Summary
Mikroglia anses vara några av de mest mångsidiga cellerna i kroppen, kapabla till morfologisk och funktionell anpassning. Deras heterogenitet och multifunktionalitet gör det möjligt att upprätthålla hjärnans homeostas, samtidigt som de är kopplade till olika neurologiska patologier. Här beskrivs en teknik för rening av ryggmärgsmikroglia.
Abstract
Ryggraden definierar ett ryggradsdjur och formar ryggmärgskanalen, ett hålrum som omsluter och skyddar ryggmärgen. Korrekt utveckling och funktion av däggdjurens centrala nervsystem är i hög grad beroende av aktiviteten hos makrofager som kallas mikroglia. Mikroglia uppvisar heterogenitet och multifunktionalitet, vilket möjliggör distinkt genuttryck och beteende i ryggmärgen och hjärnan. Många studier har undersökt hjärnans mikroglias funktion och detaljerat beskrivit reningsmetoder i stor utsträckning. Reningen av mikroglia från ryggmärgen hos möss saknar dock en heltäckande beskrivning. Däremot saknar användningen av ett högrenat kollagenas, i motsats till ett oraffinerat extrakt, rapportering inom centrala nervsystemets vävnader. I denna studie avlägsnades kotpelaren och ryggmärgen från 8-10 veckor gamla C57BL/6-möss. Efterföljande nedbrytning använde ett högrenat kollagenas, och mikroglia-rening använde en densitetsgradient. Cellerna genomgick färgning för flödescytometri och bedömde viabilitet och renhet genom CD11b- och CD45-färgning. Resultaten gav en genomsnittlig viabilitet på 80 % och en genomsnittlig renhet på 95 %. Sammanfattningsvis involverade manipulation av mikroglia hos möss matsmältning med ett högrenat kollagenas, följt av en densitetsgradient. Detta tillvägagångssätt gav effektivt upphov till betydande populationer av ryggmärgsmikroglia.
Introduction
Det utmärkande kännetecknet för ryggradsdjur är ryggraden, där notokordet har ersatts av en sekvens av segmenterade ben som kallas ryggkotor, åtskilda av intervertebrala skivor. Denna följd av benmaterial formar ryggmärgskanalen, ett hålrum som omsluter och skyddar ryggmärgen. I släktet Rodentia bildas ryggraden vanligen av sju halskotor, tretton bröstkotor, sex ländkotor och ett varierande antal svanskotor 2,3. Ryggmärgens längd liknar ryggradens, och terminalfilum är en icke-nervös struktur som förankrar ryggmärgen till korsbenet. Dessutom går nervfibrer ut genom den intervertebrala foramen1.
Utvecklingen och funktionen av det centrala nervsystemet hos däggdjur beror i hög grad på aktiviteten hos nervsystemets inneboende makrofager, kallade mikroglia4. Även om mikroglia ursprungligen beskrevs som fagocyter som är bosatta i hjärnan, har ny forskning tillskrivit dessa celler många dynamiska funktioner 5,6. Microglias storlek varierar från 7 till 10 μm i homeostas; De anses vara bland de mest mångsidiga cellerna i kroppen och kan anpassa sig morfologiskt och funktionellt till sin ständigt föränderliga miljö7. Dessa celler uppvisar hög heterogenitet under både det embryonala och det vuxna stadiet8,9, medan de i vuxenstadiet också uppvisar komplex funktionell heterogenitet baserat på deras spatiotemporala sammanhang10. Mikroglias heterogenitet och multipla funktioner möjliggör differentiellt genuttryck och beteende i ryggmärgen och hjärnan. Det har visat sig att CD11b, CD45, CD86 och CCR9 uttrycks högre i ryggmärgen jämfört med hjärnan 8,9.
Det finns flera protokoll för isolering av cerebrala mikroglia11,12; Det finns dock bara ett fåtal för ryggmärgsmikroglia13,14. Att optimera en metod för att rena mikroglia från ryggmärgen underlättar utvecklingen av flera studier med fokus på att upptäcka mikroglias fysiologi. Detta protokoll syftar till att beskriva en enkel och mycket reproducerbar extraktion av ryggmärgen hos möss och rening av mikroglia (figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studien genomfördes i enlighet med den officiella mexikanska standarden NOM-062-ZOO-1999 och guiden för vård och användning av försöksdjur. Godkännande för studien erhölls från kommittéerna för forskning, etik och biosäkerhet vid Mexico Children's Hospital (HIM/2023/006) och Research and Bioethics Committee of the General Hospital of Mexico Eduardo Liceaga (DI/21/501/04/62). Tre C57BL/6-möss i åldern 6 till 8 veckor erhölls från Mexico Children's Hospital, där de föddes upp under isolerade förhållanden i ventilerade ställningar, i enlighet med riktlinjer för institutionell djurvård och användning.
