Summary
本研究では、密度勾配遠心分離(DGC) により ヒトの糞便から濃縮した細菌の細胞外小胞(BEV)を単離・精製する方法を説明し、形態、粒子径、濃度からBEVの物理的特性を特定し、臨床研究および科学研究におけるDGCアプローチの潜在的な応用について議論します。
Abstract
細菌細胞外小胞(BEV)は、細菌由来のナノ小胞で、細菌間および細菌と宿主のコミュニケーションにおいて積極的な役割を果たし、親細菌から受け継いだタンパク質、脂質、核酸などの生理活性分子を輸送します。腸内細菌叢に由来するBEVは、消化管内で作用し、遠隔地の臓器に到達する可能性があるため、生理学や病理学に大きな影響を与えます。ヒトの糞便に由来するBEVの種類、量、役割を探る理論的研究は、腸内細菌叢からのBEVの分泌と機能を理解する上で非常に重要です。これらの調査では、BEVの分離と精製に関する現在の戦略の改善も必要になります。
この研究では、トップダウンとボトムアップの2つの密度勾配遠心分離(DGC)モードを確立することにより、BEVの分離および精製プロセスを最適化しました。BEVの濃縮分布は、フラクション6〜8(F6-F8)で決定されました。このアプローチの有効性は、粒子の形態、サイズ、濃度、およびタンパク質含有量に基づいて評価されました。粒子およびタンパク質の回収率を計算し、特定のマーカーの存在を分析して、2 つの DGC モードの回収率と純度を比較しました。その結果、トップダウン遠心分離モードの方が汚染レベルが低く、ボトムアップモードと同等の回収率と純度を達成していることが示されました。7時間の遠心分離時間は、糞便BEV濃度108/mgを達成するのに十分でした。
糞便とは別に、この方法は、成分と粘度の違いに応じて適切に変更することで、他の体液タイプに適用できます。結論として、この詳細で信頼性の高いプロトコルは、BEVの標準化された分離と精製を容易にし、その後のマルチオミクス分析と機能実験の基礎を築きます。
Introduction
腸は、人体で最も豊富な微生物群集を持つ器官として広く認識されており、細菌の90%以上がコロニー形成と増殖に関与しています1,2。腸内細菌叢は腸内微小環境を調節し、同時に主に腸管関門の障害を介して遠隔臓器の機能障害と相互作用することが広範な証拠によって実証されています3,4。腸内細菌叢の不均衡と炎症性腸疾患(IBD)の進行5,6、および腸脳軸を介した認知障害との相関関係を示す証拠が増えています5,6,7,8。細菌によって産生される細菌の細胞外小胞(BEV)は、これらの病理学的プロセスにおいて重要な役割を果たします。
BEVは、直径20〜400nmの細菌誘導体をカプセル化するナノスケールの粒子です。それらは、バクテリアとその宿主生物との間の相互作用を促進することが実証されています9,10。これらの粒子は目に見えないにもかかわらず、診断バイオマーカー、治療標的、薬物送達媒体として幅広い用途が期待されているため、研究者からの注目が高まっています11。主に腸内細菌を原料とするヒトの糞便は、BEV研究の生体試料としてよく使用され、水、細菌、脂質、タンパク質、未消化の食物残渣、剥離した上皮細胞などが複雑に混ざり合っています。複雑な糞便組成は、BEVの分離と純度に課題をもたらし、BEVの包括的、客観的、かつ現実的な分析を妨げています。したがって、汚染されたコンポーネントからの干渉を最小限に抑え、BEVの歩留まりを向上させるための効果的な戦略が、早急な対応を必要とする重要な問題として浮上しています。
既存の単離戦略は、超高速遠心分離(UC)、密度勾配遠心分離(DGC)、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)などの技術に大きく依存しています12,13,14,15,16,17。現在、DGCはBEV分離の分野で最も広く適用されている方法の1つであり、サンプルの初期ローディング位置によって決定される「トップダウン」と「ボトムアップ」の2つの沈降フローティングモードを包含しています。これらの方法論は、サイズと密度の格差に基づいて細胞外小胞(EV)を他の成分と区別し、さまざまな純度と回収率を生み出します。これまでの研究では、血液中のリポタンパク質18や尿中のTamm-Horsfallタンパク質19など、体液サンプル中の可溶性タンパク質からEVを適切に分離するには、シングルアプローチ戦略では不十分であることが示されています。さらに、真核生物の細胞外小胞(EEV)のサイズ分布はBEVのサイズ分布と重複することが多いため、BEVの収量を最適化するには、さらなる方法論的強化が必要です。したがって、BEVの研究を進めるには、効果的な分離および精製方法の開発にかかっています。特に、Tulkens et al 15 は、糞便 BEV を EEV から分離するために直交生物物理学的戦略を採用しており、ボトムアップ DGC モードの遠心分離時間は最大18 時間でした。対照的に、この試験では 7 時間に短縮され、グラジエント超遠心分離時間が大幅に短縮され、プロセスが簡素化されました。
本研究では、低速から超高速まで、さまざまな異なる遠心分離速度でBEVを濃縮した後、最適化された緩衝条件下で、2つのDGCモードを用いて糞便BEVを分離および精製しました。形態、粒子径、および濃度に基づく評価は、この強化された分析法による称賛に値する性能を示しました。この研究は、将来の研究の基盤となり、その応用範囲をより広い領域に拡大し、人体におけるBEVの不均一性に関する洞察を提供する可能性があります。また、BEVの分離・分析技術の標準化にも貢献します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
南方医科大学南方病院の倫理委員会は、参加者のインフォームドコンセントに基づいて実施されたこの研究を承認しました。ここで採用されているすべての方法は、ヒトマイクロバイオーム国際基準(IHMS:http://www.microbiome-standards.org/)によって提供される標準的な運用ガイドラインに準拠しています。その後のすべてのリキッドハンドリング手順は、バイオセーフティキャビネットまたは超クリーンベンチ内で実施することが義務付けられました。
1. 糞便検体の採取と分注
- 便サンプラー、密封された袋、アイスボックスを配布し、サンプルの調達方法と保存方法について参加者に包括的な指示を提供します。
- 各参加者に、提供されたサンプラーを使用して糞便サンプルを収集し、24 時間以内に 4 °C の温度でラボに輸送するように指示します。
- ラボで受け取ったら、滅菌スプーンを使用して、事前に計量した50 mL遠心チューブに3.5 g未満の糞便を分注します。その後の前処理手順のために、チューブに糞便サンプルの重量を記録します。
一時停止ポイント:サンプルの即時処理が不可能な場合は、適切な表記の後、サンプルを-80°Cで長期保存するために割り当てます。
2. 糞便サンプル調製
- 500 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を4°Cで冷却します。 50 mLシリンジを使用して、0.22 μmのポリエーテルスルホン(PES)フィルターで事前に冷却したPBSを10本の50 mL遠心分離チューブにろ過します。
- それぞれ3.5gの糞便サンプルを入れた2本の50 mLチューブを氷上に配置します。各チューブに35 mLのPBSを加えます。
注:糞便の溶解に必要なPBSの量を計算し、最大サンプル濃度が10%(w / v)になるようにします。追加のサンプルを処理する場合は、必要に応じてより多くのチューブを使用します。 - サンプルを300rpmで4°Cで2時間振とうするか、糞便が完全に目に見える形で浮遊するまで少なくとも4°Cで8時間置きます。
3. 差動速度遠心分離
- 高速冷蔵遠心分離機を4°Cに冷却します。
- ステップ2.3で調製したサンプルを含む2本のチューブの重量をPBSで調整し、合計重量が0.1gになるようにします。
- サンプルを3, 000 × g で4°Cで20分間遠心分離します。
- 上清を2本の清潔な50 mL遠心チューブに慎重にピペットで移し、ペレットの上に約1 mLを残します。このプロセスには、使い捨てのプラスチック製パスツールピペットを使用してください。
- PBSで2本のチューブの重量を調整し、合計重量が0.1g±以内になるようにします。
- 移した上清を12, 000 × g で4°Cで30分間遠心分離します。
- 20 mLのシリンジを使用して上清を吸引し、シリンジニードルを取り外し、0.22 μmのフィルターで50 mLのチューブにろ過します。この時点で、上清の量は約30mLである必要があります。
注:12,000 × g の遠心分離後もかなりの量の不純物が見られる場合は、12,000 × g で4°Cで30分間遠心分離ステップを繰り返す必要があります。 これを怠ると、ろ過中の細孔の詰まりにより、BEVが大幅に失われる可能性があります。
4. 超高速遠心分離
- ローターとバケットを75%(v / v)アルコールで拭いて清掃し、残留汚染を取り除きます。
- 38.5 mLの超遠心チューブをチューブホルダーに入れます。
注:サンプル量に基づいて適切な超遠心チューブを選択してください。製品マニュアルに示されているように、遠心チューブの滅菌に紫外線や不適切な化学試薬は避けてください。 - ステップ3.7でろ過した糞便上清約30 mLを超遠心チューブに移します。
- 超遠心チューブに約8 mLのPBSを充填し、チューブの開口部から3 mmの隙間を残します。
