Summary
Diese Studie beschreibt eine Methode zur Isolierung und Reinigung bakterieller extrazellulärer Vesikel (BEVs), die aus menschlichen Fäkalien mittels Dichtegradientenzentrifugation (DGC) angereichert wurden, identifiziert die physikalischen Eigenschaften von BEVs anhand von Morphologie, Partikelgröße und Konzentration und diskutiert die potenziellen Anwendungen des DGC-Ansatzes in der klinischen und wissenschaftlichen Forschung.
Abstract
Bakterielle extrazelluläre Vesikel (BEVs) sind Nanovesikel von Bakterien, die eine aktive Rolle bei der Kommunikation zwischen Bakterien und Bakterien spielen, indem sie bioaktive Moleküle wie Proteine, Lipide und Nukleinsäuren übertragen, die von den Mutterbakterien geerbt wurden. BEVs, die aus der Darmmikrobiota gewonnen werden, haben Wirkungen im Magen-Darm-Trakt und können entfernte Organe erreichen, was erhebliche Auswirkungen auf die Physiologie und Pathologie hat. Theoretische Untersuchungen, die die Arten, Mengen und Rollen von BEVs aus menschlichen Fäkalien untersuchen, sind entscheidend für das Verständnis der Sekretion und Funktion von BEVs aus der Darmmikrobiota. Diese Untersuchungen erfordern auch eine Verbesserung der aktuellen Strategie zur Isolierung und Reinigung von BEVs.
In dieser Studie wurde der Isolierungs- und Reinigungsprozess von BEVs optimiert, indem zwei Dichtegradientenzentrifugationsmodi (DGC) etabliert wurden: Top-down und Bottom-up. Die angereicherte Verteilung der BEVs wurde in den Fraktionen 6 bis 8 (F6-F8) bestimmt. Die Wirksamkeit des Ansatzes wurde anhand der Partikelmorphologie, der Größe, der Konzentration und des Proteingehalts bewertet. Die Partikel- und Proteinrückgewinnungsraten wurden berechnet und das Vorhandensein spezifischer Marker analysiert, um die Wiederfindung und Reinheit der beiden DGC-Modi zu vergleichen. Die Ergebnisse zeigten, dass der Top-down-Zentrifugationsmodus geringere Kontaminationswerte aufwies und eine ähnliche Rückgewinnungsrate und Reinheit wie der Bottom-up-Modus erreichte. Eine Zentrifugationszeit von 7 h war ausreichend, um eine fäkale BEV-Konzentration von 108/mg zu erreichen.
Abgesehen von Fäkalien kann diese Methode auch auf andere Arten von Körperflüssigkeiten angewendet werden, wobei die entsprechenden Modifikationen entsprechend den Unterschieden in den Komponenten und der Viskosität durchgeführt werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses detaillierte und zuverlässige Protokoll die standardisierte Isolierung und Aufreinigung von BEVs erleichtern und damit eine Grundlage für nachfolgende Multi-Omics-Analysen und funktionelle Experimente schaffen würde.
Introduction
Der Darm gilt weithin als das Organ, das die am häufigsten vorkommenden mikrobiellen Gemeinschaften im menschlichen Körper beherbergt, wobei über 90 % der Bakterien an der Besiedlung und Vermehrung beteiligt sind 1,2. Es gibt umfangreiche Belege dafür, dass die Darmmikrobiota die Darmmikroumgebung moduliert und gleichzeitig mit Funktionsstörungen in entfernten Organen interagiert, vor allem durch eine gestörte Darmbarriere 3,4. Es gibt immer mehr Hinweise auf einen Zusammenhang zwischen dem Ungleichgewicht der Darmmikrobiota und dem Fortschreiten von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (CED)5,6 sowie kognitiven Störungen über die Darm-Hirn-Achse 5,6,7,8. Bakterielle extrazelluläre Vesikel (BEVs), die von Bakterien produziert werden, spielen eine wichtige Rolle bei diesen pathologischen Prozessen.
BEVs sind nanoskalige Partikel, die bakterielle Derivate mit Durchmessern von 20 bis 400 nm verkapseln. Es wurde gezeigt, dass sie Interaktionen zwischen Bakterien und ihren Wirtsorganismen erleichtern 9,10. Trotz ihrer Unsichtbarkeit haben diese Partikel aufgrund ihrer potenziellen breiten Anwendung als diagnostische Biomarker, therapeutische Ziele und Vehikel zur Verabreichung von Medikamenten zunehmend die Aufmerksamkeit von Forschern auf sich gezogen11. Menschliche Fäkalien, die häufig als Bioproben für die Untersuchung von BEVs verwendet werden und überwiegend aus Darmbakterien stammen, enthalten unter anderem eine komplexe Mischung aus Wasser, Bakterien, Lipiden, Proteinen, unverdauten Nahrungsresten und abgeblätterten Epithelzellen. Die komplizierte Zusammensetzung der Fäkalien stellt eine Herausforderung für die Isolierung und Reinheit von BEVs dar und erschwert so eine umfassende, objektive und realistische Analyse von BEVs. Daher haben sich wirksame Strategien zur Minimierung von Störungen durch kontaminierende Komponenten und zur Steigerung der Ausbeute von BEVs als kritische Themen herausgestellt, die sofortige Aufmerksamkeit erfordern.
Bestehende Isolationsstrategien stützen sich weitgehend auf Techniken wie Ultrahochgeschwindigkeitszentrifugation (UC), Dichtegradientenzentrifugation (DGC) und Größenausschlusschromatographie (SEC)12,13,14,15,16,17. Derzeit ist DGC eine der am weitesten verbreiteten Methoden im Bereich der BEV-Trennung, die zwei Sedimentations-Schwimmmodi umfasst, "Top-down" und "Bottom-up", die durch die anfängliche Belastungsposition der Probe bestimmt werden. Diese Methoden unterscheiden extrazelluläre Vesikel (EVs) von anderen Komponenten auf der Grundlage von Größen- und Dichteunterschieden, was zu unterschiedlichen Reinheiten und Wiederfindungsraten führt. Frühere Forschungen haben gezeigt, dass Single-Approach-Strategien nicht ausreichen, um EVs angemessen von löslichen Proteinen in Körperflüssigkeitsproben wie Lipoprotein im Blut18 und Tamm-Horsfall-Protein im Urin19 zu trennen. Darüber hinaus überschneidet sich die Größenverteilung von eukaryotischen extrazellulären Vesikeln (EEVs) oft mit der von BEVs, was weitere methodische Verbesserungen zur Optimierung der BEV-Ausbeute erforderlich macht. Folglich hängt die Weiterentwicklung der Erforschung von BEVs von der Entwicklung effektiver Trenn- und Reinigungsmethoden ab. Bemerkenswert ist, dass Tulkens etal. 15 eine orthogonale biophysikalische Strategie zur Trennung von fäkalen BEVs von EEVs verwendeten, bei der die Zentrifugationszeit eines Bottom-up-DGC-Modus bis zu 18 h betrug. Im Gegensatz dazu reduzierte diese Studie sie auf 7 Stunden, was die Gradienten-Ultrazentrifugationszeit erheblich spart und den Prozess vereinfacht.
In der vorliegenden Studie haben wir fäkale BEVs unter Verwendung von zwei DGC-Modi unter optimierten Pufferbedingungen isoliert und gereinigt, nachdem wir BEVs mit einer Reihe von unterschiedlichen Zentrifugationsgeschwindigkeiten angereichert hatten, von niedriger bis extrem hoher Geschwindigkeit. Auswertungen auf der Grundlage von Morphologie, Partikelgröße und Konzentration zeigten eine lobenswerte Leistung dieser verbesserten Methode. Diese Studie könnte als Grundlage für zukünftige Forschungen dienen, ihre Anwendungen auf einen breiteren Bereich ausdehnen und Einblicke in die Heterogenität von BEVs im menschlichen Körper bieten. Es trägt auch zur Standardisierung von BEV-Trenn- und Analysetechniken bei.
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Protocol
Die Ethikkommission des Nanfang Krankenhauses der Southern Medical University genehmigte diese Studie, die mit der informierten Zustimmung der Teilnehmer durchgeführt wurde. Alle hier verwendeten Methoden entsprechen den Standard-Betriebsrichtlinien der International Human Microbiome Standards (IHMS: http://www.microbiome-standards.org/). Alle nachfolgenden Liquid-Handling-Verfahren mussten in einer Biosicherheitswerkbank oder einer Reinstbank durchgeführt werden.
1. Entnahme und Aliquotierung von Kotproben
- Verteilen Sie einen Stuhlprobenehmer, einen versiegelten Beutel und eine Eisbox und geben Sie den Teilnehmern umfassende Anweisungen zur Beschaffung und Konservierung der Proben.
- Weisen Sie jeden Teilnehmer an, seine Kotprobe mit dem bereitgestellten Probenehmer zu entnehmen und innerhalb eines 24-Stunden-Fensters bei einer Temperatur von 4 °C ins Labor zu transportieren.
- Nach Erhalt im Labor mit einem sterilen Löffel weniger als 3,5 g Kot in ein vorgewogenes 50-ml-Zentrifugenröhrchen aliquotieren. Notieren Sie das Gewicht der Kotprobe auf dem Röhrchen für nachfolgende Vorbehandlungsverfahren.
PAUSENPUNKT: Wenn eine sofortige Verarbeitung der Proben nicht möglich ist, weisen Sie die Probe nach entsprechender Notation für die Langzeitlagerung bei -80 °C zu.
2. Vorbereitung der Kotproben
- 500 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) bei 4 °C kalt stellen. Filtrieren Sie das vorgekühlte PBS durch einen 0,22 μm Polyethersulfon (PES)-Filter mit einer 50-ml-Spritze in zehn 50-ml-Zentrifugationsröhrchen.