1. Beredning av material och reagenser
- Förvärm Ca 2+ och Mg2+ fri PBS samt Hanks balanserade saltlösning (HBSS) till 37 °C.
- Komplettera HBSS-lösningen med 100 μg/ml Liberase och 4 μg/ml DNas (HBSS-LD). Se till att lösningen håller ett fysiologiskt pH på 7,4.
OBS: 1 ml arbetslösning per ryggmärg kommer att behövas. - Bered en isoton 90 %-lösning för densitetsgradientcentrifugering (finns i handeln, se materialtabell) och förvärm den till 37 °C.
- Förbered färgningsbufferten genom att kombinera 5 % värmeinaktiverat fetalt bovint serum (FBS) med PBS och förvara blandningen på is.
- Förvärm Dulbecco's Modified Eagle's Medium-high glukos (1 g/L) (DMEM) till 37 °C.
- Komplettera DMEM-mediet med 10 % FBS, 2 mM L-glutamin, 200 E/ml penicillin, 200 μg/ml streptomycin och 500 pg/ml amfotericin B (se materialförteckning) för att bereda DMEM-S.
2. Dissektion och preparering av ryggmärgen
- Avliva musen med en intraperitoneal överdos av pentobarbital i en dos på 150 mg/kg. Sterilisera musens bröstkorg och rygg med 70 % etanol.
OBS: Bekräfta att eutanasin lyckades innan du fortsätter med musdissektionen. - Raka torakolumbala området och fäst extremiteterna på dissektionsbrädan med tejp.
- Använd en skalpell och gör ett försiktigt snitt längs den dorsala mittlinjen från occipitalregionen till den sakrala regionen (Figur 2).
- Med hjälp av ett stereoskopiskt kirurgiskt mikroskop, dissekera i lager tills du når ländryggen och identifierar den sista kustbågen.
OBS: De 13 kustbågarna är ledade i bröstkotorna; när de dissekeras blir de synliga överlägsna L1-kotan2. - Bestäm den sista halskotan och korsbenet och gör sedan ett snitt för att separera ryggraden (Figur 2).
- Använd dissekerande pincett och utför en dorsal laminektomi av kotorna för att extrahera ryggmärgen (Figur 3A-D).
OBS: Med undantag för de två första halskotorna (atlas och axel) delar alla rörliga kotor en gemensam morfologisk design i olika regioner (livmoderhals, bröstkorg eller ländrygg). Varje typisk rörlig kota har en cylindrisk kotkropp i den främre änden. På baksidan av kroppen sitter en benbåge som kallas kotbågen (neuralbågen), som består av lameller och ryggradsutskott. Mellan dessa strukturer ligger kotforamen15. - Ta bort de nerver som kommer ut genom foramina (dorsala och ventrala rötter) som utgör det perifera nervsystemet och som kan innehålla infiltrerade makrofager (figur 3D).
OBS: Det är onödigt att ta bort pia mater eller hjärnhinnor eftersom densitetsgradientmediet effektivt eliminerar kontaminerande astrocyter. Dessutom minskar kvarhållandet av hjärnhinnorna reningstiden och förbättrar livskraften.
3. Vävnadsnedbrytning och isolering av mikroglia
- Placera ryggmärgen på dissektionsbrädan och klipp ryggmärgen i 2 mm bitar med hjälp av en Vannas-sax, vilket ger i genomsnitt 10 bitar.
- Överför ryggmärgens sektioner till ett 2 ml mikrorör med platt botten (Figur 3E,F).
- Tillsätt 1 ml av HBSS-LD-arbetslösningen (steg 1.2). Inkubera vid 37 °C i 25 minuter, virvlande kraftigt var 5:e minut.
- Låt innehållet i varje uppslutning passera genom en 40 μm sil och tillsätt sedan 7 ml HBSS med 2 % FBS för att neutralisera matsmältningen.
