Summary
Este estudo descreve um método para isolar e purificar vesículas extracelulares bacterianas (BEVs) enriquecidas de fezes humanas via centrifugação por gradiente de densidade (DGC), identifica as características físicas dos BEVs a partir da morfologia, tamanho de partícula e concentração, e discute as potenciais aplicações da abordagem DGC em pesquisa clínica e científica.
Abstract
As vesículas extracelulares bacterianas (BEVs) são nanovesículas derivadas de bactérias que desempenham um papel ativo na comunicação bactéria-bactéria e bactéria-hospedeiro, transferindo moléculas bioativas como proteínas, lipídios e ácidos nucléicos herdados das bactérias mãe. Os BEVs derivados da microbiota intestinal têm efeitos dentro do trato gastrointestinal e podem atingir órgãos distantes, resultando em implicações significativas para a fisiologia e patologia. Investigações teóricas que explorem os tipos, quantidades e papéis de BEVs derivados de fezes humanas são cruciais para entender a secreção e a função de BEVs da microbiota intestinal. Essas investigações também requerem um aprimoramento na estratégia atual de isolamento e purificação de BEVs.
Este estudo otimizou o processo de isolamento e purificação de BEVs estabelecendo dois modos de centrifugação por gradiente de densidade (DGC): Top-down e Bottom-up. A distribuição enriquecida dos BEVs foi determinada nas frações 6 a 8 (F6-F8). A eficácia da abordagem foi avaliada com base na morfologia das partículas, tamanho, concentração e teor de proteínas. As taxas de recuperação de partículas e proteínas foram calculadas, e a presença de marcadores específicos foi analisada para comparar a recuperação e pureza dos dois modos de DGC. Os resultados indicaram que o modo de centrifugação Top-down apresentou menores níveis de contaminação e alcançou uma taxa de recuperação e pureza semelhante à do modo Bottom-up. Um tempo de centrifugação de 7 h foi suficiente para atingir uma concentração de BEV fecal de 108/mg.
Além das fezes, este método pode ser aplicado a outros tipos de fluidos corporais com modificação adequada de acordo com as diferenças de componentes e viscosidade. Em conclusão, este protocolo detalhado e confiável facilitaria o isolamento e purificação padronizados de BEVs e, assim, estabeleceria uma base para análises multi-ômicas subsequentes e experimentos funcionais.
Introduction
O intestino é amplamente reconhecido como o órgão que abriga as comunidades microbianas mais abundantes no corpo humano, com mais de 90% das bactérias envolvidas na colonização e multiplicação 1,2. Extensas evidências têm demonstrado que a microbiota intestinal modula o microambiente intestinal e, simultaneamente, interage com disfunção em órgãos distantes, principalmente através de uma barreira intestinal prejudicada 3,4. Evidências crescentes indicam uma correlação entre o desequilíbrio da microbiota intestinal e a progressão da doença inflamatória intestinal (DII)5,6, bem como distúrbios cognitivos através do eixo intestino-cérebro5,6,7,8. As vesículas extracelulares bacterianas (BEVs) produzidas por bactérias desempenham papéis significativos nesses processos patológicos.
BEVs são partículas em nanoescala que encapsulam derivados bacterianos, com diâmetros variando de 20 a 400 nm. Eles têm sido demonstrados para facilitar as interações entre bactérias e seus organismos hospedeiros 9,10. Apesar de sua invisibilidade, essas partículas têm recebido cada vez mais atenção dos pesquisadores devido às suas amplas aplicações prospectivas como biomarcadores diagnósticos, alvos terapêuticos e veículos de liberação de fármacos11. As fezes humanas, frequentemente usadas como bioespécimes para estudar BEVs, predominantemente provenientes de bactérias intestinais, contêm uma mistura complexa de água, bactérias, lipídios, proteínas, resíduos alimentares não digeridos e células epiteliais esfoliadas, entre outros. A intrincada composição fecal coloca desafios ao isolamento e pureza dos BEVs, impedindo uma análise abrangente, objetiva e realista dos BEVs. Assim, estratégias efetivas para minimizar a interferência de componentes contaminantes e aumentar o rendimento dos BEVs têm emergido como questões críticas que merecem atenção imediata.
As estratégias de isolamento existentes dependem em grande parte de técnicas como centrifugação em ultra-alta velocidade (UC), centrifugação por gradiente de densidade (DGC) e cromatografia de exclusão de tamanho (SEC)12,13,14,15,16,17. Atualmente, a DGC é um dos métodos mais amplamente aplicados no campo da separação de BEV, englobando dois modos de sedimentação-flutuação, "Top-down" e "Bottom-up", que são determinados pela posição de carregamento inicial da amostra. Essas metodologias diferenciam as vesículas extracelulares (EVs) de outros componentes com base nas disparidades de tamanho e densidade, produzindo taxas variáveis de pureza e recuperação. Pesquisas anteriores indicaram que estratégias de abordagem única são insuficientes para separar adequadamente os EVs das proteínas solúveis em amostras de fluido corporal, como a lipoproteína no sangue18 e a proteína Tamm-Horsfall na urina19. Além disso, a distribuição de tamanho das vesículas extracelulares (EEVs) eucarióticas frequentemente se sobrepõe à dos BEVs, necessitando de maiores aprimoramentos metodológicos para otimizar o rendimento do BEV. Consequentemente, o avanço do estudo dos BEVs depende do desenvolvimento de metodologias eficazes de separação e purificação. Notavelmente, Tulkens e cols.15 empregaram uma estratégia biofísica ortogonal para separar BEVs fecais de EEVs, na qual o tempo de centrifugação de um modo Bottom-up DGC foi de até18 h. Em contrapartida, este estudo reduziu para 7 h, economizando muito o tempo de gradiente-ultracentrifugação e simplificando o processo.
No presente estudo, isolamos e purificamos BEVs fecais empregando dois modos de DGC sob condições de tampão otimizadas, após enriquecer BEVs com uma faixa de velocidades de centrifugação diferencial, de baixa a extremamente alta velocidade. Avaliações baseadas em morfologia, tamanho de partícula e concentração indicaram um desempenho louvável por este método aprimorado. Este estudo poderia servir como base para pesquisas futuras, estendendo suas aplicações para um domínio mais amplo e oferecendo insights sobre a heterogeneidade dos BEVs dentro do corpo humano. Também contribui para a padronização das técnicas de separação e análise de BEV.
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Protocol
O Comitê de Ética do Hospital Nanfang, Southern Medical University, sancionou este estudo, que foi conduzido com o consentimento informado dos participantes. Todos os métodos aqui empregados seguiram as diretrizes operacionais padrão fornecidas pelas Normas Internacionais de Microbioma Humano (IHMS: http://www.microbiome-standards.org/). Todos os procedimentos subsequentes de manuseio de líquidos foram obrigados a serem realizados dentro de um gabinete de biossegurança ou uma bancada ultralimpa.
1. Coleta e aliquotação de amostras fecais
- Distribua um amostrador de fezes, um saco selado e uma caixa gelada e forneça instruções abrangentes aos participantes sobre como adquirir e preservar as amostras.
- Instrua cada participante a coletar sua amostra fecal usando o amostrador fornecido e a transportá-la para o laboratório a uma temperatura de 4 °C dentro de uma janela de 24 horas.