- Positionieren Sie zwei 50-ml-Röhrchen mit jeweils 3,5 g Kotproben auf Eis. Geben Sie 35 ml PBS in jedes Röhrchen.
HINWEIS: Berechnen Sie die erforderliche Menge an PBS für die Stuhlauflösung und stellen Sie eine maximale Probenkonzentration von 10 % (w/v) sicher. Wenn Sie zusätzliche Proben verarbeiten, verwenden Sie bei Bedarf mehr Röhrchen. - Schütteln Sie die Proben bei 300 U/min für 2 h bei 4 °C oder legen Sie sie für 8 h mindestens bei 4 °C, bis der Kot vollständig sichtbar suspendiert ist.
3. Zentrifugation mit unterschiedlicher Drehzahl
- Die gekühlte Hochgeschwindigkeitszentrifuge auf 4 °C abkühlen.
- Das Gewicht der beiden Röhrchen mit den in Schritt 2.3 mit PBS vorbereiteten Proben wird so eingestellt, dass ein Gesamtgewicht von 0,1 g erreicht wird.
- Die Proben werden bei 3.000 × g für 20 min bei 4 °C zentrifugiert.
- Pipettieren Sie den Überstand vorsichtig in zwei saubere 50-ml-Zentrifugenröhrchen, wobei Sie etwa 1 ml über dem Pellet lassen. Verwenden Sie für diesen Vorgang eine Einweg-Pasteurpipette aus Kunststoff.
- Passen Sie das Gewicht der beiden Röhrchen mit PBS an, um ein Gesamtgewicht innerhalb von ± 0,1 g zu erreichen.
- Der überführte Überstand wird bei 12.000 × g für 30 min bei 4 °C zentrifugiert.
- Saugen Sie den Überstand mit einer 20-ml-Spritze an, entfernen Sie die Spritzennadel und filtrieren Sie ihn durch 0,22-μm-Filter in 50-ml-Röhrchen. Zu diesem Zeitpunkt sollte das überstehende Volumen etwa 30 ml betragen.
HINWEIS: Wenn nach der Zentrifugation von 12.000 × g immer noch eine signifikante Menge an Verunreinigungen sichtbar ist, muss der Zentrifugationsschritt bei 12.000 × g für 30 min bei 4 °C wiederholt werden. Andernfalls kann es zu einem erheblichen Verlust von BEVs aufgrund von Porenverstopfungen während der Filtration kommen.
4. Ultra-Hochgeschwindigkeits-Zentrifugation
- Reinigen Sie den Rotor und die Schaufel, indem Sie sie mit 75%igem Alkohol (v/v) abwischen, um alle verbleibenden Verunreinigungen zu entfernen.
- Positionieren Sie ein 38,5-ml-Ultrazentrifugenröhrchen im Röhrchenhalter.
HINWEIS: Wählen Sie das geeignete Ultrazentrifugenröhrchen basierend auf dem Probenvolumen aus. Vermeiden Sie ultraviolette Strahlung und ungeeignete chemische Reagenzien für die Sterilisation von Zentrifugalröhrchen, wie im Produkthandbuch angegeben. - Etwa 30 ml des filtrierten Stuhlüberstandes aus Schritt 3.7 in das Ultrazentrifugenröhrchen überführen.
- Füllen Sie das Ultrazentrifugenröhrchen mit ca. 8 ml PBS und lassen Sie dabei einen Abstand von 3 mm von der Öffnung des Röhrchens.
- Platzieren Sie die beiden Ultrazentrifugenröhrchen mit den Proben in gegenüberliegenden Ultrazentrifugationsbehältern, z. B. entspricht Eimer 1 4 (1-4), 2-5, 3-6.
- Passen Sie das Gewicht der beiden Eimer mit PBS an, um ein Gesamtgewicht innerhalb von ± 0,005 g zu erreichen.
- Montieren Sie alle Schaufeln auf dem Rotor, unabhängig davon, ob die Rohre beladen sind.
- Das Vakuum wird eingeleitet und die Proben bei 160.000 × g für 70 min bei 4 °C zentrifugiert.
- Lassen Sie das Kammervakuum los und öffnen Sie die Tür, sobald Bereit auf der Startseite des Geräts angezeigt wird.
- Entfernen Sie den Rotor aus der Ultrazentrifuge.
- Bewegen Sie die Eimer vom Rotor zum Gestell und entnehmen Sie die Röhrchen mit einer Zange.
- Entsorgen Sie den Überstand, der am Boden sichtbare braune Pellets enthält.
- Resuspendieren Sie die Pellets, indem Sie sie wiederholt mit einer 1.000-μl-Pipette mit 1 ml vorgekühltem (4 °C) PBS auf und ab pipettieren, bis sie vollständig suspendiert sind. Füllen Sie das Röhrchen mit ca. 37 ml PBS und lassen Sie dabei einen Abstand von 3 mm von der Öffnung.
- Führen Sie eine weitere Ultrazentrifugation gemäß den Schritten 4.5-4.11 bei 160.000 × g für 70 min bei 4 °C durch, um teilweise anhaftende kontaminierende Komponenten von den Röhrchenwänden zu entfernen.
- Entsorgen Sie den Überstand, drehen Sie die beiden Ultrazentrifugenröhrchen 5 Minuten lang um und entfernen Sie die Restlösung an der Innenwand mit Wischtüchern.
HINWEIS: Die Reinigung der Innenwand minimiert die Beeinträchtigung durch Restverunreinigungen, die an der Wand des Ultrazentrifugenröhrchens haften. Wählen Sie Abstreifer, die die BEV-Analyse nicht beeinflussen, insbesondere in Bezug auf die Partikelgröße. - Resuspendieren Sie die Pellets in jedem Röhrchen, indem Sie sie mit 1,2 ml vorgekühltem (4 °C) PBS mit einer 1.000-μl-Pipette auf und ab pipettieren.
- 1,2 ml der PBS/BEV-Lösung aus einem Ultrazentrifugenröhrchen in ein sauberes 1,5-ml-Mikroröhrchen überführen.
PAUSENPUNKT: Die PBS/BEV-Lösung, die aus einem Ultrazentrifugenröhrchen entnommen wurde, kann mit Schritt 6 fortfahren. Lagern Sie die Lösung aus dem anderen Röhrchen bei -80 °C.
5. Lösungsvorbereitung für die Dichtegradientenzentrifugation
- Herstellung von 0,02 M HEPES-Puffer
- Kombinieren Sie 0,477 g HEPES-Pulver und 0,8 g NaCl mit 90 ml autoklaviertem deionisiertem Wasser.
- Stellen Sie den pH-Wert auf 7,2 ein, indem Sie 1 M Natriumhydroxid (NaOH) hinzufügen. Bringen Sie das Volumen mit deionisiertem Wasser auf 100 ml und filtern Sie die Lösung durch 0,22 μm PES-Membranen.
ACHTUNG: Natriumhydroxid ist ein stark ätzendes Alkali. Die Bediener müssen es sorgfältig in einem Abzug handhaben und zubereiten.
- Herstellung von Dichtegradientenpuffer
- Berechnen Sie das erforderliche Volumen jedes Dichtegradientenpuffers basierend auf der Anzahl der Ultrazentrifugenröhrchen für die Dichtegradientenzentrifugation (Schritt 6) (In diesem Protokoll betrugen die Volumina für 60 %, 50 %, 40 %, 20 % und 10 % Gradientenlösungen 2,5 ml, 3 ml, 6 ml, 6 ml bzw. 6 ml).
- Für die Herstellung einer 50%igen (w/v) Iodixanol-Arbeitslösung wird der 0,02 M HEPES-Puffer und die 60%ige (w/v) Iodixanol-Stammlösung in einem Volumenverhältnis von 1:5 (0,5 ml:2,5 ml) gemischt.
HINWEIS: Verwenden Sie eine 20-ml-Einwegspritze, um die Iodixanol-Stammlösung zu entnehmen und das Einbringen von Luft zu vermeiden. - Um Iodixanolpuffer mit unterschiedlichen Konzentrationen herzustellen, wird die 50%ige Iodixanol-Arbeitslösung aus Schritt 5.2.2 mit dem in Schritt 5.1 erhaltenen HEPES-Puffer unter Verwendung einer 1.000-μl-Pipette gemäß den in Tabelle 1 angegebenen Anteilen kombiniert.
HINWEIS: Führen Sie Schritt 5 auf einer ultrareinen Bank bei ausgeschaltetem Licht durch. Lagern Sie die geöffnete Iodixanol-Stammlösung im Kühlschrank bei 4 °C, um Bakterienwachstum zu verhindern. Bewahren Sie die Iodixanollösung und den HEPES-Puffer lichtgeschützt auf.
6. Etablierung eines Dichtegradientenzentrifugationssystems
- Top-Down-DGC-Modus
- Kombinieren Sie 500 μl PBS/BEV-Lösung, isoliert aus Schritt 4, mit 3 ml PBS. Mischen Sie die Lösungen vorsichtig mit einer 1.000-μl-Pipette, um 3,5 ml PBS/BEV-Lösung zu erhalten.
- Stellen Sie ein 31-ml-Ultrazentrifugenröhrchen auf eine Schaumstoffplatte mit Löchern und beschriften Sie es mit "↓".
- Geben Sie 3 ml der 50%igen Iodixanollösung mit einer 1.000-μl-Pipette vertikal auf den Boden des Röhrchens.
- Kippen Sie das Rohr in einen Winkel von 70° und positionieren Sie einen Röhrchenhalter oder eine andere Halterung etwas oberhalb der Höhe der Schaumstoffplatte, unterhalb der Öffnung des Rohrs.
