Summary
이 연구는 밀도 구배 원심분리(DGC)를 통해 인간의 대변에서 농축된 박테리아 세포외 소포체(BEV)를 분리 및 정제하는 방법을 설명하고, 형태, 입자 크기 및 농도에서 BEV의 물리적 특성을 식별하고, 임상 및 과학 연구에서 DGC 접근 방식의 잠재적 응용 분야에 대해 논의합니다.
Abstract
박테리아 세포외 소포체(BEV)는 박테리아-박테리아 및 박테리아-숙주 통신에 적극적인 역할을 하는 박테리아에서 파생된 나노소포체로, 모체 박테리아에서 물려받은 단백질, 지질 및 핵산과 같은 생체 활성 분자를 전달합니다. 장내 미생물군에서 유래한 BEV는 위장관 내에서 영향을 미치고 멀리 떨어진 장기에 도달할 수 있어 생리학 및 병리학에 상당한 영향을 미칩니다. 인간의 대변에서 유래한 BEV의 유형, 수량 및 역할을 탐구하는 이론적 연구는 장내 미생물군에서 BEV의 분비와 기능을 이해하는 데 매우 중요합니다. 이러한 조사는 또한 BEV를 분리하고 정제하기 위한 현재 전략의 개선을 필요로 합니다.
이 연구는 하향식(Top-down)과 상향식(Bottom-up)의 두 가지 밀도 구배 원심분리(DGC) 모드를 설정하여 BEV의 분리 및 정제 프로세스를 최적화했습니다. BEV의 농축 분포는 분획 6 내지 8(F6-F8)로 결정하였다. 접근법의 효과는 입자 형태, 크기, 농도 및 단백질 함량을 기반으로 평가되었습니다. 입자 및 단백질 회수율을 계산하고 특정 마커의 존재를 분석하여 두 DGC 모드의 회수율과 순도를 비교했습니다. 그 결과 하향식 원심분리 모드는 오염 수준이 낮고 상향식 모드와 유사한 회수율과 순도를 달성한 것으로 나타났습니다. 7시간의 원심분리 시간은 108/mg의 분변 BEV 농도를 달성하기에 충분했습니다.
대변 외에도 이 방법은 성분과 점도의 차이에 따라 적절하게 수정하여 다른 체액 유형에 적용할 수 있습니다. 결론적으로, 이 상세하고 신뢰할 수 있는 프로토콜은 BEV의 표준화된 분리 및 정제를 용이하게 하여 후속 다중 오믹스 분석 및 기능 실험을 위한 토대를 마련할 것입니다.
Introduction
소화관은 인체에서 가장 풍부한 미생물 군집을 보유한 기관으로 널리 알려져 있으며, 박테리아의 90% 이상이 집락 형성 및 증식에 관여합니다 1,2. 장내 미생물총(microbiota)이 장내 미세환경을 조절하고 동시에 주로 손상된 장 장벽(intestal barrier)을 통해 멀리 떨어진 장기의 기능 장애와 상호 작용한다는 광범위한 증거가 입증되었습니다 3,4. 장내 미생물군의 불균형과 염증성 장 질환(IBD)5,6 및 장-뇌 축 을 통한 인지 장애(5,6,7,8)의 진행 사이에 상관관계가 있다는 증거가 늘어나고 있습니다. 박테리아에 의해 생성되는 박테리아 세포외 소포체(BEV)는 이러한 병리학적 과정에서 중요한 역할을 합니다.
BEV는 직경이 20nm에서 400nm에 이르는 박테리아 유도체를 캡슐화하는 나노 크기의 입자입니다. 박테리아와 숙주 유기체 사이의 상호작용을 촉진하는 것으로 입증되었다 9,10. 눈에 보이지 않음에도 불구하고, 이러한 입자는 진단 바이오마커, 치료 표적 및 약물 전달 수단으로서 광범위한 응용 분야로 인해 연구자들로부터 점점 더 많은 관심을 받고 있습니다11. BEV 연구를 위한 생체 표본으로 자주 사용되는 인간 대변은 주로 장내 세균에서 추출하며 물, 박테리아, 지질, 단백질, 소화되지 않은 음식물 찌꺼기, 박리된 상피 세포의 복잡한 혼합물을 함유하고 있습니다. 복잡한 배설물 구성은 BEV의 분리 및 순도에 문제를 제기하여 BEV에 대한 포괄적이고 객관적이며 현실적인 분석을 방해합니다. 따라서 오염 부품의 간섭을 최소화하고 BEV의 수율을 높이기 위한 효과적인 전략이 즉각적인 주의가 필요한 중요한 문제로 떠올랐습니다.
기존의 분리 전략은 초고속 원심분리(UC), 밀도 구배 원심분리(DGC) 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC)12,13,14,15,16,17과 같은 기술에 크게 의존합니다. 현재 DGC는 BEV 분리 분야에서 가장 널리 적용되는 방법 중 하나로, 시료의 초기 로딩 위치에 의해 결정되는 "하향식(Top-down)" 및 "상향식(Bottom-up)"의 두 가지 침전 부유 모드를 포함합니다. 이러한 방법론은 크기 및 밀도 차이에 따라 세포외 소포체(EV)를 다른 구성 요소와 구별하여 다양한 순도와 회수율을 제공합니다. 선행 연구에 따르면 단일 접근법 전략은 혈액 내 지단백질18 및 소변 내 Tamm-Horsfall 단백질과 같은 체액 샘플의 용해성 단백질에서 EV를 적절하게 분리하는 데 불충분하다고 합니다19. 또한 진핵 세포외 소포체(EEV)의 크기 분포는 BEV의 크기 분포와 겹치는 경우가 많으므로 BEV 수율을 최적화하기 위해 추가적인 방법론적 개선이 필요합니다. 결과적으로 BEV 연구의 발전은 효과적인 분리 및 정제 방법론의 개발에 달려 있습니다. 특히, Tulkens et al15는 EEV에서 분변 BEV를 분리하기 위해 직교 생물물리학 전략을 사용했으며, 상향식 DGC 모드의 원심분리 시간은 최대 18시간이었습니다. 대조적으로, 이 연구는 이를 7시간으로 줄여 그래디언트-초원심분리 시간을 크게 절약하고 프로세스를 단순화했습니다.
본 연구에서는 저속에서 극도로 빠른 속도까지 다양한 차등 원심분리 속도로 BEV를 농축한 후 최적화된 완충 조건에서 두 가지 DGC 모드를 사용하는 분변 BEV를 분리하고 정제했습니다. 형태학, 입자 크기 및 농도를 기반으로 한 평가는 이 향상된 방법으로 칭찬할 만한 성능을 나타냈습니다. 이 연구는 향후 연구의 토대가 될 수 있으며, 더 넓은 영역으로 응용 분야를 확장하고 인체 내 BEV의 이질성에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 BEV 분리 및 분석 기술의 표준화에도 기여합니다.
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Protocol
남방의과대학 난팡병원 윤리위원회는 참가자들의 사전 동의 하에 진행된 이 연구를 승인했다. 여기에 사용된 모든 방법은 국제 인간 마이크로바이옴 표준(IHMS: http://www.microbiome-standards.org/)에서 제공하는 표준 운영 지침을 준수했습니다. 이후의 모든 액체 취급 절차는 생물 안전 캐비닛 또는 매우 깨끗한 벤치 내에서 수행되어야 했습니다.
1. 분변 샘플의 채취 및 분취
- 대변 샘플러, 밀봉된 백, 아이스 박스를 배포하고 참가자들에게 샘플을 조달하고 보존하는 방법에 대한 포괄적인 지침을 제공합니다.
- 각 참가자에게 제공된 샘플러를 사용하여 대변 샘플을 수집하고 24시간 이내에 4°C의 온도로 실험실로 운송하도록 지시합니다.