- Após o recebimento no laboratório, use uma colher estéril para aliquotar menos de 3,5 g de fezes em um tubo de centrífuga pré-pesado de 50 mL. Anotar o peso da amostra fecal no tubo para procedimentos subsequentes de pré-tratamento.
PONTO DE PAUSA: Se o processamento imediato das amostras não for viável, alocar a amostra para armazenamento a longo prazo a -80 °C após notação apropriada.
2. Preparo da amostra de fezes
- Resfriar 500 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) a 4 °C. Filtrar o PBS pré-resfriado através de um filtro de polietersulfona (PES) de 0,22 μm usando uma seringa de 50 mL em dez tubos de centrifugação de 50 mL.
- Posicionar dois tubos de 50 mL sobre gelo, cada um contendo 3,5 g de amostras fecais. Adicionar 35 mL de PBS a cada tubo.
NOTA: Calcular a quantidade necessária de PBS para a dissolução das fezes, garantindo uma concentração máxima da amostra de 10% (p/v). Se processar amostras adicionais, empregue mais tubos conforme necessário. - Agitar as amostras a 300 rpm durante 2 h a 4 °C ou colocá-las durante 8 h pelo menos a 4 °C até que as fezes estejam completamente suspensas visivelmente.
3. Centrifugação de velocidade diferencial
- Resfriar a centrífuga refrigerada de alta velocidade a 4 °C.
- Ajustar o peso dos dois tubos contendo as amostras preparadas na etapa 2.3 com PBS para atingir um peso total de 0,1 g.
- Centrifugar as amostras a 3 000 × g durante 20 min a 4 °C.
- Pipetar cuidadosamente o sobrenadante em dois tubos de centrífuga limpos de 50 mL, deixando aproximadamente 1 mL acima do pellet. Utilize uma pipeta plástica descartável Pasteur para este processo.
- Ajuste o peso dos dois tubos com PBS para atingir um peso total dentro de ± 0,1 g.
- Centrifugar o sobrenadante transferido a 12 000 × g durante 30 min a 4 °C.
- Aspirar o sobrenadante com uma seringa de 20 mL, remover a agulha da seringa e filtrá-la através de filtros de 0,22 μm em tubos de 50 mL. Nesse momento, o volume sobrenadante deve ser de aproximadamente 30 mL.
NOTA: Se uma quantidade significativa de impureza ainda for visível após a centrifugação de 12.000 × g, é necessário repetir a etapa de centrifugação a 12.000 × g por 30 min a 4 °C. A falha em fazê-lo pode resultar em uma perda significativa de BEVs devido ao bloqueio dos poros durante a filtração.
4. Centrifugação de ultra-alta velocidade
- Limpe o rotor e a caçamba limpando-os com álcool 75% (v/v) para eliminar qualquer contaminação residual.
- Posicione um tubo ultracentrífugo de 38,5 mL no suporte do tubo.
NOTA: Selecione o tubo de ultracentrífuga apropriado com base no volume da amostra. Evitar radiação ultravioleta e reagentes químicos inadequados para esterilização de tubos centrífugos, conforme indicado no manual do produto. - Transferir aproximadamente 30 mL do sobrenadante fecal filtrado do Passo 3.7 para o tubo de ultracentrífuga.
- Preencher o tubo da ultracentrífuga com aproximadamente 8 mL de PBS, deixando uma folga de 3 mm da abertura do tubo.
- Coloque os dois tubos de ultracentrífuga com as amostras em baldes de ultracentrifugação opostos, por exemplo, a caçamba 1 corresponde a 4 (1-4), 2-5, 3-6.
- Ajuste o peso das duas caçambas com PBS para atingir um peso total dentro de ± 0,005 g.
- Instale todas as caçambas no rotor, independentemente de os tubos estarem carregados.
- Iniciar o vácuo e centrifugar as amostras a 160.000 × g durante 70 min a 4 °C.
- Solte o vácuo da câmara e abra a porta assim que Ready for exibido na página inicial do instrumento.
- Remova o rotor da ultracentrífuga.
- Mova as caçambas do rotor para o rack e recupere os tubos usando um nipper.
- Descarte o sobrenadante, que conterá pellets marrons visíveis na parte inferior.
- Ressuspenda os pellets pipetando-os repetidamente para cima e para baixo usando uma pipeta de 1.000 μL com 1 mL de PBS pré-resfriado (4 °C) até a suspensão completa. Preencher o tubo com aproximadamente 37 mL de PBS, deixando uma folga de 3 mm da abertura.
- Execute outra ultracentrifugação seguindo as etapas 4.5-4.11 a 160.000 × g por 70 min a 4 °C para remover componentes contaminantes parcialmente conectados das paredes do tubo.
- Descarte o sobrenadante, inverta os dois tubos ultracentrífugos por 5 min e limpe qualquer solução restante na parede interna com limpadores.
NOTA: A limpeza da parede interna minimiza a interferência da contaminação residual aderida à parede do tubo ultracentrífugo. Escolha limpadores que não influenciem a análise de BEV, especialmente no que diz respeito ao tamanho das partículas. - Ressuspenda os pellets em cada tubo pipetando-os para cima e para baixo com 1,2 mL de PBS pré-resfriado (4 °C) usando uma pipeta de 1.000 μL.
- Transferir 1,2 ml da solução PBS/BEV de um tubo de ultracentrífuga para um microtubo limpo de 1,5 ml.
PONTO DE PAUSA: A solução PBS/BEV coletada de um tubo de ultracentrífuga pode prosseguir para a Etapa 6. Conservar a solução do outro tubo a -80 °C.
5. Preparação da solução para centrifugação por gradiente de densidade
- Preparação do tampão HEPES 0,02 M
- Combinar 0,477 g de pó de HEPES e 0,8 g de NaCl com 90 mL de água deionizada autoclavada.
- Ajustar o pH para 7,2 adicionando 1 M de hidróxido de sódio (NaOH). Levar o volume a 100 ml com água deionizada e filtrar a solução através de membranas de PES de 0,22 μm.
CUIDADO: O hidróxido de sódio é um álcali cáustico forte. Os operadores devem manuseá-lo e prepará-lo cuidadosamente em um armário de fumos.
- Preparação do tampão de gradiente de densidade
- Calcular o volume necessário de cada tampão de gradiente de densidade com base no número de tubos de ultracentrífuga para centrifugação por gradiente de densidade (Passo 6) (Neste protocolo, os volumes para soluções de gradiente de 60%, 50%, 40%, 20% e 10% foram de 2,5 mL, 3 mL, 6 mL, 6 mL e 6 mL, respectivamente).
- Para a preparação de uma solução de trabalho de iodixanol a 50% (p/v), misturar o tampão HEPES 0,02 M e a solução-mãe de iodixanol a 60% (p/v) numa relação de volume de 1:5 (0,5 ml:2,5 ml).
NOTA: Use uma seringa descartável de 20 mL para retirar a solução estoque de iodixanol e evitar a introdução de ar. - Para preparar tampões de iodixanol com diferentes concentrações, combinar a solução de trabalho de iodixanol a 50% da Etapa 5.2.2 com o tampão HEPES obtido na Etapa 5.1 usando uma pipeta de 1.000 μL de acordo com as proporções mostradas na Tabela 1.
NOTA: Execute a Etapa 5 em uma bancada ultralimpa com as luzes apagadas. Conservar a solução-mãe de iodixanol aberta no frigorífico a 4 °C para evitar o crescimento bacteriano. Mantenha a solução de iodixanol e o tampão HEPES protegidos da luz.
