Summary
Denne studien beskriver en metode for å isolere og rense bakterielle ekstracellulære vesikler (BEVs) beriket fra menneskelig avføring via tetthetsgradientsentrifugering (DGC), identifiserer de fysiske egenskapene til BEVs fra morfologi, partikkelstørrelse og konsentrasjon, og diskuterer potensielle anvendelser av DGC-tilnærmingen i klinisk og vitenskapelig forskning.
Abstract
Bakterielle ekstracellulære vesikler (BEVs) er nanovesikler avledet fra bakterier som spiller en aktiv rolle i bakterier-bakterier og bakterier-vertkommunikasjon, og overfører bioaktive molekyler som proteiner, lipider og nukleinsyrer arvet fra foreldrebakteriene. BEVs avledet fra tarmmikrobiota har effekter i mage-tarmkanalen og kan nå fjerne organer, noe som resulterer i betydelige implikasjoner for fysiologi og patologi. Teoretiske undersøkelser som undersøker typer, mengder og roller av BEVs avledet fra menneskelig avføring er avgjørende for å forstå sekresjon og funksjon av BEVs fra tarmmikrobiota. Disse undersøkelsene krever også en forbedring i dagens strategi for å isolere og rense BEVs.
Denne studien optimaliserte isolasjons- og renseprosessen til BEVs ved å etablere to tetthetsgradientsentrifugeringsmoduser (DGC): Top-down og Bottom-up. Den berikede fordelingen av BEVs ble bestemt i fraksjonene 6 til 8 (F6-F8). Effektiviteten av tilnærmingen ble evaluert basert på partikkelmorfologi, størrelse, konsentrasjon og proteininnhold. Partikkel- og proteinutvinningshastighetene ble beregnet, og tilstedeværelsen av spesifikke markører ble analysert for å sammenligne utvinning og renhet av de to DGC-modusene. Resultatene indikerte at Top-down sentrifugeringsmodus hadde lavere forurensningsnivåer og oppnådde en gjenvinningsgrad og renhet som ligner på Bottom-up-modus. En sentrifugeringstid på 7 timer var tilstrekkelig til å oppnå en fekal BEV-konsentrasjon på 108/mg.
Bortsett fra avføring, kan denne metoden brukes på andre kroppsvæsketyper med riktig modifikasjon i henhold til forskjellene i komponenter og viskositet. Avslutningsvis vil denne detaljerte og pålitelige protokollen lette standardisert isolasjon og rensing av BEVs og dermed legge grunnlaget for påfølgende multi-omics analyse og funksjonelle eksperimenter.
Introduction
Tarmen er allment anerkjent som organet som har de rikeste mikrobielle samfunnene i menneskekroppen, med over 90% av bakteriene involvert i kolonisering og multiplikasjon 1,2. Omfattende bevis har vist at tarmmikrobiota modulerer tarmmikromiljøet og samtidig interagerer med dysfunksjon i fjerne organer, primært gjennom en nedsatt tarmbarriere 3,4. Monteringsbevis indikerer en sammenheng mellom ubalansen i tarmmikrobiota og utviklingen av inflammatorisk tarmsykdom (IBD) 5,6, samt kognitive forstyrrelser gjennom tarm-hjerneaksen 5,6,7,8. Bakterielle ekstracellulære vesikler (BEVs) produsert av bakterier spiller viktige roller i disse patologiske prosessene.
BEVs er nanoskala partikler innkapsling bakterielle derivater, med diametre fra 20 til 400 nm. De har vist seg å lette interaksjoner mellom bakterier og deres vertsorganismer 9,10. Til tross for deres usynlighet har disse partiklene fått økende oppmerksomhet fra forskere på grunn av deres potensielle brede applikasjoner som diagnostiske biomarkører, terapeutiske mål og legemiddelleveringsbiler11. Menneskelig avføring, ofte brukt som biospecimens for å studere BEVs, hovedsakelig hentet fra tarmbakterier, inneholder en kompleks blanding av vann, bakterier, lipider, proteiner, ufordøyd matrester og eksfolierte epitelceller blant andre. Den intrikate fekale sammensetningen utgjør utfordringer for isolasjon og renhet av BEVs, og dermed hindre en omfattende, objektiv og realistisk analyse av BEVs. Derfor har effektive strategier for å minimere forstyrrelser fra forurensende komponenter og øke utbyttet av BEVs dukket opp som kritiske problemer som garanterer umiddelbar oppmerksomhet.
Eksisterende isolasjonsstrategier er i stor grad avhengige av teknikker som ultra-høyhastighets sentrifugering (UC), tetthetsgradientsentrifugering (DGC) og størrelsesekskluderingskromatografi (SEC) 12,13,14,15,16,17. For tiden er DGC en av de mest anvendte metodene innen BEV-separasjon, som omfatter to sedimenteringsflytende moduser, "Top-down" og "Bottom-up", som bestemmes av prøvens opprinnelige lastposisjon. Disse metodene skiller ekstracellulære vesikler (EV) fra andre komponenter basert på størrelses- og tetthetsforskjeller, noe som gir variabel renhet og gjenvinningshastighet. Tidligere forskning har indikert at enkelttilnærmingsstrategier er utilstrekkelige for tilstrekkelig å skille EV fra løselige proteiner i kroppsvæskeprøver, som lipoprotein i blod18 og Tamm-Horsfall-protein i urin19. I tillegg overlapper størrelsesfordelingen av eukaryote ekstracellulære vesikler (EEVs) ofte med BEVs, og nødvendiggjør dermed ytterligere metodologiske forbedringer for å optimalisere BEV-utbyttet. Følgelig, fremme studiet av BEVs hengsler på utvikling av effektive separasjon og rensing metoder. Spesielt benyttet Tulkens et al 15 en ortogonal biofysisk strategi for å skille fekale BEVs fra EEVs, hvor sentrifugeringstiden for en Bottom-up DGC-modus var opptil18 timer. I kontrast reduserte denne studien den til 7 timer, noe som sparte gradient-ultracentrifugeringstiden og forenklet prosessen.
I denne studien isolerte og renset vi fekale BEVs ved å bruke to DGC-moduser under optimaliserte bufferforhold, etter å ha beriket BEVs med en rekke differensielle sentrifugeringshastigheter, fra lav til ekstremt høy hastighet. Evalueringer basert på morfologi, partikkelstørrelse og konsentrasjon indikerte en prisverdig ytelse ved denne forbedrede metoden. Denne studien kan tjene som grunnlag for fremtidig forskning, utvide sine applikasjoner til et bredere domene, og gir innsikt i heterogeniteten av BEVs i menneskekroppen. Det bidrar også til standardisering av BEV separasjon og analyse teknikker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den etiske komiteen ved Nanfang Hospital, Southern Medical University, sanksjonerte denne studien, som ble utført med informert samtykke fra deltakerne. Alle metodene som ble brukt her fulgte standard driftsretningslinjer gitt av International Human Microbiome Standards (IHMS: http://www.microbiome-standards.org/). Alle påfølgende væskehåndteringsprosedyrer ble pålagt å bli utført i et biosikkerhetsskap eller en ultraren benk.
1. Innsamling og aliquoting av fekale prøver
- Del ut en avføringsprøvetaker, en forseglet pose og en isboks, og gi omfattende instruksjoner til deltakerne om hvordan de skal anskaffe og bevare prøvene.
- Instruer hver deltaker om å samle avføringsprøven ved hjelp av den medfølgende prøvetakeren, og å transportere den til laboratoriet ved en temperatur på 4 ° C innen et 24-timers vindu.
- Ved mottak på laboratoriet, bruk en steril skje til å aliquot mindre enn 3,5 g avføring i et forhåndsveid 50 ml sentrifugerør. Legg merke til fekalprøvens vekt på røret for påfølgende forbehandlingsprosedyrer.
PAUSEPUNKT: Hvis umiddelbar behandling av prøvene ikke er mulig, tildel prøven til langtidslagring ved -80 °C etter passende notasjon.
2. Forberedelse av avføringsprøve
- Avkjøl 500 ml fosfatbufret saltvann (PBS) ved 4 °C. Filtrer den forkjølte PBS gjennom et 0,22 μm polyetersulfon (PES)-filter ved hjelp av en 50 ml sprøyte i ti 50 ml sentrifugeringsrør.
- Plasser to 50 ml rør på is, hver inneholdende 3,5 g avføringsprøver. Tilsett 35 ml PBS til hvert rør.