- 실험실에서 수령하면 멸균 스푼을 사용하여 3.5g 미만의 대변을 미리 칭량된 50mL 원심분리 튜브에 분주합니다. 후속 전처리 절차를 위해 튜브에 대변 샘플의 무게를 기록합니다.
일시 중지 지점: 샘플을 즉시 처리할 수 없는 경우 적절한 표기 후 -80°C에서 장기 보관을 위해 샘플을 할당합니다.
2. 대변 시료 전처리
- 500mL의 인산염 완충 식염수(PBS)를 4°C에서 식힙니다. 50mL 주사기를 사용하여 0.22μm 폴리에테르설폰(PES) 필터를 통해 사전 냉각된 PBS를 50mL 원심분리 튜브 10개에 넣습니다.
- 각각 3.5g의 분변 샘플이 들어 있는 두 개의 50mL 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 각 튜브에 35mL의 PBS를 추가합니다.
알림: 대변 용해에 필요한 PBS의 양을 계산하여 최대 샘플 농도 10%(w/v)를 보장합니다. 추가 샘플을 처리하는 경우 필요에 따라 더 많은 튜브를 사용하십시오. - 샘플을 300rpm에서 4°C에서 2시간 동안 흔들거나 대변이 완전히 눈에 띄게 부유할 때까지 최소 4°C에서 8시간 동안 둡니다.
3. 차동 속도 원심분리
- 고속 냉장 원심분리기를 4°C로 식힙니다.
- PBS를 사용하여 2.3단계에서 준비한 샘플이 들어 있는 두 튜브의 무게를 조정하여 총 무게가 0.1g에 도달하도록 합니다.
- 4 °C에 20 분 동안 3, 000 × g 에 표본을 분리하십시오.
- 상층액을 두 개의 깨끗한 50mL 원심분리기 튜브에 조심스럽게 피펫팅하여 펠릿 위에 약 1mL를 남겨 둡니다. 이 과정에는 일회용 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하십시오.
- PBS로 두 튜브의 무게를 조정하여 총 무게가 ± 0.1g 이내로 도달하도록 합니다.
- 4 °C에 30 분 동안 12, 000 × g 에 옮겨진 상청액을 분리하십시오.
- 20mL 주사기를 사용하여 상층액을 흡인하고 주사기 바늘을 제거한 다음 0.22μm 필터를 통해 50mL 튜브에 여과합니다. 이 시점에서 상층액 부피는 약 30mL여야 합니다.
알림: 12,000 × g의 원심분리 후에도 상당한 양의 불순물이 여전히 보이면 12,000 × g에서 4°C에서 30분 동안 원심분리 단계를 반복해야 합니다. 그렇게 하지 않으면 여과 중 기공 막힘으로 인해 BEV가 크게 손실될 수 있습니다.
4. 초고속 원심분리
- 로터와 버킷을 75%(v/v) 알코올로 닦아 청소하여 잔류 오염을 제거합니다.
- 38.5mL 초원심분리기 튜브를 튜브 홀더에 넣습니다.
알림: 샘플 부피에 따라 적절한 초원심분리기 튜브를 선택하십시오. 제품 설명서에 표시된 대로 원심 튜브를 살균하기 위해 자외선과 부적합한 화학 시약을 피하십시오. - 3.7단계에서 여과된 분변 상층액 약 30mL를 초원심분리 튜브로 옮깁니다.
- 초원심분리기 튜브에 약 8mL의 PBS를 채우고 튜브 입구에서 3mm의 간격을 둡니다.
- 두 개의 초원심분리기 튜브를 샘플과 함께 반대쪽 초원심분리 버킷에 놓습니다.ample, 버킷 1은 4(1-4), 2-5, 3-6에 해당합니다.
- PBS로 두 버킷의 무게를 조정하여 총 무게가 0.005g 이± 되도록 합니다.
- 튜브가 로드되었는지 여부에 관계없이 모든 버킷을 로터에 설치합니다.
- 진공을 시작하고 160,000× g 에서 4°C에서 70분 동안 샘플을 원심분리합니다.
- 챔버 진공을 해제하고 기기의 홈 페이지에 Ready가 표시되면 도어를 엽니다.
- 초원심분리기에서 로터를 제거합니다.
- 로터에서 랙으로 버킷을 이동하고 니퍼를 사용하여 튜브를 회수하십시오.
- 바닥에 눈에 띄는 갈색 알갱이가 포함된 상층액을 버리십시오.
- 펠릿이 완전히 부유될 때까지 1,000 μL 피펫과 1 mL의 사전 냉각된(4 °C) PBS를 사용하여 위아래로 반복적으로 피펫팅하여 펠릿을 재현탁시킵니다. 튜브에 약 37mL의 PBS를 채우고 입구에서 3mm의 간격을 둡니다.
- 4°C에서 70분 동안 160,000× g 에서 4.5-4.11단계에 따라 또 다른 초원심분리를 수행하여 튜브 벽에서 부분적으로 부착된 오염 성분을 제거합니다.
- 상층액을 버리고 두 개의 초원심분리기 튜브를 5분 동안 뒤집은 다음 와이퍼로 내벽에 남아 있는 용액을 제거합니다.
알림: 내벽을 청소하면 초원심분리기 튜브 벽에 부착된 잔류 오염으로 인한 간섭을 최소화할 수 있습니다. 특히 입자 크기와 관련하여 BEV 분석에 영향을 미치지 않는 와이퍼를 선택하십시오. - 1,000μL 피펫을 사용하여 1.2mL의 사전 냉각된(4°C) PBS로 위아래로 피펫팅하여 펠릿을 각 튜브에 재현탁시킵니다.
- PBS/BEV 용액 1.2mL를 하나의 초원심분리기 튜브에서 깨끗한 1.5mL 마이크로튜브로 옮깁니다.
일시 중지 지점: 하나의 초원심분리기 튜브에서 수집된 PBS/BEV 용액은 6단계로 진행할 수 있습니다. 다른 튜브의 용액을 -80°C에서 보관합니다.
5. 밀도 구배 원심분리를 위한 용액 준비
- 0.02M HEPES 완충액의 제조
- 0.477g의 HEPES 분말과 0.8g의 NaCl을 90mL의 오토클레이브 탈이온수와 결합합니다.
- 7.2M 수산화나트륨(NaOH)을 추가하여 pH를 1로 조정합니다. 탈이온수로 부피를 100mL로 낮추고 0.22μm PES 멤브레인을 통해 용액을 여과합니다.
주의 : 수산화 나트륨은 강한 부식성 알칼리입니다. 작업자는 흄 찬장에서 조심스럽게 취급하고 준비해야 합니다.
- 밀도 그래디언트 완충액의 제조
- 밀도 그래디언트 원심분리를 위한 초원심분리 튜브의 수를 기준으로 각 밀도 그래디언트 완충액의 필요한 부피를 계산합니다(단계 6)(이 프로토콜에서 60%, 50%, 40%, 20% 및 10% 그래디언트 용액의 부피는 각각 2.5mL, 3mL, 6mL, 6mL 및 6mL였습니다).
- 50%(w/v) 요오드릭사놀 작업 용액을 제조하기 위해 0.02M HEPES 완충액과 60%(w/v) 요오드릭사놀 원액을 1:5(0.5mL:2.5mL)의 부피 비율로 혼합합니다.
알림: 일회용 20mL 주사기를 사용하여 요오딕산올 원액을 빼내고 공기가 유입되지 않도록 하십시오. - 농도가 다른 요오딕산올 완충액을 제조하려면 표 1에 표시된 비율에 따라 1,000μL 피펫을 사용하여 5.2.2단계의 50% 요오딕산올 작동 용액과 5.1단계에서 얻은 HEPES 완충액을 결합합니다.