6. Estabelecimento de um sistema de centrifugação por gradiente de densidade
- Modo DGC de cima para baixo
- Combinar 500 μL de solução de PBS/BEV isolada da Etapa 4 com 3 mL de PBS. Misturar suavemente as soluções utilizando uma pipeta de 1.000 μL para obter 3,5 ml de solução de PBS/BEV.
- Coloque um tubo de ultracentrífuga de 31 mL em uma placa de espuma com furos e rotule-o como "↓".
- Adicionar verticalmente 3 mL da solução de iodixanol a 50% ao fundo do tubo usando uma pipeta de 1.000 μL.
- Incline o tubo para um ângulo de 70° e posicione um suporte de tubo ou outro suporte ligeiramente acima do nível da placa de espuma, abaixo da abertura do tubo.
- Adicionar 3 mL de solução de iodixanol a 40% sobre a solução de iodixanol a 50% usando uma pipeta de 1.000 μL.
- Adicionar 3 ml de solução de iodixanol a 20% sobre a solução de iodixanol a 40% utilizando uma pipeta de 1.000 μL.
- Adicionar 3 mL de solução de iodixanol a 10% sobre a solução de iodixanol a 20% usando uma pipeta de 1.000 μL.
- Adicionar 3,5 ml de solução PBS/BEV do passo 6.1.1 sobre a solução de iodixanol a 10% utilizando uma pipeta de 1.000 μL.
- Retorne suavemente os tubos para uma posição vertical.
NOTA: Após a pipetagem, a estratificação deve estar visível.
- Modo DGC de baixo para cima
- Coloque um tubo de ultracentrífuga de 31 mL em uma placa de espuma com furos e rotule-o como "↑".
- Adicionar verticalmente 2,5 ml da solução-mãe de iodixanol a 60% ao fundo do tubo. Misturar suavemente com 500 μL de solução de PBS/BEV isolada da Etapa 4 usando uma pipeta de 1.000 μL para obter 3 mL de solução de iodixanol/BEV a 50%.
- Incline o tubo para um ângulo de 70° e posicione um suporte de tubo ou outro suporte ligeiramente acima do nível da placa de espuma, abaixo da abertura do tubo.
- Adicionar 3 ml da solução de iodixanol a 40% sobre a solução de iodixanol/BEV a 50% utilizando uma pipeta de 1.000 μL.
- Adicionar 3 ml da solução de iodixanol a 20% sobre a solução de iodixanol a 40% utilizando uma pipeta de 1000 μL.
- Adicionar 3 ml da solução de iodixanol a 10% sobre a solução de iodixanol a 20% utilizando uma pipeta de 1000 μL.
- Adicionar 3,5 mL de PBS sobre a solução de iodixanol a 10% usando uma pipeta de 1.000 μL.
- Retorne suavemente os tubos para uma posição vertical.
- Nesse momento, restaram 200 μL da suspensão obtida na Etapa 4.17, que pode ser analisada posteriormente como um grupo denominado "UC".
NOTA: Ao transferir soluções no Passo 6, mantenha sempre a ponta da pipeta contra a parede do tubo ultracentrífuga perpendicular ao eixo do tubo.
7. Centrifugação por gradiente de densidade e coleta de frações
- Ajuste o peso dos dois tubos com PBS para atingir um peso total dentro de ± 0,005 g.
- Colocar os tubos nos baldes de acordo com o passo 4.5 e submetê-los à centrifugação a 160.000 × g durante 7 h a 4 °C.
- Coletar as frações usando um pipetador (1000 μL) de cima para baixo contra a parede lateral na seguinte ordem: 3 mL, 2 mL, 1 mL, 1 mL, 1 mL, 1 mL, 1 mL, 1 mL, 1 mL, 1,5 mL e 3 mL em um tubo de ultracentrífuga de 38,5 mL.
NOTA: Mantenha a linha de visão no mesmo nível da superfície líquida. - Conduzir a ultracentrifugação para cada fração obtida na etapa 7.3 de acordo com a etapa 4 a 160.000 × g por 70 min a 4 °C.
- Retire o sobrenadante e inverta os tubos ultracentrífugos por 5 min.
- Ressuspender os pellets em 200 μL de PBS pré-resfriado (4 °C) usando uma pipeta de 200 μL.
- Transfira a solução de PBS/BEV para um microtubo limpo de 1,5 ml.
- Rotule as frações de F1 a F10 e analise-as com base na Etapa 8.
PONTO DE PAUSA: Se as amostras obtidas na etapa 7.8 não puderem ser processadas imediatamente, armazená-las a -80 °C.
8. Caracterização e análise quantitativa das frações coletadas
- Determinar os valores de absorbância (OD 340 nm) de cada fração usando um detector de microplacas com um controle em branco para calcular sua densidade correspondente.
Observação : substitua a solução PBS/BEV (etapa 6.1.1 e etapa 6.2.2) com PBS para estabelecer um controle em branco.- Preparar 100 μL cada de solução de iodixanol a 0%, 5%, 10%, 12,5% e 20% diluída por HEPES 0,02 M com base em solução estoque a 50% (Passo 5.2.2) conforme os padrões, correspondendo às densidades de 1,0058 g/mL, 1,0318 g/mL, 1,058 g/mL, 1,0708 g/mL e 1,111 g/mL, respectivamente.
- Adicionar 50 μL de cada fracção do controlo em branco (preparado no passo 7.3) e 50 μL de cada solução-padrão (preparado no passo 8.1.1) aos poços duplicados de uma placa de 96 poços.
- Ajuste o comprimento de onda para 340 nm, meça a densidade óptica do ponto final e calcule a densidade de cada fração.
- Identifique F4-F9 como a faixa de frações de BEV com base em sua densidade.
- Determinar a concentração proteica das fracções de BEV utilizando o ensaio do ácido bicinconínico (BCA).
- Diluir a substância dez vezes em PBS fornecido pelo fabricante para preparar uma solução-padrão proteica de 0,5 μg/μL.
- Adicionar a solução-padrão proteica (preparada na etapa 8.2.1) com volumes variáveis de acordo com as instruções do reagente e complementar cada poço de uma placa de 96 poços com PBS até um volume total de 20 μL.
- Adicionar 20 μL das amostras preparadas na etapa 7.8 e as amostras deixadas após UC definida na etapa 6.2.9 em cada poço.
- Misturar os reagentes A e B na proporção de 50:1 e transferir 200 μL para cada poço.
- Incubar a placa em banho-maria a 37 °C durante 30 min.
- Medir o valor de absorbância utilizando um leitor de microplacas, calcular a concentração de proteínas (μg/μL) e determinar o teor de proteínas (μg) das amostras com base na curva padrão (x: densidade óptica; y: concentração de proteínas) gerada a partir dos valores das soluções-padrão diluídas na etapa 8.2.2.
- Caracterizar as frações de BEV definidas na etapa 8.1.4 usando microscopia eletrônica de transmissão (MET) para verificar a presença de BEVs. Todos os procedimentos abaixo devem ser realizados no gelo.
- Aplicar 10 μL de cada fracção F4-F9 isolada do Passo 7.8 e das amostras deixadas após a UC definida no Passo 6.2.9 em grelhas de cobre suportadas com Formvar/Carbon durante 20 minutos e borrifar com papel de filtro.