- Krossa den återstående vävnaden med en 1 ml sprutkolv. Centrifugera suspensionen i ett 50 ml koniskt rör i 5 minuter vid 220 x g, 4 °C.
- Kassera supernatanten med en 1 ml mikropipett och återsuspendera pelleten i 2 ml HBSS med 2 % FBS i ett 15 ml koniskt rör. Kombinera med 2 ml 90 % isotoniskt densitetsgradientmedium. Centrifugera i 25 minuter vid 160 x g, 18 °C.
OBS: Använd långsam acceleration och undvik att använda bromsen. - Använd en överföringspipett för att hämta gränssnittet och överföra det till ett 15 ml koniskt rör. Tvätta cellerna med 10 ml PBS och centrifugera i 5 minuter vid 220 x g, 4 °C.
- Återsuspendera cellerna i DMEM-S (steg 1.6) och förvara dem på is.
4. Bestämning av renhet/livsduglighet
- För kvantifiering av livskraftiga celler med hjälp av en hemocytometerkammare, använd en 0.4 % Trypan blå fläck (se materialförteckning).
OBS: I genomsnitt ger en enda mus 4-6 miljoner celler. - För att kvantifiera livskraftiga celler via en flödescytometer, använd kommersiellt tillgänglig aminreaktiv fluorescerande färgfärgning (se materialförteckning).
- Överför 1 miljon celler till ett 5 ml polystyrenrör med rund botten (FACS). Späd det fluorescerande färgämnet med PBS i förhållandet 1:1000 (skapa livskraftslösningen).
- Inkubera proverna med viabilitetslösningen i mörker vid 4 °C i 30 minuter. Tvätta cellerna med iskall PBS två gånger. Återsuspendera cellerna i 400 μl färgningsbuffert (steg 1.4).
- Blockera cellerna med 2.4G2 anti-FcRIII/I (se materialtabell) i den iskalla färgningsbufferten i 15 minuter vid 4 °C.
- Formulera antikroppsfärgningscocktailen genom att tillsätta de fluorescerande monoklonala antikropparna CD45-PerCP och CD11b-eFluor 450 till färgningsbufferten (vid en spädning på 1:300) (se Materialförteckning).
OBS: Även om båda teknikerna är tillgängliga, välj den som bäst överensstämmer med det efterföljande protokollet. - Inkubera proverna med antikroppsfärgningscocktailen i mörker vid 4 °C i 30 minuter. Tvätta cellerna med iskall färgningsbuffert två gånger. Återsuspendera cellerna i 400 μl färgningsbuffert.
- Samla in 250 000 händelser på en flödescytometer, enligt beskrivningen i gating-strategin i steg 6 (figur 4).
5. Immunofluorescerande färgning
- Placera ett förbehandlat täckglas i en brunn på en 6-hålsplatta.
OBS: För att behandla täckglas, lägg dem i en petriskål med 500 μL L-polylysin (0.01 mg/ml, se Materialtabell) lösning och inkubera i 1 timme. Tvätta dem sedan tre gånger med destillerat vatten och låt dem torka. - Frö 200 000 celler på det behandlade täckglaset med 500 μL DMEM-S-lösning. Inkubera i 24 timmar.
- Ta bort täckglasen och fixera cellerna med 3,7 % paraformaldehyd (PFA) i 20 minuter i rumstemperatur. Tvätta täckglasen tre gånger med iskall PBS.
- Permeabilisera cellerna med 0,2 % Triton X-100 i PBS i 15 min vid rumstemperatur. Tvätta sedan täckglasen tre gånger med kall PBS. Blockera cellerna med 0,2 % BSA i PBS i 1 timme vid rumstemperatur.
- Späd de fluorescensmärkta monoklonala antikropparna (vid en spädning på 1:300, se Materialförteckning) i den blockerande lösningen och inkubera i 1 timme vid rumstemperatur. Tvätta täckglasen tre gånger med iskall PBS.
- Applicera monteringsmedium som innehåller DAPI på objektglaset och försegla det sedan med ett täckglas.
OBS: Objektglasen kan omedelbart analyseras med hjälp av ett fluorescens- eller konfokalmikroskop, eller så kan de förvaras i upp till 3 månader vid -20°C.
