клетки в 400 мкл окрашивающего буфера (шаг 1.4).
- Заблокируйте ячейки 2.4G2 anti-FcRIII/I (см. таблицу материалов) в ледяном окрашивающем буфере на 15 мин при 4 °C.
- Разработайте рецепт для окрашивания антителами, добавив флуоресцентно меченные моноклональные антитела CD45-PerCP и CD11b-eFluor 450 в окрашивающий буфер (в разведении 1:300) (см. таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что доступны оба метода, выберите тот, который лучше всего соответствует последующему протоколу. - Инкубируют образцы с коктейлем из окрашивания антителами в темноте при 4 °C в течение 30 мин. Промойте клетки ледяным красящим буфером дважды. Ресуспендируйте клетки в 400 мкл окрашивающего буфера.
- Регистрируйте 250 000 событий на проточном цитометре, как описано в стратегии стробирования на шаге 6 (рис. 4).
5. Иммунофлуоресцентное окрашивание
- Поместите предварительно обработанный покровный листок в углубление 6-луночной пластины.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для обработки покровных стекол поместите их в чашку Петри с 500 мкл раствора L-полилизина (0,01 мг/мл, см. таблицу материалов) и инкубируйте в течение 1 ч. После этого трижды промойте их дистиллированной водой и дайте высохнуть. - Высевают 200 000 клеток на обработанное покровное стекло, используя 500 мкл раствора DMEM-S. Инкубируют в течение 24 ч.
- Снимите покровные стекла и зафиксируйте ячейки с помощью 3,7% параформальдегида (PFA) в течение 20 минут при комнатной температуре. Трижды промойте покровные стекла ледяным ПБС.
- Пермеабилизацию клеток 0,2% Triton X-100 в PBS в течение 15 мин при комнатной температуре. Впоследствии трижды промойте покровные стекла холодной ПБС. Блокируйте клетки 0,2% БСА в PBS в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Флуоресцентно-меченные моноклональные антитела разводят (в разведении 1:300, см. таблицу материалов) в блокирующем растворе и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. Трижды промойте покровные стекла ледяным ПБС.
- Нанесите монтажный материал, содержащий DAPI, на предметное стекло, а затем запечатайте его покровным стеклом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предметные стекла можно сразу же проанализировать с помощью флуоресцентного или конфокального микроскопа, или они могут храниться до 3 месяцев при -20°C.
6. Стратегия стробирования при микроглии спинного мозга
- Сгенерируйте точечную диаграмму и установите ворота для выделения жизнеспособных клеток на основе окрашивания жизнеспособности и пустого флуоресцентного канала16. Исключите нежизнеспособные клетки.
- Постройте еще один график с использованием параметров прямого и бокового рассеяния для устранения мусора16.
- Разработайте дополнительную точечную диаграмму и проанализируйте экспрессию CD11b и CD45 для дифференциации микроглии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
С использованием тканей спинного мозга мышей ферментативное пищеварение проводили с использованием смеси, сильно обогащенной коллагеназой и термолизином. Полученная переваренная ткань проходила через фильтр 40 мкм для удаления непереваренного материала. Собранные клетки обогащали с помощью градиента плотности по Перколлу, где 90% в нижней части и 45% в верхней. Клетки, обогащенные микроглией в пределах интерфейса, затем окрашивали антителами к CD45 и CD11b и подвергали проточному цитометрическому анализу (рис. 1).
Рассечение позвоночного столба, простирающегося от затылочной области до крестца, включает в себя обнажение и рассечение паравертебральной мускулатуры. Для освобождения позвоночного столба были обнажены реберные дуги, и их измерение проводилось от позвонка Т13 до Т1. Позвоночный столб, сочленяющийся с черепом и крестцом, стал виден, и с каждой стороны был выполнен разрез для его полного освобождения (рис. 2).
Извлечение спинного мозга достигалось через боковой разрез в телах позвонков, образуя канал. Во время удаления спинного мозга периферические нервы были перерезаны, чтобы предотвратить контаминацию периферическими макрофагами. В дальнейшем полученный спинной мозг распределяли по столу для вскрытия и разрезали на кусочки по 2 мм, которые добавляли в раствор для пищеварения (рис. 3). Впервые сообщается об использовании либеразы для пищеварения в спинном мозге, в результате чего на взрослую мышь приходится от 4 до 6 миллионов высокожизнеспособных микроглиальных клеток. Оптимальная жизнеспособность, достигаемая с помощью этого процесса, составляет от 80% до 99%.
Для подтверждения процесса очистки проводили FACS-окрашивание микроглии с использованием антител CD45 и CD11b. Процесс очистки показал эффективность, в результате чего было получено до 99% микроглиальных клеток (рис. 4). Кроме того, иммунофлуоресцентное окрашивание было проведено на полученной микроглии с использованием тех же антител, наблюдая дважды положительные клетки со средним размером 10 мкм, что соответствует заявленному размеру неактивированной микроглии. Это говорит о том, что эти клетки пригодны для активационных исследований (рис. 4E). Вполне вероятно, что во время воспалительных процессов могут присутствовать другие иммунные клетки или что микроглия может претерпевать морфологические изменения при различных стимулах. В таких случаях рекомендуется включение специфических маркеров для идентификации каждой популяции клеток.