- Mit einer 1.000-μl-Pipette 3 ml 40%ige Iodixanollösung auf die 50%ige Iodixanollösung geben.
- Mit einer 1.000-μl-Pipette 3 ml 20%ige Iodixanollösung auf die 40%ige Iodixanollösung geben.
- Mit einer 1.000-μl-Pipette 3 ml 10%ige Iodixanol-Lösung auf die 20%ige Iodixanol-Lösung geben.
- Mit einer 1.000-μl-Pipette werden 3,5 ml PBS/BEV-Lösung aus Schritt 6.1.1 auf die 10%ige Iodixanollösung gegeben.
- Bringen Sie die Röhrchen vorsichtig wieder in eine aufrechte Position.
HINWEIS: Nach dem Pipettieren sollte die Schichtung sichtbar sein.
- DGC-Modus von unten nach oben
- Stellen Sie ein 31-ml-Ultrazentrifugenröhrchen auf eine Schaumstoffplatte mit Löchern und beschriften Sie es mit "↑".
- Geben Sie 2,5 ml der 60%igen Iodixanol-Stammlösung vertikal auf den Boden des Röhrchens. Mischen Sie es vorsichtig mit 500 μl PBS/BEV-Lösung, die aus Schritt 4 isoliert wurde, mit einer 1.000-μl-Pipette, um 3 ml 50%ige Iodixanol/BEV-Lösung zu erhalten.
- Kippen Sie das Rohr in einen Winkel von 70° und positionieren Sie einen Röhrchenhalter oder eine andere Halterung etwas oberhalb der Höhe der Schaumstoffplatte, unterhalb der Öffnung des Rohrs.
- Mit einer 1.000-μl-Pipette werden 3 ml der 40%igen Iodixanol-Lösung auf die 50%ige Iodixanol/BEV-Lösung gegeben.
- Mit einer 1000-μl-Pipette werden 3 ml der 20%igen Iodixanollösung auf die 40%ige Iodixanollösung gegeben.
- Mit einer 1000-μl-Pipette werden 3 ml der 10%igen Iodixanol-Lösung auf die 20%ige Iodixanol-Lösung gegeben.
- Mit einer 1.000-μl-Pipette 3,5 ml PBS auf die 10%ige Iodixanollösung geben.
- Bringen Sie die Röhrchen vorsichtig wieder in eine aufrechte Position.
- Zu diesem Zeitpunkt waren noch 200 μl der in Schritt 4.17 erhaltenen Suspension übrig, die anschließend als Gruppe mit der Bezeichnung "UC" analysiert werden können.
HINWEIS: Halten Sie beim Umfüllen von Lösungen in Schritt 6 die Pipettenspitze immer senkrecht zur Achse des Röhrchens an der Wand des Ultrazentrifugenröhrchens.
7. Dichtegradientenzentrifugation und Fraktionssammlung
- Passen Sie das Gewicht der beiden Röhrchen mit PBS an, um ein Gesamtgewicht innerhalb von ± 0,005 g zu erreichen.
- Die Röhrchen werden gemäß Schritt 4.5 in die Eimer gegeben und bei 160.000 × g für 7 h bei 4 °C zentrifugiert.
- Sammeln Sie die Fraktionen mit einer Pipette (1000 μl) von oben nach unten an der Seitenwand in der folgenden Reihenfolge: 3 ml, 2 ml, 1 ml, 1 ml, 1 ml, 1 ml, 1 ml, 1 ml, 1 ml, 1,5 ml und 3 ml in ein 38,5-ml-Ultrazentrifugenröhrchen.
HINWEIS: Halten Sie die Sichtlinie auf der gleichen Höhe wie die Flüssigkeitsoberfläche. - Die Ultrazentrifugation für jede in Schritt 7.3 erhaltene Fraktion wird gemäß Schritt 4 bei 160.000 × g für 70 min bei 4 °C durchgeführt.
- Entfernen Sie den Überstand und drehen Sie die Ultrazentrifugenröhrchen für 5 Minuten um.
- Resuspendieren Sie die Pellets mit einer 200-μl-Pipette in 200 μl vorgekühltem (4 °C) PBS.
- Überführen Sie die PBS/BEV-Lösung in ein sauberes 1,5-ml-Mikroröhrchen.
- Beschriften Sie die Brüche von F1 bis F10 und analysieren Sie sie basierend auf Schritt 8.
PAUSENPUNKT: Wenn die in Schritt 7.8 gewonnenen Proben nicht sofort verarbeitet werden können, lagern Sie sie bei -80 °C.
8. Charakterisierung und quantitative Analyse der gesammelten Fraktionen
- Bestimmen Sie die Absorptionswerte (OD 340 nm) jeder Fraktion mit einem Mikroplattendetektor mit einer Blindkontrolle, um die entsprechende Dichte zu berechnen.
HINWEIS: Ersetzen Sie die PBS/BEV-Lösung (Schritt 6.1.1 und Schritt 6.2.2) durch PBS, um ein leeres Steuerelement einzurichten.- Bereiten Sie jeweils 100 μl 0-, 5-, 10-, 12,5- und 20%ige Iodixanollösung, verdünnt mit 0,02 M HEPES, basierend auf 50%iger Stammlösung (Schritt 5.2.2) als Standards vor, entsprechend Dichten von 1,0058 g/ml, 1,0318 g/ml, 1,058 g/ml, 1,0708 g/ml bzw. 1,111 g/ml.
- Fügen Sie 50 μl jeder Fraktion aus der Blindkontrolle (vorbereitet in Schritt 7.3) und 50 μl jeder Standardlösung (hergestellt in Schritt 8.1.1) hinzu, um die Vertiefungen einer 96-Well-Platte zu duplizieren.
- Stellen Sie die Wellenlänge auf 340 nm ein, messen Sie die optische Dichte des Endpunkts und berechnen Sie die Dichte jeder Fraktion.
- Identifizieren Sie F4-F9 als den Bereich der BEV-Fraktionen basierend auf ihrer Dichte.
- Bestimmen Sie die Proteinkonzentration der BEV-Fraktionen mit dem Bicinchoninsäure-Assay (BCA).
- Verdünnen Sie die Substanz in PBS des Herstellers um das Zehnfache, um eine 0,5 μg/μl Standardproteinlösung herzustellen.
- Die Standardproteinlösung (hergestellt in Schritt 8.2.1) wird mit unterschiedlichen Volumina gemäß den Reagenzanweisungen zugegeben und jede Vertiefung einer 96-Well-Platte mit PBS zu einem Gesamtvolumen von 20 μl ergänzt.
- In jede Vertiefung werden 20 μl der in Schritt 7.8 vorbereiteten Proben und der nach der in Schritt 6.2.9 definierten UC verbleibenden Proben gegeben.
- Mischen Sie die Reagenzien A und B in einem Verhältnis von 50:1 und geben Sie 200 μl in jede Vertiefung.
- Die Platte im 37 °C warmen Wasserbad 30 min inkubieren.
- Messen Sie den Absorptionswert mit einem Mikroplatten-Reader, berechnen Sie die Proteinkonzentration (μg/μl) und bestimmen Sie den Proteingehalt (μg) der Proben auf der Grundlage der Standardkurve (x: optische Dichte; y: Proteinkonzentration), die aus den Werten der in Schritt 8.2.2 verdünnten Standardlösungen generiert wird.
- Charakterisierung der in Schritt 8.1.4 definierten BEV-Fraktionen mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), um das Vorhandensein von BEVs zu überprüfen. Alle folgenden Verfahren sollten auf Eis durchgeführt werden.
- Tragen Sie 10 μl jeder isolierten F4-F9-Fraktion aus Schritt 7.8 und die nach der in Schritt 6.2.9 definierten UC verbleibenden Proben 20 Minuten lang auf Formvar/Carbon-gestützte Kupfergitter auf und tupfen Sie sie mit Filterpapier ab.
- Spülen Sie die Proben dreimal für jeweils 1 Minute mit 100 μl PBS ab und tupfen Sie sie mit Filterpapier ab.
- Fixieren Sie die Proben mit 100 μl 1%igem Glutaraldehyd für 5 Minuten und tupfen Sie sie mit Filterpapier ab.
- Waschen Sie die Gitter zehnmal für jeweils 2 Minuten mit 100 μl PBS und tupfen Sie sie mit Filterpapier ab.
- Färben Sie die Gitter 10 Minuten lang mit 50 μl 1,5 % (w/v) Uranylacetat und tupfen Sie sie mit Filterpapier ab.
ACHTUNG: Uranylacetat ist radioaktiv und extrem giftig, wenn es mit der Haut in Berührung kommt oder eingeatmet wird. Behandeln Sie Lösungen mit Uranylacetat in einem Abzug und befolgen Sie die entsprechenden Sicherheitsmaßnahmen. - Die Gitter für 5 min auf einen 1%igen (w/v) Methylcellulosetropfen geben und mit Filterpapier abtupfen.
- Lagern Sie die luftgetrockneten Gitter bis zur Beobachtung in einer dunklen, staubfreien Umgebung.
- Erfassen Sie Bilder und analysieren Sie sie mit einem TEM.
- Charakterisieren Sie die in Schritt 8.1.4 definierten BEV-Fraktionen mithilfe der Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA), um die Anzahl der Partikel zu zählen.
- Kalibrieren Sie das System mit 110-nm-Polystyrolpartikeln.
- Waschen Sie den Probenpool mit PBS.
- Die Proben aus verschiedenen Fraktionen, die in Schritt 7.8 entnommen wurden, und die Proben, die nach der in Schritt 6.2.9 definierten UC übrig geblieben sind, werden auf eine Konzentration im Bereich von 105 bis 109 Partikel/ml mit einer optimierten Konzentration von 107 Partikeln/ml verdünnt.