알림: 조명이 꺼진 상태에서 매우 깨끗한 벤치에서 5단계를 수행합니다. 개봉한 요오딕산올 원액을 4°C의 냉장고에 보관하여 박테리아 성장을 방지합니다. 요오드화 용액과 HEPES 완충액을 빛으로부터 보호하십시오.
6. 밀도 구배 원심분리 시스템 구축
- 하향식 DGC 모드
- 4단계에서 분리한 500μL의 PBS/BEV 용액과 3mL의 PBS를 결합합니다. 1,000μL 피펫을 사용하여 용액을 부드럽게 혼합하여 3.5mL의 PBS/BEV 용액을 얻습니다.
- 구멍이 있는 폼 플레이트에 31mL 초원심분리기 튜브를 놓고 "↓"라고 표시합니다.
- 1,000μL 피펫을 사용하여 50% 요오드산올 용액 3mL를 튜브 바닥에 수직으로 추가합니다.
- 튜브를 70° 각도로 기울이고 튜브 홀더 또는 기타 지지대를 폼 플레이트 높이보다 약간 높은 튜브 입구 아래에 배치합니다.
- 1,000μL 피펫을 사용하여 50% 요오드옥산올 용액 위에 40% 요오드산올 용액 3mL를 추가합니다.
- 1,000μL 피펫을 사용하여 40% 요오드옥산올 용액 위에 20% 요오드산올 용액 3mL를 추가합니다.
- 1,000μL 피펫을 사용하여 20% 요오드옥산올 용액 위에 10% 요오드산올 용액 3mL를 추가합니다.
- 1,000μL 피펫을 사용하여 10% 요오드옥산올 용액 위에 6.1.1단계에서 3.5mL의 PBS/BEV 용액을 추가합니다.
- 튜브를 부드럽게 똑바로 세웁니다.
참고: 피펫팅 후 층화가 보여야 합니다.
- 상향식 DGC 모드
- 구멍이 있는 폼 플레이트에 31mL 초원심분리기 튜브를 놓고 "↑"라고 표시합니다.
- 60% 요오딕산올 원액 2.5mL를 튜브 바닥에 수직으로 추가합니다. 1,000μL 피펫을 사용하여 4단계에서 분리한 500μL의 PBS/BEV 용액과 부드럽게 혼합하여 3mL의 50% 요오드옥산올/BEV 용액을 얻습니다.
- 튜브를 70° 각도로 기울이고 튜브 홀더 또는 기타 지지대를 폼 플레이트 높이보다 약간 높은 튜브 입구 아래에 배치합니다.
- 1,000μL 피펫을 사용하여 50% 요오드화올/BEV 용액 위에 40% 요오드산올 용액 3mL를 추가합니다.
- 1000μL 피펫을 사용하여 3% 요오드산올 용액 위에 20% 요오드산올 용액 40mL를 추가합니다.
- 1000 μL 피펫을 사용하여 20% 요오드산올 용액 위에 10% 요오드산올 용액 3mL를 추가합니다.
- 1,000μL 피펫을 사용하여 10% 요오드산올 용액 위에 3.5mL의 PBS를 추가합니다.
- 튜브를 부드럽게 똑바로 세웁니다.
- 이 시점에서, 단계 4.17에서 수득한 현탁액의 200μL가 남았으며, 이는 "UC"라는 그룹으로 이후에 분석될 수 있다.
알림: 6단계에서 용액을 이송할 때 항상 피펫 팁을 튜브 축에 수직인 초원심분리기 튜브 벽에 대고 유지하십시오.
7. 밀도 구배 원심분리 및 분획 수집
- PBS로 두 튜브의 무게를 조정하여 총 무게를 ± 0.005g 이내로 만듭니다.
- 4.5단계에 따라 튜브를 버킷에 넣고 4°C에서 7시간 동안 160,000× g 에서 원심분리합니다.
- 피펫터(1000 μL)를 사용하여 38.5 mL 초원심분리 튜브에 3 mL, 2 mL, 1 mL, 1 mL, 1 mL, 1 mL, 1 mL 및 3 mL의 순서로 측벽에 대해 위에서 아래로 분획을 수집합니다.
알림: 시선을 액체 표면과 같은 높이로 유지하십시오. - 4°C에서 70분 동안 160,000× g 에서 4단계에 따라 7.3단계에서 얻은 각 분획에 대해 초원심분리를 수행합니다.
- 상층액을 제거하고 초원심분리기 튜브를 5분 동안 뒤집습니다.
- 200μL 피펫을 사용하여 200μL의 사전 냉각된(4°C) PBS에 펠릿을 재현탁시킵니다.
- PBS/BEV 용액을 깨끗한 1.5mL 마이크로튜브에 옮깁니다.
- F1에서 F10까지의 분획에 레이블을 지정하고 8단계를 기준으로 분석합니다.
일시 중지 지점: 7.8단계에서 얻은 샘플을 즉시 처리할 수 없는 경우 -80°C에서 보관하십시오.
8. 수집된 분획물의 특성화 및 정량 분석
- 블랭크 대조군이 있는 마이크로플레이트 검출기를 사용하여 각 분획의 흡광도 값(OD 340 nm)을 측정하여 해당 밀도를 계산합니다.
알림: PBS/BEV 솔루션(6.1.1단계 및 6.2.2단계)을 PBS로 교체하여 빈 컨트롤을 설정합니다.- 각각 1.0058 g/mL, 1.0318 g/mL, 1.058 g/mL, 1.0708 g/mL, 1.111 g/mL의 밀도에 해당하는 50% 원액(단계 5.2.2)을 기준으로 0.02 M HEPES로 희석한 0, 5%, 10%, 12.5%, 20% 요오딕산올 용액을 각각 100μL씩 준비한다.
- 블랭크 대조군(7.3단계에서 준비)에서 각 분획 50μL와 각 표준물질 용액(8.1.1단계에서 준비)의 50μL를 96웰 플레이트의 복제 웰에 추가합니다.
- 파장을 340nm로 설정하고, 종말점 optical density를 측정하고, 각 fraction의 density를 계산합니다.
- F4-F9를 밀도를 기준으로 BEV 분획의 범위로 식별합니다.
- bicinchoninic acid assay(BCA)를 사용하여 BEV 분획의 단백질 농도를 측정합니다.
- 제조업체에서 제공한 PBS에 물질을 10배 희석하여 0.5μg/μL 표준 단백질 용액을 제조합니다.
- 시약 지침에 따라 다양한 부피의 표준 단백질 용액(8.2.1단계에서 준비)을 추가하고 PBS로 96웰 플레이트의 각 웰을 총 부피 20μL로 보충합니다.
- 7.8단계에서 준비한 샘플 20μL와 6.2.9단계에서 정의된 UC 후 남은 샘플을 각 웰에 추가합니다.
- 시약 A와 B를 50:1의 비율로 혼합하고 각 웰에 200μL를 전달합니다.
- 플레이트를 37°C 수조에서 30분 동안 배양합니다.
- 마이크로플레이트 리더를 사용하여 흡광도 값을 측정하고, 단백질 농도(μg/μL)를 계산하고, 8.2.2단계에서 희석된 표준 용액 값에서 생성된 표준 곡선(x: 광학 밀도, y: 단백질 농도)을 기반으로 샘플의 단백질 함량(μg)을 결정합니다.
- BEV의 존재를 확인하기 위해 투과 전자 현미경(TEM)을 사용하여 8.1.4단계에서 정의된 BEV 분획을 특성화합니다. 아래의 모든 절차는 얼음 위에서 수행해야 합니다.
- 7.8단계에서 분리된 각 F4-F9 분획 10μL와 6.2.9단계에서 정의된 UC 후 남은 샘플을 Formvar/Carbon 지지 구리 그리드에 20분 동안 적용하고 여과지로 블롯합니다.
- 샘플을 100μL의 PBS로 각각 1분 동안 세 번 헹구고 여과지로 닦아냅니다.