- サンプルの入った2本の超遠心チューブを対向する超遠心分離バケットに入れます(例えば、バケット1は4(1-4)、2-5、3-6に対応します。
- PBSで2つのバケットの重量を調整し、合計重量が±0.005g以内になるようにします。
- チューブがロードされているかどうかに関係なく、すべてのバケットをローターに取り付けます。
- 真空を開始し、サンプルを160,000 × g で4°Cで70分間遠心分離します。
- チャンバーの掃除機を解除し、機器のホームページに「準備完了」と表示されたらドアを開けます。
- ローターを超遠心分離機から取り外します。
- バケットをローターからラックに移動し、ニッパーを使用してチューブを回収します。
- 底に目に見える茶色のペレットを含む上澄みを捨てます。
- 1,000 μLのピペットと1 mLのプレチル(4°C)PBSを使用して、完全に懸濁するまで繰り返しピペッティングして、ペレットを再懸濁します。チューブに約37 mLのPBSを充填し、開口部から3 mmの隙間を残します。
- ステップ4.5-4.11に従って、160,000 × g 、4°Cで70分間、別の超遠心分離を行い、部分的に付着した汚染成分をチューブ壁から除去します。
- 上清を廃棄し、2本の超遠心チューブを5分間反転させ、内壁に残っている溶液をワイパーで取り除きます。
注意: 内壁を清掃すると、超遠心チューブの壁に付着した残留汚染による干渉が最小限に抑えられます。特に粒子径に関して、BEV分析に影響を与えないワイパーを選択してください。 - 1,000 μLのピペットを使用して、1.2 mLの冷やした(4°C)PBSでピペッティングして、各チューブ内のペレットを再懸濁します。
- 1.2 mL の PBS/BEV 溶液を 1 本の超遠心チューブから清潔な 1.5 mL マイクロチューブに移します。
一時停止ポイント:1本の超遠心チューブから回収したPBS/BEV溶液は、ステップ6に進むことができます。他のチューブからの溶液を-80°Cで保存します。
5. 密度勾配遠心分離のための溶液調製
- 0.02 M HEPES緩衝液の調製
- 0.477 gのHEPES粉末と0.8 gのNaClを90 mLのオートクレーブ滅菌水と組み合わせます。
- 1 M 水酸化ナトリウム(NaOH)を添加して pH を 7.2 に調整します。脱イオン水で容量を100 mLにし、0.22 μmのPESメンブレンで溶液をろ過します。
注意: 水酸化ナトリウムは強苛性アルカリです。オペレーターは、ヒュームキャビネットで慎重に取り扱い、準備する必要があります。
- 密度勾配緩衝液の調製
- 密度勾配遠心分離用の超遠心チューブの数に基づいて、各密度勾配バッファーの必要容量を計算します(このプロトコルでは、60%、50%、40%、20%、および10%グラジエント溶液の容量は、それぞれ2.5 mL、3 mL、6 mL、6 mL、および6 mLでした)。
- 50%(w/v)のイオジキサノールワーキング溶液を調製するには、0.02 M HEPESバッファーと60%(w/v)のヨジキサノールストック溶液を1:5(0.5 mL:2.5 mL)の体積比で混合します。
注:使い捨ての20 mLシリンジを使用して、イオジキサノールストック溶液を回収し、空気が入らないようにします。 - 異なる濃度のヨウジキサノール緩衝液を調製するには、ステップ5.2.2の50%イオジキサノールワーキング溶液とステップ5.1で得られたHEPES緩衝液を、 表1に示す割合に従って1,000 μLのピペットで混合します。
注意: 手順5は、ライトを消した超クリーンベンチで実行してください。開封したヨウジキサノール原液は、細菌の繁殖を防ぐため、4°Cの冷蔵庫で保存してください。ヨウジキサノール溶液とHEPES緩衝液を光から保護してください。
6. 密度勾配遠心分離システムの確立
- トップダウンDGCモード
- ステップ 4 で単離した 500 μL の PBS/BEV 溶液を 3 mL の PBS と混ぜ合わせます。1,000 μL のピペットを使用して溶液を穏やかに混合し、3.5 mL の PBS/BEV 溶液を得ます。
- 穴の開いた発泡スチロールプレートに31mLの超遠心チューブを置き、「↓」とラベルを付けます。
- 1,000 μLのピペットを使用して、50%イオジキサノール溶液3 mLをチューブの底部に垂直に加えます。
- チューブを70°の角度に傾け、チューブホルダーまたはその他のサポートをフォームプレートのレベルより少し上、チューブの開口部の下に配置します。
- 1,000 μLのピペットを使用して、50%イオジキサノール溶液の上に3 mLの40%イオジキサノール溶液を加えます。
- 1,000 μLのピペットを使用して、40%ヨジキサノール溶液の上に3 mLの20%ヨジキサノール溶液を加えます。
- 1,000 μL のピペットを使用して、20% イオジキサノール溶液の上に 3 mL の 10% イオジキサノール溶液を加えます。
- 1,000 μLのピペットを使用して、10%ヨジキサノール溶液の上にステップ6.1.1のPBS/BEV溶液3.5 mLを加えます。
- チューブをそっと直立位置に戻します。
注:ピペッティング後、成層化が見えるはずです。
- ボトムアップDGCモード
- 穴の開いた発泡スチロールプレートに31 mLの超遠心チューブを置き、「↑」とラベルを付けます。
- 2.5 mL の 60% イオジキサノール原液をチューブの底に垂直に加えます。1,000 μLのピペットを使用して、ステップ4で単離した500 μLのPBS/BEV溶液と穏やかに混合し、3 mLの50%ヨジキサノール/BEV溶液を得ます。
- チューブを70°の角度に傾け、チューブホルダーまたはその他のサポートをフォームプレートのレベルより少し上、チューブの開口部の下に配置します。
- 1,000 μL のピペットを使用して、50% iodixanol/BEV 溶液の上に 40% iodixanol 溶液 3 mL を加えます。
- 1000 μLのピペットを使用して、40%イオジキサノール溶液の上に20%イオジキサノール溶液3 mLを加えます。
- 1000 μLのピペットを使用して、20%イオジキサノール溶液の上に10%イオジキサノール溶液3 mLを加えます。
- 1,000 μLのピペットを使用して、10%イオジキサノール溶液の上に3.5 mLのPBSを加えます。
- チューブをそっと直立位置に戻します。
- この時点で、ステップ4.17で得られた懸濁液の200μLが残存しており、これは、後に「UC」と名付けられた基として分析することができる。
注:ステップ6で溶液を移すときは、必ずピペットチップを超遠心チューブの壁に当ててチューブの軸に垂直にしてください。
7. 密度勾配遠心分離とフラクション回収
- PBSで2本のチューブの重量を調整し、総重量が0.005g以内±ようにします。
- ステップ4.5に従ってチューブをバケットに入れ、160,000 × g で4°Cで7時間遠心分離します。
- ピペッター(1000 μL)を使用して、側壁に上から下へ、3 mL、2 mL、1 mL、1 mL、1 mL、1 mL、1 mL、1.5 mL、3 mLの順にフラクションを38.5 mLの超遠心チューブに回収します。
注意: 視線を液面と同じ高さに維持してください。 - ステップ7.3で得られた各画分について、ステップ4に従って、160,000 × g で4°Cで70分間超遠心分離を行います。
- 上澄み液を取り除き、超遠心チューブを5分間反転させます。
- 200 μLのピペットを使用して、200 μLのプレチル(4°C)PBSにペレットを再懸濁します。
- PBS/BEV溶液を清潔な1.5 mLマイクロチューブに移します。
- F1からF10までの分数にラベルを付け、ステップ8に基づいて分析します。
一時停止ポイント:ステップ7.8で得られたサンプルをすぐに処理できない場合は、-80°Cで保存してください。
8. 回収した画分の特性評価と定量分析
- ブランクコントロールを備えたマイクロプレート検出器を使用して、各フラクションの吸光度値(OD 340 nm)を決定し、対応する密度を計算します。
注意: PBS / BEV溶液(ステップ6.1.1およびステップ6.2.2)をPBSに置き換えて、ブランクコントロールを確立します。- 0%、5%、10%、12.5%、および20%のヨジキサノール溶液を、それぞれ1.0058 g/mL、1.0318 g/mL、1.058 g/mL、1.0708 g/mL、および1.111 g/mLの密度に対応する0.02 M HEPESで希釈した各100 μLを調製します(ステップ5.2.2)。
- ブランクコントロール(ステップ 7.3 で調製)から得られた各フラクション 50 μL と、各標準溶液(ステップ 8.1.1 で調製)から 50 μL を 96 ウェルプレートの複製ウェルに加えます。
- 波長を 340 nm に設定し、端点の光学濃度を測定し、各フラクションの密度を計算します。
- F4-F9 を、その密度に基づく BEV フラクションの範囲として特定します。
- ビシンコニン酸アッセイ(BCA)を用いてBEV画分のタンパク質濃度を測定します。
- メーカー提供のPBSで10倍に希釈し、0.5 μg/μLの標準タンパク質溶液を調製する。
- 試薬の指示に従って、標準タンパク質溶液(ステップ8.2.1で調製)をさまざまな容量で添加し、96ウェルプレートの各ウェルにPBSを添加して合計容量20 μLにします。