- Enxaguar as amostras com 100 μL de PBS três vezes por 1 min cada, e borrifar com papel de filtro.
- Fixar as amostras com 100 μL de glutaraldeído a 1% (p/v) durante 5 min e borrifar com papel de filtro.
- Lave as grades com 100 μL de PBS dez vezes por 2 min cada, e borre com papel filtro.
- Manchar as grades com 50 μL de acetato de uranila a 1,5% (p/v) por 10 min e borrifar com papel de filtro.
CUIDADO: O acetato de uranila é radioativo e extremamente tóxico quando em contato com a pele ou inalado. Manuseie soluções com acetato de uranila em um armário de fumaça e siga as medidas de segurança adequadas. - Transfira as grades para uma gota de metilcelulose de 1% (p/v) por 5 min e borrife com papel de filtro.
- Guarde as grades secas ao ar em um ambiente escuro e livre de poeira até a observação.
- Capture imagens e analise-as usando um TEM.
- Caracterizar as frações de BEV definidas na Etapa 8.1.4 usando análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) para contar o número de partículas.
- Calibrar o sistema utilizando partículas de poliestireno de 110 nm.
- Lave o pool de amostras usando PBS.
- Diluir as amostras das diferentes fracções adquiridas na Etapa 7.8 e as amostras deixadas após a UC definida na Etapa 6.2.9 para uma concentração na gama de 105-10 9 partículas/ml, com uma concentração otimizada de 10a 7 partículas/ml.
- Registrar e analisar em 11 posições com três repetições, mantendo a temperatura em torno de 23-30 °C.
- Analisar o conteúdo proteico das amostras por coloração de azul brilhante de coomassie (CBBS) e western blotting (WB).
- Diluir as amostras de BEV das diferentes fracções obtidas na Etapa 7.8 e as amostras deixadas após a UC definida na Etapa 6.2.9 utilizando PBS e tampão de carga de 5 × para uma concentração final de 0,5 ou 1 μg/μL, se for necessária quantificação, garantindo uma carga suficiente da amostra de 20 μL (10 μg ou 20 μg) de cada poço na Etapa 8.5.2. Ferver as amostras a 95 °C durante 10 min.
- Montar o gel pré-fabricado de poliacrilamida no tanque de eletroforese e transferir as amostras para os poços.
- Realizar eletroforese vertical com os seguintes parâmetros: 160 V por 50 min.
- Manchar o gel em solução azul brilhante Coomassie por 1 h, enxaguar em água deionizada até que o fundo azul claree e capturar imagens com uma câmera.
- Realizar procedimentos de blotting de proteínas para outros géis com os seguintes parâmetros: 400 mA por 20 min.
- Bloquear as membranas de blotting com uma solução de BSA a 5% (p/v) durante 1 h à temperatura ambiente.
- Lave as membranas em tampão TBST três vezes por 5 min cada.
- Incubar as membranas com anticorpos primários (marcadores BEV: LPS, OMPA, LTA; Marcadores EEV: CD63, CD9, TSG-101, Sintenina, Integrina β1; Outros marcadores de contaminação: Flagelina, Calnexina) por 8-12 h a 4 °C.
- Lave as membranas em tampão TBST três vezes por 10 min cada.
- Incubar as membranas com anticorpos secundários durante 1 h à temperatura ambiente.
- Execute a etapa 8.5.9.
- Desenvolver o blotting usando um aparelho de quimioluminescência.
- Substitua a solução PBS/BEV (Passo 6.1.1 e Passo 6.2.2) por BEVs de Escherichia coli para estabelecer um controlo positivo (ver Tabela de Materiais para o procedimento de isolamento de E. coli-BEVs brutos) e conduzir todos os experimentos acima para caracterizar BEVs.
PONTO DE PAUSA: Determinar F6-F8 como a distribuição das frações enriquecidas com BEV com base nos resultados da caracterização descrita acima para BEVs fecais e utilizar essa faixa estreita para análises subsequentes.
- Calcular as taxas de recuperação em termos de partículas e proteínas para avaliar a eficiência dos dois modos DGC. Os resultados a seguir são apresentados em porcentagem.
- Calcular as taxas de recuperação de partículas no modo descendente: partículas totais em F6-F8/partículas após UC definidas na etapa 6.2.9.
- Calcular as taxas de recuperação de partículas no modo ascendente: partículas totais em F6-F8/partículas após UC definidas na Etapa 6.2.9.
- Calcular as taxas de recuperação de proteínas no modo Top-down: conteúdo total de proteínas em F6-F8 (μg)/teor de proteínas após UC definido na Etapa 6.2.9 (μg).
- Calcular as taxas de recuperação de proteínas no modo ascendente: conteúdo total de proteínas em F6-F8 (μg)/teor de proteínas após UC definido no Passo 6.2.9 (μg).
- Calcule a relação partícula/proteína para avaliar a pureza tradicionalmente definida da RCU e dos dois modos de DGC, e os resultados abaixo foram todos apresentados como porcentagens.
- Relação partícula/proteína após RCU definida na etapa 6.2.9: partículas após UC/teor de proteínas após UC (μg).
- Relação partícula/proteína no modo Top-down: partículas totais em F6-F8/teor de proteína em F6-F8 (μg).
- Relação partícula/proteína no modo Bottom-up: partículas totais em F6-F8/teor de proteína em F6-F8 (μg).
- Selecione o modo de centrifugação mais adequado (o modo Top-down foi selecionado no protocolo) para purificação fecal de BEV e análises futuras.
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Representative Results
Determinar a distribuição das frações enriquecidas com BEV
Para determinar a distribuição das frações enriquecidas com vesículas extracelulares bacterianas (BEVs), um controle em branco foi estabelecido para medir os valores de absorbância em OD 340 nm, e a densidade de cada fração foi calculada com base nas medidas e diretrizes de iodixanol (Passo 8.1). A Tabela 2 apresenta os resultados de densidade, demonstrando que as frações F4 a F9 exibiram densidades dentro da faixa tipicamente associada a vesículas extracelulares. Esse achado sugeriu que a maioria dos BEVs foi isolada nessas frações, levando à definição de F4-F9 como a faixa aproximada para BEVs. A microscopia eletrônica de transmissão (MET) foi empregada para caracterizar as características morfológicas dos BEVs fecais isolados como mostrado na Figura 1 nas frações F4-F9. As imagens de ETM (Figura 2) revelaram a presença de estruturas clássicas em forma de taça, características dos BEVs. Análises de rastreamento de nanopartículas (NTA) e ensaio de ácido bicinconínico (BCA) foram conduzidos para determinar o número de partículas e a concentração de proteínas, respectivamente, permitindo uma avaliação mais aprofundada das taxas de recuperação e pureza. A Figura 3 apresenta as concentrações de proteínas e partículas para cada fração, indicando que F6 e F7 apresentaram as maiores concentrações, seguidas por F5 e F8. Posteriormente, a coloração de azul brilhante de Coomassie (CBBS) e o western blotting (WB) foram realizados para fornecer uma análise global da proteína. Os resultados da CBBS foram consistentes com os achados de concentração de proteínas, com F6 e F7 exibindo as bandas mais intensas (Figura 4). Para confirmar a distribuição dos BEVs, vesículas extracelulares derivadas de Escherichia coli foram empregadas como controle positivo (definido no Passo 8.5.13). Os procedimentos de isolamento e purificação seguiram os passos descritos na Tabela de Materiais e nas seções do protocolo supracitado (Passos 3, 4). A análise WB confirmou ainda a presença da proteína A da membrana externa (OmpA), um componente principal da membrana externa das bactérias e um marcador específico para BEVs, nas frações F6-F8. Com base nesses resultados, as frações F6-F8 foram definidas como frações enriquecidas com BEV adequadas para experimentos e análises subsequentes.