- 100μL의 1%(w/v) 글루타르알데히드로 샘플을 5분 동안 고정하고 여과지로 블라이트합니다.
- 그리드를 100μL의 PBS로 각각 2분 동안 10회 세척하고 여과지로 닦습니다.
- 50μL의 1.5%(w/v) 우라닐 아세테이트로 그리드를 10분 동안 염색하고 여과지로 얼룩지게 합니다.
주의 : 우라닐 아세테이트는 방사성이며 피부와 접촉하거나 흡입할 때 매우 유독합니다. 우라닐 아세테이트가 함유된 용액을 흄 찬장에서 취급하고 적절한 안전 조치를 따르십시오. - 그리드를 1%(w/v) 메틸셀룰로오스 방울에 5분 동안 옮기고 여과지로 닦아냅니다.
- 자연 건조된 그리드는 관찰할 때까지 어둡고 먼지가 없는 환경에 보관하십시오.
- TEM을 사용하여 이미지를 캡처하고 분석합니다.
- 입자 수를 계산하기 위해 나노 입자 추적 분석(NTA)을 사용하여 8.1.4단계에서 정의된 BEV 분획을 특성화합니다.
- 110nm 폴리스티렌 입자를 사용하여 시스템을 보정합니다.
- PBS를 사용하여 샘플 풀을 세척합니다.
- 7.8단계에서 수득한 상이한 분획의 샘플과 6.2.9단계에서 정의된 UC 이후에 남은 샘플을 10 7 입자/mL의 최적화된 농도로 105-10 9 입자/mL 범위의 농도로 희석합니다.
- 3개의 복제로 11개 위치에서 기록 및 분석하고 온도를 약 23-30°C로 유지합니다.
- coomassie brilliant blue staining(CBBS) 및 western blotting(WB)으로 샘플의 단백질 함량을 분석합니다.
- 정량 분석이 필요한 경우 PBS 및 5 × 로딩 버퍼를 사용하여 7.8단계에서 얻은 다른 분획의 BEV 샘플과 6.2.9단계에서 정의된 UC 후 남은 샘플을 0.5 또는 1μg/μL의 최종 농도로 희석하여 8.5.2단계에서 각 웰의 20μL(10μg 또는 20μg)의 충분한 샘플 로딩을 보장합니다. 샘플을 95°C에서 10분 동안 끓입니다.
- 조립식으로 만들어진 polyacrylamide 젤을 전기 이동법 탱크로 조립하고, 우물에 표본을 옮깁니다.
- 다음 매개변수로 수직 전기영동을 수행합니다: 160분 동안 50V.
- Coomassie 브릴리언트 블루 용액에 젤을 1시간 동안 염색하고 파란색 배경이 밝아질 때까지 탈이온수로 헹구고 카메라로 이미지를 캡처합니다.
- 다음 매개변수를 사용하여 다른 겔에 대해 단백질 블로팅 절차를 수행합니다: 400분 동안 20mA.
- 블로팅 멤브레인을 실온에서 1시간 동안 5%(w/v) BSA 용액으로 차단합니다.
- TBST 버퍼에서 멤브레인을 각각 5분 동안 세 번 세척합니다.
- 1차 항체(BEV 마커: LPS, OmpA, LTA; EEV 마커: CD63, CD9, TSG-101, 신테닌, 인테그린 β1; 기타 오염 마커: Flagellin, Calnexin) 4°C에서 8-12시간 동안.
- TBST 버퍼에서 멤브레인을 각각 10분 동안 세 번 세척합니다.
- 실온에서 1시간 동안 2차 항체로 멤브레인을 배양합니다.
- 8.5.9단계를 수행합니다.
- 화학발광 장치를 사용하여 블로팅을 개발합니다.
- PBS/BEV 용액(6.1.1단계 및 6.2.2단계)을 대장균의 BEV로 대체하여 양성 대조군을 설정하고(미정제 대장균-BEV 분리 절차는 재료 표 참조) BEV 특성화를 위한 위의 모든 실험을 수행합니다.
일시 중지 지점: 대변 BEV에 대해 위에서 설명한 특성화 결과를 기반으로 F6-F8을 BEV 농축 분획의 분포로 결정하고 이 좁은 범위를 후속 분석에 활용합니다.
- 입자 및 단백질의 회수율을 계산하여 두 가지 DGC 모드의 효율성을 평가합니다. 아래 결과는 백분율로 표시됩니다.
- 하향식 모드에서 입자의 회수율 계산: F6-F8의 총 입자/6.2.9단계에서 정의된 UC 이후의 입자.
- 상향식 모드에서 입자의 회수율 계산: F6-F8의 총 입자/6.2.9단계에서 정의된 UC 이후의 입자.
- 하향식 모드에서 단백질의 회수율 계산: F6-F8의 총 단백질 함량(μg)/6.2.9단계에서 정의된 UC 이후의 단백질 함량(μg).
- 상향식(Bottom-up) 모드에서 단백질의 회수율 계산: F6-F8의 총 단백질 함량(μg)/6.2.9단계에서 정의된 UC 이후의 단백질 함량(μg).
- 입자/단백질 비율을 계산하여 UC와 두 가지 DGC 모드의 전통적으로 정의된 순도를 평가하고 아래 결과는 모두 백분율로 제시되었습니다.
- 6.2.9단계에서 정의된 UC 이후의 입자/단백질 비율: UC 이후의 입자/UC 후의 단백질 함량(μg).
- 하향식 모드의 입자/단백질 비율: F6-F8의 총 입자/F6-F8의 단백질 함량(μg).
- 상향식 모드의 입자/단백질 비율: F6-F8의 총 입자/F6-F8의 단백질 함량(μg).
- 분변 BEV 정제 및 향후 분석을 위해 가장 적합한 원심분리 모드(프로토콜에서 하향식 모드 선택)를 선택합니다.
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Representative Results
BEV 농축 분획의 분포 결정
박테리아 세포외 소포체(BEV)-농축 분획물의 분포를 결정하기 위해, OD 340nm에서 흡광도 값을 측정하기 위해 블랭크 대조군을 설정하고, 측정 및 요오드화놀 가이드라인을 기반으로 각 분획의 밀도를 계산하였다(단계 8.1). 표 2 는 밀도 결과를 제시하며, 분획 F4 내지 F9가 전형적으로 세포외 소포체와 관련된 범위 내에서 밀도를 나타낸다는 것을 보여줍니다. 이 발견은 대부분의 BEV가 이러한 분획에서 분리되어 F4-F9를 BEV의 대략적인 범위로 정의했음을 시사합니다. 투과 전자 현미경(TEM)을 사용하여 그림 1 에서 분획 F4-F9로 표시된 것처럼 분리된 분변 BEV의 형태학적 특징을 특성화했습니다. TEM 이미지(그림 2)는 BEV의 특징인 고전적인 컵 모양의 구조의 존재를 보여주었습니다. 나노 입자 추적 분석(NTA) 및 비신코닌산 분석(BCA)을 각각 수행하여 입자 수와 단백질 농도를 측정하여 회수율과 순도를 추가로 평가할 수 있었습니다. 그림 3 은 각 분획에 대한 단백질 및 입자 농도를 표시하며, F6 및 F7이 가장 높은 농도를 나타내고 F5 및 F8이 그 뒤를 잇는다는 것을 나타냅니다. 그 후, Coomassie brilliant blue staining(CBBS) 및 western blotting(WB)을 수행하여 전체 단백질 분석을 제공했습니다. CBBS의 결과는 단백질 농도 결과와 일치했으며, F6 및 F7은 가장 강렬한 밴드를 표시했습니다(그림 4). BEV의 분포를 확인하기 위해, 대장균(Escherichia coli )에서 유래한 세포외 소포체를 양성 대조군으로 사용하였다(단계 8.5.13에 정의됨). 분리 및 정제 절차는 재료 표 및 앞서 언급한 프로토콜 섹션(3, 4단계)에 설명된 단계를 따랐습니다. WB 분석은 박테리아 외막의 주요 구성 요소이자 BEV의 특정 마커인 외막 단백질 A(OmpA)의 분획 F6-F8의 존재를 추가로 확인했습니다. 이러한 결과에 기초하여, 분획 F6-F8은 후속 실험 및 분석에 적합한 BEV-농축 분획으로 정의되었다.
