Summary
Cette étude décrit une méthode permettant d’isoler et de purifier les vésicules extracellulaires bactériennes (VEB) enrichies à partir de matières fécales humaines par centrifugation à gradient de densité (DGC), identifie les caractéristiques physiques des VEB à partir de la morphologie, de la taille des particules et de la concentration, et discute des applications potentielles de l’approche DGC dans la recherche clinique et scientifique.
Abstract
Les vésicules extracellulaires bactériennes (VEB) sont des nanovésicules dérivées de bactéries qui jouent un rôle actif dans la communication bactérie-bactérie et bactérie-hôte, en transférant des molécules bioactives telles que des protéines, des lipides et des acides nucléiques hérités de la bactérie mère. Les VEB dérivés du microbiote intestinal ont des effets dans le tractus gastro-intestinal et peuvent atteindre des organes éloignés, ce qui a des implications importantes pour la physiologie et la pathologie. Les recherches théoriques qui explorent les types, les quantités et les rôles des VEB dérivés des matières fécales humaines sont cruciales pour comprendre la sécrétion et la fonction des VEB à partir du microbiote intestinal. Ces recherches nécessitent également une amélioration de la stratégie actuelle d’isolement et d’épuration des VEB.
Cette étude a permis d’optimiser le processus d’isolement et de purification des VEB en établissant deux modes de centrifugation à gradient de densité (DGC) : Top-down et Bottom-up. La distribution enrichie des VEB a été déterminée dans les fractions 6 à 8 (F6-F8). L’efficacité de l’approche a été évaluée en fonction de la morphologie, de la taille, de la concentration et de la teneur en protéines des particules. Les taux de récupération des particules et des protéines ont été calculés, et la présence de marqueurs spécifiques a été analysée pour comparer la récupération et la pureté des deux modes DGC. Les résultats ont indiqué que le mode de centrifugation descendante avait des niveaux de contamination plus faibles et atteignait un taux de récupération et une pureté similaires à ceux du mode ascendant. Un temps de centrifugation de 7 h a été suffisant pour atteindre une concentration fécale de 108/mg.
Outre les matières fécales, cette méthode pourrait être appliquée à d’autres types de fluides corporels avec une modification appropriée en fonction des différences de composants et de viscosité. En conclusion, ce protocole détaillé et fiable faciliterait l’isolement et la purification standardisés des BEV et jetterait ainsi les bases d’analyses multi-omiques ultérieures et d’expériences fonctionnelles.
Introduction
L’intestin est largement reconnu comme l’organe abritant les communautés microbiennes les plus abondantes dans le corps humain, avec plus de 90% des bactéries impliquées dans la colonisation et la multiplication 1,2. De nombreuses preuves ont démontré que le microbiote intestinal module le microenvironnement intestinal et interagit simultanément avec le dysfonctionnement d’organes distants, principalement par le biais d’une barrière intestinale altérée 3,4. De plus en plus de preuves indiquent une corrélation entre le déséquilibre du microbiote intestinal et la progression des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI)5,6, ainsi que des troubles cognitifs à travers l’axe intestin-cerveau 5,6,7,8. Les vésicules extracellulaires bactériennes (VEB) produites par les bactéries jouent un rôle important dans ces processus pathologiques.
Les BEV sont des particules à l’échelle nanométrique encapsulant des dérivés bactériens, avec des diamètres allant de 20 à 400 nm. Il a été démontré qu’ils facilitent les interactions entre les bactéries et leurs organismes hôtes 9,10. Malgré leur invisibilité, ces particules ont attiré de plus en plus l’attention des chercheurs en raison de leurs vastes applications potentielles en tant que biomarqueurs diagnostiques, cibles thérapeutiques et véhicules d’administration de médicaments11. Les excréments humains, souvent utilisés comme échantillons biologiques pour l’étude des VEB, provenant principalement de bactéries intestinales, contiennent un mélange complexe d’eau, de bactéries, de lipides, de protéines, de résidus alimentaires non digérés et de cellules épithéliales exfoliées, entre autres. La composition complexe des matières fécales pose des défis à l’isolement et à la pureté des VEB, ce qui empêche une analyse complète, objective et réaliste des VEB. Par conséquent, des stratégies efficaces visant à minimiser les interférences causées par des composants contaminants et à améliorer le rendement des VEB sont apparues comme des problèmes critiques nécessitant une attention immédiate.