- ステップ7.8で調製したサンプル20 μLと、ステップ6.2.9で定義したUC後に残ったサンプルを各ウェルに加えます。
- 試薬AとBを50:1の比率で混合し、各ウェルに200μLを移します。
- プレートを37°Cのウォーターバスで30分間インキュベートします。
- マイクロプレートリーダーを用いて吸光度値を測定し、タンパク質濃度(μg/μL)を算出し、ステップ8.2.2で希釈した標準液の値から得られた検量線(x:光学濃度、y:タンパク質濃度)からサンプルのタンパク質含量(μg)を求めます。
- 透過型電子顕微鏡(TEM)を用いてステップ8.1.4で定義したBEVフラクションを特性評価し、BEVの存在を確認します。以下のすべての手順は氷上で実行する必要があります。
- ステップ 7.8 で単離した各 F4-F9 フラクション 10 μL と、ステップ 6.2.9 で定義した UC の後に残したサンプルを Formvar/Carbon 担持銅グリッドに 20 分間塗布し、ろ紙でブロットします。
- サンプルを100μLのPBSで1分間ずつ3回洗浄し、ろ紙でブロットします。
- サンプルを1%(w/v)グルタルアルデヒド100 μLで5分間固定し、ろ紙でブロットします。
- 100 μL の PBS でグリッドを 2 分間ずつ 10 回洗浄し、ろ紙でブロットします。
- グリッドを 50 μL の 1.5% (w/v) 酢酸ウラニルで 10 分間染色し、ろ紙でブロットします。
注意: 酢酸ウラニルは放射性であり、皮膚に接触したり吸入したりすると非常に有毒です。酢酸ウラニルを含む溶液をヒュームキャビネットで取り扱い、適切な安全対策に従ってください。 - グリッドを1%(w/v)メチルセルロース滴に5分間移し、ろ紙でブロットします。
- 風乾したグリッドは、観察するまで暗くほこりのない環境で保管してください。
- TEMを使用して画像を取得し、分析します。
- ステップ8.1.4で定義したBEV画分をナノ粒子トラッキング分析(NTA)を用いて特性評価し、粒子数をカウントします。
- 110 nm のポリスチレン粒子を使用してシステムをキャリブレーションします。
- PBSを使用してサンプルプールを洗浄します。
- ステップ7.8で取得したさまざまなフラクションのサンプルと、ステップ6.2.9で定義したUCの後に残ったサンプルを、105-10 9 粒子/mLの範囲の濃度に希釈し、最適化濃度は107 粒子/mLにします。
- 温度を23〜30°C前後に維持しながら、3回の複製で11か所で記録および分析します。
- サンプルのタンパク質含有量をクマシーブリリアントブルー染色(CBBS)およびウェスタンブロッティング(WB)で分析します。
- 定量が必要な場合は、ステップ 7.8 で得られたさまざまなフラクションの BEV サンプルと、ステップ 6.2.9 で定義した UC の後に残ったサンプルを、PBS と 5 ×ローディングバッファーを使用して最終濃度 0.5 または 1 μg/μL に希釈し、ステップ 8.5.2 で各ウェルに 20 μL(10 μg または 20 μg)の十分なサンプルローディングを確保します。サンプルを95°Cで10分間煮沸します。
- プレハブのポリアクリルアミドゲルを電気泳動タンクに組み立て、サンプルをウェルに移します。
- 以下のパラメータで垂直電気泳動を実施します:160 V で 50 分間。
- ゲルをクマシーブリリアントブルー溶液で1時間染色し、青色の背景が明るくなるまで脱イオン水ですすぎ、カメラで画像を撮影します。
- 以下のパラメーターで他のゲルのタンパク質ブロッティング手順を実行します:400 mA で 20 分間。
- ブロッティングメンブレンを5%(w/v)BSA溶液で室温で1時間ブロッキングします。
- メンブレンをTBSTバッファーで3回、それぞれ5分間洗浄します。
- メンブレンを一次抗体(BEVマーカー:LPS、OmpA、LTA;EEVマーカー:CD63、CD9、TSG-101、シンテニン、インテグリンβ1;その他の汚染マーカー:フラジェリン、カルネキシン)を4°Cで8〜12時間。
- メンブレンをTBSTバッファーで3回、それぞれ10分間洗浄します。
- メンブレンを二次抗体とともに室温で1時間インキュベートします。
- 手順8.5.9を実行します。
- 化学発光装置を用いてブロッティングを現像する。
- PBS/BEV溶液(ステップ6.1.1およびステップ6.2.2)を大腸菌由来のBEVに置き換えてポジティブコントロールを確立し(粗大腸菌BEVの単離手順については資料表を参照)、BEVの特性評価のために上記のすべての実験を実施します。
一時停止ポイント:糞便BEVの上記の特性評価の結果に基づいて、F6-F8をBEVに富む画分の分布として決定し、この狭くなった範囲をその後の分析に利用します。
- 粒子とタンパク質の回収率を計算して、2 つの DGC モードの効率を評価します。以下の結果はパーセンテージで表示されます。
- トップダウンモードでの粒子の回収率を計算します:F6-F8の総粒子数/ステップ6.2.9で定義したUC後の粒子。
- ボトムアップモードでの粒子の回収率を計算します:F6-F8の総粒子数/ステップ6.2.9で定義したUC後の粒子。
- トップダウンモードでのタンパク質の回収率を計算します:F6-F8の総タンパク質含有量(μg)/ステップ6.2.9で定義されたUC後のタンパク質含有量(μg)。
- ボトムアップモードでのタンパク質の回収率を計算します:F6-F8の総タンパク質含有量(μg)/ステップ6.2.9で定義されたUC後のタンパク質含有量(μg)。
- 粒子/タンパク質比を計算して、UC と 2 つの DGC モードで従来定義されていた純度を評価し、以下の結果はすべてパーセンテージで表示しました。
- ステップ6.2.9で定義したUC後の粒子/タンパク質比:UC後の粒子/UC後のタンパク質含有量(μg)。
- トップダウンモードでの粒子/タンパク質比:F6-F8の総粒子数/F6-F8のタンパク質含有量(μg)。
- ボトムアップモードでの粒子/タンパク質比:F6-F8の総粒子数/F6-F8のタンパク質含有量(μg)。
- 糞便BEVの精製と将来の分析に最も適した遠心分離モード(プロトコルではトップダウンモードを選択)を選択します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
BEV富化画分の分布の決定
細菌の細胞外小胞(BEV)濃縮画分の分布を決定するために、外径 340 nm での吸光度値を測定するためのブランクコントロールを確立し、測定値とヨウジキサノールガイドラインに基づいて各画分の密度を計算しました(ステップ 8.1)。 表2 は密度の結果を示しており、フラクションF4〜F9が細胞外小胞に典型的に関連する範囲内の密度を示したことを示している。この発見は、BEVの大部分がこれらのフラクションで分離されていることを示唆しており、F4-F9をBEVの大まかな範囲として定義することにつながりました。透過型電子顕微鏡(TEM)を用いて、 図1 に示すようにフラクションF4-F9で単離された糞便BEVの形態学的特徴を特徴付けました。TEM画像(図2)からは、BEVの特徴である古典的なカップ状の構造が見られました。ナノ粒子追跡分析(NTA)とビシンコニン酸アッセイ(BCA)を実施して、それぞれ粒子数とタンパク質濃度を決定し、回収率と純度のさらなる評価を可能にしました。 図 3 は、各フラクションのタンパク質および粒子濃度を示しており、F6 と F7 が最も高い濃度を示し、F5 と F8 がそれに続いていることを示しています。続いて、クマシーブリリアントブルー染色(CBBS)およびウェスタンブロッティング(WB)を実施して、全体的なタンパク質分析を行いました。CBBSの結果はタンパク質濃度の所見と一致しており、F6とF7が最も強いバンドを示しました(図4)。BEVの分布を確認するために、 大腸菌 由来の細胞外小胞をポジティブコントロール(ステップ8.5.13で定義)として使用しました。単離および精製の手順は、 材料表 および前述のプロトコルのセクション(ステップ 3、4)に記載されている手順に従いました。WB分析により、細菌の外膜の主成分であり、BEVの特異的マーカーである外膜プロテインA(OmpA)が画分F6-F8に存在することがさらに確認されました。これらの結果に基づいて、フラクションF6-F8は、その後の実験および分析に適したBEV濃縮フラクションとして定義されました。
干渉成分の提示範囲の検証
BEVと同程度の大きさと密度を持つ真核生物の細胞外小胞(EEV)は、BEVの解析における主要な干渉として特定されました。これに対処するために、3つのEEVタンパク質をトップダウンモードとボトムアップモードの両方からフラクション5〜8でプローブし、遠心分離時間は7時間と15時間でした。 EEV関連膜貫通タンパク質であるCD63は主にF5で検出され、BEVマーカーLPSはフラクション6〜7で濃縮されました。このパターンは両方のモードで観察されたが、ボトムアップモードではF7でCD63-EEVのわずかな縞模様が見られた。しかし、他のEEVマーカーであるCD9およびTSG-101は、モードや遠心分離時間に関係なく、これらのフラクションで可視シグナルを示さなかった。独立した実験では、シンテニンとインテグリンβ1を標的とする抗体を使用して、フラクション5〜8にわたるEEVに固有の異なるタンパク質マーカーの濃縮を確認しました。シンテニンはF5、特にトップダウンアプローチの範囲内で顕著に検出され、インテグリンβ1の存在はF6で識別されました(図5)。干渉粒子の存在をさらに評価するために、Dil標識低密度リポタンパク質(Dil-LDL)を密度勾配システムに導入し、すべての画分で蛍光強度を測定しました。トップダウンモードでは、フラクション1〜4が比較的高い蛍光値を示し、ボトムアップモードでは、F1〜F6がより高い強度を示しました(図6)。