MERK: Beregn den nødvendige mengden PBS for avføringsoppløsning, og sørg for en maksimal prøvekonsentrasjon på 10% (w / v). Hvis du behandler flere prøver, bruk flere rør etter behov. - Rist prøvene ved 300 o / min i 2 timer ved 4 °C, eller legg dem i 8 timer ved minst 4 °C til avføringen er synlig opphengt.
3. Differensialhastighetssentrifugering
- Kjøl ned sentrifugen med høy hastighet til 4 °C.
- Juster vekten på de to tubene som inneholder prøvene fremstilt i trinn 2.3 med PBS for å nå en totalvekt på 0,1 g.
- Sentrifuger prøvene ved 3 000 × g i 20 minutter ved 4 °C.
- Pipetter supernatanten forsiktig inn i to rene 50 ml sentrifugerør, og etterlater ca. 1 ml over pelleten. Bruk en engangs plast Pasteur pipette for denne prosessen.
- Juster vekten av de to rørene med PBS for å nå en totalvekt innen ± 0,1 g.
- Sentrifuger den overførte supernatanten ved 12 000 × g i 30 minutter ved 4 °C.
- Aspirer supernatanten med en 20 ml sprøyte, fjern sprøytenålen og filtrer den gjennom 0,22 μm filtre i 50 ml rør. På dette tidspunktet bør supernatantvolumet være ca. 30 ml.
MERK: Hvis en betydelig mengde urenhet fortsatt er synlig etter sentrifugeringen på 12 000 × g, er det nødvendig å gjenta sentrifugeringstrinnet ved 12 000 × g i 30 minutter ved 4 ° C. Unnlatelse av å gjøre dette kan føre til et betydelig tap av BEVs på grunn av pore blokkering under filtrering.
4. Sentrifugering med ultrahøy hastighet
- Rengjør rotoren og bøtten ved å tørke dem med 75 % (v/v) alkohol for å eliminere eventuell restforurensning.
- Plasser et 38,5 ml ultrasentrifugerør i rørholderen.
MERK: Velg riktig ultrasentrifugerør basert på prøvevolumet. Unngå ultrafiolett stråling og uegnede kjemiske reagenser for sterilisering av sentrifugalrør som angitt i produkthåndboken. - Overfør ca. 30 ml av den filtrerte fekale supernatanten fra trinn 3,7 til ultrasentrifugerøret.
- Fyll ultrasentrifugerøret med ca. 8 ml PBS, og etterlater et 3 mm gap fra rørets åpning.
- Plasser de to ultrasentrifugerørene med prøvene i motsatte ultrasentrifugeringsbøtter, for eksempel tilsvarer bøtte 1 4 (1-4), 2-5, 3-6.
- Juster vekten på de to skuffene med PBS for å oppnå en totalvekt innen ± 0,005 g.
- Monter alle skuffer på rotoren, uavhengig av om rørene er lastet.
- Start vakuumet og sentrifuger prøvene ved 160 000 × g i 70 minutter ved 4 °C.
- Slipp kammervakuumet, og åpne døren når Ready vises på instrumentets hjemmeside.
- Fjern rotoren fra ultrasentrifugen.
- Flytt bøttene fra rotoren til stativet, og hent rørene med en nipper.
- Kast supernatanten, som vil inneholde synlige brune pellets nederst.
- Resuspender pelletsene ved å pipettere dem opp og ned gjentatte ganger med en 1000 μL pipette med 1 ml forkjølt (4 °C) PBS til den er helt opphengt. Fyll røret med ca. 37 ml PBS, og etterlater et 3 mm gap fra åpningen.
- Utfør en ny ultrasentrifugering ved å følge trinn 4,5–4,11 ved 160 000 × g i 70 minutter ved 4 °C for å fjerne delvis festede forurensende komponenter fra rørveggene.
- Kast supernatanten, snu de to ultrasentrifugerørene i 5 minutter og fjern eventuell gjenværende oppløsning på innerveggen med vindusviskere.
MERK: Rengjøring av den indre veggen minimerer forstyrrelser fra gjenværende forurensning som fester seg til ultrasentrifugerørveggen. Velg vindusviskere som ikke vil påvirke BEV-analysen, spesielt med hensyn til partikkelstørrelse. - Resuspender pelletsene i hvert rør ved å pipetere dem opp og ned med 1,2 ml forkjølt (4 °C) PBS ved hjelp av en 1000 μL pipette.
- Overfør 1,2 ml av PBS/BEV-oppløsningen fra ett ultrasentrifugerør til et rent 1,5 ml mikrorør.
PAUSEPUNKT: PBS/BEV-løsningen samlet fra ett ultrasentrifugerør kan gå videre til trinn 6. Oppbevar oppløsningen fra den andre tuben ved -80 °C.
5. Oppløsning av løsning for sentrifugering av tetthetsgradient
- Tilberedning av 0,02 M HEPES-buffer
- Kombiner 0,477 g HEPES pulver og 0,8 g NaCl med 90 ml autoklavert avionisert vann.
- Juster pH til 7,2 ved å tilsette 1 M natriumhydroksid (NaOH). Bring volumet til 100 ml med avionisert vann og filtrer løsningen gjennom 0,22 μm PES-membraner.
FORSIKTIG: Natriumhydroksid er et sterkt kaustisk alkali. Operatørene må håndtere og klargjøre den forsiktig i et avtrekkskap.
- Forberedelse av tetthetsgradientbuffer
- Beregn det nødvendige volumet av hver tetthetsgradientbuffer basert på antall ultrasentrifugerør for sentrifugering av tetthetsgradient (trinn 6) (I denne protokollen var volumene for 60%, 50%, 40%, 20% og 10% gradientløsninger henholdsvis 2,5 ml, 3 ml, 6 ml, 6 ml og 6 ml).
- For fremstilling av en 50 % (w/v) jodixanol-virkemåte, bland 0,02 M HEPES-bufferen og 60 % (w/v) jodixanoloppløsningen i et volumforhold på 1:5 (0,5 ml:2,5 ml).
MERK: Bruk en engangs 20 ml sprøyte for å trekke opp iodixanoloppløsningen og unngå å tilføre luft. - For å forberede jodixanolbuffere med forskjellige konsentrasjoner, kombiner 50 % jodixanol-arbeidsløsningen fra trinn 5.2.2 med HEPES-bufferen oppnådd i trinn 5.1 ved bruk av en 1000 μL pipette i henhold til proporsjonene vist i tabell 1.
MERK: Utfør trinn 5 på en ultraren benk med lysene av. Oppbevar den åpnede iodixanoloppløsningen i kjøleskap ved 4 °C for å hindre bakterievekst. Hold iodixanoloppløsningen og HEPES-bufferen beskyttet mot lys.
6. Etablering av et sentrifugeringssystem for tetthetsgradient
- Ovenfra og ned DGC-modus
- Kombiner 500 mikroliter PBS/BEV-oppløsning isolert fra trinn 4 med 3 ml PBS. Bland oppløsningene forsiktig med en 1000 μL pipette for å oppnå 3,5 ml PBS/BEV-løsning.
- Plasser et 31 ml ultrasentrifugerør på en skumplate med hull og merk det som "↓".
- Tilsett vertikalt 3 ml av 50% jodixanoloppløsningen til bunnen av røret ved hjelp av en 1000 μL pipette.
- Vipp røret i en 70° vinkel og plasser en rørholder eller annen støtte litt over skumplatens nivå, under åpningen av røret.
- Tilsett 3 ml 40% jodixanoloppløsning på toppen av 50% jodixanoloppløsningen ved bruk av en 1000 μL pipette.
- Tilsett 3 ml 20% jodixanoloppløsning på toppen av 40% jodixanoloppløsningen ved bruk av en 1000 μL pipette.
- Tilsett 3 ml 10% jodixanoloppløsning på toppen av 20% jodixanoloppløsningen ved bruk av en 1000 μL pipette.
- Tilsett 3,5 ml PBS/BEV-oppløsning fra trinn 6.1.1 på toppen av 10 % jodixanoloppløsningen ved bruk av en 1000 μL pipette.
- Sett rørene forsiktig tilbake i oppreist stilling.
MERK: Etter pipettering skal stratifiseringen være synlig.
- DGC-modus nedenfra og opp
- Plasser et 31 ml ultrasentrifugerør på en skumplate med hull og merk det som "↑".