간섭 구성 요소의 표시 범위 확인
BEV와 유사한 크기와 밀도를 가진 진핵생물 세포외 소포체(EEV)는 BEV 분석에서 주요 간섭으로 확인되었습니다. 이 문제를 해결하기 위해 3개의 EEV 단백질을 하향식 및 상향식 모드 모두에서 분획 5-8로 조사했으며 원심분리 시간은 7시간 및 15시간이었습니다. EEV 관련 막관통 단백질인 CD63은 주로 F5에서 검출된 반면 BEV 마커 LPS는 분획 6-7에서 농축되었습니다. 이 패턴은 두 모드 모두에서 관찰되었지만, 상향식 모드는 F7에서 CD63-EEV의 약간의 밴딩을 나타냈습니다. 그러나 다른 EEV 마커인 CD9 및 TSG-101은 모드나 원심분리 시간에 관계없이 이러한 분획에서 가시 신호를 나타내지 않았습니다. 독립적인 실험 사업에서 Syntenin 및 Integrin β1을 표적으로 하는 항체를 사용하여 분획 5-8에 걸쳐 EEV에 고유한 고유한 단백질 마커의 농축을 확인했습니다. Syntenin은 F5 내에서, 특히 하향식 접근 방식에서 두드러지게 검출되었으며, Integrin β1의 존재는 F6 내에서 식별되었습니다(그림 5). 간섭 입자의 존재를 추가로 평가하기 위해 Dil-표지된 저밀도 지단백질(Dil-LDL)을 밀도 구배 시스템에 도입하고 모든 분획에서 형광 강도를 측정했습니다. 하향식 모드에서는 분획 1-4가 상대적으로 더 높은 형광 값을 보인 반면, 상향식 모드에서는 F1-F6이 더 높은 형광 값을 나타냈습니다(그림 6).
BEV의 농도, 입자 크기 및 마커에서 두 가지 DGC 모드의 회수율과 순도를 평가합니다.
F6-F8 분획을 BEV 농축 분획으로 식별한 후, 두 가지 밀도 구배 원심분리(DGC) 모드의 회수율과 순도를 평가했습니다. 하향식(Top-down) 모드, 상향식(Bottom-up) 모드 및 초원심분리(UC) 단독으로 얻은 BEV 농축 분획의 입자 크기를 비교했습니다. 두 원심분리 모드에서 관찰된 입자 크기는 90nm에서 300nm 사이였으며 BEV의 정의된 직경과 일치했습니다(그림 7). 다음으로, DGC 전후의 입자 및 단백질 농도를 기준으로 두 모드의 입자 및 단백질 회수율을 계산하였다(표 3 및 그림 8). 특히 상향식 모드는 다른 모드에 비해 더 높은 회복률을 보였습니다. 별도의 실험군에서 두 모드에서의 단백질 회수율은 7시간 및 15시간의 서로 다른 원심분리 시간에서 평가되었습니다. 중요한 것은 사용된 그래디언트 모드에 관계없이 두 원심분리 시간 사이에 DGC 후 F6-F8 분획 내 단백질 함량에 통계적으로 유의한 차이가 없었다는 것입니다(그림 9). 입자/단백질 비율은 두 가지 모드의 순도를 대략적으로 평가하기 위해 계산되었습니다. 데이터는 모드 간의 순도에 큰 차이가 없음을 나타냈습니다. 또한 3개의 BEV 마커(LPS, OmpA 및 LTA), 1개의 EEV 마커(CD63) 및 2개의 오염 마커(Calnexin, Flagellin)에 초점을 맞춰 순도를 추가로 비교하기 위해 Coomassie brilliant blue staining(CBBS) 및 western blotting(WB)을 수행했습니다. 그 결과, DGC 후 간섭 물질이 부분적으로 감소하는 것으로 나타났으며, LPS와 OmpA는 UC 단독에 비해 두 DGC 모드 모두에서 더 두드러진 존재감을 보였습니다(그림 10).
그림 1: BEV 분리 및 정제의 개략적인 워크플로우. 약어: BEV = 박테리아 세포외 소포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: BEV 분획의 대표적인 TEM 이미지. (A) UC 후 분리된 BEV의 TEM 이미지. (B) 하향식 모드를 사용하여 DGC 후 분리된 BEV의 TEM 이미지. (C) 상향식 모드를 사용하여 DGC 후 분리된 BEV의 TEM 이미지. 모든 이미지는 200nm의 일관된 스케일로 제공되었습니다. 약어: TEM = 투과 전자 현미경; BEV = 박테리아 세포외 소포체; UC = 초원심분리; DGC = 밀도 구배 원심분리. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 하향식(Top-down) 및 상향식(Bottom-up) DGC 모드 후 BEV 분획의 단백질 및 입자 농도. BEV 분획의 단백질 농도는 BCA를 사용하여 측정되었으며 회색 막대로 표시됩니다. 입자 농도는 NTA를 사용하여 측정되었으며 파란색 막대로 표시됩니다. 약어: BEV = 박테리아 세포외 소포; DGC = 밀도 구배 원심분리; BCA = bicinchoninic acid assay; NTA = 나노 입자 추적 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: BEV 농축 분획 측정. (A) CBBS는 하향식(Top-down) 및 상향식(Bottom-up) 모드 모두에서 분변 BEV가 농축된 분획을 측정하기 위해 수행되었습니다. (B) 대장균 에서 유래한 EV를 분리, 정제하여 WB에서 양성 대조군으로 활용하여 BEV의 존재 및 분포를 확인했습니다. OmpA: BEV 마커인 외막 단백질 A. 약어: BEV = 박테리아 세포외 소포; CBBS = coomassie 브릴리언트 블루 염색; EVs = 세포외 소포체; WB = 웨스턴 블로팅. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: EEV 분포 확인. 밀도 구배 초원심분리 기간(7시간) 및 15시간(B)이 다른 하향식 및 상향식 DGC 모드에서 얻은 분획 5-8의 웨스턴 블롯 분석. (C) 및 (D)에서 입증된 바와 같이 7시간의 원심분리 기간으로 인한 F5 내지 F8에 초점을 맞춘 독립적인 시험이 실행되었습니다. 선택된 마커에는 BEV(LPS) 및 EEV(CD63, CD9, TSG-101, Syntenin, Integrin β1)와 관련된 마커가 포함되었습니다. 약어: DGC = 밀도 구배 원심분리; BEV = 박테리아 세포외 소포체; EEV = 진핵생물 세포외 소포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 저밀도 지단백질의 분포. 오염 마커로 간주되는 Dil-표지된 저밀도 지단백(Dil-LDL)을 하향식(Top-down) 및 상향식(Bottom-up) 모드 모두에서 그래디언트 시스템에 10μg의 농도로 첨가했습니다. Dil-LDL은 PBS/BEV 솔루션(Step 6.1.1 및 Step 6.2.2)을 대체하여 검출 모델을 구축했습니다. 각 분획의 형광 강도는 여기/방출 파장이 549/565nm인 마이크로플레이트 검출기를 사용하여 측정되었습니다. 약어: BEV = 박테리아 세포외 소포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: BEV 농축 분획의 입자 크기. (A) UC 후 얻은 미가공 BEV의 입자 크기 분포. (B) 하향식 밀도 구배 원심분리(DGC) 모드를 사용하여 얻은 BEV 농축 분획(F6-F8)의 입자 크기 분포. (C) BEV 농축 분획(F6-F8)의 입자 크기 분포는 상향식 DGC 모드를 사용하여 얻었습니다. NTA는 입자의 치수를 정량화하기 위해 수행되었습니다. 패널(A-C)에 사용된 희석 계수는 10,000, 2,000 및 5,000이었으며, 이에 따라 후속 결과가 보정되었습니다. 