BEVの濃度、粒子径、マーカーから2つのDGCモードの回収率と純度を評価
F6-F8 フラクションを BEV 濃縮フラクションとして同定した後、2 つの密度勾配遠心分離(DGC)モードの回収率と純度を評価しました。トップダウンモード、ボトムアップモード、および超遠心分離(UC)のみで得られたBEV濃縮画分の粒子径を比較しました。両方の遠心分離モードで観察された粒子径は 90 nm から 300 nm の範囲で、BEV の定義された直径と一致しました(図 7)。次に、DGC前後の粒子およびタンパク質濃度に基づいて、2つのモードの粒子およびタンパク質の回収率を計算しました(表3 および 図8)。特に、ボトムアップモードは他のモードと比較して高い回収率を示しました。別の実験グループでは、2 つのモードでのタンパク質回収率を、7 時間と 15 時間の異なる遠心分離時間で評価しました。重要なことは、使用したグラジエントモードに関係なく、DGC 後の F6-F8 フラクション内のタンパク質含量に 2 回の遠心分離時間間で統計的に有意な差がなかったことです(図 9)。粒子/タンパク質比を計算して、2 つのモードにおける純度の大まかな評価を行いました。このデータでは、モード間で純度に有意差は見られませんでした。さらに、3 つの BEV マーカー(LPS、OmpA、LTA)、1 つの EEV マーカー(CD63)、2 つの汚染マーカー(Calnexin、Flagellin)に焦点を当てて、クマシーブリリアントブルー染色(CBBS)およびウェスタンブロッティング(WB)を実施して純度をさらに比較しました。その結果、DGC後の干渉物質の部分的な減少が示され、LPSとOmpAはUC単独と比較して、両方のDGCモードでより顕著な存在感を示しました(図10)。
図1:BEVの分離と精製の概略ワークフロー。 略語:BEVs = 細菌性細胞外小胞。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:BEVフラクションの代表的なTEM画像。 (A)UC後に分離したBEVのTEM像。(B)トップダウンモードでDGC後に分離したBEVのTEM画像。(C)ボトムアップモードでDGC後に分離したBEVのTEM画像。すべての画像は、200 nmの一貫したスケールで提示されました。略語:TEM =透過型電子顕微鏡;BEV = 細菌の細胞外小胞;UC = 超遠心分離;DGC = 密度勾配遠心分離。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:トップダウンおよびボトムアップDGCモード後のBEVフラクションのタンパク質および粒子濃度。 BEV画分のタンパク質濃度はBCAを使用して測定したもので、灰色のバーで表されています。粒子濃度はNTAを使用して測定され、青いバーで表されています。略語:BEV =細菌性細胞外小胞;DGC = 密度勾配遠心分離;BCA = ビシンコニン酸アッセイ;NTA = ナノ粒子追跡分析。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:BEV濃縮画分の測定。 (A)CBBSは、トップダウンモードとボトムアップモードの両方で糞便BEVで濃縮された画分を決定するために実施されました。(B)大 腸菌 由来のEVを単離・精製し、WBでポジティブコントロールとして利用し、BEVの存在と分布を確認した。OmpA:外膜プロテインA、BEVマーカー。略語:BEV =細菌性細胞外小胞;CBBS = クマシーブリリアントブルー染色;EV = 細胞外小胞;WB = ウェスタンブロッティング。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図5:EEV分布の確認 密度勾配超遠心分離時間が異なるトップダウンおよびボトムアップDGCモードから得られたフラクション5〜8のウェスタンブロット分析(7時間(A)および15時間(B)。(C)および(D)に示すように、7時間の遠心分離期間から得られたF5〜F8に焦点を当てた独立した試験が実施されました。選択したマーカーには、BEV(LPS)およびEEV(CD63、CD9、TSG-101、シンテニン、インテグリンβ1)に関連するマーカーが含まれていました。略語:DGC =密度勾配遠心分離;BEV = 細菌性細胞外小胞;EEV = 真核生物の細胞外小胞。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図6:低密度リポタンパク質の分布。 コンタミネーションマーカーと見なされるジル標識低密度リポタンパク質(Dil-LDL)を、トップダウンモードとボトムアップモードの両方でグラジエントシステムに 10 μg の濃度で添加しました。Dil-LDLは、PBS/BEV溶液(ステップ6.1.1およびステップ6.2.2)を置き換えて、検出モデルを確立しました。各フラクションの蛍光強度は、励起/発光波長549/565nmのマイクロプレート検出器を使用して測定しました。略語:BEV = 細菌性細胞外小胞。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図7:BEV濃縮画分の粒子径。 (A)UC後に得られた粗BEVの粒度分布。(B)トップダウン密度勾配遠心分離(DGC)モードを使用して得られたBEV濃縮画分(F6-F8)の粒度分布。(C)BEV濃縮画分(F6-F8)の粒度分布は、ボトムアップDGCモードを使用して取得しました。NTAは、粒子の寸法を定量化するために実施されました。パネル(A-C)に採用された希釈係数は、それぞれ10,000、2,000、および5,000であり、その後の結果は較正されました。略語:BEV =細菌性細胞外小胞;UC = 超遠心分離;DGC = 密度勾配遠心分離;NTA = ナノ粒子追跡分析。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図8:トップダウンおよびボトムアップDGCモードのタンパク質および粒子回収率。 (A)DGC(UC)前後のタンパク質濃度の比として計算された2つのモードのタンパク質回収率。(B)2つのモードの粒子回収率は、DGC(UC)前後の粒子濃度の比で算出します。(C)UC、トップダウン、ボトムアップモードの粒子/タンパク質比。データは平均±SEMとして表示されます。 統計分析は、パネルAおよびBの両側対応のないt検定と、パネルCのTukey事後検定による一元配置分散分析(ANOVA)を使用して実行されました。有意差は認められなかった。略語:DGC =密度勾配遠心分離;UC = 超遠心分離。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図9:異なる密度関連超遠心分離時間を使用した、トップダウンDGCモードとボトムアップDGCモードに基づくタンパク質回収率の比較。 7 時間および 15 時間のグラジエント超遠心分離から得られたフラクション F6-F8 のタンパク質回収率を、トップダウンモードとボトムアップモードの両方を使用した独立した実験で評価しました。データは平均±SEMとして表示されます。 統計分析は、フィッシャーの最小有意差検定による二元配置分散分析(ANOVA)を使用して実行されました。有意差は認められなかった。略語:DGC = 密度勾配遠心分離。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図10:トップダウンおよびボトムアップDGCモードの純度評価 。 (A)CBBSは、UC、トップダウン、ボトムアップモードのタンパク質分布を比較するために実施されました。(B)WBは、UC、トップダウン、ボトムアップモードの純度を評価するために実施されました。カルネキシン:小胞体関連タンパク質マーカー;フラジェリン、バクテリアからのタンパク質マーカーを汚染します。CD63:真核生物の細胞外小胞の膜貫通タンパク質マーカー;LTA:グラム陽性菌由来のBEVマーカー。LPS、OmpA:グラム陰性菌由来のBEVマーカー。略語:DGC =密度勾配遠心分離;UC = 超遠心分離;CBBS = クマシーブリリアントブルー染色;WB = ウェスタンブロッティング。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
| ヨウジキサノール溶液濃度(%) | 0.02 M HEPESバッファー | 50%ヨウジキサノール作業溶液 |
| 40 | 1 | 4 |
| 20 | 3 | 2 |
| 10 | 4 | 1 |
表1:ヨジキサノール密度グラジエントバッファーを調製するための比率。 この表は、特定の濃度のヨウジキサノール溶液を得るための 0.02 M HEPES 緩衝液と 50% ヨジキサノール作業溶液の比率を示しています。
| F1キー | F2キー | F3キー | F4 キー | F5キー | F6 キー | F7 キー | F8 キー | F9 キー | F10 キー | |
| 密度 (g/mL) | 1.023 | 1.038 | 1.049 | 1.062 | 1.074 | 1.098 | 1.144 | 1.185 | 1.239 | 1.293 |