- Tilsett vertikalt 2,5 ml av 60% iodixanol-stamoppløsningen til bunnen av røret. Bland det forsiktig med 500 mikrol PBS/BEV-oppløsning isolert fra trinn 4 ved bruk av en 1000 μL pipette for å oppnå 3 ml 50 % jodixanol/BEV-løsning.
- Vipp røret i en 70° vinkel og plasser en rørholder eller annen støtte litt over skumplatens nivå, under åpningen av røret.
- Tilsett 3 ml av 40% jodixanoloppløsningen på toppen av 50% jodixanol / BEV-løsningen ved hjelp av en 1000 μL pipette.
- Tilsett 3 ml av 20% jodixanoloppløsningen på toppen av 40% jodixanoloppløsningen ved bruk av en 1000 μL pipette.
- Tilsett 3 ml av 10% jodixanoloppløsningen på toppen av 20% jodixanoloppløsningen ved bruk av en 1000 μL pipette.
- Tilsett 3,5 ml PBS på toppen av 10% jodixanoloppløsningen ved bruk av en 1000 μL pipette.
- Sett rørene forsiktig tilbake i oppreist stilling.
- På dette tidspunktet forblir 200 μL av suspensjonen oppnådd i trinn 4.17, som kan analyseres senere som en gruppe kalt "UC".
MERK: Når du overfører løsninger i trinn 6, må du alltid holde pipettespissen mot ultrasentrifugerørveggen vinkelrett på rørets akse.
7. Tetthetsgradientsentrifugering og fraksjonsoppsamling
- Juster vekten av de to rørene med PBS for å oppnå en totalvekt innen ± 0,005 g.
- Legg rørene i bøttene i henhold til trinn 4.5 og utsett dem for sentrifugering ved 160 000 × g i 7 timer ved 4 °C.
- Samle fraksjonene ved hjelp av en pipettor (1000 μL) fra topp til bunn mot sideveggen i følgende rekkefølge: 3 ml, 2 ml, 1 ml, 1 ml, 1 ml, 1 ml, 1 ml, 1 ml, 1 ml, 1 ml, 1,5 ml og 3 ml i et 38,5 ml ultrasentrifugerør.
MERK: Hold siktlinjen på samme nivå som væskeoverflaten. - Utfør ultrasentrifugering for hver fraksjon oppnådd i trinn 7.3 i henhold til trinn 4 ved 160 000 × g i 70 minutter ved 4 °C.
- Fjern supernatanten og snu ultrasentrifugerørene i 5 minutter.
- Resuspender pelletsene i 200 mikroliter forkjølt (4 °C) PBS ved hjelp av en 200 μL pipette.
- Overfør PBS/BEV-oppløsningen til et rent 1,5 ml mikrorør.
- Merk fraksjonene fra F1 til F10 og analyser dem basert på trinn 8.
PAUSEPUNKT: Hvis prøvene tatt i trinn 7.8 ikke kan behandles umiddelbart, skal de oppbevares ved -80 °C.
8. Karakterisering og kvantitativ analyse av de innsamlede fraksjonene
- Bestem absorbansverdiene (OD 340 nm) for hver fraksjon ved hjelp av en mikroplatedetektor med en tom kontroll for å beregne deres tilsvarende tetthet.
MERK: Erstatt PBS/BEV-løsningen (trinn 6.1.1 og trinn 6.2.2) med PBS for å opprette en tom kontroll.- Tilbered 100 μL hver av 0 %, 5 %, 10 %, 12,5 % og 20 % jodixanoloppløsning fortynnet med 0,02 M HEPES basert på 50 % stamløsning (trinn 5.2.2) som standarder, tilsvarende tettheter på henholdsvis 1,0058 g/ml, 1,0318 g/ml, 1,058 g/ml, 1,0708 g/ml og 1,111 g/ml.
- Legg til 50 μL av hver fraksjon fra den tomme kontrollen (utarbeidet i trinn 7.3) og 50 μL av hver standardløsning (utarbeidet i trinn 8.1.1) for å duplisere brønner på en 96-brønnsplate.
- Sett bølgelengden til 340 nm, mål endepunktets optiske tetthet og beregn tettheten til hver fraksjon.
- Identifiser F4-F9 som rekkevidden av BEV-fraksjoner basert på tettheten.
- Bestem proteinkonsentrasjonen av BEV-fraksjonene ved bruk av bicinchoninsyreanalysen (BCA).
- Fortynn stoffet ti ganger i PBS levert av produsenten for å fremstille en 0,5 μg / μL standard proteinløsning.
- Tilsett standard proteinløsning (fremstilt i trinn 8.2.1) med varierende volum i henhold til reagensinstruksjonene, og suppler hver brønn i en 96-brønnsplate med PBS til et totalt volum på 20 μL.
- Legg til 20 μL av prøvene utarbeidet i trinn 7.8 og prøvene som er igjen etter UC definert i trinn 6.2.9 til hver brønn.
- Bland reagenser A og B i forholdet 50: 1, og overfør 200 μL til hver brønn.
- Inkuber platen i et vannbad på 37 °C i 30 minutter.
- Mål absorbansverdien ved hjelp av en mikroplateleser, beregne proteinkonsentrasjonen (μg / μL) og bestem proteininnholdet (μg) i prøvene basert på standardkurven (x: optisk tetthet; y: proteinkonsentrasjon) generert fra verdiene av standardløsningene fortynnet i trinn 8.2.2.
- Karakteriser BEV-fraksjonene definert i trinn 8.1.4 ved hjelp av transmisjonselektronmikroskopi (TEM) for å verifisere tilstedeværelsen av BEVs. Alle prosedyrer nedenfor skal utføres på is.
- Påfør 10 μL av hver isolerte F4-F9-fraksjon fra trinn 7.8 og prøvene som er igjen etter UC definert i trinn 6.2.9 på Formvar/Carbon-støttede kobbergitter i 20 minutter, og blott med filterpapir.
- Skyll prøvene med 100 μL PBS tre ganger i 1 min hver, og blott med filterpapir.
- Fest prøvene med 100 μL 1% (w / v) glutaraldehyd i 5 minutter og blott med filterpapir.
- Vask ristene med 100 μL PBS ti ganger i 2 min hver, og blott med filterpapir.
- Beis ristene med 50 μL 1,5% (w/v) uranylacetat i 10 min, og blott med filterpapir.
FORSIKTIG: Uranylacetat er radioaktivt og ekstremt giftig når det kommer i kontakt med huden eller inhaleres. Håndter løsninger med uranylacetat i et avtrekkskap og følg passende sikkerhetstiltak. - Overfør ristene til en metylcellulosedråpe på 1 % (w/v) i 5 minutter og blott med filterpapir.
- Oppbevar de lufttørkede ristene i et mørkt, støvfritt miljø til observasjon.
- Ta bilder og analyser dem ved hjelp av en TEM.
- Karakteriser BEV-fraksjonene definert i trinn 8.1.4 ved hjelp av nanopartikkelsporingsanalyse (NTA) for å telle antall partikler.
- Kalibrer systemet med 110 nm polystyrenpartikler.
- Vask prøvebassenget med PBS.
- Fortynn prøvene fra forskjellige fraksjoner oppnådd i trinn 7.8 og prøvene som er igjen etter UC definert i trinn 6.2.9 til en konsentrasjon i området 105-10 9 partikler/ml, med en optimalisert konsentrasjon på 107 partikler/ml.
- Ta opp og analyser ved 11 posisjoner med tre replikasjoner, og hold temperaturen rundt 23-30 °C.
- Analyser proteininnholdet i prøvene ved coomassie brilliant blue staining (CBBS) og western blotting (WB).
- Fortynn BEV-prøvene fra forskjellige fraksjoner oppnådd i trinn 7.8 og prøvene som er igjen etter UC definert i trinn 6.2.9 ved bruk av PBS og 5 × lastebuffer til en endelig konsentrasjon på 0,5 eller 1 μg / μL, hvis kvantifisering er nødvendig, og sikre tilstrekkelig prøvebelastning på 20 μL (10 μg eller 20 μg) av hver brønn i trinn 8.5.2. Kok prøvene ved 95 °C i 10 min.
- Monter den prefabrikkerte polyakrylamidgelen i elektroforesetanken, og overfør prøvene til brønnene.
- Utfør vertikal elektroforese med følgende parametere: 160 V i 50 minutter.
- Flekk gelen i Coomassie strålende blå løsning i 1 time, skyll i avionisert vann til den blå bakgrunnen lysner, og ta bilder med et kamera.