6. Grindstrategi för ryggmärgsmikroglia
- Generera ett punktdiagram och upprätta en grind för att isolera livskraftiga celler baserat på viabilitetsfärgning och en tom fluorescerande kanal16. Uteslut icke-livsdugliga celler.
- Producera ett annat diagram med hjälp av framåt- och sidospridningsparametrar för att eliminera skräp16.
- Utveckla ytterligare ett punktdiagram och analysera uttrycket av CD11b och CD45 för att differentiera mikroglia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av ryggmärgsvävnad från möss utfördes enzymatisk nedbrytning med hjälp av en blandning som var mycket berikad med kollagenas och termolysin. Den resulterande smälta vävnaden genomgick passage genom ett 40 μm filter för att eliminera osmält material. De insamlade cellerna berikades genom en Percoll-densitetsgradient, med 90 % i den nedre delen och 45 % i den övre delen. De mikroglia-berikade cellerna i gränsytan färgades sedan med CD45- och CD11b-antikroppar och utsattes för flödescytometrisk analys (Figur 1).
Dissektionen av ryggraden som sträcker sig från occipitalregionen till korsbenet innebär exponering och dissektion av den paravertebrala muskulaturen. För att frigöra ryggraden exponerades kustbågarna och deras mätning utfördes från kota T13 till T1. Ryggraden, som artikulerades med skallen och korsbenet, blev synlig, och ett snitt utfördes på varje sida för att frigöra den helt (Figur 2).
Extraktionen av ryggmärgen åstadkoms genom ett lateralt snitt i kotkropparna och bildade en kanal. Under avlägsnandet av ryggmärgen skars de perifera nerverna av för att förhindra kontaminering från perifera makrofager. Därefter spreds den erhållna ryggmärgen över dissektionsbordet och delades i 2 mm bitar, som tillsattes till digestionslösningen (Figur 3). Användningen av liberase för nedbrytning av ryggmärgen rapporteras för första gången, vilket ger 4 till 6 miljoner mycket livskraftiga mikrogliaceller per vuxen mus. Den optimala lönsamheten som uppnås genom denna process sträcker sig från 80 % till 99 %.
För att bekräfta reningsprocessen utfördes FACS-färgning av mikroglia med CD45- och CD11b-antikroppar. Reningsprocessen visade effektivitet och gav upp till 99 % mikrogliaceller (figur 4). Dessutom utfördes immunofluorescensfärgning på de erhållna mikroglia med samma antikroppar, och dubbelpositiva celler med en genomsnittlig storlek på 10 μm observerades - vilket överensstämmer med den rapporterade storleken på icke-aktiverade mikroglia. Detta tyder på att dessa celler är lämpliga för aktiveringsstudier (figur 4E). Det är troligt att andra immunceller kan vara närvarande under inflammatoriska processer eller att mikroglia kan genomgå morfologiska förändringar under olika stimuli. I sådana fall rekommenderas att särskilda markörer införlivas för identifiering av varje cellpopulation.
Figur 1: Schematisk översikt över reningsprotokollet för ryggmärgsmikroglia. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Ryggmärgsdissektion . Efter avlivning isolerades och dissekerades musens ryggrad. (A) Stegvis huddissektion som sträcker sig från occipitala till kaudala regioner, som avslöjar parakotmuskulaturen. (B) Sekventiell dissektion genom lagren av paravertebrala muskler. C) Avlägsnande av ryggraden efter revbensskärning. (D) Visualisering av en intakt ryggmärg i kotkanalen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Ryggmärgsextraktion och matsmältningsprocess . A) Sekventiell spinal laminektomi med två snitt på cirka 2 mm. (B) Exponerad ryggmärg. C) Avlägsnande av ryggmärgen. (D) Perifer nervsnittning. E) Ryggmärgen delades i 2 mm stora sektioner och placerades i rötningsmediet. F) Standardinkubation vid 37 °C för vävnadsnedbrytning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Bedömning av cellernas renhet och viabilitet. Immunfärgning av renade celler med hjälp av mikrogliaspecifika markörer. A) Identifiering av levande celler (fluorescerande färgnegativa celler). (B) Cellstorleksbaserat urval. (C) CD45low- och CD11b+-celler, som uppvisar en renhet som överstiger 99 %. (D) Genomsnittlig lönsamhet (87,46 ± SD 1,468) och genomsnittlig renhetsgrad (88,51 ± SD 3,948; n = 5). (E) Immunofluorescens som visar CD45+ och CD11b+ färgning i renade celler. Bilderna togs med ett konfokalmikroskop med en laser med vitt ljus vid 60x förstoring (skalstreck = 5 μm). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Många protokoll har utvecklats för studier av mikroglia på grund av deras betydelse för hjärnans homeostas. I dessa metoder kommer mikroglia vanligtvis från hjärnhalvorna hos embryonala eller neonatala råttor och möss17. Ett begränsat antal studier har behandlat rening av mikroglia från ryggmärgen hos vuxna möss13,14. Dessa tekniker involverar enzymatisk nedbrytning med kollagenas och/eller papain tillsammans med DNAse, ofta i kombination med gradientseparation med Percoll eller OptiPrep. Att använda papain-baserad ryggmärgssmältning utan gradientseparation kan dock leda till astrocytkontaminering, även efter avlägsnande av pia mater14,17.