- Aufzeichnen und Analysieren an 11 Positionen mit drei Wiederholungen, wobei die Temperatur bei etwa 23-30 °C gehalten wird.
- Analysieren Sie die Proteingehalte der Proben mittels Coomassie-Brillantblau-Färbung (CBBS) und Western Blotting (WB).
- Die BEV-Proben aus verschiedenen Fraktionen, die in Schritt 7.8 erhalten wurden, und die Proben, die nach der in Schritt 6.2.9 definierten UC übrig geblieben sind, werden unter Verwendung von PBS und 5 × Ladepuffer auf eine Endkonzentration von 0,5 oder 1 μg/μl verdünnt, falls eine Quantifizierung erforderlich ist, wobei eine ausreichende Probenbeladung von 20 μl (10 μg oder 20 μg) jeder Vertiefung in Schritt 8.5.2 sichergestellt wird. Die Proben werden bei 95 °C für 10 min gekocht.
- Montieren Sie das vorgefertigte Polyacrylamid-Gel in den Elektrophoresetank und überführen Sie die Proben in die Vertiefungen.
- Führen Sie eine vertikale Elektrophorese mit folgenden Parametern durch: 160 V für 50 min.
- Färben Sie das Gel 1 Stunde lang in Coomassie-Brillantblaulösung, spülen Sie es in deionisiertem Wasser ab, bis sich der blaue Hintergrund aufhellt, und nehmen Sie Bilder mit einer Kamera auf.
- Durchführen von Protein-Blotting-Verfahren für andere Gele mit den folgenden Parametern: 400 mA für 20 min.
- Blockieren Sie die Blotting-Membranen mit einer 5%igen (w/v) BSA-Lösung für 1 h bei Raumtemperatur.
- Waschen Sie die Membranen dreimal im TBST-Puffer für jeweils 5 Minuten.
- Inkubieren Sie die Membranen mit Primärantikörpern (BEV-Marker: LPS, OmpA, LTA; EEV-Marker: CD63, CD9, TSG-101, Syntenin, Integrin β1; Andere Kontaminationsmarker: Flagellin, Calnexin) für 8-12 h bei 4 °C.
- Waschen Sie die Membranen dreimal im TBST-Puffer für jeweils 10 Minuten.
- Inkubieren Sie die Membranen mit Sekundärantikörpern für 1 h bei Raumtemperatur.
- Führen Sie Schritt 8.5.9 aus.
- Entwickeln Sie das Blotting mit einer Chemilumineszenz-Apparatur.
- Ersetzen Sie PBS/BEV-Lösung (Schritt 6.1.1 und Schritt 6.2.2) durch BEVs aus Escherichia coli, um eine Positivkontrolle herzustellen (siehe Materialtabelle für das Verfahren zur Isolierung von rohen E. coli-BEVs), und führen Sie alle oben genannten Experimente zur Charakterisierung von BEVs durch.
PAUSENPUNKT: Bestimmen Sie F6-F8 als Verteilung der BEV-angereicherten Fraktionen basierend auf den Ergebnissen der oben beschriebenen Charakterisierung für fäkale BEVs und verwenden Sie diesen eingeengten Bereich für die anschließende Analyse.
- Berechnen Sie die Rückgewinnungsraten in Bezug auf Partikel und Proteine, um die Effizienz der beiden DGC-Modi zu bewerten. Die folgenden Ergebnisse sind in Prozent angegeben.
- Berechnen Sie die Rückgewinnungsraten von Partikeln im Top-Down-Modus: Gesamtpartikel in F6-F8/Partikel nach UC, die in Schritt 6.2.9 definiert wurden.
- Berechnen Sie die Rückgewinnungsraten von Partikeln im Bottom-up-Modus: Gesamtpartikel in F6-F8/Partikel nach UC definiert in Schritt 6.2.9.
- Berechnen Sie die Wiederfindungsraten von Proteinen im Top-Down-Modus: Gesamtproteingehalte in F6-F8 (μg)/Proteingehalt nach UC definiert in Schritt 6.2.9 (μg).
- Berechnen Sie die Wiederfindungsraten von Proteinen im Bottom-up-Modus: Gesamtproteingehalt in F6-F8 (μg)/Proteingehalt nach UC definiert in Schritt 6.2.9 (μg).
- Berechnen Sie das Partikel-Protein-Verhältnis, um die Reinheit zu bewerten, die traditionell für UC und die beiden DGC-Modi definiert ist, und die folgenden Ergebnisse wurden alle als Prozentsätze dargestellt.
- Partikel/Protein-Verhältnis nach UC definiert in Schritt 6.2.9: Partikel nach UC/Proteingehalt nach UC (μg).
- Partikel/Protein-Verhältnis im Top-Down-Modus: Gesamtpartikel in F6-F8/Proteingehalt in F6-F8 (μg).
- Partikel/Protein-Verhältnis im Bottom-up-Modus: Gesamtpartikel in F6-F8/Proteingehalt in F6-F8 (μg).
- Wählen Sie den am besten geeigneten Zentrifugationsmodus (im Protokoll wurde der Top-Down-Modus ausgewählt) für die fäkale BEV-Aufreinigung und zukünftige Analyse.
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Representative Results
Bestimmung der Verteilung von BEV-angereicherten Fraktionen
Um die Verteilung der mit bakteriellen extrazellulären Vesikeln (BEVs) angereicherten Fraktionen zu bestimmen, wurde eine Blindkontrolle zur Messung der Absorptionswerte bei OD 340 nm etabliert und die Dichte jeder Fraktion basierend auf den Messungen und den Iodixanol-Richtlinien berechnet (Schritt 8.1). Tabelle 2 zeigt die Dichteergebnisse, die zeigen, dass die Fraktionen F4 bis F9 Dichten innerhalb des Bereichs aufwiesen, der typischerweise mit extrazellulären Vesikeln assoziiert ist. Dieser Befund deutete darauf hin, dass die Mehrheit der BEVs in diesen Fraktionen isoliert war, was zur Definition von F4-F9 als grober Bereich für BEVs führte. Die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) wurde eingesetzt, um die morphologischen Merkmale von fäkalen BEVs zu charakterisieren, die wie in Abbildung 1 in den Fraktionen F4-F9 isoliert wurden. Die TEM-Bilder (Abbildung 2) zeigten das Vorhandensein klassischer becherförmiger Strukturen, die für BEVs charakteristisch sind. Die Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) und der Bicinchoninsäure-Assay (BCA) wurden durchgeführt, um die Partikelanzahl bzw. die Proteinkonzentration zu bestimmen, was eine weitere Bewertung der Wiederfindungsraten und der Reinheit ermöglichte. Abbildung 3 zeigt die Protein- und Partikelkonzentrationen für jede Fraktion und zeigt, dass F6 und F7 die höchsten Konzentrationen aufwiesen, gefolgt von F5 und F8. Anschließend wurden Coomassie Brilliant Blue Staining (CBBS) und Western Blot (WB) durchgeführt, um eine Gesamtproteinanalyse zu ermöglichen. Die Ergebnisse von CBBS stimmten mit den Ergebnissen der Proteinkonzentration überein, wobei F6 und F7 die intensivsten Banden aufwiesen (Abbildung 4). Um die Verteilung der BEVs zu bestätigen, wurden extrazelluläre Vesikel, die von Escherichia coli abgeleitet wurden, als Positivkontrolle verwendet (definiert in Schritt 8.5.13). Die Isolierungs- und Reinigungsverfahren folgten den Schritten, die in der Materialtabelle und den oben genannten Protokollabschnitten (Schritte 3, 4) beschrieben sind. Die WB-Analyse bestätigte außerdem das Vorhandensein des äußeren Membranproteins A (OmpA), eines Hauptbestandteils der äußeren Membran von Bakterien und eines spezifischen Markers für BEVs, in den Fraktionen F6-F8. Basierend auf diesen Ergebnissen wurden die Fraktionen F6-F8 als BEV-angereicherte Fraktionen definiert, die für nachfolgende Experimente und Analysen geeignet sind.
Überprüfung des Darstellungsbereichs der Störkomponenten
Eukaryotische extrazelluläre Vesikel (EEVs), die eine ähnliche Größe und Dichte wie BEVs besitzen, wurden als wesentliche Interferenz bei der Analyse von BEVs identifiziert. Um dies zu adressieren, wurden drei EEV-Proteine in den Fraktionen 5-8 sowohl im Top-down- als auch im Bottom-up-Modus untersucht, mit Zentrifugationszeiten von 7 h und 15 h. CD63, ein EEV-assoziiertes Transmembranprotein, wurde hauptsächlich in F5 nachgewiesen, während der BEV-Marker LPS in den Fraktionen 6-7 angereichert war. Dieses Muster wurde in beiden Modi beobachtet, obwohl der Bottom-up-Modus eine leichte Streifenbildung von CD63-EEVs in F7 zeigte. Andere EEV-Marker, CD9 und TSG-101, zeigten jedoch keine sichtbaren Signale in diesen Fraktionen, unabhängig von den Modi oder Zentrifugationszeiten. In einem unabhängigen experimentellen Unterfangen wurden Antikörper gegen Syntenin und Integrin β1 eingesetzt, um die Anreicherung verschiedener Proteinmarker zu bestimmen, die EEVs über die Fraktionen 5-8 hinweg innewohnen. Syntenin wurde in F5 deutlich nachgewiesen, insbesondere im Rahmen des Top-down-Ansatzes, während das Vorhandensein von Integrin β1 innerhalb von F6 festgestellt wurde (Abbildung 5). Um das Vorhandensein von störenden Partikeln weiter zu beurteilen, wurde Dil-markiertes Low-Density-Lipoprotein (Dil-LDL) in das Dichtegradientensystem eingeführt und die Fluoreszenzintensität über alle Fraktionen hinweg gemessen. Im Top-down-Modus wiesen die Fraktionen 1-4 relativ höhere Fluoreszenzwerte auf, während im Bottom-up-Modus F1-F6 höhere Intensitäten aufwiesen (Abbildung 6).