- Utfør proteinblottingsprosedyrer for andre geler med følgende parametere: 400 mA i 20 minutter.
- Blokker blottemembranene med en 5 % (w/v) BSA-løsning i 1 time ved romtemperatur.
- Vask membranene i TBST-buffer tre ganger i 5 minutter hver.
- Inkubere membranene med primære antistoffer (BEV-markører: LPS, OmpA, LTA; EEV-markører: CD63, CD9, TSG-101, Syntenin, Integrin β1; Andre forurensningsmarkører: Flagellin, Calnexin) i 8-12 timer ved 4 °C.
- Vask membranene i TBST-buffer tre ganger i 10 minutter hver.
- Inkuber membranene med sekundære antistoffer i 1 time ved romtemperatur.
- Utfør trinn 8.5.9.
- Utvikle blottingen ved hjelp av et kjemiluminescensapparat.
- Erstatt PBS / BEV-løsning (trinn 6.1.1 og trinn 6.2.2) med BEVs fra Escherichia coli for å etablere en positiv kontroll (se materialfortegnelse for prosedyren for å isolere rå E. coli-BEVs), og utfør alle de ovennevnte eksperimentene for å karakterisere BEVs.
PAUSEPUNKT: Bestem F6-F8 som fordelingen av BEV-berikede fraksjoner basert på resultatene av karakteriseringen beskrevet ovenfor for fekale BEVs, og bruk dette innsnevrede området for påfølgende analyse.
- Beregn utvinningsgraden i form av partikler og proteiner for å vurdere effektiviteten til de to DGC-modusene. Resultatene nedenfor er presentert som prosenter.
- Beregn gjenvinningsgraden for partikler i Top-down-modus: totalt antall partikler i F6-F8/partikler etter UC definert i trinn 6.2.9.
- Beregn gjenvinningsgraden for partikler i nedenfra-opp-modus: totalt antall partikler i F6-F8/partikler etter UC definert i trinn 6.2.9.
- Beregn gjenvinningsgraden av proteiner i Top-down-modus: totalt proteininnhold i F6-F8 (μg)/proteininnhold etter UC definert i trinn 6.2.9 (μg).
- Beregn utvinningsgraden av proteiner i bottom-up-modus: totalt proteininnhold i F6-F8 (μg)/proteininnhold etter UC definert i trinn 6.2.9 (μg).
- Beregn partikkel/protein-forholdet for å vurdere renheten som tradisjonelt er definert av UC og de to DGC-modusene, og resultatene nedenfor ble alle presentert som prosentandeler.
- Partikkel/protein-ratio etter UC definert i trinn 6.2.9: partikler etter UC/proteininnhold etter UC (μg).
- Partikkel/protein-forhold i Top-down-modus: totale partikler i F6-F8/proteininnhold i F6-F8 (μg).
- Partikkel/protein-forhold i Bottom-up-modus: totale partikler i F6-F8/proteininnhold i F6-F8 (μg).
- Velg den mest passende sentrifugeringsmodusen (ovenfra og ned-modus ble valgt i protokollen) for fekal BEV-rensing og fremtidig analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bestemme fordelingen av BEV-berikede fraksjoner
For å bestemme fordelingen av bakterielle ekstracellulære vesikler (BEVs)-berikede fraksjoner, ble det etablert en blank kontroll for å måle absorbansverdiene ved OD 340 nm, og tettheten av hver fraksjon ble beregnet basert på målingene og iodixanolretningslinjene (trinn 8.1). Tabell 2 presenterer tetthetsresultatene, og viser at fraksjonene F4 til F9 viste tettheter innenfor området som vanligvis er forbundet med ekstracellulære vesikler. Dette funnet antydet at flertallet av BEVs ble isolert i disse fraksjonene, noe som førte til definisjonen av F4-F9 som det grove området for BEVs. Transmisjonselektronmikroskopi (TEM) ble brukt for å karakterisere de morfologiske egenskapene til fekale BEVs isolert som vist i figur 1 i fraksjoner F4-F9. TEM-bildene (figur 2) avslørte tilstedeværelsen av klassiske koppformede strukturer, som er karakteristiske for BEVs. Nanopartikkelsporingsanalyse (NTA) og bicinchoninsyreanalyse (BCA) ble utført for å bestemme henholdsvis partikkelantall og proteinkonsentrasjon, noe som muliggjorde ytterligere evaluering av utvinningshastighet og renhet. Figur 3 viser protein- og partikkelkonsentrasjonene for hver fraksjon, noe som indikerer at F6 og F7 viste de høyeste konsentrasjonene, etterfulgt av F5 og F8. Deretter ble Coomassie brilliant blue staining (CBBS) og western blotting (WB) utført for å gi en samlet proteinanalyse. Resultatene av CBBS var i samsvar med proteinkonsentrasjonsfunnene, med F6 og F7 som viste de mest intense båndene (figur 4). For å bekrefte fordelingen av BEV ble ekstracellulære vesikler avledet fra Escherichia coli benyttet som positiv kontroll (definert i trinn 8.5.13). Isolasjons- og renseprosedyrene fulgte trinnene beskrevet i materialfortegnelsen og de nevnte protokolldelene (trinn 3, 4). WB-analyse bekreftet videre tilstedeværelsen av ytre membranprotein A (OmpA), en hovedkomponent i den ytre membranen av bakterier og en spesifikk markør for BEV, i fraksjoner F6-F8. Basert på disse resultatene ble fraksjoner F6-F8 definert som BEV-berikede fraksjoner egnet for påfølgende eksperimenter og analyser.
Verifikasjon av presentasjonsområdet for interferenskomponentene
Eukaryote ekstracellulære vesikler (EEVs), som har en lignende størrelse og tetthet som BEVs, ble identifisert som en stor forstyrrelse i analysen av BEVs. For å løse dette ble tre EEV-proteiner undersøkt i fraksjonene 5-8 fra både Top-down og Bottom-up-modus, med sentrifugeringstider på 7 timer og 15 timer. CD63, et EEV-assosiert transmembranprotein, ble hovedsakelig detektert i F5, mens BEV-markøren LPS ble anriket i fraksjoner 6-7. Dette mønsteret ble observert i begge modusene, selv om Bottom-up-modusen viste svak bånding av CD63-EEVs i F7. Imidlertid viste andre EEV-markører, CD9 og TSG-101, ikke synlige signaler i disse fraksjonene, uavhengig av moduser eller sentrifugeringstider. I et uavhengig eksperimentelt foretak ble antistoffer rettet mot syntenin og integrin β1 benyttet for å fastslå anrikningen av distinkte proteinmarkører iboende for EEVs over fraksjonene 5-8. Syntenin ble tydelig påvist innen F5, spesielt under virkeområdet til Top-down-tilnærmingen, mens tilstedeværelsen av Integrin β1 ble oppdaget innen F6 (figur 5). For ytterligere å vurdere tilstedeværelsen av forstyrrende partikler ble Dil-merket lipoprotein med lav tetthet (Dil-LDL) introdusert i tetthetsgradientsystemet, og fluorescensintensitet ble målt over alle fraksjoner. I Top-down-modus viste fraksjonene 1-4 relativt høyere fluorescensverdier, mens det i Bottom-up-modus var F1-F6 som viste høyere intensiteter (figur 6).
Vurdere utvinningsgraden og renheten til to DGC-moduser fra konsentrasjon, partikkelstørrelse og markører for BEVs
Etter å ha identifisert F6-F8-fraksjoner som BEV-berikede fraksjoner, ble utvinningsgraden og renheten av de to tetthetsgradientsentrifugeringsmodusene (DGC) evaluert. Partikkelstørrelsene av BEV-berikede fraksjoner oppnådd fra Top-down-modus, Bottom-up-modus og ultrasentrifugering (UC) alene ble sammenlignet. De observerte partikkelstørrelsene i begge sentrifugeringsmodusene varierte fra 90 til 300 nm, på linje med den definerte diameteren av BEVs (figur 7). Deretter ble partikkel- og proteinutvinningsgraden for de to modusene beregnet basert på partikkel- og proteinkonsentrasjonene før og etter DGC (tabell 3 og figur 8). Spesielt viste Bottom-up-modusen høyere utvinningsgrad sammenlignet med den andre modusen. I en separat eksperimentell gruppe ble proteinutvinning i de to modusene evaluert ved forskjellige sentrifugeringstider på 7 timer og 15 timer. Det var viktig at det ikke var noen statistisk signifikant forskjell i proteininnhold innen F6-F8-fraksjoner etter DGC mellom de to sentrifugasjonstidene, uavhengig av gradientmodus som ble brukt (figur 9). Partikkel/protein-forholdet ble beregnet for å gi en grov vurdering av renheten i de to modusene. Dataene indikerte ingen signifikant forskjell i renhet mellom modusene. I tillegg ble Coomassie brilliant blue staining (CBBS) og western blotting (WB) utført for å sammenligne renheten ytterligere, med fokus på tre BEV-markører (LPS, OmpA og LTA), en EEV-markør (CD63) og to forurensende markører (Calnexin, Flagellin). Resultatene viste en delvis reduksjon av forstyrrende stoffer etter DGC, med LPS og OmpA som viste en mer fremtredende tilstedeværelse i begge DGC-modusene sammenlignet med UC alene (figur 10).