表2:ヨジキサノールベースの密度勾配遠心分離システムの密度。 この表は、ヨジキサノールベースの密度勾配遠心分離システムにおける各フラクションの密度を示しています。ブランクコントロール:PBSベースのグラジエントシステム。
| トップダウンモード | ボトムアップモード | |
| 粒子回収率(%) | 24.08 | 35.69 |
| 蛋白質の回収率(%) | 24.5 | 32.45 |
表3:2つのモードの粒子およびタンパク質の回収率。 この表は、トップダウンモードとボトムアップモードの粒子およびタンパク質の回収率を示しています(図 8)。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
細菌の細胞外小胞(BEV)は、細菌から分泌される脂質二重層ナノ粒子であり、タンパク質、脂質、核酸、その他の生理活性分子を豊富に含み、細菌の機能的効果の媒介に寄与する20。腸に由来するBEVは、炎症性腸疾患、クローン病、大腸がんなどの疾患の発症に関与し、一般的な代謝に影響を与え、認知機能障害を媒介することが確認されています4,16,17,20,21,22,23,24,25,26 .現在、ヒトの糞便から腸内細菌由来のBEVに関する完全かつ客観的な生物学的情報を得ることは、依然として一連の要因によって制約されていますが、その中でも最も重要な課題は、複雑な宿主環境からBEVをどのように分離するかです。
超遠心分離(UC)、密度勾配遠心分離(DGC)、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)13,14,15,16,17など、BEVを分離する主な方法には、長所と短所の両方があります。一部の干渉物質の除去の難しさと一貫した操作手順の欠如は、BEVのより現実的で包括的な分析に深刻な影響を与え、分離プロセスの課題として残っています。干渉の望ましくない影響を緩和するために、多くの研究15,27,28は、特に体液からのBEVの分離を達成するために、上記の方法の2つ以上を組み合わせていますが、複雑な手順は結果の安定性に影響を与える傾向があります。BEVの場合、他の汚染物質(タンパク質凝集体、脂質成分、真核生物の細胞外小胞(EEV)など)との密度の違い15は、今日では特定の分離手段になる可能性があります。
現在、イオジキサノールは、その等張特性によりスクロースに取って代わり、EVの密度勾配分離に適した媒体として浮上しています。これらの特性は、EVの形態を維持し、各フラクション29の密度推定を容易にすることに貢献する。Tulkens et al 15 に沿って、私たちの研究では、50% (w/v)、40% (w/v)、20% (w/v)、10% (w/v)、および 0% 濃度勾配層でヨウジキサノールを利用して、DGC システムに同じ濃度を採用しました。最初のステップでは、HEPES緩衝液を使用して、さまざまな濃度のヨウジキサノール溶液を調製しました。トリス(-EDTA)-スクロース緩衝液と比較すると、適切な濃度のHEPES緩衝液は、その固有の特性により、遠心分離システム内の長期的なpH安定性を確保します。同時に、遠心分離システムの最上層に滅菌PBSバッファーを採用し、溶液調製中の細菌やその代謝物による汚染の可能性を防ぐだけでなく、DGC前後のサンプルバッファーの一貫性を維持しました。これには、UC後にペレットをPBS緩衝液で再懸濁し、DGC後にイオジキサノールをPBSに置き換えることが含まれ、それによって結果の比較分析が容易になりました。さらに、50%、40%、20%、10%、0%(PBS 層)のイオジキサノール溶液について、DGC システム内の各グラジエント層の容量をそれぞれ 3 mL、3 mL、3 mL、3 mL、3.5 mL に校正しました。この戦略は、比較的広い密度範囲(1.02-1.30 g / mL)を確立するのに役立ち、BEVと他の干渉要素との分離を強化する可能性があり、それによって勾配を複雑な汚染を伴う他の体液に適用できるようになります。
プロトコルのいくつかの段階が重要であることを強調することが重要です。特に、ステップ 2.2 で概説した希釈係数は、1 g の糞便サンプルを最低 10 mL の PBS と混合し、過飽和を防ぎ、実験リソースを節約する上で極めて重要です。これらの条件下では、粒子とタンパク質の濃度は、他の糞便特性が一定であると仮定すると、一般にサンプル中の糞便量に比例して増加します。必要に応じて、粘稠度、リポタンパク質、血液含有量などの要因を考慮したさらなる分析を行うことができます。ステップ3.4では、ペレットを乱し、大きな顆粒が0.22 μmフィルターのメンブレンを塞ぐ可能性があるため、溶液を直接注ぐことは避けるように注意する必要があります。フィルターが急速に飽和した場合(例えば、10 mL未満がフィルターを通過する場合)は、12,000 × g で追加の遠心分離ステップを行うことをお勧めします。密度勾配遠心分離では、グラジエント溶液の正確な調製が信頼性の高い結果を得るための前提条件です。さらに、上部の低密度溶液を層状にする際には、成層の混乱を防ぐためにチューブを慎重に操作することが不可欠であり、気泡は注意深くピペッティングして除去する必要があります。最後に、フラクションを吸引する際には、チューブ壁に沿って細心の注意を払って引き抜き、BEVの分布が不正確になる可能性のある吸引の過多または過少を避けることが重要です。液面を定期的に観察し、一貫した練習を行うことで、この問題を軽減することができます。
この試験では、複数の特性評価法を使用して BEV 濃縮画分(F6-F8)を決定し、トップダウンとボトムアップの 2 つの異なるグラジエント超遠心分離モードを検討しました。F4-F8 のタンパク質および粒子濃度を測定し(図 3)、回収率と純度を比較し(図 8 および図 10)、糞便サンプルから BEV を単離および精製する代替方法よりも、ボトムアップ遠心分離モードの方がタンパク質レベルと粒子レベルの両方で高い検出値が得られることが観察されました。この観察は、異なる動的プロセスを意味します。リポタンパク質などの非小胞性細胞外ナノ粒子(NVEP)29は、BEVよりも密度が低いため、サンプルが底面に載っていると浮力密度に達しない可能性があり(図6)、DGCを15時間行った後でも回収率が上昇する可能性があるという仮説が提案されました(図9)。この観察は、粒子とタンパク質の比率に基づく従来の純度定義が適用可能かどうかを検討する必要があります。さらに、F5ではEEVが優勢であったのに対し、F6-F7ではBEVが顕著に検出されたことは注目に値します(図4および図5)。特に、この差別化は、トップダウンモードを採用した場合に強調されたようです。したがって、このモードはこのプロトコルに適している可能性があります。しかし、F6内にインテグリンβ1が存在することを強調することは不可欠であり、EEV間の本質的な不均一性を示す可能性があります。この方法を血液や尿などの他の体液に適用する場合、研究者はサンプルのユニークな特徴を考慮する必要があります。このプロトコルで定義されている遠心分離時間は7時間で、他の研究で引用されている18時間よりも大幅に短くなっています。この試験で同じパターンで 15 時間の持続時間でタンパク質を回収した場合と比較すると(図 9)、この時間は必要な分離純度を達成するのに十分であると考えられます。これらの運転条件下では、トップダウンモードでの粒子回収率は、糞便1ミリグラムあたり最大10 8(4.5 × 10 7-1.5 × 10 8)に達し、以前の報告(湿った便1グラムあたり10 11 BEV)と一致しました15,29,30。最後に、ブランクコントロールの各フラクションの密度測定により、BEVの密度は1.09〜1.19 g / mLの範囲であることが確認され、これは以前の研究と一致しています。
この方法は効果的ですが、食事、腸機能、およびその他の要因が糞便組成に与える影響により、制限があります。これらの変数は糞便の粘稠度を変化させ、細菌量とBEVの回復に影響を与える可能性があります。したがって、BEVの分離と精製を標準化することが重要です31,32、糞便特性の評価に基づいて調整を行う。今後の研究では、尿中クレアチニンや尿流量に似たBEV収量を正常化するための基準を特定することに重点を置く必要があります。このようなベンチマークは、方法論的評価を強化し、糞便BEVと身体の生理学的および病理学的状態との関連性を明らかにする可能性があります。さらに、糞便BEVとさまざまな疾患との強い関連性は、その重要な臨床的可能性を強調しています。しかし、このプロトコルで規定されている遠心分離時間は、臨床医が必要とする、より便利で迅速な検査の要求を満たしていません。したがって、遠心分離時間が短くても、おそらく3時間未満で同等の結果が得られるかどうかを判断するには、さらなる調査が必要です。また、両方の遠心分離モードで発生する事象を理解するには、さらなる調査が必要です。ボトムアップモードでは、F6-F8では非小胞成分がより濃縮されると仮定されていますが、グラジエント濃度の精製は、特定の機能を持つ追加のサブタイプを特定するのに有益である可能性があります。
この研究では、DGCを使用して人間の糞便からBEVを分離および精製することに成功しました。この戦略は、血液、尿、唾液など、他の生体試料への応用が期待されており、BEVの隠れた情報を明らかにするための効果的なアプローチを研究者に提供し、臨床応用を前進させる可能性があります。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は、相反する利害関係がないことを宣言します。