Denna studie presenterar ett protokoll för rening av mikroglia från den vuxna musens ryggmärg. Protokollet använder en exakt blandning av kollagenas I och II tillsammans med termolysin, en kombination som är känd för att effektivt smälta olika vävnader med kontrollerad nedbrytning18, vilket minskar apoptos på grund av dess låga innehåll av neutrala proteaser. Hjärnhinnor eller pia mater, som ofta är källor till astrocytkontaminering, kan elimineras genom användning av en Percoll-gradient i denna procedur, vilket gör att det inte är nödvändigt att ta bort dessa lager (figur 1).
Mikroglial heterogenitet uppstår från distinkta morfologier i ryggmärgen och hjärnan8. Detta protokoll tillämpades dock också på hjärnhalvor med liknande resultat (data presenteras inte), vilket belyser dess robusthet för att analysera både ryggmärg och cerebrala mikroglia.
Höga nivåer av renhet (från 80 % till 99 %) och livskraft (85 % till 98 %) kan konsekvent uppnås med detta protokoll. Bearbetning av celler från nervsystemet är invecklat, främst på grund av att cellviabiliteten påverkas väsentligt av bearbetningstiden; Syrebrist som överstiger 20 minuter kan vara dödlig. För optimal livsduglighet rekommenderas att begränsa bearbetningstiden från ryggmärgsextraktion till matsmältning till högst 10 minuter. Denna beskrivning är skräddarsydd för friska möss i åldern 8 till 10 veckor, vilket kräver ytterligare standardisering för yngre eller äldre möss. Suboptimal livsduglighet innebär översmältning av vävnad, vilket kräver upprepning. Alternativt kan FACS-sortering rädda celler från översmälta prover.
Användningen av liberase för att smälta och rena ryggmärgsmikroglia är ny. Dess begränsade användning i nervsystemets vävnader har historiskt sett berott på viabilitetsutmaningar18,19. Denna studie visar dock ökad livskraft vid användning av detta minutiöst renade kollagenas. Alternativt kan andra kollagenaser med lägre styrka undersökas.
Flera viktiga överväganden måste erkännas, såsom förekomsten av neuroinflammation, blod-hjärnbarriär och musålder. Dessa faktorer förändrar både mikrogliamorfologi och frekvens. I fall av neuroinflammation eller störningar i blod-hjärnbarriären kan immunceller som uttrycker CD45 och CD11b infiltrera, vilket minskar mikroglia-renheten. Eftersom mikroglia utforskas i stor utsträckning vid olika neuroinflammatoriska tillstånd, har detta protokoll potential för patologiska och neurofysiologiska undersökningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna deklarerar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av bidrag från det stipendium som beviljats av National Council of Science and Technology (CONACYT) (702361). Författarna erkänner Ph.D. programmet i biologiska kemiska vetenskaper vid National School of Biological Sciences vid National Polytechnic Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL collection tubes | Corning, USA | 430790 | |
| 2 mL microtubes | Axygen, USA | MCT-200-G | |
| 2.4G2 anti-FcR | BioLegend, USA | 101302 | |
| 50 mL collection tubes | Corning, USA | 430829 | |
| 70% ethanol | |||
| Antibiotic-Antimycotic (penicillin, streptomycin, amphotericin b) | Gibco, USA | 15240062 | |
| Antibody CD11b eFluor 450 anti-mouse | eBioscience, USA | 48-0112 | |
| Antibody CD45 PerCP anti-mouse | BioLegend, USA | 103130 | |
| Balanced salt solution (PBS) calcium- magnesium-free | Corning, USA | 46-013-CM | |
| Blue Cell Strainer 40 μm | Corning, USA | 352340 | |
| Costar 6-well Clear Not Treated | Corning, USA | CLS3736 | |
| Coverslips | |||