Bewertung der Rückgewinnungsraten und Reinheit von zwei DGC-Modi anhand von Konzentration, Partikelgröße und Markern von BEVs
Nach der Identifizierung der F6-F8-Fraktionen als BEV-angereicherte Fraktionen wurden die Wiederfindungsraten und die Reinheit der beiden Dichtegradientenzentrifugationsmodi (DGC) bewertet. Die Partikelgrößen von BEV-angereicherten Fraktionen, die allein aus dem Top-down-Modus, dem Bottom-up-Modus und der Ultrazentrifugation (UC) erhalten wurden, wurden verglichen. Die beobachteten Partikelgrößen in beiden Zentrifugationsmodi reichten von 90 bis 300 nm und stimmten mit dem definierten Durchmesser von BEVs überein (Abbildung 7). Als nächstes wurden die Partikel- und Proteinrückgewinnungsraten der beiden Modi basierend auf den Partikel- und Proteinkonzentrationen vor und nach DGC berechnet (Tabelle 3 und Abbildung 8). Bemerkenswert ist, dass der Bottom-up-Modus im Vergleich zum anderen Modus höhere Rückgewinnungsraten aufwies. In einer separaten Versuchsgruppe wurde die Proteinrückgewinnung in den beiden Modi bei unterschiedlichen Zentrifugationszeiten von 7 h und 15 h untersucht. Wichtig ist, dass es keinen statistisch signifikanten Unterschied im Proteingehalt innerhalb der F6-F8-Fraktionen nach DGC zwischen den beiden Zentrifugationszeiten gab, unabhängig vom verwendeten Gradientenmodus (Abbildung 9). Das Partikel-Protein-Verhältnis wurde berechnet, um eine grobe Beurteilung der Reinheit in den beiden Modi zu ermöglichen. Die Daten zeigten keinen signifikanten Unterschied in der Reinheit zwischen den Modi. Zusätzlich wurden Coomassie-Brillantblau-Färbung (CBBS) und Western-Blotting (WB) durchgeführt, um die Reinheit weiter zu vergleichen, wobei der Schwerpunkt auf drei BEV-Markern (LPS, OmpA und LTA), einem EEV-Marker (CD63) und zwei kontaminierenden Markern (Calnexin, Flagellin) lag. Die Ergebnisse zeigten eine partielle Reduktion der störenden Substanzen nach DGC, wobei LPS und OmpA in beiden DGC-Modi eine ausgeprägtere Präsenz zeigten als UC allein (Abbildung 10).
Abbildung 1: Schematischer Ablauf der Isolierung und Reinigung von BEVs. Abkürzungen: BEVs = bakterielle extrazelluläre Vesikel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Repräsentative TEM-Bilder von BEV-Fraktionen. (A) TEM-Bilder von BEVs, die nach UC isoliert wurden. (B) TEM-Bilder von BEVs, die nach DGC im Top-down-Modus isoliert wurden. (C) TEM-Bilder von BEVs, die nach DGC im Bottom-up-Modus isoliert wurden. Alle Bilder wurden in einem konsistenten Maßstab von 200 nm präsentiert. Abkürzungen: TEM = Transmissionselektronenmikroskop; BEVs = bakterielle extrazelluläre Vesikel; UC = Ultrazentrifugation; DGC = Dichtegradientenzentrifugation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Protein- und Partikelkonzentration von BEV-Fraktionen nach Top-down- und Bottom-up-DGC-Modi. Die Proteinkonzentration der BEV-Fraktionen wurde mittels BCA bestimmt und wird durch die grauen Balken dargestellt. Die Partikelkonzentration wurde mittels NTA gemessen und wird durch die blauen Balken dargestellt. Abkürzungen: BEV = bakterielles extrazelluläres Vesikel; DGC = Dichtegradientenzentrifugation; BCA = Bicinchoninsäure-Assay; NTA = Nanopartikel-Tracking-Analyse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Bestimmung von BEV-angereicherten Fraktionen. (A) CBBS wurde durchgeführt, um die mit fäkalen BEVs angereicherten Fraktionen sowohl im Top-down- als auch im Bottom-up-Modus zu bestimmen. (B) EVs, die aus Escherichia coli gewonnen wurden, wurden isoliert, gereinigt und als Positivkontrolle in WB verwendet, um das Vorhandensein und die Verteilung von BEVs zu bestätigen. OmpA: Äußeres Membranprotein A, ein BEV-Marker. Abkürzungen: BEV = bakterielles extrazelluläres Vesikel; CBBS = Coomassie-Brillantblau-Färbung; EVs = extrazelluläre Vesikel; WB = Western Blotting. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Bestätigung der EEV-Verteilung. Western-Blot-Analyse der Fraktionen 5-8 aus den Top-down- und Bottom-up-DGC-Modi mit unterschiedlichen Dichtegradienten-Ultrazentrifugationsdauern, 7 h (A) und 15 h (B). Es wurde eine unabhängige Studie durchgeführt, die sich auf F5 bis F8 konzentrierte, die sich aus einer 7-stündigen Zentrifugationsperiode ergab, wie in (C) und (D) gezeigt. Zu den ausgewählten Markern gehörten solche, die mit BEVs (LPS) und EEVs assoziiert sind (CD63, CD9, TSG-101, Syntenin, Integrin β1). Abkürzungen: DGC = Dichtegradientenzentrifugation; BEV = bakterielles extrazelluläres Vesikel; EEV = eukaryotisches extrazelluläres Vesikel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Verteilung des Low-Density-Lipoproteins. Dil-markiertes Low-Density-Lipoprotein (Dil-LDL), das als Kontaminationsmarker gilt, wurde dem Gradientensystem in einer Konzentration von 10 μg sowohl im Top-down- als auch im Bottom-up-Modus zugesetzt. Dil-LDL ersetzte die PBS/BEV-Lösung (Schritt 6.1.1 und Schritt 6.2.2), um ein Detektionsmodell zu erstellen. Die Fluoreszenzintensität jeder Fraktion wurde mit einem Mikroplattendetektor mit einer Anregungs-/Emissionswellenlänge von 549/565 nm gemessen. Abkürzung: BEV = bakterielles extrazelluläres Vesikel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Partikelgrößen von BEV-angereicherten Fraktionen. (A) Partikelgrößenverteilung von rohen BEVs, die nach UC erhalten wurden. (B) Partikelgrößenverteilung von BEV-angereicherten Fraktionen (F6-F8), die mit der Top-down-Dichtegradientenzentrifugation (DGC) erhalten wurden. (C) Die Partikelgrößenverteilung der mit BEV angereicherten Fraktionen (F6-F8) wurde im Bottom-up-DGC-Modus ermittelt. NTA wurde durchgeführt, um die Abmessungen der Partikel zu quantifizieren. Die Verdünnungsfaktoren, die für die Panels (A-C) verwendet wurden, betrugen 10.000, 2.000 und 5.000, wobei die resultierenden Ergebnisse kalibriert wurden. Abkürzungen: BEV = bakterielles extrazelluläres Vesikel; UC = Ultrazentrifugation; DGC = Dichtegradientenzentrifugation; NTA = Nanopartikel-Tracking-Analyse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 8: Protein- und Partikelrückgewinnungsraten der Top-down- und Bottom-up-DGC-Modi. (A) Proteinrückgewinnungsraten der beiden Modi, berechnet als Verhältnis der Proteinkonzentration nach und vor DGC (UC). (B) Die Partikelrückgewinnungsraten der beiden Modi werden durch das Verhältnis der Partikelkonzentration nach und vor DGC (UC) berechnet. (C) Partikel-Protein-Verhältnisse der UC-, Top-down- und Bottom-up-Modi. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Die statistische Analyse wurde mit einem zweiseitigen, ungepaarten t-Test für die Panels A und B und einer unidirektionalen Varianzanalyse (ANOVA) mit dem Tukey-Post-hoc-Test für Panel C durchgeführt. Es wurden keine signifikanten Unterschiede beobachtet. Abkürzungen: DGC = Dichtegradientenzentrifugation; UC = Ultrazentrifugation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 9: Vergleich der Proteinrückgewinnung basierend auf Top-down- und Bottom-up-DGC-Modi unter Verwendung unterschiedlicher dichteassoziierter Ultrazentrifugationszeiten. Die Proteinrückgewinnungsraten in den Fraktionen F6-F8, die durch Gradientenultrazentrifugation für 7 h und 15 h erhalten wurden, wurden in unabhängigen Experimenten sowohl im Top-down- als auch im Bottom-up-Modus bewertet. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Die statistische Analyse wurde mit Hilfe der Zwei-Wege-Varianzanalyse (ANOVA) mit dem Fisher-Test der geringsten signifikanten Differenz durchgeführt. Es wurden keine signifikanten Unterschiede beobachtet. Abkürzungen: DGC = Dichtegradientenzentrifugation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 10: Reinheitsbewertung von Top-down- und Bottom-up-DGC-Moden. (A) CBBS wurde durchgeführt, um die Proteinverteilung von UC-, Top-down- und Bottom-up-Modi zu vergleichen. (B) WB wurde durchgeführt, um die Reinheit von UC-, Top-down- und Bottom-up-Modi zu bewerten. Calnexin: endoplasmatischer Retikulum-assoziierter Proteinmarker; Flagellin, kontaminierender Proteinmarker von Bakterien. CD63: Transmembranproteinmarker für eukaryotische extrazelluläre Vesikel; LTA: BEV-Marker aus grampositiven Bakterien; LPS, OmpA: BEV-Marker von gramnegativen Bakterien. Abkürzungen: DGC = Dichtegradientenzentrifugation; UC = Ultrazentrifugation; CBBS = Coomassie Brilliant Blue Färbung; WB = Western Blotting. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Konzentration der Iodixanollösung (%) | 0,02 M HEPES-Puffer | 50% Iodixanol Arbeitslösung |
| 40 | 1 | 4 |
| 20 | 3 | 2 |
| 10 | 4 | 1 |
Tabelle 1: Verhältnisse für die Herstellung von Iodixanol-Dichtegradientenpuffern. Die Tabelle lieferte das Verhältnis von 0,02 M HEPES-Puffer und 50%iger Iodixanol-Arbeitslösung, um eine bestimmte Konzentration von Iodixanollösung zu erhalten.