Figur 1: Skjematisk arbeidsflyt av BEVs isolasjon og rensing. Forkortelser: BEVs = bakterielle ekstracellulære vesikler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representative TEM-bilder av BEV-fraksjoner. (A) TEM-bilder av BEVs isolert etter UC. (B) TEM-bilder av BEV-er isolert etter DGC ved hjelp av ovenfra og ned-modus. (C) TEM-bilder av BEV-er isolert etter DGC ved hjelp av nedenfra og opp-modus. Alle bildene ble presentert i en konsekvent skala på 200 nm. Forkortelser: TEM = transmisjonselektronmikroskop; BEVs = bakterielle ekstracellulære vesikler; UC = ultracentrifugation; DGC = sentrifugering av tetthetsgradient. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Protein- og partikkelkonsentrasjon av BEV-fraksjoner etter Top-down og Bottom-up DGC-modus. Proteinkonsentrasjonen av BEV-fraksjoner ble bestemt ved bruk av BCA og er representert av de grå stolpene. Partikkelkonsentrasjonen ble målt ved hjelp av NTA og er representert av de blå stolpene. Forkortelser: BEV = bakteriell ekstracellulær vesikkel; DGC = sentrifugering av tetthetsgradient; BCA = bicinchoninsyreanalyse; NTA = nanopartikkelsporingsanalyse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Bestemmelse av BEV-berikede fraksjoner. (A) CBBS ble utført for å bestemme fraksjonene beriket med fekale BEVs i både Top-down og Bottom-up-modus. (B) EVer avledet fra Escherichia coli ble isolert, renset og brukt som en positiv kontroll i WB for å bekrefte tilstedeværelsen og distribusjonen av BEVs. OmpA: Ytre membranprotein A, en BEV-markør. Forkortelser: BEV = bakteriell ekstracellulær vesikkel; CBBS = coomassie strålende blå farging; EV = ekstracellulære vesikler; WB = vestlig blotting. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Bekreftelse av EEV-fordeling. Western blot-analyse av fraksjoner 5-8 oppnådd fra Top-down og Bottom-up DGC-modusene med forskjellige tetthetsgradient-ultrasentrifugasjonsvarigheter, 7 timer (A) og 15 timer (B). En uavhengig studie med fokus på F5 til F8 som følge av en 7-timers sentrifugeringsperiode ble utført, som demonstrert i (C) og (D). Utvalgte markører inkluderte de assosiert med BEVs (LPS) og EEVs (CD63, CD9, TSG-101, Syntenin, Integrin β1). Forkortelser: DGC = tetthetsgradientsentrifugering; BEV = bakteriell ekstracellulær vesikkel; EEV = eukaryot ekstracellulær vesikkel. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Distribusjon av lipoprotein med lav tetthet. Dil-merket lipoprotein med lav tetthet (Dil-LDL), betraktet som en forurensningsmarkør, ble tilsatt i en konsentrasjon på 10 μg til gradientsystemet i både Top-down- og Bottom-up-modus. Dil-LDL erstattet PBS/BEV-løsningen (trinn 6.1.1 og trinn 6.2.2) for å etablere en deteksjonsmodell. Fluorescensintensiteten til hver fraksjon ble målt ved hjelp av en mikroplatedetektor med en eksitasjons-/emisjonsbølgelengde på 549/565 nm. Forkortelse: BEV = bakteriell ekstracellulær vesikkel. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Partikkelstørrelser av BEV-berikede fraksjoner. (A) Partikkelstørrelsesfordeling av råolje BEVs oppnådd etter UC. (B) Partikkelstørrelsesfordeling av BEV-berikede fraksjoner (F6-F8) oppnådd ved bruk av DGC-modus (Top-down density gradient centrifugation). (C) Partikkelstørrelsesfordeling av BEV-berikede fraksjoner (F6-F8) ble oppnådd ved bruk av nedenfra og opp DGC-modus. NTA ble foretatt for å kvantifisere dimensjonene til partiklene. Fortynningsfaktorene som ble brukt for paneler (A-C) var 10 000, 2 000 og 5 000, tilsvarende, med de påfølgende resultatene kalibrert. Forkortelser: BEV = bakteriell ekstracellulær vesikkel; UC = ultracentrifugation; DGC = sentrifugering av tetthetsgradient; NTA = nanopartikkelsporingsanalyse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Protein- og partikkelgjenvinningshastigheter for Top-down og Bottom-up DGC-modus. (A) Proteinutvinningshastigheter for de to modusene beregnet som forholdet mellom proteinkonsentrasjon etter og før DGC (UC). (B) Partikkelutvinningshastigheten for de to modusene beregnes av forholdet mellom partikkelkonsentrasjon etter og før DGC (UC). (C) Partikkel/protein-forhold for UC-, Top-down- og Bottom-up-modus. Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM. Statistisk analyse ble utført med tosidig, uparret t-test for panel A og B og enveis variansanalyse (ANOVA) med Tukey post hoc-test for panel C. Ingen signifikante forskjeller ble observert. Forkortelser: DGC = tetthetsgradientsentrifugering; UC = ultrasentrifugering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 9: Sammenligning av proteinutvinning basert på Top-down og Bottom-up DGC-modus ved bruk av forskjellige tetthetsassosierte ultrasentrifugeringstider. Proteinutvinningshastigheter i fraksjoner F6-F8 oppnådd fra gradientultrasentrifugering i 7 timer og 15 timer ble evaluert i uavhengige eksperimenter ved bruk av både Top-down og Bottom-up-modus. Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av toveis variansanalyse (ANOVA) med Fishers minste signifikante forskjellstest. Ingen signifikante forskjeller ble observert. Forkortelser: DGC = sentrifugering av tetthetsgradient. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 10: Renhetsvurdering av DGC-modusene Top-down og Bottom-up. (A) CBBS ble utført for å sammenligne proteinfordelingen av UC-, Top-down- og Bottom-up-modus. (B) WB ble utført for å vurdere renheten til UC-, Top-down- og Bottom-up-modus. Calnexin: endoplasmatisk retikulumassosiert proteinmarkør; Flagellin, forurensende proteinmarkør fra bakterier. CD63: transmembran proteinmarkør for eukaryote ekstracellulære vesikler; LTA: BEVs markør fra gram-positive bakterier; LPS, OmpA: BEVs markører fra gram-negative bakterier. Forkortelser: DGC = tetthetsgradientsentrifugering; UC = ultracentrifugation; CBBS = Coomassie Brilliant Blue farging; WB = vestlig blotting. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Konsentrasjon av Iodixanol oppløsning (%) | 0,02 M HEPES-buffer | 50% Iodixanol arbeider løsning |
| 40 | 1 | 4 |
| 20 | 3 | 2 |
| 10 | 4 | 1 |
Tabell 1: Forhold for fremstilling av iodixanoltetthetsgradientbuffere. Tabellen ga forholdet mellom 0,02 M HEPES-buffer og 50% jodixanol-arbeidsløsning for å oppnå en viss konsentrasjon av jodixanoloppløsning.
| F1 | F2 | F3 | F4 | F5 | F6 | F7 | F8 | F9 | F10 | |
| Tetthet (g/ml) | 1.023 | 1.038 | 1.049 | 1.062 | 1.074 | 1.098 | 1.144 | 1.185 | 1.239 | 1.293 |
Tabell 2: Tettheten av det jodixanolbaserte tetthetsgradientsentrifugeringssystemet. Tabellen viste tettheten av hver fraksjon i et jodixanolbasert tetthetsgradientsentrifugeringssystem. Tom kontroll: PBS-basert gradientsystem.