Verificação da faixa de apresentação dos componentes de interferência
Vesículas extracelulares (EEVs) eucarióticas, que possuem tamanho e densidade semelhantes aos BEVs, foram identificadas como uma interferência importante na análise de BEVs. Para resolver isso, três proteínas EEV foram sondadas nas frações 5-8 dos modos Top-down e Bottom-up, com tempos de centrifugação de 7 h e 15 h. CD63, uma proteína transmembrana associada ao EEV, foi predominantemente detectada em F5, enquanto o marcador BEV LPS foi enriquecido nas frações 6-7. Esse padrão foi observado em ambos os modos, embora o modo Bottom-up tenha exibido leve bandagem dos EEVs CD63 em F7. Entretanto, outros marcadores EEV, CD9 e TSG-101, não mostraram sinais visíveis nessas frações, independentemente dos modos ou tempos de centrifugação. Em um empreendimento experimental independente, anticorpos direcionados à Sintenina e à Integrina β1 foram empregados para determinar o enriquecimento de marcadores proteicos distintos inerentes a EEVs através das frações 5-8. A sintensina foi detectada com destaque em F5, particularmente no âmbito da abordagem Top-down, enquanto a presença de integrina β1 foi detectada em F6 (Figura 5). Para avaliar melhor a presença de partículas interferentes, a lipoproteína de baixa densidade marcada com Dil (LDL-Dil) foi introduzida no sistema de gradiente de densidade, e a intensidade da fluorescência foi medida em todas as frações. No modo Top-down, as frações 1-4 exibiram valores de fluorescência relativamente mais altos, enquanto no modo Bottom-up foi F1-F6 que apresentou maiores intensidades (Figura 6).
Avaliar as taxas de recuperação e pureza de dois modos DGC a partir da concentração, tamanho de partícula e marcadores de BEVs
Após a identificação das frações F6-F8 como frações enriquecidas com BEV, as taxas de recuperação e a pureza dos dois modos de centrifugação por gradiente de densidade (DGC) foram avaliadas. Os tamanhos de partículas das frações enriquecidas com BEV obtidas apenas dos modos Top-down, Bottom-up e ultracentrifugação (UC) foram comparados. Os tamanhos de partículas observados em ambos os modos de centrifugação variaram de 90 a 300 nm, alinhando-se com o diâmetro definido dos BEVs (Figura 7). Em seguida, as taxas de recuperação de partículas e proteínas dos dois modos foram calculadas com base nas concentrações de partículas e proteínas antes e após a DGC (Tabela 3 e Figura 8). Notavelmente, o modo Bottom-up exibiu taxas de recuperação mais altas em comparação com o outro modo. Em um grupo experimental separado, a recuperação de proteínas nos dois modos foi avaliada em diferentes tempos de centrifugação de 7 h e 15 h. É importante ressaltar que não houve diferença estatisticamente significativa no conteúdo de proteína dentro das frações F6-F8 após DGC entre os dois tempos de centrifugação, independentemente do modo de gradiente utilizado (Figura 9). A relação partícula/proteína foi calculada para fornecer uma avaliação aproximada da pureza nos dois modos. Os dados indicaram que não houve diferença significativa na pureza entre os modos. Adicionalmente, a coloração azul brilhante de Coomassie (CBBS) e o western blotting (WB) foram realizados para comparar ainda mais a pureza, focando em três marcadores BEV (LPS, OmpA e LTA), um marcador EEV (CD63) e dois marcadores contaminantes (Calnexin, Flagellin). Os resultados demonstraram uma redução parcial das substâncias interferentes após a DGC, com LPS e OmpA mostrando uma presença mais proeminente em ambas as modalidades de DGC em comparação com a RCU isolada (Figura 10).
Figura 1: Fluxo de trabalho esquemático de isolamento e purificação de BEVs. Abreviações: BEVs = vesículas extracelulares bacterianas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagens representativas de MET de frações BEV. (A) Imagens de TEM de BEVs isolados após RCU. (B) Imagens de ETM de BEVs isolados após DGC usando o modo Top-down. (C) Imagens de MET de BEVs isolados após DGC usando o modo Bottom-up. Todas as imagens foram apresentadas em uma escala consistente de 200 nm. Abreviações: TEM = microscópio eletrônico de transmissão; BEVs = vesículas extracelulares bacterianas; RCU = ultracentrifugação; DGC = centrifugação por gradiente de densidade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Concentração de proteínas e partículas das frações de BEV após os modos DGC Top-down e Bottom-up. A concentração proteica das frações do BEV foi determinada usando BCA e é representada pelas barras cinzas. A concentração de partículas foi medida usando NTA e é representada pelas barras azuis. Abreviações: BEV = vesícula extracelular bacteriana; DGC = centrifugação por gradiente de densidade; BCA = ensaio do ácido bicinconínico; NTA = análise de rastreamento de nanopartículas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Determinação das fracções enriquecidas com BEV. (A) A CBBS foi realizada para determinar as frações enriquecidas com BEVs fecais nos modos Top-down e Bottom-up. (B) EVs derivados de Escherichia coli foram isolados, purificados e utilizados como controle positivo em WB para confirmar a presença e distribuição de BEVs. OmpA: Proteína A da membrana externa, um marcador BEV. Abreviações: BEV = vesícula extracelular bacteriana; CBBS = coloração azul brilhante de coomassie; EVs = vesículas extracelulares; WB = western blotting. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Confirmação da distribuição do EEV. Análise por Western blot das frações 5-8 obtidas dos modos Top-down e Bottom-up DGC com diferentes durações de ultracentrifugação com gradiente de densidade, 7 h (A) e 15 h (B). Um ensaio independente enfocando F5 a F8 resultante de um período de centrifugação de 7 horas foi realizado, como demonstrado em (C) e (D). Os marcadores selecionados incluíram aqueles associados a BEVs (LPS) e EEVs (CD63, CD9, TSG-101, Sintenina, Integrina β1). Abreviações: DGC = centrifugação por gradiente de densidade; BEV = vesícula extracelular bacteriana; EEV = vesícula extracelular eucariótica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Distribuição da lipoproteína de baixa densidade. A lipoproteína de baixa densidade marcada com Dil (LDL-Dil), considerada um marcador de contaminação, foi adicionada na concentração de 10 μg ao sistema gradiente nos modos Top-down e Bottom-up. Dil-LDL substituiu a solução PBS/BEV (Passo 6.1.1 e Passo 6.2.2) para estabelecer um modelo de detecção. A intensidade de fluorescência de cada fração foi medida usando um detector de microplacas com comprimento de onda de excitação/emissão de 549/565 nm. Abreviação: BEV = vesícula extracelular bacteriana. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Granulometria das frações enriquecidas com BEV. (A) Distribuição granulométrica dos BEVs brutos obtidos após UC. (B) Distribuição granulométrica de frações enriquecidas com BEV (F6-F8) obtidas usando o modo de centrifugação por gradiente de densidade descendente (DGC). (C) A distribuição granulométrica das frações enriquecidas com BEV (F6-F8) foi obtida usando o modo Bottom-up DGC. A NTA foi realizada para quantificar as dimensões das partículas. Os fatores de diluição empregados para os painéis (A-C) foram 10.000, 2.000 e 5.000, correspondentemente, com os resultados subsequentes calibrados. Abreviações: BEV = vesícula extracelular bacteriana; RCU = ultracentrifugação; DGC = centrifugação por gradiente de densidade; NTA = análise de rastreamento de nanopartículas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Taxas de recuperação de proteínas e partículas dos modos DGC Top-down e Bottom-up. (A) Taxas de recuperação de proteínas dos dois modos calculadas como a razão da concentração de proteínas após e antes de DGC (UC). (B) As taxas de recuperação de partículas dos dois modos são calculadas pela razão da concentração de partículas após e antes da DGC (UC). (C) Razões partícula/proteína dos modos UC, Top-down e Bottom-up. Os dados são apresentados como média ± EPM. A análise estatística foi realizada por meio do teste t bicaudal não pareado para os painéis A e B e análise de variância (ANOVA) one-way com teste post hoc de Tukey para o painel C. Não foram observadas diferenças significativas. Abreviações: DGC = centrifugação por gradiente de densidade; UC = ultracentrifugação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: Comparação da recuperação de proteínas com base nos modos DGC Top-down e Bottom-up usando diferentes tempos de ultracentrifugação associados à densidade. As taxas de recuperação de proteínas nas frações F6-F8 obtidas a partir de ultracentrifugação por gradiente por 7 h e 15 h foram avaliadas em experimentos independentes usando os modos Top-down e Bottom-up. Os dados são apresentados como média ± EPM. A análise estatística foi realizada por meio da análise de variância (ANOVA) two-way com teste de diferença mínima significativa de Fisher. Não foram observadas diferenças significativas. Abreviações: DGC = centrifugação por gradiente de densidade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 10: Avaliação da pureza dos modos DGC Top-down e Bottom-up. (A) A CBBS foi conduzida para comparar a distribuição proteica dos modos UC, Top-down e Bottom-up. (B) WB foi conduzido para avaliar a pureza dos modos UC, Top-down e Bottom-up. Calnexina: marcador proteico associado ao retículo endoplasmático; Flagelina, marcador proteico contaminante de bactérias. CD63: marcador proteico transmembrana para vesículas extracelulares eucarióticas; LTA: marcador BEVs de bactérias gram-positivas; LPS, OmpA: marcadores BEVs de bactérias gram-negativas. Abreviações: DGC = centrifugação por gradiente de densidade; RCU = ultracentrifugação; CBBS = coloração Coomassie Brilliant Blue; WB = western blotting. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Concentração da solução de iodixanol (%) | Buffer HEPES de 0,02 M | Solução de trabalho de 50% Iodixanol |
| 40 | 1 | 4 |
| 20 | 3 | 2 |
| 10 | 4 | 1 |
Tabela 1: Razões para a preparação de buffers de gradiente de densidade de iodixanol. A tabela forneceu a relação entre tampão HEPES 0,02 M e solução de trabalho de iodixanol a 50% para obter uma determinada concentração de solução de iodixanol.
| F1 | F2 | F3 | F4 | F5 | F6 | F7 | F8 | F9 | F10 | |
| Densidade (g/mL) | 1.023 | 1.038 | 1.049 | 1.062 | 1.074 | 1.098 | 1.144 | 1.185 | 1.239 | 1.293 |
Tabela 2: Densidade do sistema de centrifugação por gradiente de densidade baseado em iodixanol. A tabela mostrou a densidade de cada fração em um sistema de centrifugação por gradiente de densidade baseado em iodixanol. Controle em branco: sistema de gradiente baseado em PBS.
| Modo de cima para baixo | Modo ascendente | |
| Taxa de recuperação de partículas (%) | 24.08 | 35.69 |
| Taxa de recuperação de proteína (%) | 24.5 | 32.45 |
Tabela 3: Taxas de recuperação de partículas e proteínas de dois modos. A tabela mostra as taxas de recuperação de partículas e proteínas dos modos Top-down e Bottom-up (Figura 8).
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Discussion
As vesículas extracelulares bacterianas (VEB) são nanopartículas de bicamada lipídica secretadas por bactérias, carregando uma riqueza de proteínas, lipídios, ácidos nucléicos e outras moléculas bioativas, contribuindo para mediar os efeitos funcionais das bactérias20. Verificou-se que os BEVs derivados do intestino estão envolvidos no desenvolvimento de doenças, como doença inflamatória intestinal, doença de Crohn e câncer colorretal, além de afetar o metabolismo geral e mediar comprometimento da função cognitiva 4,16,17,20,21,22,23,24,25,26 . Atualmente, a obtenção de informações biológicas completas e objetivas sobre BEVs de origem bacteriana intestinal a partir de espécimes-fezes humanos ainda é limitada por uma série de fatores, entre os quais o primeiro e principal questão fundamental é como isolar BEVs do complexo ambiente hospedeiro.
Os principais métodos de isolamento de BEVs, como ultracentrifugação (UC), centrifugação por gradiente de densidade (DGC) e cromatografia de exclusão de tamanho (SEC)13,14,15,16,17, possuem tanto upsides quanto downsides. A dificuldade em remover algumas substâncias interferentes e a falta de procedimentos operacionais coerentes, que afetam seriamente uma análise mais realista e abrangente dos BEVs, continuam a ser desafios para o processo de separação. Para amenizar os efeitos indesejáveis das interferências, muitos estudos 15,27,28 combinaram dois ou mais dos métodos acima para conseguir a separação dos VEB, particularmente dos fluidos corpóreos, mas procedimentos complexos tendem a afetar a estabilidade dos resultados. Para os BEVs, a diferença de densidade com outros contaminantes (por exemplo, agregados proteicos, componentes lipídicos, vesículas extracelulares eucarióticas (EEVs)15) pode se tornar um meio específico de isolamento atualmente.
Atualmente, o iodixanol tem emergido como o meio preferido para a separação por gradiente de densidade de EVs, substituindo a sacarose devido às suas propriedades isotônicas. Essas propriedades contribuem para preservar a morfologia do EV e facilitar a estimativa da densidade para cada fração29. Em alinhamento com Tulkens e cols.15, nosso estudo adotou uma concentração idêntica para o sistema DGC, utilizando iodixanol nas camadas de gradiente de concentração de 50% (p/v), 40% (p/v), 20% (p/v),10% (p/v) e 0%. A etapa inicial envolveu o uso de tampão HEPES para preparar várias concentrações de soluções de iodixanol. Quando comparado ao tampão Tris (-EDTA)-sacarose, uma concentração apropriada do tampão HEPES garante a estabilidade do pH a longo prazo dentro do sistema de centrifugação, graças às suas propriedades intrínsecas. Concomitantemente, tampão PBS estéril foi empregado na camada superior do sistema de centrifugação, não apenas para proteger contra a contaminação potencial por bactérias e seus metabólitos durante o preparo da solução, mas também para manter a consistência do tampão da amostra pré e pós-DGC. Isso envolveu a ressuspensão do pellet com tampão PBS após UC e a substituição de iodixanol por PBS após DGC, facilitando assim uma análise comparativa dos resultados. Além disso, o volume de cada camada de gradiente dentro do sistema DGC foi calibrado para 3 mL, 3 mL, 3 mL, 3 mL e 3,5 mL para soluções de iodixanol a 50%, 40%, 20%, 10% e 0% (camada PBS), respectivamente. Essa estratégia auxilia no estabelecimento de uma faixa de densidade relativamente mais ampla (1,02-1,30 g/mL), potencialmente aumentando a separação dos BEVs de outros elementos interferentes, tornando os gradientes aplicáveis a outros fluidos corporais com contaminação complexa.