약어: BEV = 박테리아 세포외 소포; UC = 초원심분리; DGC = 밀도 구배 원심분리; NTA = 나노 입자 추적 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 하향식(Top-down) 및 상향식(Bottom-up) DGC 모드의 단백질 및 입자 회수율. (A) DGC(UC) 전과 후의 단백질 농도 비율로 계산된 두 모드의 단백질 회수율. (B) 두 모드의 입자 회수율은 DGC(UC) 전후의 입자 농도 비율로 계산됩니다. (C) UC, Top-down 및 Bottom-up 모드의 입자/단백질 비율. 데이터는 SEM± 평균으로 표시됩니다. 통계 분석은 패널 A와 B에 대해 양측 쌍을 이루지 않은 t-검정을 사용하고 패널 C에 대해 Tukey 사후 검정을 사용한 일원 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 수행되었습니다. 유의한 차이는 관찰되지 않았다. 약어: DGC = 밀도 구배 원심분리; UC = 초원심분리. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9: 서로 다른 밀도 관련 초원심분리 시간을 사용한 Top-down 및 Bottom-up DGC 모드를 기반으로 한 단백질 회수율 비교. 7시간 및 15시간 동안 그래디언트 초원심분리에서 얻은 분획 F6-F8의 단백질 회수율은 하향식 및 상향식 모드를 모두 사용하는 독립적인 실험에서 평가되었습니다. 데이터는 SEM± 평균으로 표시됩니다. 통계 분석은 Fisher의 최소 유의차 검정과 함께 이원 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 수행되었습니다. 유의한 차이는 관찰되지 않았다. 약어: DGC = 밀도 구배 원심분리. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 10: 하향식(Top-down) 및 상향식(Bottom-up) DGC 모드의 순도 평가. (A) CBBS는 UC, Top-down 및 Bottom-up 모드의 단백질 분포를 비교하기 위해 수행되었습니다. (B) WB는 UC, Top-down 및 Bottom-up 모드의 순도를 평가하기 위해 수행되었습니다. 칼넥신(Calnexin): 소포체-관련 단백질 마커; Flagellin, 박테리아로부터 단백질 마커를 오염시킵니다. CD63: 진핵생물 세포외 소포체에 대한 막관통 단백질 마커; LTA: 그람 양성 박테리아의 BEV 마커; LPS, OmpA: 그람 음성 박테리아의 BEV 마커. 약어: DGC = 밀도 구배 원심분리; UC = 초원심분리; CBBS = 쿠마시 브릴리언트 블루 염색; WB = 웨스턴 블로팅. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 요오딕산올 용액 농도(%) | 0.02M HEPES 버퍼 | 50% 요오딕사놀 작업 솔루션 |
| 40 | 1 | 4 |
| 20 | 3 | 2 |
| 10 | 4 | 1 |
표 1: 요오딕사놀 밀도 그래디언트 완충액을 제조하기 위한 비율. 표는 특정 농도의 요오드릭산올 용액을 얻기 위해 0.02M HEPES 완충액과 50% 요오드옥산올 작동 용액의 비율을 제공했습니다.
| F1 키 | F2 키 | F3 키 | F4 키 | F5 키 | F6 키 | F7 키 | F8 키 | F9 키 | F10 키 | |
| 밀도(g/mL) | 1.023 | 1.038 | 1.049 | 1.062 | 1.074 | 1.098 | 1.144 | 1.185 | 1.239 | 1.293 |
표 2: 요오드릭사놀 기반 밀도 구배 원심분리 시스템의 밀도. 표는 요오드릭사놀 기반 밀도 구배 원심분리 시스템에서 각 분획의 밀도를 보여주었습니다. 블랭크 컨트롤: PBS 기반 그래디언트 시스템.
| 하향식 모드 | 상향식 모드 | |
| 입자 회수율(%) | 24.08 | 35.69 |
| 단백질 회수율(%) | 24.5 | 32.45 |
표 3: 두 가지 모드의 입자 및 단백질 회수율. 표는 Top-down 및 Bottom-up 모드의 입자 및 단백질 회수율을 보여줍니다(그림 8).
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Discussion
박테리아 세포외 소포체(BEV)는 박테리아가 분비하는 지질-이중층 나노입자로, 풍부한 단백질, 지질, 핵산 및 기타 생체 활성 분자를 운반하여 박테리아20의 기능적 효과를 매개하는 데 기여합니다. 장에서 유래한 BEV는 염증성 장 질환, 크론병, 대장암과 같은 질병의 발병에 관여하고 일반적인 대사에 영향을 미치고 인지 기능 장애를 중재하는 것으로 확인되었습니다 4,16,17,20,21,22,23,24,25,26 . 현재, 인간 표본-대변에서 장내 세균 유래의 BEV에 대한 완전하고 객관적인 생물학적 정보를 얻는 것은 여전히 일련의 요인에 의해 제약을 받고 있으며, 그 중 가장 중요한 문제는 복잡한 숙주 환경에서 BEV를 분리하는 방법입니다.
초원심분리(UC), 밀도 구배 원심분리(DGC) 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC)13,14,15,16,17과 같은 BEV를 분리하는 주요 방법은 장점과 단점을 모두 가지고 있습니다. 일부 간섭 물질을 제거하는 데 어려움이 있고 BEV에 대한 보다 현실적이고 포괄적인 분석에 심각한 영향을 미치는 일관된 운영 절차의 부족은 분리 공정의 과제로 남아 있습니다. 간섭의 바람직하지 않은 영향을 완화하기 위해, 많은 연구들15,27,28은 특히 체액으로부터 BEV를 분리하기 위해 상기 방법들 중 두 가지 이상을 결합하였으나, 복잡한 절차들은 결과의 안정성에 영향을 미치는 경향이 있다. BEV의 경우 다른 오염 물질(예: 단백질 응집체, 지질 성분, 진핵 세포외 소포체(EEV)15)과의 밀도 차이가 오늘날 특정 분리 수단이 될 수 있습니다.
현재, 요오딕산올은 그것의 등장성 재산 때문에 자당을 대체하는 EVs의 조밀도 구배 별거를 위한 선호한 매체로 부상했다. 이러한 특성은 EV 형태를 보존하고 각 분획에 대한 밀도 추정을 용이하게 하는 데 기여한다(29). Tulkens et al15에 따라 본 연구는 50%(w/v), 40%(w/v), 20%(w/v), 10%(w/v) 및 0% 농도 구배 층에서 요오드릭산올을 사용하여 DGC 시스템에 대해 동일한 농도를 채택했습니다. 초기 단계는 HEPES 완충액을 사용하여 다양한 농도의 요오딕산올 용액을 제조하는 것을 포함했습니다. 트리스(-EDTA)-자당 완충액과 비교할 때 적절한 농도의 HEPES 완충액은 고유 특성 덕분에 원심분리 시스템 내에서 장기적인 pH 안정성을 보장합니다. 동시에, 멸균 PBS 완충액은 용액 준비 중 박테리아 및 그 대사 산물에 의한 잠재적 오염을 방지할 뿐만 아니라 DGC 전후에 시료 완충액의 일관성을 유지하기 위해 원심분리 시스템의 최상층에 사용되었습니다. 여기에는 UC 후 PBS 완충액으로 펠릿을 재현탁시키고 DGC 후 PBS로 요오딕산올을 대체하여 결과의 비교 분석을 용이하게 하는 것이 포함되었습니다. 또한, DGC 시스템 내의 각 그래디언트 층의 부피는 각각 50%, 40%, 20%, 10% 및 0%(PBS 층) 요오드화 용액에 대해 3mL, 3mL, 3mL, 3mL 및 3.5mL로 보정되었습니다. 이 전략은 상대적으로 더 넓은 밀도 범위(1.02-1.30g/mL)를 설정하는 데 도움이 되며, 잠재적으로 다른 간섭 요소로부터 BEV의 분리를 향상시켜 복잡한 오염이 있는 다른 체액에 기울기를 적용할 수 있도록 합니다.