Рисунок 1: Схематический обзор протокола очистки микроглии спинного мозга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Процедура рассечения спинного мозга. После эвтаназии позвоночный столб мыши был изолирован и препарирован. (А) Ступенчатое рассечение кожи, простирающееся от затылочной до хвостовой областей, обнажающее паравертебральную мускулатуру. (Б) Последовательное рассечение слоев паравертебральных мышц. (C) Удаление позвоночника после перерезания ребер. (D) Визуализация интактного спинного мозга в позвоночном канале. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Процесс экстракции и пищеварения спинного мозга . (A) Последовательная спинномозговая ламинэктомия с двумя разрезами размером около 2 мм. (Б) Обнаженный спинной мозг. (C) Удаление спинного мозга. (D) Рассечение периферических нервов. (E) Спинной мозг был разделен на 2-миллиметровые участки и помещен в пищеварительную среду. (F) Стандартная инкубация при температуре 37 °C для переваривания тканей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Оценка чистоты и жизнеспособности клеток. Иммуноокрашивание очищенных клеток с использованием маркеров, специфичных для микроглии. (А) Идентификация живых клеток (флуоресцентных красителей-отрицательных клеток). (B) Выбор на основе размера ячейки. (C) клетки CD45low и CD11b+, демонстрирующие чистоту более 99%. (D) Средняя жизнеспособность (87,46 ± SD 1,468) и средняя чистота (88,51 ± SD 3,948; n = 5). (E) Иммунофлуоресценция, отображающая окрашивание CD45+ и CD11b+ в очищенных клетках. Изображения были получены с помощью конфокального микроскопа с лазером белого света при 60-кратном увеличении (масштабная линейка = 5 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Было разработано множество протоколов для изучения микроглии из-за ее значимости в гомеостазе мозга. В этих методах микроглия обычно поступает из полушарий головного мозга эмбриональных или неонатальных крыс и мышей17. Ограниченное число исследований было посвящено очистке микроглии из спинного мозга взрослых мышей13,14. Эти методы включают ферментативное расщепление с использованием коллагеназы и/или папаина вместе с ДНКазой, часто в сочетании с градиентным разделением с использованием Percoll или OptiPrep. Тем не менее, использование расщепления в спинном мозге на основе папаина без градиентного разделения может привести к контаминации астроцитов, даже после удаления pia mater14,17.
В этом исследовании представлен протокол очистки микроглии из спинного мозга взрослой мыши. В протоколе используется точная смесь коллагеназы I и II вместе с термолизином, комбинацией, известной тем, что она эффективно переваривает различные ткани с контролируемой деградацией18, тем самым снижая апоптоз из-за низкого содержания нейтральных протеаз. Мозговые оболочки или pia mater, часто являющиеся источниками загрязнения астроцитов, могут быть устранены с помощью градиента Перколла в этой процедуре, что сводит на нет необходимость удаления этих слоев (рис. 1).
Гетерогенность микроглии возникает из-за различных морфологий в спинном и головном мозге8. Тем не менее, этот протокол также был применен к полушариям головного мозга с аналогичными исходами (данные не представлены), что подчеркивает его надежность для анализа как спинного мозга, так и церебральной микроглии.
С помощью этого протокола можно стабильно достигать высоких уровней чистоты (от 80% до 99%) и жизнеспособности (от 85% до 98%). Обработка клеток нервной системы является сложной задачей, в первую очередь потому, что на жизнеспособность клеток существенно влияет продолжительность обработки; Гипоксия, превышающая 20 мин, может привести к летальному исходу. Для оптимальной жизнеспособности рекомендуется ограничить время обработки от извлечения спинного мозга до пищеварения не более 10 мин. Это описание адаптировано для здоровых мышей в возрасте от 8 до 10 недель, что требует дальнейшей стандартизации для более молодых или пожилых мышей. Неоптимальная жизнеспособность подразумевает чрезмерное переваривание тканей, что требует повторения. Кроме того, сортировка FACS может спасти клетки от переваренных образцов.
Применение либеразы для переваривания и очищения микроглии спинного мозга является новым. Его ограниченное использование в тканях нервной системы исторически было связано с проблемами жизнеспособности18,19. Это исследование, однако, демонстрирует повышенную жизнеспособность при использовании этой тщательно очищенной коллагеназы. В качестве альтернативы могут быть изучены другие коллагеназы с более низкой активностью.