É importante ressaltar que algumas etapas do protocolo são cruciais. Notavelmente, o fator de diluição descrito na Etapa 2.2, onde 1 g de amostras fecais é misturado com um mínimo de 10 mL de PBS, é fundamental para prevenir a supersaturação e conservar os recursos experimentais. Nessas condições, a concentração de partículas e proteínas geralmente aumenta proporcionalmente com a massa fecal de uma amostra, supondo que outras características fecais sejam constantes. Se necessário, uma análise adicional considerando fatores como consistência, lipoproteína ou conteúdo sanguíneo pode ser realizada. Durante o Passo 3.4, deve-se ter cuidado para evitar derramar diretamente a solução, pois isso pode perturbar o pellet, potencialmente causando grânulos maiores para obstruir a membrana do filtro de 0,22 μm. Se o filtro ficar rapidamente saturado (por exemplo, se menos de 10 ml passar por um filtro), é aconselhável um passo adicional de centrifugação a 12.000 × g . No contexto da centrifugação por gradiente de densidade, a preparação precisa de soluções de gradiente é um pré-requisito para resultados confiáveis. Além disso, a manipulação cuidadosa do tubo ao estratificar as soluções superiores de baixa densidade é essencial para evitar a ruptura da estratificação, e quaisquer bolhas devem ser eliminadas por pipetagem atenta. Finalmente, ao aspirar as frações, é importante retirá-las meticulosamente ao longo da parede do tubo, evitando qualquer sobreaspiração ou subaspiração que possa levar a uma distribuição imprecisa do VEB. A observação regular do nível de líquido e a prática consistente podem ajudar a mitigar esse problema.
Este estudo determinou as frações enriquecidas com BEVs (F6-F8) usando métodos de caracterização múltipla e explorou dois modos distintos de ultracentrifugação em gradiente: Top-down e Bottom-up. Através da medição da concentração de proteínas e partículas em F4-F8 (Figura 3) e comparando as taxas de recuperação e pureza (Figura 8 e Figura 10), observou-se que o modo de centrifugação Bottom-up produziu valores mais elevados detectados em ambos os níveis de proteína e partícula do que o método alternativo em isolar e purificar BEVs de amostras fecais. Essa observação implica diferentes processos dinâmicos. Foi proposta a hipótese de que nanopartículas extracelulares não vesiculares (NVEPs)29, como lipoproteínas, com densidade menor que os BEVs, podem não atingir suas densidades flutuantes se as amostras forem carregadas no fundo (Figura 6), potencialmente causando uma taxa de recuperação inflada, mesmo após 15 h de DGC (Figura 9). Essa observação requer considerar se a definição tradicional de pureza, baseada na proporção de partículas e proteínas, é aplicável. Além disso, vale ressaltar que os EEVs exibiram preponderância dentro de F5, enquanto os BEVs foram detectados com destaque em F6-F7 (Figura 4 e Figura 5). Notavelmente, essa diferenciação pareceu ser acentuada ao adotar o modo Top-down. Assim, essa modalidade pode ser mais adequada para esse protocolo. No entanto, é essencial destacar a presença de integrina β1 em F6, potencialmente significando a heterogeneidade intrínseca entre os EEVs. Ao aplicar esse método a outros fluidos corporais, como sangue e urina, os pesquisadores devem considerar as características únicas das amostras. O tempo de centrifugação definido neste protocolo é de 7 h, significativamente menor que o tempo citado em outros estudos, que pode chegar a 18 h. Quando comparado à recuperação proteica com duração de 15 h executada no mesmo padrão deste estudo (Figura 9), esse tempo parece suficiente para atingir a pureza de separação requerida. Nessas condições operacionais, a recuperação de partículas no modo Top-down atingiu até 10 8 (4,5 × 10 7-1,5 × 10 8) por miligrama de fezes, alinhando-se com relatos anteriores (10a 11 BEVs por grama de fezes úmidas)15,29,30. Por fim, as medidas de densidade de cada fração do controle em branco confirmaram que a densidade de BEVs variou de 1,09-1,19 g/mL, o que é consistente com pesquisas anteriores.
Este método, embora eficaz, apresenta uma limitação devido ao impacto das dietas, função intestinal e outros fatores sobre a composição fecal. Essas variáveis podem alterar a consistência fecal, potencialmente afetando a abundância bacteriana e a recuperação do BEV. Portanto, é fundamental padronizar o isolamento e a purificação dos BEVs31,32, com ajustes feitos com base na avaliação das características fecais. Pesquisas futuras devem se concentrar na identificação de um padrão para normalizar o rendimento de BEV, semelhante à creatinina urinária ou à taxa de fluxo urinário. Tal referência poderia melhorar a avaliação metodológica e iluminar a ligação entre os BEVs fecais e o estado fisiológico e patológico do organismo. Além disso, a forte associação entre BEVs fecais e várias doenças ressalta seu significativo potencial clínico. No entanto, o tempo de centrifugação estipulado neste protocolo não atende à demanda por testes mais convenientes e rápidos como os clínicos. Portanto, mais investigações são necessárias para determinar se tempos de centrifugação mais curtos, talvez inferiores a 3 h, podem produzir resultados equivalentes. Uma exploração mais aprofundada também é necessária para entender os eventos que ocorrem em ambos os modos de centrifugação. Embora se postule que componentes não-vesiculares são mais enriquecidos em F6-F8 no modo Bottom-up, refinar as concentrações de gradiente pode ser benéfico na identificação de subtipos adicionais com funções específicas.