| Formel 1 | F2 | F3 | F4 | F5 | F6 | F7 | F8 | F9 | F10 | |
| Dichte (g/ml) | 1.023 | 1.038 | 1.049 | 1.062 | 1.074 | 1.098 | 1.144 | 1.185 | 1.239 | 1.293 |
Tabelle 2: Die Dichte des Dichtegradientenzentrifugationssystems auf Iodixanolbasis. Die Tabelle zeigt die Dichte jeder Fraktion in einem Dichtegradientenzentrifugationssystem auf Iodixanolbasis. Blank Control: PBS-basiertes Gradientensystem.
| Top-Down-Modus | Bottom-up-Modus | |
| Partikel-Rückgewinnungsrate (%) | 24.08 | 35.69 |
| Protein-Rückgewinnungsrate (%) | 24.5 | 32.45 |
Tabelle 3: Die Partikel- und Proteinrückgewinnungsraten von zwei Modi. Die Tabelle zeigt die Partikel- und Proteinrückgewinnungsraten der Top-down- und Bottom-up-Modi (Abbildung 8).
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Discussion
Bakterielle extrazelluläre Vesikel (BEVs) sind Lipid-Doppelschicht-Nanopartikel, die von Bakterien abgesondert werden und eine Fülle von Proteinen, Lipiden, Nukleinsäuren und anderen bioaktiven Molekülen tragen, die zur Vermittlung der funktionellen Wirkungen von Bakterien beitragen20. Es wurde nachgewiesen, dass aus dem Darm gewonnene BEVs an der Entwicklung von Krankheiten wie entzündlichen Darmerkrankungen, Morbus Crohn und Darmkrebs beteiligt sind, den allgemeinen Stoffwechsel beeinflussen und beeinträchtigte kognitive Funktionen vermitteln 4,16,17,20,21,22,23,24,25,26 . Derzeit ist die Gewinnung vollständiger und objektiver biologischer Informationen über BEVs aus Darmbakterien aus menschlichen Proben und Fäkalien noch durch eine Reihe von Faktoren eingeschränkt, unter denen die erste und wichtigste Schlüsselfrage darin besteht, wie BEVs aus der komplexen Wirtsumgebung isoliert werden können.
Die wichtigsten Methoden zur Isolierung von BEVs, wie die Ultrazentrifugation (UC), die Dichtegradientenzentrifugation (DGC) und die Größenausschlusschromatographie (SEC)13,14,15,16,17, haben sowohl Vor- als auch Nachteile. Schwierigkeiten bei der Entfernung einiger störender Substanzen und das Fehlen einheitlicher Betriebsverfahren, die eine realistischere und umfassendere Analyse von BEVs ernsthaft beeinträchtigen, stellen nach wie vor Herausforderungen für den Trennprozess dar. Um die unerwünschten Auswirkungen von Interferenzen zu verringern, haben viele Studien 15,27,28 zwei oder mehr der oben genannten Methoden kombiniert, um die Trennung von BEVs, insbesondere von Körperflüssigkeiten, zu erreichen, aber komplexe Verfahren neigen dazu, die Stabilität der Ergebnisse zu beeinträchtigen. Bei BEVs kann der Dichteunterschied zu anderen Kontaminanten (z. B. Proteinaggregate, Lipidkomponenten, eukaryotische extrazelluläre Vesikel (EEVs)15) heutzutage zu einem spezifischen Mittel der Isolierung werden.
Gegenwärtig hat sich Iodixanol als bevorzugtes Medium für die Dichtegradiententrennung von EVs herauskristallisiert und ersetzt Saccharose aufgrund seiner isotonischen Eigenschaften. Diese Eigenschaften tragen dazu bei, die EV-Morphologie zu erhalten und die Dichteschätzung für jede Fraktion29 zu erleichtern. In Übereinstimmung mit Tulkens et al.15 wurde in unserer Studie eine identische Konzentration für das DGC-System angenommen, wobei Iodixanol bei 50 % (w/v), 40 % (w/v), 20 % (w/v), 10 % (w/v) und 0 % Konzentrationsgradientenschichten verwendet wurde. Der erste Schritt bestand in der Verwendung von HEPES-Puffer zur Herstellung verschiedener Konzentrationen von Iodixanollösungen. Im Vergleich zu Tris(-EDTA)-Saccharosepuffer sorgt eine angemessene Konzentration des HEPES-Puffers dank seiner intrinsischen Eigenschaften für eine langfristige pH-Stabilität innerhalb des Zentrifugationssystems. Gleichzeitig wurde steriler PBS-Puffer in der obersten Schicht des Zentrifugationssystems eingesetzt, nicht nur zum Schutz vor einer möglichen Kontamination durch Bakterien und ihre Metaboliten während der Lösungsherstellung, sondern auch zur Aufrechterhaltung der Konsistenz des Probenpuffers vor und nach der DGC. Dabei wurde das Pellet nach UC mit PBS-Puffer resuspendiert und nach DGC durch PBS ersetzt, um eine vergleichende Analyse der Ergebnisse zu ermöglichen. Darüber hinaus wurde das Volumen jeder Gradientenschicht innerhalb des DGC-Systems auf 3 ml, 3 ml, 3 ml, 3 ml und 3,5 ml für 50 %, 40 %, 20 %, 10 % bzw. 0 % (PBS-Schicht) Iodixanollösungen kalibriert. Diese Strategie trägt dazu bei, einen relativ breiteren Dichtebereich (1,02-1,30 g/ml) zu etablieren, wodurch die Trennung von BEVs von anderen störenden Elementen verbessert werden kann, wodurch die Gradienten auf andere Körperflüssigkeiten mit komplexer Kontamination anwendbar werden.
Es ist wichtig zu betonen, dass einige Phasen des Protokolls entscheidend sind. Insbesondere der in Schritt 2.2 beschriebene Verdünnungsfaktor, bei dem 1 g Fäkalproben mit mindestens 10 ml PBS gemischt werden, ist entscheidend, um eine Übersättigung zu verhindern und experimentelle Ressourcen zu schonen. Unter diesen Bedingungen steigt die Partikel- und Proteinkonzentration im Allgemeinen proportional zur Kotmasse in einer Probe an, vorausgesetzt, die anderen fäkalen Eigenschaften sind konstant. Bei Bedarf können weitere Analysen unter Berücksichtigung von Faktoren wie Konsistenz, Lipoprotein oder Blutgehalt durchgeführt werden. Bei Schritt 3.4 ist Vorsicht geboten, um ein direktes Ausgießen der Lösung zu vermeiden, da dies das Pellet stören und möglicherweise dazu führen kann, dass größere Granulate die Membran des 0,22-μm-Filters verstopfen. Wenn der Filter schnell gesättigt ist (z. B. wenn weniger als 10 ml einen Filter passieren), wird ein zusätzlicher Zentrifugationsschritt bei 12.000 × g empfohlen. Im Rahmen der Dichtegradientenzentrifugation ist die präzise Herstellung von Gradientenlösungen Voraussetzung für zuverlässige Ergebnisse. Darüber hinaus ist eine sorgfältige Manipulation des Röhrchens beim Schichten der oberen Lösungen mit niedriger Dichte unerlässlich, um eine Unterbrechung der Schichtung zu vermeiden, und alle Blasen müssen durch aufmerksames Pipettieren beseitigt werden. Schließlich ist es beim Absaugen der Fraktionen wichtig, sie sorgfältig entlang der Rohrwand abzuziehen und eine Über- oder Unteraspiration zu vermeiden, die zu einer ungenauen BEV-Verteilung führen könnte. Regelmäßige Beobachtung des Flüssigkeitsstandes und konsequentes Üben können helfen, dieses Problem zu entschärfen.