Необходимо учитывать несколько важных факторов, таких как наличие нейровоспаления, нарушение гематоэнцефалического барьера и возраст мышей. Эти факторы изменяют как морфологию микроглии, так и частоту. В случаях нейровоспаления или нарушения гематоэнцефалического барьера иммунные клетки, экспрессирующие CD45 и CD11b, могут проникать внутрь, снижая чистоту микроглии. Поскольку микроглия широко исследуется при различных нейровоспалительных состояниях, этот протокол обладает потенциалом для патологических и нейрофизиологических исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами стипендии, предоставленной Национальным советом по науке и технологиям (CONACYT) (702361). Авторы отмечают докторантуру по биологическим химическим наукам Национальной школы биологических наук Национального политехнического института.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL collection tubes | Corning, USA | 430790 | |
| 2 mL microtubes | Axygen, USA | MCT-200-G | |
| 2.4G2 anti-FcR | BioLegend, USA | 101302 | |
| 50 mL collection tubes | Corning, USA | 430829 | |
| 70% ethanol | |||
| Antibiotic-Antimycotic (penicillin, streptomycin, amphotericin b) | Gibco, USA | 15240062 | |
| Antibody CD11b eFluor 450 anti-mouse | eBioscience, USA | 48-0112 | |
| Antibody CD45 PerCP anti-mouse | BioLegend, USA | 103130 | |
| Balanced salt solution (PBS) calcium- magnesium-free | Corning, USA | 46-013-CM | |
| Blue Cell Strainer 40 μm | Corning, USA | 352340 | |
| Costar 6-well Clear Not Treated | Corning, USA | CLS3736 | |
| Coverslips | |||
| Digital Heating Shaking Drybath | Thermo Scientific Digital HS Drybath, USA | 88870001 | |
| Dissecting forceps for microsurgery | FT by DUMONT | ||
| DNase | Roche, USA | 4536282001 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium-high glucose (DMEM) | Merck, USA | D6429 | |
| Electric shaver | |||
| FACS tube | Thermo, USA | 352058 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAN Biotech, Alemania | P30-3306 | |
| Flow cytometer Cytoflex | Beckman Coulter | ||
| Hank’s balanced salt solution | Merck, USA | H2387 | |
| L-glutamine | Corning, USA | 15393631 | |
| Liberase TM | Roche, USA | 5401119001 | |
| Neubauer chamber Counting Chambers | China | 1103 | |
| Pentobarbital | |||
| Percoll | Merck, USA | 17089101 | density gradient centrifugation |
| Poly-L-lysine solution | Merck, USA | P8920 | |
| Scalpel No. 25 | HERGOM, Mexico | H23 | |
| Snaplock Microcentrifuge Tubes 2 mL | Axygen, USA | 10011-680 | |
| Stereoscopic microscope | Velab, Mexico | HG927831 | |
| Straight surgical scissors (10 cm) | HERGOM, Mexico | ||
| Straight Vannas scissors | HERGOM, Mexico | ||
| Triton X100 | Merck, USA | X100 | |
| Trypan blue Stain 0.4% | Merck, USA | 15250-061 | |
| Vortex mixer | DLAB, China | 8031102000 | |
| Zombie Aqua Fixable Viability Kit | BioLegend, USA | 423102 | amine-reactive fluorescent dye staining |
References
- Schröder,, Moser,, Huggenberger, Neuroanatomy of the Mouse. , Springer, Switzerland. 59-78 (2020).
- Sengul, G., et al. Cytoarchitecture of the spinal cord of the postnatal (P4) mouse. Anat Rec. 295, 837-845 (2012).
- Bab, I., et al. Microtomographic atlas of the mouse skeleton. VIII, First ed, Springer. 205 (2007).
- Nayak, D., et al.
- Martinez, F. O., et al.
- Masuda, T., et al.
- Prinz, M. Microglia biology: one century of evolving concepts. Cell. 179 (2), 292-311 (2019).
- de Haas, A. H., et al. Region-specific expression of immunoregulatory proteins on microglia in the healthy CNS. Glia. 56 (8), 888-894 (2008).
- Xuan, F. L., et al. Differences of microglia in the brain and the spinal cord. Front Cell Neurosci. 13, 504 (2019).
- Paolicelli, R. Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads. Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).
- Li, Q., et al. Spinal IL-36γ/IL-36R participates in the maintenance of chronic inflammatory pain through astroglial JNK pathway. Glia. 67 (3), 438-451 (2019).
- Prinz, M., et al. Microglia and central nervous system-associated macrophages-from origin to disease modulation. Annu Rev Immunol. 39, 251-277 (2021).
- Yip, P. K., et al. Rapid isolation and culture of primary microglia from adult mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 183 (2), 223-237 (2009).
- Akhmetzyanova, E. R., et al. Severity- and time-dependent activation of microglia in spinal cord injury. Int J Mo. Sci. 24 (9), 1-16 (2023).
- Mahadevan, V.
- Krukowski, K., et al. Temporary microglia-depletion after cosmic radiation modifies phagocytic activity and prevents cognitive deficits. Sci Rep. 8 (1), 1-13 (2018).
- Cardona, A., et al. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
- Schmidt, V. M., et al. Comparison of the enzymatic efficiency of Liberase TM and tumor dissociation enzyme: effect on the viability of cells digested from fresh and cryopreserved human ovarian cortex. Reprod Biol Endocrinol. 16 (57), 1-14 (2018).
- Kusminski, C. M., et al. MitoNEET-parkin effects in pancreatic α- and β-cells, cellular survival, and intrainsular cross talk. Diabetes. 65 (6), 1534-1555 (2016).