| Digital Heating Shaking Drybath | Thermo Scientific Digital HS Drybath, USA | 88870001 | |
| Dissecting forceps for microsurgery | FT by DUMONT | ||
| DNase | Roche, USA | 4536282001 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium-high glucose (DMEM) | Merck, USA | D6429 | |
| Electric shaver | |||
| FACS tube | Thermo, USA | 352058 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAN Biotech, Alemania | P30-3306 | |
| Flow cytometer Cytoflex | Beckman Coulter | ||
| Hank’s balanced salt solution | Merck, USA | H2387 | |
| L-glutamine | Corning, USA | 15393631 | |
| Liberase TM | Roche, USA | 5401119001 | |
| Neubauer chamber Counting Chambers | China | 1103 | |
| Pentobarbital | |||
| Percoll | Merck, USA | 17089101 | density gradient centrifugation |
| Poly-L-lysine solution | Merck, USA | P8920 | |
| Scalpel No. 25 | HERGOM, Mexico | H23 | |
| Snaplock Microcentrifuge Tubes 2 mL | Axygen, USA | 10011-680 | |
| Stereoscopic microscope | Velab, Mexico | HG927831 | |
| Straight surgical scissors (10 cm) | HERGOM, Mexico | ||
| Straight Vannas scissors | HERGOM, Mexico | ||
| Triton X100 | Merck, USA | X100 | |
| Trypan blue Stain 0.4% | Merck, USA | 15250-061 | |
| Vortex mixer | DLAB, China | 8031102000 | |
| Zombie Aqua Fixable Viability Kit | BioLegend, USA | 423102 | amine-reactive fluorescent dye staining |
References
- Schröder,, Moser,, Huggenberger, Neuroanatomy of the Mouse. , Springer, Switzerland. 59-78 (2020).
- Sengul, G., et al. Cytoarchitecture of the spinal cord of the postnatal (P4) mouse. Anat Rec. 295, 837-845 (2012).
- Bab, I., et al. Microtomographic atlas of the mouse skeleton. VIII, First ed, Springer. 205 (2007).
- Nayak, D., et al.
- Martinez, F. O., et al.
- Masuda, T., et al.
- Prinz, M. Microglia biology: one century of evolving concepts. Cell. 179 (2), 292-311 (2019).
- de Haas, A. H., et al. Region-specific expression of immunoregulatory proteins on microglia in the healthy CNS. Glia. 56 (8), 888-894 (2008).
- Xuan, F. L., et al. Differences of microglia in the brain and the spinal cord. Front Cell Neurosci. 13, 504 (2019).
- Paolicelli, R. Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads. Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).
- Li, Q., et al. Spinal IL-36γ/IL-36R participates in the maintenance of chronic inflammatory pain through astroglial JNK pathway. Glia. 67 (3), 438-451 (2019).
- Prinz, M., et al. Microglia and central nervous system-associated macrophages-from origin to disease modulation. Annu Rev Immunol. 39, 251-277 (2021).
- Yip, P. K., et al. Rapid isolation and culture of primary microglia from adult mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 183 (2), 223-237 (2009).
- Akhmetzyanova, E. R., et al. Severity- and time-dependent activation of microglia in spinal cord injury. Int J Mo. Sci. 24 (9), 1-16 (2023).
- Mahadevan, V.
- Krukowski, K., et al. Temporary microglia-depletion after cosmic radiation modifies phagocytic activity and prevents cognitive deficits. Sci Rep. 8 (1), 1-13 (2018).
- Cardona, A., et al. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
- Schmidt, V. M., et al. Comparison of the enzymatic efficiency of Liberase TM and tumor dissociation enzyme: effect on the viability of cells digested from fresh and cryopreserved human ovarian cortex. Reprod Biol Endocrinol. 16 (57), 1-14 (2018).
- Kusminski, C. M., et al. MitoNEET-parkin effects in pancreatic α- and β-cells, cellular survival, and intrainsular cross talk. Diabetes. 65 (6), 1534-1555 (2016).