| Ovenfra og ned-modus | Nedenfra-og-opp-modus | |
| Partikkelutvinningsgrad (%) | 24.08 | 35.69 |
| Proteinutvinningsgrad (%) | 24.5 | 32.45 |
Tabell 3: Partikkel- og proteinutvinningsgraden for to moduser. Tabellen viste partikkel- og proteinutvinningsratene for top-down- og bottom-up-modusene (figur 8).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bakterielle ekstracellulære vesikler (BEVs) er lipid-bilayer nanopartikler utskilt av bakterier, som bærer et vell av proteiner, lipider, nukleinsyrer og andre bioaktive molekyler, noe som bidrar til å formidle de funksjonelle effektene av bakterier20. BEVs avledet fra tarmen har blitt bekreftet å være involvert i utviklingen av sykdommer, som inflammatorisk tarmsykdom, Crohns sykdom og kolorektal kreft, og påvirker også generell metabolisme og medierer nedsatt kognitiv funksjon 4,16,17,20,21,22,23,24,25,26 . For tiden er innhenting av fullstendig og objektiv biologisk informasjon om BEVs av tarmbakterier opprinnelse fra menneskelige prøver-avføring fortsatt begrenset av en rekke faktorer, blant annet det første og fremst nøkkelspørsmålet er hvordan man isolerer BEVs fra det komplekse vertsmiljøet.
De viktigste metodene for å isolere BEVs, som ultracentrifugation (UC), density gradient centrifugation (DGC) og size exclusion chromatography (SEC) 13,14,15,16,17, har både oppsider og ulemper. Vanskeligheter med å fjerne noen forstyrrende stoffer og mangelen på konsekvente driftsprosedyrer, som alvorlig påvirker en mer realistisk og omfattende analyse av BEVs, forblir utfordringer for separasjonsprosessen. For å lette de uønskede effektene av forstyrrelser, har mange studier 15,27,28 kombinert to eller flere av de ovennevnte metodene for å oppnå separasjon av BEVs, spesielt fra kroppsvæsker, men komplekse prosedyrer har en tendens til å påvirke stabiliteten av resultatene. For BEV kan forskjellen i tetthet med andre forurensninger (f.eks. proteinaggregater, lipidkomponenter, eukaryote ekstracellulære vesikler (EEV)15) bli et spesifikt middel for isolasjon i dag.
For tiden har iodixanol dukket opp som det foretrukne mediet for tetthetsgradientseparasjon av EV, og erstatter sukrose på grunn av dets isotoniske egenskaper. Disse egenskapene bidrar til å bevare EV-morfologi og legge til rette for tetthetsestimering for hver fraksjon29. I samsvar med Tulkens et al 15 vedtok vår studie en identisk konsentrasjon for DGC-systemet, ved bruk av jodixanol ved 50% (w / v), 40% (w / v), 20% (w / v),10% (w / v) og 0% konsentrasjonsgradientlag. Det første trinnet involverte bruk av HEPES-buffer for å fremstille forskjellige konsentrasjoner av jodixanolløsninger. Sammenlignet med Tris (-EDTA)-sukrosebuffer, sikrer en passende konsentrasjon av HEPES-buffer langsiktig pH-stabilitet i sentrifugeringssystemet, takket være dens iboende egenskaper. Samtidig ble steril PBS-buffer brukt i det øverste laget av sentrifugeringssystemet, ikke bare for å beskytte mot potensiell forurensning av bakterier og deres metabolitter under oppløsning av løsningen, men også for å opprettholde prøvebufferkonsistens før og etter DGC. Dette innebar å resuspendere pelleten med PBS-buffer etter UC og erstatte iodixanol med PBS etter DGC, og dermed legge til rette for en komparativ analyse av resultatene. Videre ble volumet av hvert gradientlag i DGC-systemet kalibrert til 3 ml, 3 ml, 3 ml, 3 ml og 3,5 ml for henholdsvis 50 %, 40 %, 20 %, 10 % og 0 % (PBS-lag) iodixanoloppløsninger. Denne strategien hjelper til med å etablere et relativt bredere tetthetsområde (1,02-1,30 g / ml), potensielt øke separasjonen av BEVs fra andre forstyrrende elementer, og dermed gjøre gradientene gjeldende for andre kroppsvæsker med kompleks forurensning.
Det er viktig å understreke at noen stadier av protokollen er avgjørende. Spesielt er fortynningsfaktoren skissert i trinn 2.2, hvor 1 g fekale prøver blandes med minimum 10 ml PBS, avgjørende for å forhindre overmetning og bevare eksperimentelle ressurser. Under disse forholdene øker partikkel- og proteinkonsentrasjonen generelt proporsjonalt med fekalmassen i en prøve, forutsatt at andre fekale egenskaper er konstante. Om nødvendig kan ytterligere analyse med tanke på faktorer som konsistens, lipoprotein eller blodinnhold utføres. Under trinn 3.4 bør forsiktighet utvises for å unngå å helle oppløsningen direkte, da dette kan forstyrre pelleten og potensielt føre til at større granulat blokkerer membranen til 0,22 μm filteret. Hvis filteret raskt blir mettet (for eksempel hvis mindre enn 10 ml passerer gjennom et filter), anbefales et ekstra sentrifugeringstrinn ved 12 000 × g . I sammenheng med sentrifugering av tetthetsgradient er presis fremstilling av gradientløsninger en forutsetning for pålitelige resultater. I tillegg er nøye manipulering av røret ved lagdeling av de øvre løsningene med lav tetthet avgjørende for å forhindre forstyrrelse av stratifisering, og eventuelle bobler må elimineres ved oppmerksom pipettering. Til slutt, når du aspirerer fraksjonene, er det viktig å trekke dem av omhyggelig langs rørveggen, og unngå over- eller underaspirasjon som kan føre til unøyaktig BEV-fordeling. Regelmessig observasjon av væskenivået og konsekvent praksis kan bidra til å redusere dette problemet.
Denne studien bestemte BEVs-berikede fraksjoner (F6-F8) ved hjelp av flere karakteriseringsmetoder og utforsket to forskjellige gradient ultrasentrifugeringsmoduser: Top-down og Bottom-up. Gjennom måling av protein- og partikkelkonsentrasjon i F4-F8 (figur 3) og sammenligning av utvinningsgrad og renhet (figur 8 og figur 10) ble det observert at nedenfra og opp-sentrifugeringsmodus ga høyere påviste verdier på både protein- og partikkelnivå enn den alternative metoden for å isolere og rense BEVs fra fekale prøver. Denne observasjonen innebærer forskjellige dynamiske prosesser. En hypotese ble foreslått at ikke-vesikulære ekstracellulære nanopartikler (NVEPs) 29, som lipoproteiner, med lavere tetthet enn BEVs, kanskje ikke når deres oppdriftstetthet hvis prøvene er bunnbelastet (figur 6), noe som potensielt forårsaker en oppblåst utvinningsgrad, selv etter 15 timer DGC (figur 9). Denne observasjonen nødvendiggjør vurdering av om den tradisjonelle renhetsdefinisjonen, basert på forholdet mellom partikler og proteiner, er anvendelig. Videre er det verdt å merke seg at EEVs viste overvekt innen F5, mens BEVs ble fremtredende påvist i F6-F7 (figur 4 og figur 5). Spesielt syntes denne differensieringen å bli fremhevet når man tok i bruk Top-down-modus. Derfor kan denne modusen være mer egnet for denne protokollen. Det er imidlertid viktig å fremheve tilstedeværelsen av Integrin β1 i F6, som potensielt betyr den inneboende heterogeniteten blant EEVs. Ved bruk av denne metoden på andre kroppsvæsker som blod og urin, bør forskerne vurdere de unike egenskapene til prøvene. Sentrifugeringstiden definert i denne protokollen er 7 timer, betydelig mindre enn varigheten nevnt i andre studier, som kan være så lang som 18 timer. Sammenlignet med proteinutvinning med en 15-timers varighet utført i samme mønster i denne studien (figur 9), synes denne tiden tilstrekkelig til å oppnå den nødvendige separasjonsrenheten. Under disse driftsforholdene nådde partikkelutvinningen i Top-down-modus opp til 10 8 (4,5 × 10 7-1,5 × 10 8) per milligram avføring, i tråd med tidligere rapporter (10 11 BEVs per gram våt avføring) 15,29,30. Til slutt bekreftet tetthetsmålinger av hver fraksjon fra den tomme kontrollen at tettheten av BEVs varierte fra 1,09-1,19 g / ml, noe som stemmer overens med tidligere forskning.