In dieser Studie wurden die mit BEVs angereicherten Fraktionen (F6-F8) unter Verwendung mehrerer Charakterisierungsmethoden bestimmt und zwei unterschiedliche Gradienten-Ultrazentrifugationsmodi untersucht: Top-down und Bottom-up. Durch die Messung der Protein- und Partikelkonzentration in F4-F8 (Abbildung 3) und den Vergleich von Wiederfindungsraten und Reinheit (Abbildung 8 und Abbildung 10) wurde beobachtet, dass der Bottom-up-Zentrifugationsmodus sowohl auf Protein- als auch auf Partikelebene höhere detektierte Werte lieferte als die alternative Methode zur Isolierung und Reinigung von BEVs aus Stuhlproben. Diese Beobachtung impliziert unterschiedliche dynamische Prozesse. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass nicht-vesikuläre extrazelluläre Nanopartikel (NVEPs)29, wie z. B. Lipoproteine, mit geringerer Dichte als BEVs, ihre Auftriebsdichte möglicherweise nicht erreichen, wenn die Proben von unten belastet werden (Abbildung 6), was möglicherweise zu einer überhöhten Wiederfindungsrate führt, selbst nach 15 Stunden DGC (Abbildung 9). Diese Beobachtung erfordert eine Überlegung, ob die traditionelle Reinheitsdefinition, die auf dem Verhältnis von Partikeln zu Proteinen basiert, anwendbar ist. Darüber hinaus ist es erwähnenswert, dass EEVs innerhalb von F5 überwiegen, während BEVs in F6-F7 prominent detektiert wurden (Abbildung 4 und Abbildung 5). Bemerkenswert ist, dass diese Differenzierung bei der Anwendung des Top-down-Modus noch verstärkt zu werden schien. Daher ist dieser Modus möglicherweise besser für dieses Protokoll geeignet. Es ist jedoch wichtig, das Vorhandensein von Integrin β1 in F6 hervorzuheben, was möglicherweise auf die intrinsische Heterogenität zwischen EEVs hinweist. Bei der Anwendung dieser Methode auf andere Körperflüssigkeiten wie Blut und Urin sollten die Forscher die einzigartigen Eigenschaften der Proben berücksichtigen. Die in diesem Protokoll definierte Zentrifugationszeit beträgt 7 h und ist damit deutlich kürzer als die in anderen Studien angegebene Dauer, die bis zu 18 h betragen kann. Im Vergleich zur Proteinrückgewinnung mit einer Dauer von 15 Stunden, die in dieser Studie nach dem gleichen Muster durchgeführt wurde (Abbildung 9), scheint diese Zeit ausreichend zu sein, um die erforderliche Trennreinheit zu erreichen. Unter diesen Betriebsbedingungen erreichte die Partikelrückgewinnung im Top-Down-Modus bis zu 10 8 (4,5 × 10 7-1,5 × 108) pro Milligramm Kot, was mit früheren Berichten übereinstimmt (1011 BEVs pro Gramm nasser Stuhl)15,29,30. Schließlich bestätigten Dichtemessungen jeder Fraktion aus der Blindkontrolle, dass die Dichte der BEVs zwischen 1,09 und 1,19 g/ml lag, was mit früheren Untersuchungen übereinstimmt.
Diese Methode ist zwar effektiv, stellt jedoch aufgrund des Einflusses von Ernährung, Darmfunktion und anderen Faktoren auf die Stuhlzusammensetzung eine Einschränkung dar. Diese Variablen können die fäkale Konsistenz verändern, was sich möglicherweise auf die Bakterienhäufigkeit und die Erholung von BEV auswirkt. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, die Isolierung und Reinigung von BEVs31,32 zu standardisieren, wobei Anpassungen auf der Grundlage der Bewertung der fäkalen Eigenschaften vorgenommen werden. Zukünftige Forschung sollte sich darauf konzentrieren, einen Standard für die Normalisierung der BEV-Ausbeute zu identifizieren, ähnlich dem Urinkreatinin oder der Urinflussrate. Eine solche Benchmark könnte die methodische Bewertung verbessern und den Zusammenhang zwischen fäkalen BEVs und dem physiologischen und pathologischen Zustand des Körpers beleuchten. Darüber hinaus unterstreicht die starke Assoziation zwischen fäkalen BEVs und verschiedenen Erkrankungen ihr signifikantes klinisches Potenzial. Die in diesem Protokoll festgelegte Zentrifugationszeit entspricht jedoch nicht der Forderung nach bequemeren und schnelleren Tests, wie sie von Klinikern gefordert werden. Daher sind weitere Untersuchungen erforderlich, um festzustellen, ob kürzere Zentrifugationszeiten, vielleicht weniger als 3 h, zu gleichwertigen Ergebnissen führen können. Weitere Untersuchungen sind auch erforderlich, um die Ereignisse zu verstehen, die in beiden Zentrifugationsmodi auftreten. Obwohl postuliert wird, dass nicht-vesikuläre Komponenten in F6-F8 im Bottom-up-Modus stärker angereichert sind, kann sich die Verfeinerung der Gradientenkonzentrationen als vorteilhaft erweisen, um zusätzliche Subtypen mit spezifischen Funktionen zu identifizieren.
In dieser Studie wurde die Isolierung und Reinigung von BEVs aus menschlichen Fäkalien mit DGC erfolgreich demonstriert. Die Strategie ist vielversprechend für die Anwendung auf andere biologische Proben wie Blut, Urin und Speichel und bietet Forschern einen effektiven Ansatz, um die verborgenen Informationen von BEVs aufzudecken und so die klinischen Anwendungen voranzutreiben.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass keine entgegenstehenden Interessen bestehen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt durch den National Science Fund for Distinguished Young Scholars (82025024); das Schlüsselprojekt der National Natural Science Foundation of China (82230080); das National Key F&E-Programm Chinas (2021YFA1300604); die National Natural Science Foundation of China (81871735, 82272438 und 82002245); Guangdong Natural Science Fund for Distinguished Young Scholars (2023B1515020058); die Naturwissenschaftliche Stiftung der Provinz Guangdong (2021A1515011639); das Major State Basic Research Development Program der Natural Science Foundation der Provinz Shandong in China (ZR2020ZD11); die Postdoktoranden-Wissenschaftsstiftung (2022M720059); das Outstanding Youths Development Scheme des Nanfang Hospital, Southern Medical University (2022J001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 % (w/v) glutaraldehyde (prepared from 2.5 % stock solution in deionized water) | ACMEC | AP1126 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.3 |
| 1 % (w/v) methylcellulose (prepared from original powder in deionized water) | Sigma-Aldrich | M7027 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.6 |
| 1.5 % (w/v) uranyl acetate (prepared from original powder in deionized water) | Polysciences | 21447-25 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.5 |
| 1000 μL, 200 μL, 10 μL Pipette | KIRGEN | KG1313, KG1212, KG1011 | Transfer the solution |
| 5 % (w/v) bovine serum albumin solution (prepared from the original powder in TBST buffer) | Fdbio science | FD0030 | Used in western blotting for blocking at Step 8.5.6 |
| 5 × loading buffer | Fdbio science | FD006 | Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5.1 |
| 75 % (v/v) alcohol | LIRCON | LIRCON-500 mL | Surface disinfection |
| 96-well plate | Rar | A8096 | Measure the absorbance values |
| Anti-Calnexin antibody | Abcam | ab92573 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-CD63 antibody | Abcam | ab134045 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-CD9 antibody | Abcam | ab236630 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-Flagellin antibody | Sino Biological | 40067-MM06 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-Integrin beta 1 antibody | Abcam | ab30394 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-LPS antibody | Thermo Fisher | MA1-83152 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-LTA antibody | Thermo Fisher | MA1-7402 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-OmpA antibody | CUSABIO | CSB-PA359226ZA01EOD, https://www.cusabio.com/ | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-Syntenin antibody | Abcam | ab133267 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-TSG101 antibody | Abcam | ab125011 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Autoclave | ZEALWAY | GR110DP | Sterilization for supplies and mediums used in the experiment |
| Balance | Mettler Toledo | AL104 | Balance the tube sample-loaded with PBS |
| Bicinchoninic acid assay | Fdbio science | FD2001 | Measure protein content of BEVs at Step 8.2 |
| BioRender | BioRender | https://app.biorender.com | Make the schematic workflow of BEVs isolation and purification showed in Figure 1 |
| Biosafety cabinet | Haier | HR1200- II B2 | Peform the procedures about feces sample handling |
| Centrifuge 5810 R; Rotor F-34-6-38 | Eppendorf | 5805000092; 5804727002, adapter: 5804774000 | Preprocess for BEVs (Step 3) |
| Chemiluminescence Apparatus | BIO-OI | OI600SE-MF | Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12 |
| Cytation 5 | BioTek | F01 | Microplate detector for measuring the absorbance (Step 8.1) and fluorescence (Figure 6) values |
| Dil-labled low density lipoprotein | ACMEC | AC12038 | Definition of distribution of interfering components |
| Electrophoresis equipment | Bio-rad | 1658033 | Used in western blotting for protein separation and transfer at Step 8.5.2, 8.5.3, 8.5.5 |
| Enhanced Chemiluminescence kit HRP | Fdbio science | FD8020 | Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12 |
| Escherichia coli | American Type Culture Collection | ATCC8739 | Isolate BEVs as a positive control. Protocol: Dissolve 25 g of the LB powder in 1 L deionized water, and autoclave. Transfer the 800 μL of preserved Escherichia coli into the medium. Cultivate at 37 °C in the incubator shaker. Then centrifuge at 3, 000 × g for 20 min at 4 °C, 12, 000 × g for 30 min at 4 °C, filter the supernatant through 0.22 μm membrane, and perform ultra-speed centrifugation at 160, 000 × g for 70 min at 4 °C. Pellet defined as crude BEVs from Escherichia coli was suspended in 1.2 mL PBS (Step 3, 4). |
| Falcon tubes 50 mL | KIRGEN | KG2811 | Preprocess for BEVs (Step 3) |
| Feto Protein Staining Buffer | Absci | ab.001.50 | Coomassie brilliant blue staining at Step 8.5.4 |
| Filter paper | Biosharp | BS-TFP-070B | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 (Blotting the solution) |