Acknowledgments
この研究は 、中国国家自然科学基金(82230080)の主要プロジェクトであるNational Science Fund for Distinguished Young Scholars(82025024)の支援を受けました。中国の国家重点研究開発プログラム(2021YFA1300604);中国国家自然科学基金会(81871735、82272438、82002245)広東省著名な若手学者のための広東省自然科学基金(2023B1515020058); 広東省自然科学財団(2021A1515011639); 中国山東省自然科学基金会の主要国家基礎研究開発プログラム(ZR2020ZD11) ポスドク科学財団(2022M720059);南方医科大学南方病院の優れた青少年育成スキーム(2022J001)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 % (w/v) glutaraldehyde (prepared from 2.5 % stock solution in deionized water) | ACMEC | AP1126 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.3 |
| 1 % (w/v) methylcellulose (prepared from original powder in deionized water) | Sigma-Aldrich | M7027 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.6 |
| 1.5 % (w/v) uranyl acetate (prepared from original powder in deionized water) | Polysciences | 21447-25 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.5 |
| 1000 μL, 200 μL, 10 μL Pipette | KIRGEN | KG1313, KG1212, KG1011 | Transfer the solution |
| 5 % (w/v) bovine serum albumin solution (prepared from the original powder in TBST buffer) | Fdbio science | FD0030 | Used in western blotting for blocking at Step 8.5.6 |
| 5 × loading buffer | Fdbio science | FD006 | Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5.1 |
| 75 % (v/v) alcohol | LIRCON | LIRCON-500 mL | Surface disinfection |
| 96-well plate | Rar | A8096 | Measure the absorbance values |
| Anti-Calnexin antibody | Abcam | ab92573 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-CD63 antibody | Abcam | ab134045 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-CD9 antibody | Abcam | ab236630 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-Flagellin antibody | Sino Biological | 40067-MM06 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-Integrin beta 1 antibody | Abcam | ab30394 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-LPS antibody | Thermo Fisher | MA1-83152 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-LTA antibody | Thermo Fisher | MA1-7402 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-OmpA antibody | CUSABIO | CSB-PA359226ZA01EOD, https://www.cusabio.com/ | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-Syntenin antibody | Abcam | ab133267 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-TSG101 antibody | Abcam | ab125011 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Autoclave | ZEALWAY | GR110DP | Sterilization for supplies and mediums used in the experiment |
| Balance | Mettler Toledo | AL104 | Balance the tube sample-loaded with PBS |
| Bicinchoninic acid assay | Fdbio science | FD2001 | Measure protein content of BEVs at Step 8.2 |
| BioRender | BioRender | https://app.biorender.com | Make the schematic workflow of BEVs isolation and purification showed in Figure 1 |
| Biosafety cabinet | Haier | HR1200- II B2 | Peform the procedures about feces sample handling |
| Centrifuge 5810 R; Rotor F-34-6-38 | Eppendorf | 5805000092; 5804727002, adapter: 5804774000 | Preprocess for BEVs (Step 3) |
| Chemiluminescence Apparatus | BIO-OI | OI600SE-MF | Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12 |
| Cytation 5 | BioTek | F01 | Microplate detector for measuring the absorbance (Step 8.1) and fluorescence (Figure 6) values |
| Dil-labled low density lipoprotein | ACMEC | AC12038 | Definition of distribution of interfering components |
| Electrophoresis equipment | Bio-rad | 1658033 | Used in western blotting for protein separation and transfer at Step 8.5.2, 8.5.3, 8.5.5 |
| Enhanced Chemiluminescence kit HRP | Fdbio science | FD8020 | Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12 |
| Escherichia coli | American Type Culture Collection | ATCC8739 | Isolate BEVs as a positive control. Protocol: Dissolve 25 g of the LB powder in 1 L deionized water, and autoclave. Transfer the 800 μL of preserved Escherichia coli into the medium. Cultivate at 37 °C in the incubator shaker. Then centrifuge at 3, 000 × g for 20 min at 4 °C, 12, 000 × g for 30 min at 4 °C, filter the supernatant through 0.22 μm membrane, and perform ultra-speed centrifugation at 160, 000 × g for 70 min at 4 °C. Pellet defined as crude BEVs from Escherichia coli was suspended in 1.2 mL PBS (Step 3, 4). |