프로토콜의 일부 단계가 중요하다는 점을 강조하는 것이 중요합니다. 특히, 2.2단계에서 설명한 희석 계수는 1g의 분변 샘플과 최소 10mL의 PBS를 혼합하여 과포화를 방지하고 실험 자원을 보존하는 데 중추적인 역할을 합니다. 이러한 조건에서 입자 및 단백질 농도는 일반적으로 다른 분변 특성이 일정하다고 가정할 때 샘플의 분변 질량에 비례하여 증가합니다. 필요한 경우 일관성, 지단백질 또는 혈액 함량과 같은 요소를 고려한 추가 분석을 수행할 수 있습니다. 3.4단계 동안 용액을 직접 붓지 않도록 주의해야 합니다., 펠릿을 방해할 수 있습니다., 잠재적으로 더 큰 과립이 0.22μm 필터의 멤브레인을 막을 막을 일으킬 수 있습니다. 필터가 급격히 포화되는 경우(예: 10mL 미만이 필터를 통과하는 경우) 12,000× g 에서 추가 원심분리 단계를 수행하는 것이 좋습니다. 밀도 구배 원심분리의 맥락에서 그래디언트 용액의 정밀한 준비는 신뢰할 수 있는 결과를 위한 전제 조건입니다. 또한 상부 저밀도 용액을 적층할 때 튜브를 조심스럽게 조작하는 것은 층화의 중단을 방지하는 데 필수적이며, 세심한 피펫팅을 통해 기포를 제거해야 합니다. 마지막으로, 분획을 흡입할 때 부정확한 BEV 분포로 이어질 수 있는 과흡인 또는 과소 흡인을 피하면서 튜브 벽을 따라 세심하게 분획을 떼어내는 것이 중요합니다. 액체 레벨을 정기적으로 관찰하고 일관된 관행을 수행하면 이 문제를 완화하는 데 도움이 될 수 있습니다.
이 연구는 여러 특성화 방법을 사용하여 BEV 농축 분획(F6-F8)을 측정하고 하향식 및 상향식의 두 가지 뚜렷한 그래디언트 초원심분리 모드를 탐색했습니다. F4-F8의 단백질 및 입자 농도 측정(그림 3)과 회수율 및 순도 비교(그림 8 및 그림 10)를 통해 상향식 원심분리 모드가 분변 샘플에서 BEV를 분리하고 정제하는 대체 방법보다 단백질 및 입자 수준 모두에서 더 높은 검출 값을 산출하는 것으로 관찰되었습니다. 이 관찰은 서로 다른 동적 프로세스를 의미합니다. BEV보다 밀도가 낮은 지단백질과 같은 비소포성 세포외 나노입자(NVEP)29는 샘플이 바닥에 로드된 경우(그림 6) 부력 밀도에 도달하지 못할 수 있으며, DGC 15시간 후에도 회수율이 부풀려질 수 있다는 가설이 제안되었습니다(그림 9). 이러한 관찰은 입자와 단백질의 비율을 기반으로 하는 전통적인 순도 정의가 적용 가능한지 여부를 고려할 필요가 있습니다. 또한 EEV는 F5 내에서 우세를 보인 반면 BEV는 F6-F7에서 두드러지게 검출되었습니다(그림 4 및 그림 5). 특히 이러한 차별화는 하향식 모드를 채택할 때 더욱 두드러진 것으로 나타났습니다. 따라서 이 모드는 이 프로토콜에 더 적합할 수 있습니다. 그러나 F6 내에서 Integrin β1의 존재를 강조하는 것이 필수적이며, 이는 잠재적으로 EEV 간의 본질적인 이질성을 의미합니다. 이 방법을 혈액 및 소변과 같은 다른 체액에 적용할 때 연구원은 샘플의 고유한 특징을 고려해야 합니다. 이 프로토콜에 정의된 원심분리 시간은 7시간으로, 다른 연구에서 인용된 기간(18시간)보다 훨씬 짧습니다. 이 연구에서 동일한 패턴으로 실행된 15시간 기간의 단백질 회수와 비교할 때(그림 9), 이 시간은 필요한 분리 순도를 달성하기에 충분한 것으로 보입니다. 이러한 작동 조건에서 하향식 모드의 입자 회수율은 대변 밀리그램 당 최대 10 8 (4.5 × 10 7-1.5 × 108)에 도달하여 이전 보고서 (젖은 대변 그램 당 1011 BEV)와 일치합니다 15,29,30. 마지막으로, 블랭크 대조군의 각 분획의 밀도 측정은 BEV의 밀도가 1.09-1.19g/mL 범위임을 확인했으며, 이는 이전 연구와 일치합니다.
이 방법은 효과적이기는 하지만 식이요법, 장 기능 및 기타 요인이 대변 구성에 미치는 영향으로 인해 한계가 있습니다. 이러한 변수는 대변의 일관성을 변화시켜 잠재적으로 박테리아 풍부도와 BEV 회복에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 BEV31,32의 분리 및 정제를 표준화하고 분변 특성 평가에 따라 조정하는 것이 중요합니다. 향후 연구는 소변 크레아티닌 또는 소변 유량과 유사한 BEV 수율을 정상화하기 위한 표준을 식별하는 데 중점을 둘 것입니다. 이러한 벤치마크는 방법론적 평가를 강화하고 분변 BEV와 신체의 생리학적 및 병리학적 상태 사이의 연관성을 밝힐 수 있습니다. 또한 분변 BEV와 다양한 질병 간의 강한 연관성은 상당한 임상 잠재력을 강조합니다. 그러나 이 프로토콜에 규정된 원심분리 시간은 임상의가 필요로 하는 보다 편리하고 빠른 검사에 대한 요구를 충족시키지 못합니다. 따라서 더 짧은 원심분리 시간(아마도 3시간 미만)이 동등한 결과를 얻을 수 있는지 결정하기 위해 추가 조사가 필요합니다. 두 원심분리 모드에서 발생하는 이벤트를 이해하기 위해 추가 탐색도 필요합니다. 상향식(Bottom-up) 모드에서 F6-F8에서 비소포성 성분이 더 풍부하다고 가정되지만, 그래디언트 농도를 정제하는 것은 특정 기능을 가진 추가 아형을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다.
이 연구는 DGC를 사용하여 인간 대변에서 BEV를 분리하고 정제하는 것을 성공적으로 입증했습니다. 이 전략은 혈액, 소변 및 타액과 같은 다른 생물학적 표본에 적용할 수 있는 가능성을 가지고 있으며, 연구자들에게 BEV의 숨겨진 정보를 발견할 수 있는 효과적인 접근 방식을 제공하여 잠재적으로 임상 적용을 발전시킬 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 상충되는 이해관계가 없음을 선언한다.