Este estudo demonstrou com sucesso o isolamento e purificação de BEVs de fezes humanas usando DGC. A estratégia é promissora para aplicação em outros espécimes biológicos, como sangue, urina e saliva, fornecendo aos pesquisadores uma abordagem eficaz para descobrir informações ocultas dos BEVs, potencialmente avançando as aplicações clínicas.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflito de interesses.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo National Science Fund for Distinguished Young Scholars (82025024); o projeto-chave da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82230080); o Programa Nacional de P&D da China (2021YFA1300604); a Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (81871735, 82272438 e 82002245); Fundo de Ciências Naturais de Guangdong para Jovens Académicos Ilustres (2023B1515020058); Fundação de Ciências Naturais da Província de Guangdong (2021A1515011639); o Programa Estadual de Desenvolvimento de Pesquisa Básica da Fundação de Ciências Naturais da Província de Shandong, na China (ZR2020ZD11); a Fundação de Ciência Pós-doutoral (2022M720059); o Esquema de Desenvolvimento de Jovens Excepcionais do Hospital Nanfang, Southern Medical University (2022J001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 % (w/v) glutaraldehyde (prepared from 2.5 % stock solution in deionized water) | ACMEC | AP1126 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.3 |
| 1 % (w/v) methylcellulose (prepared from original powder in deionized water) | Sigma-Aldrich | M7027 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.6 |
| 1.5 % (w/v) uranyl acetate (prepared from original powder in deionized water) | Polysciences | 21447-25 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.5 |
| 1000 μL, 200 μL, 10 μL Pipette | KIRGEN | KG1313, KG1212, KG1011 | Transfer the solution |
| 5 % (w/v) bovine serum albumin solution (prepared from the original powder in TBST buffer) | Fdbio science | FD0030 | Used in western blotting for blocking at Step 8.5.6 |
| 5 × loading buffer | Fdbio science | FD006 | Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5.1 |
| 75 % (v/v) alcohol | LIRCON | LIRCON-500 mL | Surface disinfection |
| 96-well plate | Rar | A8096 | Measure the absorbance values |
| Anti-Calnexin antibody | Abcam | ab92573 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-CD63 antibody | Abcam | ab134045 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-CD9 antibody | Abcam | ab236630 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-Flagellin antibody | Sino Biological | 40067-MM06 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-Integrin beta 1 antibody | Abcam | ab30394 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-LPS antibody | Thermo Fisher | MA1-83152 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-LTA antibody | Thermo Fisher | MA1-7402 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-OmpA antibody | CUSABIO | CSB-PA359226ZA01EOD, https://www.cusabio.com/ | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-Syntenin antibody | Abcam | ab133267 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-TSG101 antibody | Abcam | ab125011 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Autoclave | ZEALWAY | GR110DP | Sterilization for supplies and mediums used in the experiment |
| Balance | Mettler Toledo | AL104 | Balance the tube sample-loaded with PBS |
| Bicinchoninic acid assay | Fdbio science | FD2001 | Measure protein content of BEVs at Step 8.2 |
| BioRender | BioRender | https://app.biorender.com | Make the schematic workflow of BEVs isolation and purification showed in Figure 1 |
| Biosafety cabinet | Haier | HR1200- II B2 | Peform the procedures about feces sample handling |
| Centrifuge 5810 R; Rotor F-34-6-38 | Eppendorf | 5805000092; 5804727002, adapter: 5804774000 | Preprocess for BEVs (Step 3) |
| Chemiluminescence Apparatus | BIO-OI | OI600SE-MF | Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12 |
| Cytation 5 | BioTek | F01 | Microplate detector for measuring the absorbance (Step 8.1) and fluorescence (Figure 6) values |
| Dil-labled low density lipoprotein | ACMEC | AC12038 | Definition of distribution of interfering components |
| Electrophoresis equipment | Bio-rad | 1658033 | Used in western blotting for protein separation and transfer at Step 8.5.2, 8.5.3, 8.5.5 |
| Enhanced Chemiluminescence kit HRP | Fdbio science | FD8020 | Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12 |
| Escherichia coli | American Type Culture Collection | ATCC8739 | Isolate BEVs as a positive control. Protocol: Dissolve 25 g of the LB powder in 1 L deionized water, and autoclave. Transfer the 800 μL of preserved Escherichia coli into the medium. Cultivate at 37 °C in the incubator shaker. Then centrifuge at 3, 000 × g for 20 min at 4 °C, 12, 000 × g for 30 min at 4 °C, filter the supernatant through 0.22 μm membrane, and perform ultra-speed centrifugation at 160, 000 × g for 70 min at 4 °C. Pellet defined as crude BEVs from Escherichia coli was suspended in 1.2 mL PBS (Step 3, 4). |
| Falcon tubes 50 mL | KIRGEN | KG2811 | Preprocess for BEVs (Step 3) |
| Feto Protein Staining Buffer | Absci | ab.001.50 | Coomassie brilliant blue staining at Step 8.5.4 |
| Filter paper | Biosharp | BS-TFP-070B | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 (Blotting the solution) |
| Formvar/Carbon supported copper grids | Sigma-Aldrich | TEM-FCF200CU50 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 |
| HEPES powder | Meilunbio | MB6078 | Prepare iodixanol buffers with different concentrations for density gradient centrifugation |
| HRP AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Fdbio science | FDM007 | Western blotting (Secondary Antibody) |
| HRP AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Fdbio science | FDR007 | Western blotting (Secondary Antibody) |
| Incubator shaker | Qiangwen | DHZ-L | Cultivate Escherichia coli |
| Kimwipes™ Delicate Task Wipes | Kimtech Science | 34155 | Wipe the inner wall of the ultracentrifuge tube at Step 4.15 |
| LB broth | Hopebio | HB0128 | Cultivate Escherichia coli |
| Low temperature freezer (-80 °C) | Haier | DW-86L338J | Store the samples |
| Methanol | Alalddin | M116118 | Used in western blotting for activating PVDF membrane at Step 8.5.5 |
| Micro tubes 1.5 mL | KIRGEN | KG2211 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
| Micro tubes 2 mL | KIRGEN | KG2911 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
| Micro tubes 5 mL | BBI | F610888-0001 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
| Microplate reader | Thermo Fisher | Multiskan MK3 | Measure protein content of BEVs at Step 8.2 |
| Millipore filter 0.22 μm | Merck millipore | SLGP033RB | Filtration sterilization; Material: polyethersulfone, PES |
| NaCl | GHTECH | 1.01307.040 | Density gradient centrifugation solution |
| NaOH | GHTECH | 1.01394.068 | Density gradient centrifugation solution (pH adjustment) |
| Optima™ XPN-100 | Beckman Coulter | A94469 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
| OptiPrep™ | Serumwerk Bernburg AG | 1893 | Density gradient centrifugation stock solution |
| Orbital Shaker | Youning | CS-100 | Dissolve feces at Step 2 |
| Phosphate buffered saline | Procell | PB180327 | Dissolve feces at Step 2 |
| Pipettor | Eppendorf | 3120000267, 3120000259 | Transfer the solution |
| Plastic pasteur pipette | ABCbio | ABC217003-4 | Remove supernatant in preprocessing at Step 3.4 |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes | Millipore | ISEQ00010, IPVH00010 | Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5 |
| Prefabricated polyacrylamide gel, 4–20% 15 Wells | ACE | F15420Gel | Used in western blotting for protein separation at Step 8.5.2, 8.5.3 |
| Primary antibody diluent | Fdbio science | FD0040 | Used in western blotting at Step 8.5.8 |
| Protein ladder | Fdbio science | FD0672 | Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5 |
| Rapid protein blotting solution | UBIO | UW0500 | Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5 |
| Rotor SW 32 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 369650 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
| Syringe 20 mL, 50 mL | Jetway | ZSQ-20ML, YCXWJZSQ-50 mL | Transfer buffers amd remove supernatant in preprocessing |
| TBS powder | Fdbio science | FD1021 | Used in western blotting at Step 8.5 |
| Transmission electron microscope (TEM) | Hitachi | H-7650 | Morphological observation for BEVs at Step 8.3 |
| Tween-20 | Fdbio science | FD0020 | Used in western blotting at Step 8.5 |
| Ultracentrifuge tube | Beckman | 326823, 355642 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
| Ultra-clean bench | AIRTECH | SW-CJ-2FD | Peform the procedures about liquid handling |
| Water bath | Bluepard | CU600 | Used for measuring protein content of BEVs at Step 8.2.5 |
| ZetaView | Particle Metrix | S/N 21-734, Software ZetaView (version 8.05.14 SP7) | Nanoparticle tracking analysis (NTA) for measuring the particle size and concentrarion of BEVs at Step 8.4 |
References
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