Denne metoden, selv om den er effektiv, presenterer en begrensning på grunn av virkningen av dietter, tarmfunksjon og andre faktorer på fekal sammensetning. Disse variablene kan endre fekal konsistens, potensielt påvirke bakteriell overflod og BEV-utvinning. Derfor er det avgjørende å standardisere isolering og rensing av BEVs31,32, med justeringer gjort basert på vurdering av fekale egenskaper. Fremtidig forskning bør fokusere på å identifisere en standard for normalisering av BEV-utbytte, beslektet med urinkreatinin eller urinstrømningshastighet. En slik målestokk kan forbedre metodologisk vurdering og belyse sammenhengen mellom fekale BEVs og kroppens fysiologiske og patologiske tilstand. Videre understreker den sterke sammenhengen mellom fekale BEVs og ulike sykdommer deres betydelige kliniske potensial. Sentrifugeringstiden som er fastsatt i denne protokollen, oppfyller imidlertid ikke etterspørselen etter mer praktisk og raskere testing som klinikere nødvendiggjør. Derfor er det nødvendig med ytterligere undersøkelser for å avgjøre om kortere sentrifugeringstider, kanskje mindre enn 3 timer, kan gi tilsvarende resultater. Videre utforskning er også nødvendig for å forstå hendelsene som forekommer i begge sentrifugeringsmodusene. Selv om det er postulert at ikke-vesikulære komponenter er mer beriket i F6-F8 i bottom-up-modus, kan raffinering av gradientkonsentrasjoner vise seg å være gunstig for å identifisere flere undertyper med spesifikke funksjoner.
Denne studien demonstrerte vellykket isolering og rensing av BEVs fra menneskelig avføring ved hjelp av DGC. Strategien holder løfte om anvendelse på andre biologiske prøver, som blod, urin og spytt, og gir forskere en effektiv tilnærming til å avdekke BEVs skjulte informasjon, potensielt fremme kliniske applikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen motstridende interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Science Fund for Distinguished Young Scholars (82025024); Key-prosjektet til National Natural Science Foundation of China (82230080); Kinas nasjonale nøkkelforsknings- og utviklingsprogram (2021YFA1300604); National Natural Science Foundation of China (81871735, 82272438 og 82002245); Guangdong Natural Science Fund for Distinguished Young Scholars (2023B1515020058); Natural Science Foundation i Guangdong-provinsen (2021A1515011639); Major State Basic Research Development Program of Natural Science Foundation of Shandong-provinsen i Kina (ZR2020ZD11); Stiftelsen Postdoktor Science (2022M720059); den fremragende ungdomsutviklingsordningen til Nanfang Hospital, Southern Medical University (2022J001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 % (w/v) glutaraldehyde (prepared from 2.5 % stock solution in deionized water) | ACMEC | AP1126 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.3 |
| 1 % (w/v) methylcellulose (prepared from original powder in deionized water) | Sigma-Aldrich | M7027 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.6 |
| 1.5 % (w/v) uranyl acetate (prepared from original powder in deionized water) | Polysciences | 21447-25 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.5 |
| 1000 μL, 200 μL, 10 μL Pipette | KIRGEN | KG1313, KG1212, KG1011 | Transfer the solution |
| 5 % (w/v) bovine serum albumin solution (prepared from the original powder in TBST buffer) | Fdbio science | FD0030 | Used in western blotting for blocking at Step 8.5.6 |
| 5 × loading buffer | Fdbio science | FD006 | Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5.1 |
| 75 % (v/v) alcohol | LIRCON | LIRCON-500 mL | Surface disinfection |
| 96-well plate | Rar | A8096 | Measure the absorbance values |
| Anti-Calnexin antibody | Abcam | ab92573 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-CD63 antibody | Abcam | ab134045 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-CD9 antibody | Abcam | ab236630 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-Flagellin antibody | Sino Biological | 40067-MM06 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-Integrin beta 1 antibody | Abcam | ab30394 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-LPS antibody | Thermo Fisher | MA1-83152 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-LTA antibody | Thermo Fisher | MA1-7402 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-OmpA antibody | CUSABIO | CSB-PA359226ZA01EOD, https://www.cusabio.com/ | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-Syntenin antibody | Abcam | ab133267 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-TSG101 antibody | Abcam | ab125011 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Autoclave | ZEALWAY | GR110DP | Sterilization for supplies and mediums used in the experiment |
| Balance | Mettler Toledo | AL104 | Balance the tube sample-loaded with PBS |
| Bicinchoninic acid assay | Fdbio science | FD2001 | Measure protein content of BEVs at Step 8.2 |
| BioRender | BioRender | https://app.biorender.com | Make the schematic workflow of BEVs isolation and purification showed in Figure 1 |
| Biosafety cabinet | Haier | HR1200- II B2 | Peform the procedures about feces sample handling |
| Centrifuge 5810 R; Rotor F-34-6-38 | Eppendorf | 5805000092; 5804727002, adapter: 5804774000 | Preprocess for BEVs (Step 3) |
| Chemiluminescence Apparatus | BIO-OI | OI600SE-MF | Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12 |
| Cytation 5 | BioTek | F01 | Microplate detector for measuring the absorbance (Step 8.1) and fluorescence (Figure 6) values |
| Dil-labled low density lipoprotein | ACMEC | AC12038 | Definition of distribution of interfering components |
| Electrophoresis equipment | Bio-rad | 1658033 | Used in western blotting for protein separation and transfer at Step 8.5.2, 8.5.3, 8.5.5 |
| Enhanced Chemiluminescence kit HRP | Fdbio science | FD8020 | Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12 |
| Escherichia coli | American Type Culture Collection | ATCC8739 | Isolate BEVs as a positive control. Protocol: Dissolve 25 g of the LB powder in 1 L deionized water, and autoclave. Transfer the 800 μL of preserved Escherichia coli into the medium. Cultivate at 37 °C in the incubator shaker. Then centrifuge at 3, 000 × g for 20 min at 4 °C, 12, 000 × g for 30 min at 4 °C, filter the supernatant through 0.22 μm membrane, and perform ultra-speed centrifugation at 160, 000 × g for 70 min at 4 °C. Pellet defined as crude BEVs from Escherichia coli was suspended in 1.2 mL PBS (Step 3, 4). |
| Falcon tubes 50 mL | KIRGEN | KG2811 | Preprocess for BEVs (Step 3) |
| Feto Protein Staining Buffer | Absci | ab.001.50 | Coomassie brilliant blue staining at Step 8.5.4 |
| Filter paper | Biosharp | BS-TFP-070B | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 (Blotting the solution) |
| Formvar/Carbon supported copper grids | Sigma-Aldrich | TEM-FCF200CU50 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 |
| HEPES powder | Meilunbio | MB6078 | Prepare iodixanol buffers with different concentrations for density gradient centrifugation |
| HRP AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Fdbio science | FDM007 | Western blotting (Secondary Antibody) |
| HRP AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Fdbio science | FDR007 | Western blotting (Secondary Antibody) |
| Incubator shaker | Qiangwen | DHZ-L | Cultivate Escherichia coli |
| Kimwipes™ Delicate Task Wipes | Kimtech Science | 34155 | Wipe the inner wall of the ultracentrifuge tube at Step 4.15 |
| LB broth | Hopebio | HB0128 | Cultivate Escherichia coli |
| Low temperature freezer (-80 °C) | Haier | DW-86L338J | Store the samples |
| Methanol | Alalddin | M116118 | Used in western blotting for activating PVDF membrane at Step 8.5.5 |
| Micro tubes 1.5 mL | KIRGEN | KG2211 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
| Micro tubes 2 mL | KIRGEN | KG2911 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
| Micro tubes 5 mL | BBI | F610888-0001 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
| Microplate reader | Thermo Fisher | Multiskan MK3 | Measure protein content of BEVs at Step 8.2 |
| Millipore filter 0.22 μm | Merck millipore | SLGP033RB | Filtration sterilization; Material: polyethersulfone, PES |
| NaCl | GHTECH | 1.01307.040 | Density gradient centrifugation solution |
| NaOH | GHTECH | 1.01394.068 | Density gradient centrifugation solution (pH adjustment) |
| Optima™ XPN-100 | Beckman Coulter | A94469 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
| OptiPrep™ | Serumwerk Bernburg AG | 1893 | Density gradient centrifugation stock solution |
| Orbital Shaker | Youning | CS-100 | Dissolve feces at Step 2 |
| Phosphate buffered saline | Procell | PB180327 | Dissolve feces at Step 2 |
| Pipettor | Eppendorf | 3120000267, 3120000259 | Transfer the solution |
| Plastic pasteur pipette | ABCbio | ABC217003-4 | Remove supernatant in preprocessing at Step 3.4 |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes | Millipore | ISEQ00010, IPVH00010 | Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5 |
| Prefabricated polyacrylamide gel, 4–20% 15 Wells | ACE | F15420Gel | Used in western blotting for protein separation at Step 8.5.2, 8.5.3 |
| Primary antibody diluent | Fdbio science | FD0040 | Used in western blotting at Step 8.5.8 |
| Protein ladder | Fdbio science | FD0672 | Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5 |
| Rapid protein blotting solution | UBIO | UW0500 | Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5 |
| Rotor SW 32 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 369650 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
| Syringe 20 mL, 50 mL | Jetway | ZSQ-20ML, YCXWJZSQ-50 mL | Transfer buffers amd remove supernatant in preprocessing |
| TBS powder | Fdbio science | FD1021 | Used in western blotting at Step 8.5 |
| Transmission electron microscope (TEM) | Hitachi | H-7650 | Morphological observation for BEVs at Step 8.3 |
| Tween-20 | Fdbio science | FD0020 | Used in western blotting at Step 8.5 |
| Ultracentrifuge tube | Beckman | 326823, 355642 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
| Ultra-clean bench | AIRTECH | SW-CJ-2FD | Peform the procedures about liquid handling |
| Water bath | Bluepard | CU600 | Used for measuring protein content of BEVs at Step 8.2.5 |
| ZetaView | Particle Metrix | S/N 21-734, Software ZetaView (version 8.05.14 SP7) | Nanoparticle tracking analysis (NTA) for measuring the particle size and concentrarion of BEVs at Step 8.4 |
References
- Costello, E. K., et al. Bacterial community variation in human body habitats across space and time. Science. 326 (5960), 1694-1697 (2009).