Acknowledgments
이 연구는 저명한 젊은 학자를 위한 국립 과학 기금(National Science Fund for Distinguished Young Scholars, 82025024)의 지원을 받았습니다. 중국 국립 자연 과학 재단 (82230080)의 핵심 프로젝트; 중국 국가 핵심 R&D 프로그램(2021YFA1300604); 중국 국립 자연 과학 재단 (81871735, 82272438 및 82002245); 저명한 젊은 학자를 위한 광둥성 자연과학 기금(2023B1515020058); 광둥성 자연과학재단(2021A1515011639); 중국 산둥성 자연과학재단의 주요 국가 기초 연구 개발 프로그램(ZR2020ZD11); 박사후 과학 재단(2022M720059); 남부 의과 대학 Nanfang 병원의 뛰어난 청소년 개발 계획(2022J001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 % (w/v) glutaraldehyde (prepared from 2.5 % stock solution in deionized water) | ACMEC | AP1126 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.3 |
| 1 % (w/v) methylcellulose (prepared from original powder in deionized water) | Sigma-Aldrich | M7027 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.6 |
| 1.5 % (w/v) uranyl acetate (prepared from original powder in deionized water) | Polysciences | 21447-25 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.5 |
| 1000 μL, 200 μL, 10 μL Pipette | KIRGEN | KG1313, KG1212, KG1011 | Transfer the solution |
| 5 % (w/v) bovine serum albumin solution (prepared from the original powder in TBST buffer) | Fdbio science | FD0030 | Used in western blotting for blocking at Step 8.5.6 |
| 5 × loading buffer | Fdbio science | FD006 | Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5.1 |
| 75 % (v/v) alcohol | LIRCON | LIRCON-500 mL | Surface disinfection |
| 96-well plate | Rar | A8096 | Measure the absorbance values |
| Anti-Calnexin antibody | Abcam | ab92573 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-CD63 antibody | Abcam | ab134045 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-CD9 antibody | Abcam | ab236630 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-Flagellin antibody | Sino Biological | 40067-MM06 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-Integrin beta 1 antibody | Abcam | ab30394 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-LPS antibody | Thermo Fisher | MA1-83152 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-LTA antibody | Thermo Fisher | MA1-7402 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-OmpA antibody | CUSABIO | CSB-PA359226ZA01EOD, https://www.cusabio.com/ | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-Syntenin antibody | Abcam | ab133267 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-TSG101 antibody | Abcam | ab125011 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Autoclave | ZEALWAY | GR110DP | Sterilization for supplies and mediums used in the experiment |
| Balance | Mettler Toledo | AL104 | Balance the tube sample-loaded with PBS |
| Bicinchoninic acid assay | Fdbio science | FD2001 | Measure protein content of BEVs at Step 8.2 |
| BioRender | BioRender | https://app.biorender.com | Make the schematic workflow of BEVs isolation and purification showed in Figure 1 |
| Biosafety cabinet | Haier | HR1200- II B2 | Peform the procedures about feces sample handling |
| Centrifuge 5810 R; Rotor F-34-6-38 | Eppendorf | 5805000092; 5804727002, adapter: 5804774000 | Preprocess for BEVs (Step 3) |
| Chemiluminescence Apparatus | BIO-OI | OI600SE-MF | Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12 |
| Cytation 5 | BioTek | F01 | Microplate detector for measuring the absorbance (Step 8.1) and fluorescence (Figure 6) values |
| Dil-labled low density lipoprotein | ACMEC | AC12038 | Definition of distribution of interfering components |
| Electrophoresis equipment | Bio-rad | 1658033 | Used in western blotting for protein separation and transfer at Step 8.5.2, 8.5.3, 8.5.5 |
| Enhanced Chemiluminescence kit HRP | Fdbio science | FD8020 | Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12 |
| Escherichia coli | American Type Culture Collection | ATCC8739 | Isolate BEVs as a positive control. Protocol: Dissolve 25 g of the LB powder in 1 L deionized water, and autoclave. Transfer the 800 μL of preserved Escherichia coli into the medium. Cultivate at 37 °C in the incubator shaker. Then centrifuge at 3, 000 × g for 20 min at 4 °C, 12, 000 × g for 30 min at 4 °C, filter the supernatant through 0.22 μm membrane, and perform ultra-speed centrifugation at 160, 000 × g for 70 min at 4 °C. Pellet defined as crude BEVs from Escherichia coli was suspended in 1.2 mL PBS (Step 3, 4). |
| Falcon tubes 50 mL | KIRGEN | KG2811 | Preprocess for BEVs (Step 3) |
| Feto Protein Staining Buffer | Absci | ab.001.50 | Coomassie brilliant blue staining at Step 8.5.4 |
| Filter paper | Biosharp | BS-TFP-070B | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 (Blotting the solution) |
| Formvar/Carbon supported copper grids | Sigma-Aldrich | TEM-FCF200CU50 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 |
| HEPES powder | Meilunbio | MB6078 | Prepare iodixanol buffers with different concentrations for density gradient centrifugation |
| HRP AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Fdbio science | FDM007 | Western blotting (Secondary Antibody) |
| HRP AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Fdbio science | FDR007 | Western blotting (Secondary Antibody) |
| Incubator shaker | Qiangwen | DHZ-L | Cultivate Escherichia coli |
| Kimwipes™ Delicate Task Wipes | Kimtech Science | 34155 | Wipe the inner wall of the ultracentrifuge tube at Step 4.15 |
| LB broth | Hopebio | HB0128 | Cultivate Escherichia coli |
| Low temperature freezer (-80 °C) | Haier | DW-86L338J | Store the samples |
| Methanol | Alalddin | M116118 | Used in western blotting for activating PVDF membrane at Step 8.5.5 |
| Micro tubes 1.5 mL | KIRGEN | KG2211 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
| Micro tubes 2 mL | KIRGEN | KG2911 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
| Micro tubes 5 mL | BBI | F610888-0001 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
| Microplate reader | Thermo Fisher | Multiskan MK3 | Measure protein content of BEVs at Step 8.2 |
| Millipore filter 0.22 μm | Merck millipore | SLGP033RB | Filtration sterilization; Material: polyethersulfone, PES |
| NaCl | GHTECH | 1.01307.040 | Density gradient centrifugation solution |
| NaOH | GHTECH | 1.01394.068 | Density gradient centrifugation solution (pH adjustment) |
| Optima™ XPN-100 | Beckman Coulter | A94469 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
| OptiPrep™ | Serumwerk Bernburg AG | 1893 | Density gradient centrifugation stock solution |
| Orbital Shaker | Youning | CS-100 | Dissolve feces at Step 2 |
| Phosphate buffered saline | Procell | PB180327 | Dissolve feces at Step 2 |
| Pipettor | Eppendorf | 3120000267, 3120000259 | Transfer the solution |
| Plastic pasteur pipette | ABCbio | ABC217003-4 | Remove supernatant in preprocessing at Step 3.4 |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes | Millipore | ISEQ00010, IPVH00010 | Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5 |
| Prefabricated polyacrylamide gel, 4–20% 15 Wells | ACE | F15420Gel | Used in western blotting for protein separation at Step 8.5.2, 8.5.3 |
| Primary antibody diluent | Fdbio science | FD0040 | Used in western blotting at Step 8.5.8 |
| Protein ladder | Fdbio science | FD0672 | Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5 |
| Rapid protein blotting solution | UBIO | UW0500 | Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5 |
| Rotor SW 32 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 369650 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
| Syringe 20 mL, 50 mL | Jetway | ZSQ-20ML, YCXWJZSQ-50 mL | Transfer buffers amd remove supernatant in preprocessing |
| TBS powder | Fdbio science | FD1021 | Used in western blotting at Step 8.5 |
| Transmission electron microscope (TEM) | Hitachi | H-7650 | Morphological observation for BEVs at Step 8.3 |
| Tween-20 | Fdbio science | FD0020 | Used in western blotting at Step 8.5 |
| Ultracentrifuge tube | Beckman | 326823, 355642 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
| Ultra-clean bench | AIRTECH | SW-CJ-2FD | Peform the procedures about liquid handling |
| Water bath | Bluepard | CU600 | Used for measuring protein content of BEVs at Step 8.2.5 |
| ZetaView | Particle Metrix | S/N 21-734, Software ZetaView (version 8.05.14 SP7) | Nanoparticle tracking analysis (NTA) for measuring the particle size and concentrarion of BEVs at Step 8.4 |
References
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