| Falcon tubes 50 mL | KIRGEN | KG2811 | Preprocess for BEVs (Step 3) |
| Feto Protein Staining Buffer | Absci | ab.001.50 | Coomassie brilliant blue staining at Step 8.5.4 |
| Filter paper | Biosharp | BS-TFP-070B | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 (Blotting the solution) |
| Formvar/Carbon supported copper grids | Sigma-Aldrich | TEM-FCF200CU50 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 |
| HEPES powder | Meilunbio | MB6078 | Prepare iodixanol buffers with different concentrations for density gradient centrifugation |
| HRP AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Fdbio science | FDM007 | Western blotting (Secondary Antibody) |
| HRP AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Fdbio science | FDR007 | Western blotting (Secondary Antibody) |
| Incubator shaker | Qiangwen | DHZ-L | Cultivate Escherichia coli |
| Kimwipes™ Delicate Task Wipes | Kimtech Science | 34155 | Wipe the inner wall of the ultracentrifuge tube at Step 4.15 |
| LB broth | Hopebio | HB0128 | Cultivate Escherichia coli |
| Low temperature freezer (-80 °C) | Haier | DW-86L338J | Store the samples |
| Methanol | Alalddin | M116118 | Used in western blotting for activating PVDF membrane at Step 8.5.5 |
| Micro tubes 1.5 mL | KIRGEN | KG2211 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
| Micro tubes 2 mL | KIRGEN | KG2911 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
| Micro tubes 5 mL | BBI | F610888-0001 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
| Microplate reader | Thermo Fisher | Multiskan MK3 | Measure protein content of BEVs at Step 8.2 |
| Millipore filter 0.22 μm | Merck millipore | SLGP033RB | Filtration sterilization; Material: polyethersulfone, PES |
| NaCl | GHTECH | 1.01307.040 | Density gradient centrifugation solution |
| NaOH | GHTECH | 1.01394.068 | Density gradient centrifugation solution (pH adjustment) |
| Optima™ XPN-100 | Beckman Coulter | A94469 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
| OptiPrep™ | Serumwerk Bernburg AG | 1893 | Density gradient centrifugation stock solution |
| Orbital Shaker | Youning | CS-100 | Dissolve feces at Step 2 |
| Phosphate buffered saline | Procell | PB180327 | Dissolve feces at Step 2 |
| Pipettor | Eppendorf | 3120000267, 3120000259 | Transfer the solution |
| Plastic pasteur pipette | ABCbio | ABC217003-4 | Remove supernatant in preprocessing at Step 3.4 |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes | Millipore | ISEQ00010, IPVH00010 | Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5 |
| Prefabricated polyacrylamide gel, 4–20% 15 Wells | ACE | F15420Gel | Used in western blotting for protein separation at Step 8.5.2, 8.5.3 |
| Primary antibody diluent | Fdbio science | FD0040 | Used in western blotting at Step 8.5.8 |
| Protein ladder | Fdbio science | FD0672 | Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5 |
| Rapid protein blotting solution | UBIO | UW0500 | Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5 |
| Rotor SW 32 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 369650 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
| Syringe 20 mL, 50 mL | Jetway | ZSQ-20ML, YCXWJZSQ-50 mL | Transfer buffers amd remove supernatant in preprocessing |
| TBS powder | Fdbio science | FD1021 | Used in western blotting at Step 8.5 |
| Transmission electron microscope (TEM) | Hitachi | H-7650 | Morphological observation for BEVs at Step 8.3 |
| Tween-20 | Fdbio science | FD0020 | Used in western blotting at Step 8.5 |
| Ultracentrifuge tube | Beckman | 326823, 355642 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
| Ultra-clean bench | AIRTECH | SW-CJ-2FD | Peform the procedures about liquid handling |
| Water bath | Bluepard | CU600 | Used for measuring protein content of BEVs at Step 8.2.5 |
| ZetaView | Particle Metrix | S/N 21-734, Software ZetaView (version 8.05.14 SP7) | Nanoparticle tracking analysis (NTA) for measuring the particle size and concentrarion of BEVs at Step 8.4 |
References
- Costello, E. K., et al. Bacterial community variation in human body habitats across space and time. Science. 326 (5960), 1694-1697 (2009).