| Formvar/Carbon supported copper grids | Sigma-Aldrich | TEM-FCF200CU50 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 |
| HEPES powder | Meilunbio | MB6078 | Prepare iodixanol buffers with different concentrations for density gradient centrifugation |
| HRP AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Fdbio science | FDM007 | Western blotting (Secondary Antibody) |
| HRP AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Fdbio science | FDR007 | Western blotting (Secondary Antibody) |
| Incubator shaker | Qiangwen | DHZ-L | Cultivate Escherichia coli |
| Kimwipes™ Delicate Task Wipes | Kimtech Science | 34155 | Wipe the inner wall of the ultracentrifuge tube at Step 4.15 |
| LB broth | Hopebio | HB0128 | Cultivate Escherichia coli |
| Low temperature freezer (-80 °C) | Haier | DW-86L338J | Store the samples |
| Methanol | Alalddin | M116118 | Used in western blotting for activating PVDF membrane at Step 8.5.5 |
| Micro tubes 1.5 mL | KIRGEN | KG2211 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
| Micro tubes 2 mL | KIRGEN | KG2911 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
| Micro tubes 5 mL | BBI | F610888-0001 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
| Microplate reader | Thermo Fisher | Multiskan MK3 | Measure protein content of BEVs at Step 8.2 |
| Millipore filter 0.22 μm | Merck millipore | SLGP033RB | Filtration sterilization; Material: polyethersulfone, PES |
| NaCl | GHTECH | 1.01307.040 | Density gradient centrifugation solution |
| NaOH | GHTECH | 1.01394.068 | Density gradient centrifugation solution (pH adjustment) |
| Optima™ XPN-100 | Beckman Coulter | A94469 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
| OptiPrep™ | Serumwerk Bernburg AG | 1893 | Density gradient centrifugation stock solution |
| Orbital Shaker | Youning | CS-100 | Dissolve feces at Step 2 |
| Phosphate buffered saline | Procell | PB180327 | Dissolve feces at Step 2 |
| Pipettor | Eppendorf | 3120000267, 3120000259 | Transfer the solution |
| Plastic pasteur pipette | ABCbio | ABC217003-4 | Remove supernatant in preprocessing at Step 3.4 |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes | Millipore | ISEQ00010, IPVH00010 | Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5 |
| Prefabricated polyacrylamide gel, 4–20% 15 Wells | ACE | F15420Gel | Used in western blotting for protein separation at Step 8.5.2, 8.5.3 |
| Primary antibody diluent | Fdbio science | FD0040 | Used in western blotting at Step 8.5.8 |
| Protein ladder | Fdbio science | FD0672 | Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5 |
| Rapid protein blotting solution | UBIO | UW0500 | Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5 |
| Rotor SW 32 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 369650 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
| Syringe 20 mL, 50 mL | Jetway | ZSQ-20ML, YCXWJZSQ-50 mL | Transfer buffers amd remove supernatant in preprocessing |
| TBS powder | Fdbio science | FD1021 | Used in western blotting at Step 8.5 |
| Transmission electron microscope (TEM) | Hitachi | H-7650 | Morphological observation for BEVs at Step 8.3 |
| Tween-20 | Fdbio science | FD0020 | Used in western blotting at Step 8.5 |
| Ultracentrifuge tube | Beckman | 326823, 355642 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
| Ultra-clean bench | AIRTECH | SW-CJ-2FD | Peform the procedures about liquid handling |
| Water bath | Bluepard | CU600 | Used for measuring protein content of BEVs at Step 8.2.5 |
| ZetaView | Particle Metrix | S/N 21-734, Software ZetaView (version 8.05.14 SP7) | Nanoparticle tracking analysis (NTA) for measuring the particle size and concentrarion of BEVs at Step 8.4 |
References
- Costello, E. K., et al. Bacterial community variation in human body habitats across space and time. Science. 326 (5960), 1694-1697 (2009).
- Greenhalgh, K., Meyer, K. M., Aagaard, K. M., Wilmes, P. The human gut microbiome in health: establishment and resilience of microbiota over a lifetime. Environmental Microbiology. 18 (7), 2103-2116 (2016).
- de Vos, W. M., Tilg, H., Van Hul, M., Cani, P. D. Gut microbiome and health: mechanistic insights. Gut. 71 (5), 1020-1032 (2022).
- Zhou, P., Yang, D., Sun, D., Zhou, Y. Gut microbiome: New biomarkers in early screening of colorectal cancer. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 36 (5), 24359 (2022).
- Paik, D., et al. Human gut bacteria produce Τ(Η)17-modulating bile acid metabolites. Nature. 603 (7903), 907-912 (2022).
- Parada Venegas, D., et al. Short chain fatty acids (SCFAs)-mediated gut epithelial and immune regulation and its relevance for inflammatory bowel diseases. Frontiers in Immunology. 10, 277 (2019).
- Jiang, C., Li, G., Huang, P., Liu, Z., Zhao, B. The Gut microbiota and Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 58 (1), 1-15 (2017).
- Morais, L. H., Schreiber, H. L. t, Mazmanian, S. K. The gut microbiota-brain axis in behaviour and brain disorders. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 241-255 (2021).
- Kim, J. H., Lee, J., Park, J., Gho, Y. S. Gram-negative and Gram-positive bacterial extracellular vesicles. Seminars in Cell and Developmental Biology. 40, 97-104 (2015).
- Toyofuku, M., Nomura, N., Eberl, L. Types and origins of bacterial membrane vesicles. Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 13-24 (2019).
- Xie, J., Li, Q., Haesebrouck, F., Van Hoecke, L., Vandenbroucke, R. E. The tremendous biomedical potential of bacterial extracellular vesicles. Trends in Biotechnology. 40 (10), 1173-1194 (2022).
- Coumans, F. A. W., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).
- Northrop-Albrecht, E. J., Taylor, W. R., Huang, B. Q., Kisiel, J. B., Lucien, F. Assessment of extracellular vesicle isolation methods from human stool supernatant. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (4), 12208 (2022).
- Park, Y. E., et al. Microbial changes in stool, saliva, serum, and urine before and after anti-TNF-α therapy in patients with inflammatory bowel diseases. Scientific Reports. 12 (1), 6359 (2022).
- Tulkens, J., De Wever, O., Hendrix, A. Analyzing bacterial extracellular vesicles in human body fluids by orthogonal biophysical separation and biochemical characterization. Nature Protocols. 15 (1), 40-67 (2020).
- Tulkens, J., et al. Increased levels of systemic LPS-positive bacterial extracellular vesicles in patients with intestinal barrier dysfunction. Gut. 69 (1), 191-193 (2020).
- Kang, C. S., et al. Extracellular vesicles derived from gut microbiota, especially Akkermansia muciniphila, protect the progression of dextran sulfate sodium-induced colitis. PloS one. 8 (10), 76520 (2013).
- Simonsen, J. B. What are we looking at? Extracellular vesicles, lipoproteins, or both. Circulation Research. 121 (8), 920-922 (2017).
- Correll, V. L., et al. Optimization of small extracellular vesicle isolation from expressed prostatic secretions in urine for in-depth proteomic analysis. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12184 (2022).
- Liang, X., et al. Gut bacterial extracellular vesicles: important players in regulating intestinal microenvironment. Gut Microbes. 14 (1), 2134689 (2022).
- Alberti, G., et al. Extracellular vesicles derived from gut microbiota in inflammatory bowel disease and colorectal cancer. Biomedical papers of the Medical Faculty of the University Palacky, Olomouc, Czech Republic. 165 (3), 233-240 (2021).
- Díez-Sainz, E., Milagro, F. I., Riezu-Boj, J. I., Lorente-Cebrián, S. Effects of gut microbiota-derived extracellular vesicles on obesity and diabetes and their potential modulation through diet. Journal of Physiology and Biochemistry. 78 (2), 485-499 (2022).
- Lajqi, T., et al. Gut microbiota-derived small extracellular vesicles endorse memory-like inflammatory responses in murine neutrophils. Biomedicines. 10 (2), 442 (2022).
- Lee, K. E., et al. The extracellular vesicle of gut microbial Paenalcaligenes hominis is a risk factor for vagus nerve-mediated cognitive impairment. Microbiome. 8 (1), 107 (2020).
- Villard, A., Boursier, J., Andriantsitohaina, R. Bacterial and eukaryotic extracellular vesicles and nonalcoholic fatty liver disease: new players in the gut-liver axis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 320 (4), G485-G495 (2021).
- Wei, S., et al. Outer membrane vesicles enhance tau phosphorylation and contribute to cognitive impairment. Journal of Cellular Physiology. 235 (5), 4843-4855 (2020).
- Bitto, N. J., Kaparakis-Liaskos, M. Methods of bacterial membrane vesicle production, purification, quantification, and examination of their immunogenic functions. Methods in Molecular Biology. 2523, 43-61 (2022).
- Stentz, R., Miquel-Clopés, A., Carding, S. R. Production, isolation, and characterization of bioengineered bacterial extracellular membrane vesicles derived from Bacteroides thetaiotaomicron and their use in vaccine development. Methods in Molecular Biology. 2414, 171-190 (2022).
- Zhang, Q., Jeppesen, D. K., Higginbotham, J. N., Franklin, J. L., Coffey, R. J. Comprehensive isolation of extracellular vesicles and nanoparticles. Nature Protocols. 18 (5), 1462-1487 (2023).
- Iwai, K., Minamisawa, T., Suga, K., Yajima, Y., Shiba, K. Isolation of human salivary extracellular vesicles by iodixanol density gradient ultracentrifugation and their characterizations. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 30829 (2016).
- Vandeputte, D., et al. Stool consistency is strongly associated with gut microbiota richness and composition, enterotypes and bacterial growth rates. Gut. 65 (1), 57-62 (2016).
- Wen, M., et al. Bacterial extracellular vesicles: A position paper by the Microbial Vesicles Task Force of the Chinese Society of Extracellular Vesicles. Interdisciplinary Medicine. 1, 12046 (2023).