- Greenhalgh, K., Meyer, K. M., Aagaard, K. M., Wilmes, P. The human gut microbiome in health: establishment and resilience of microbiota over a lifetime. Environmental Microbiology. 18 (7), 2103-2116 (2016).
- de Vos, W. M., Tilg, H., Van Hul, M., Cani, P. D. Gut microbiome and health: mechanistic insights. Gut. 71 (5), 1020-1032 (2022).
- Zhou, P., Yang, D., Sun, D., Zhou, Y. Gut microbiome: New biomarkers in early screening of colorectal cancer. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 36 (5), 24359 (2022).
- Paik, D., et al. Human gut bacteria produce Τ(Η)17-modulating bile acid metabolites. Nature. 603 (7903), 907-912 (2022).
- Parada Venegas, D., et al. Short chain fatty acids (SCFAs)-mediated gut epithelial and immune regulation and its relevance for inflammatory bowel diseases. Frontiers in Immunology. 10, 277 (2019).
- Jiang, C., Li, G., Huang, P., Liu, Z., Zhao, B. The Gut microbiota and Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 58 (1), 1-15 (2017).
- Morais, L. H., Schreiber, H. L. t, Mazmanian, S. K. The gut microbiota-brain axis in behaviour and brain disorders. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 241-255 (2021).
- Kim, J. H., Lee, J., Park, J., Gho, Y. S. Gram-negative and Gram-positive bacterial extracellular vesicles. Seminars in Cell and Developmental Biology. 40, 97-104 (2015).
- Toyofuku, M., Nomura, N., Eberl, L. Types and origins of bacterial membrane vesicles. Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 13-24 (2019).
- Xie, J., Li, Q., Haesebrouck, F., Van Hoecke, L., Vandenbroucke, R. E. The tremendous biomedical potential of bacterial extracellular vesicles. Trends in Biotechnology. 40 (10), 1173-1194 (2022).
- Coumans, F. A. W., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).
- Northrop-Albrecht, E. J., Taylor, W. R., Huang, B. Q., Kisiel, J. B., Lucien, F. Assessment of extracellular vesicle isolation methods from human stool supernatant. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (4), 12208 (2022).
- Park, Y. E., et al. Microbial changes in stool, saliva, serum, and urine before and after anti-TNF-α therapy in patients with inflammatory bowel diseases. Scientific Reports. 12 (1), 6359 (2022).
- Tulkens, J., De Wever, O., Hendrix, A. Analyzing bacterial extracellular vesicles in human body fluids by orthogonal biophysical separation and biochemical characterization. Nature Protocols. 15 (1), 40-67 (2020).
- Tulkens, J., et al. Increased levels of systemic LPS-positive bacterial extracellular vesicles in patients with intestinal barrier dysfunction. Gut. 69 (1), 191-193 (2020).
- Kang, C. S., et al. Extracellular vesicles derived from gut microbiota, especially Akkermansia muciniphila, protect the progression of dextran sulfate sodium-induced colitis. PloS one. 8 (10), 76520 (2013).
- Simonsen, J. B. What are we looking at? Extracellular vesicles, lipoproteins, or both. Circulation Research. 121 (8), 920-922 (2017).
- Correll, V. L., et al. Optimization of small extracellular vesicle isolation from expressed prostatic secretions in urine for in-depth proteomic analysis. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12184 (2022).
- Liang, X., et al. Gut bacterial extracellular vesicles: important players in regulating intestinal microenvironment. Gut Microbes. 14 (1), 2134689 (2022).
- Alberti, G., et al. Extracellular vesicles derived from gut microbiota in inflammatory bowel disease and colorectal cancer. Biomedical papers of the Medical Faculty of the University Palacky, Olomouc, Czech Republic. 165 (3), 233-240 (2021).
- Díez-Sainz, E., Milagro, F. I., Riezu-Boj, J. I., Lorente-Cebrián, S. Effects of gut microbiota-derived extracellular vesicles on obesity and diabetes and their potential modulation through diet. Journal of Physiology and Biochemistry. 78 (2), 485-499 (2022).
- Lajqi, T., et al. Gut microbiota-derived small extracellular vesicles endorse memory-like inflammatory responses in murine neutrophils. Biomedicines. 10 (2), 442 (2022).
- Lee, K. E., et al. The extracellular vesicle of gut microbial Paenalcaligenes hominis is a risk factor for vagus nerve-mediated cognitive impairment. Microbiome. 8 (1), 107 (2020).
- Villard, A., Boursier, J., Andriantsitohaina, R. Bacterial and eukaryotic extracellular vesicles and nonalcoholic fatty liver disease: new players in the gut-liver axis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 320 (4), G485-G495 (2021).
- Wei, S., et al. Outer membrane vesicles enhance tau phosphorylation and contribute to cognitive impairment. Journal of Cellular Physiology. 235 (5), 4843-4855 (2020).
- Bitto, N. J., Kaparakis-Liaskos, M. Methods of bacterial membrane vesicle production, purification, quantification, and examination of their immunogenic functions. Methods in Molecular Biology. 2523, 43-61 (2022).
- Stentz, R., Miquel-Clopés, A., Carding, S. R. Production, isolation, and characterization of bioengineered bacterial extracellular membrane vesicles derived from Bacteroides thetaiotaomicron and their use in vaccine development. Methods in Molecular Biology. 2414, 171-190 (2022).
- Zhang, Q., Jeppesen, D. K., Higginbotham, J. N., Franklin, J. L., Coffey, R. J. Comprehensive isolation of extracellular vesicles and nanoparticles. Nature Protocols. 18 (5), 1462-1487 (2023).
- Iwai, K., Minamisawa, T., Suga, K., Yajima, Y., Shiba, K. Isolation of human salivary extracellular vesicles by iodixanol density gradient ultracentrifugation and their characterizations. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 30829 (2016).
- Vandeputte, D., et al. Stool consistency is strongly associated with gut microbiota richness and composition, enterotypes and bacterial growth rates. Gut. 65 (1), 57-62 (2016).
- Wen, M., et al. Bacterial extracellular vesicles: A position paper by the Microbial Vesicles Task Force of the Chinese Society of Extracellular Vesicles. Interdisciplinary Medicine. 1, 12046 (2023).