- Greenhalgh, K., Meyer, K. M., Aagaard, K. M., Wilmes, P. The human gut microbiome in health: establishment and resilience of microbiota over a lifetime. Environmental Microbiology. 18 (7), 2103-2116 (2016).
- de Vos, W. M., Tilg, H., Van Hul, M., Cani, P. D. Gut microbiome and health: mechanistic insights. Gut. 71 (5), 1020-1032 (2022).
- Zhou, P., Yang, D., Sun, D., Zhou, Y. Gut microbiome: New biomarkers in early screening of colorectal cancer. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 36 (5), 24359 (2022).
- Paik, D., et al. Human gut bacteria produce Τ(Η)17-modulating bile acid metabolites. Nature. 603 (7903), 907-912 (2022).
- Parada Venegas, D., et al. Short chain fatty acids (SCFAs)-mediated gut epithelial and immune regulation and its relevance for inflammatory bowel diseases. Frontiers in Immunology. 10, 277 (2019).
- Jiang, C., Li, G., Huang, P., Liu, Z., Zhao, B. The Gut microbiota and Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 58 (1), 1-15 (2017).
- Morais, L. H., Schreiber, H. L. t, Mazmanian, S. K. The gut microbiota-brain axis in behaviour and brain disorders. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 241-255 (2021).
- Kim, J. H., Lee, J., Park, J., Gho, Y. S. Gram-negative and Gram-positive bacterial extracellular vesicles. Seminars in Cell and Developmental Biology. 40, 97-104 (2015).
- Toyofuku, M., Nomura, N., Eberl, L. Types and origins of bacterial membrane vesicles. Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 13-24 (2019).
- Xie, J., Li, Q., Haesebrouck, F., Van Hoecke, L., Vandenbroucke, R. E. The tremendous biomedical potential of bacterial extracellular vesicles. Trends in Biotechnology. 40 (10), 1173-1194 (2022).
- Coumans, F. A. W., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).
- Northrop-Albrecht, E. J., Taylor, W. R., Huang, B. Q., Kisiel, J. B., Lucien, F. Assessment of extracellular vesicle isolation methods from human stool supernatant. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (4), 12208 (2022).
- Park, Y. E., et al. Microbial changes in stool, saliva, serum, and urine before and after anti-TNF-α therapy in patients with inflammatory bowel diseases. Scientific Reports. 12 (1), 6359 (2022).
- Tulkens, J., De Wever, O., Hendrix, A. Analyzing bacterial extracellular vesicles in human body fluids by orthogonal biophysical separation and biochemical characterization. Nature Protocols. 15 (1), 40-67 (2020).
- Tulkens, J., et al. Increased levels of systemic LPS-positive bacterial extracellular vesicles in patients with intestinal barrier dysfunction. Gut. 69 (1), 191-193 (2020).
- Kang, C. S., et al. Extracellular vesicles derived from gut microbiota, especially Akkermansia muciniphila, protect the progression of dextran sulfate sodium-induced colitis. PloS one. 8 (10), 76520 (2013).
- Simonsen, J. B. What are we looking at? Extracellular vesicles, lipoproteins, or both. Circulation Research. 121 (8), 920-922 (2017).
- Correll, V. L., et al. Optimization of small extracellular vesicle isolation from expressed prostatic secretions in urine for in-depth proteomic analysis. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12184 (2022).
- Liang, X., et al. Gut bacterial extracellular vesicles: important players in regulating intestinal microenvironment. Gut Microbes. 14 (1), 2134689 (2022).
- Alberti, G., et al. Extracellular vesicles derived from gut microbiota in inflammatory bowel disease and colorectal cancer. Biomedical papers of the Medical Faculty of the University Palacky, Olomouc, Czech Republic. 165 (3), 233-240 (2021).
- Díez-Sainz, E., Milagro, F. I., Riezu-Boj, J. I., Lorente-Cebrián, S. Effects of gut microbiota-derived extracellular vesicles on obesity and diabetes and their potential modulation through diet. Journal of Physiology and Biochemistry. 78 (2), 485-499 (2022).
- Lajqi, T., et al. Gut microbiota-derived small extracellular vesicles endorse memory-like inflammatory responses in murine neutrophils. Biomedicines. 10 (2), 442 (2022).
- Lee, K. E., et al. The extracellular vesicle of gut microbial Paenalcaligenes hominis is a risk factor for vagus nerve-mediated cognitive impairment. Microbiome. 8 (1), 107 (2020).
- Villard, A., Boursier, J., Andriantsitohaina, R. Bacterial and eukaryotic extracellular vesicles and nonalcoholic fatty liver disease: new players in the gut-liver axis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 320 (4), G485-G495 (2021).
- Wei, S., et al. Outer membrane vesicles enhance tau phosphorylation and contribute to cognitive impairment. Journal of Cellular Physiology. 235 (5), 4843-4855 (2020).
- Bitto, N. J., Kaparakis-Liaskos, M. Methods of bacterial membrane vesicle production, purification, quantification, and examination of their immunogenic functions. Methods in Molecular Biology. 2523, 43-61 (2022).
- Stentz, R., Miquel-Clopés, A., Carding, S. R. Production, isolation, and characterization of bioengineered bacterial extracellular membrane vesicles derived from Bacteroides thetaiotaomicron and their use in vaccine development. Methods in Molecular Biology. 2414, 171-190 (2022).
- Zhang, Q., Jeppesen, D. K., Higginbotham, J. N., Franklin, J. L., Coffey, R. J. Comprehensive isolation of extracellular vesicles and nanoparticles. Nature Protocols. 18 (5), 1462-1487 (2023).
- Iwai, K., Minamisawa, T., Suga, K., Yajima, Y., Shiba, K. Isolation of human salivary extracellular vesicles by iodixanol density gradient ultracentrifugation and their characterizations. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 30829 (2016).
- Vandeputte, D., et al. Stool consistency is strongly associated with gut microbiota richness and composition, enterotypes and bacterial growth rates. Gut. 65 (1), 57-62 (2016).
- Wen, M., et al. Bacterial extracellular vesicles: A position paper by the Microbial Vesicles Task Force of the Chinese Society of Extracellular Vesicles. Interdisciplinary Medicine. 1, 12046 (2023).