Les stratégies d’isolement existantes reposent en grande partie sur des techniques telles que la centrifugation à ultra-haute vitesse (UC), la centrifugation à gradient de densité (DGC) et la chromatographie d’exclusion de taille (SEC)12,13,14,15,16,17. À l’heure actuelle, la DGC est l’une des méthodes les plus largement appliquées dans le domaine de la séparation des VEB, englobant deux modes de sédimentation-flottement, « Top-down » et « Bottom-up », qui sont déterminés par la position de chargement initiale de l’échantillon. Ces méthodologies différencient les vésicules extracellulaires (VE) des autres composants en fonction des disparités de taille et de densité, ce qui permet d’obtenir des taux de pureté et de récupération variables. Des recherches antérieures ont indiqué que les stratégies à approche unique sont insuffisantes pour séparer adéquatement les VE des protéines solubles dans les échantillons de fluides corporels, telles que la lipoprotéine dans le sang18 et la protéine Tamm-Horsfall dans l’urine19. De plus, la distribution de la taille des vésicules extracellulaires eucaryotes (EEV) chevauche souvent celle des BEV, ce qui nécessite d’autres améliorations méthodologiques pour optimiser le rendement des BEV. Par conséquent, l’avancement de l’étude des VEB repose sur le développement de méthodologies efficaces de séparation et de purification. En particulier, Tulkens et al15 ont utilisé une stratégie biophysique orthogonale pour séparer les VEB fécaux des VEE, dans laquelle le temps de centrifugation d’un mode DGC ascendant était jusqu’à 18 h. En revanche, cette étude l’a réduit à 7 h, ce qui a permis de gagner considérablement le temps d’ultracentrifugation par gradient et de simplifier le processus.
Dans la présente étude, nous avons isolé et purifié des VEB fécaux en utilisant deux modes DGC dans des conditions tampons optimisées, après avoir enrichi les VEB avec une gamme de vitesses de centrifugation différentielles, allant de faible à extrêmement élevée vitesse. Des évaluations basées sur la morphologie, la taille des particules et la concentration ont indiqué une performance louable de cette méthode améliorée. Cette étude pourrait servir de base à de futures recherches, en étendant ses applications à un domaine plus large et en offrant un aperçu de l’hétérogénéité des VEB dans le corps humain. Il contribue également à la standardisation des techniques de séparation et d’analyse des VEB.
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Protocol
Le comité d’éthique de l’hôpital de Nanfang, Southern Medical University, a approuvé cette étude, qui a été menée avec le consentement éclairé des participants. Toutes les méthodes employées dans le présent document ont respecté les directives opérationnelles standard fournies par les Normes internationales sur le microbiome humain (IHMS : http://www.microbiome-standards.org/). Toutes les procédures subséquentes de manipulation des liquides devaient être effectuées dans une enceinte de sécurité biologique ou un banc ultra-propre.
1. Collecte et aliquotage d’échantillons fécaux
- Distribuez un échantillonneur de selles, un sac scellé et une boîte glacée, et fournissez des instructions complètes aux participants sur la façon de se procurer et de conserver les échantillons.
- Demandez à chaque participant de prélever son échantillon de selles à l’aide de l’échantillonneur fourni et de le transporter au laboratoire à une température de 4 °C dans un délai de 24 heures.
- À la réception au laboratoire, utiliser une cuillère stérile pour aliquoter moins de 3,5 g de matières fécales dans un tube à centrifuger de 50 ml pré-pesé. Notez le poids de l’échantillon fécal sur le tube pour les procédures de prétraitement ultérieures.
POINT DE PAUSE : S’il n’est pas possible de traiter immédiatement les échantillons, allouer l’échantillon pour un stockage à long terme à -80 °C après une notation appropriée.
2. Préparation des échantillons de matières fécales
- Réfrigérer 500 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à 4 °C. Filtrer le PBS pré-refroidi à travers un filtre en polyéthersulfone (PES) de 0,22 μm à l’aide d’une seringue de 50 ml dans dix tubes à centrifuger de 50 ml.
- Placez deux tubes de 50 ml sur de la glace, chacun contenant 3,5 g d’échantillons fécaux. Ajouter 35 mL de PBS dans chaque tube.
REMARQUE : Calculer la quantité requise de PBS pour la dissolution des matières fécales, en veillant à ce que la concentration maximale de l’échantillon soit de 10 % (p/v). Si vous traitez des échantillons supplémentaires, utilisez plus de tubes au besoin. - Agiter les échantillons à 300 tr/min pendant 2 h à 4 °C, ou les placer pendant 8 h au moins à 4 °C jusqu’à ce que les matières fécales soient complètement en suspension visible.
3. Centrifugation à vitesse différentielle
- Refroidir la centrifugeuse réfrigérée à grande vitesse à 4 °C.
- Ajustez le poids des deux tubes contenant les échantillons préparés à l’étape 2.3 avec du PBS pour atteindre un poids total de 0,1 g.
- Centrifuger les échantillons à 3 000 × g pendant 20 min à 4 °C.
- Pipeter délicatement le surnageant dans deux tubes à centrifuger propres de 50 mL, en laissant environ 1 mL au-dessus de la pastille. Utilisez une pipette Pasteur jetable en plastique pour ce processus.
- Ajustez le poids des deux tubes avec du PBS pour atteindre un poids total à moins de ± 0,1 g.
- Centrifuger le surnageant transféré à 12 000 × g pendant 30 min à 4 °C.
- Aspirer le surnageant à l’aide d’une seringue de 20 ml, retirer l’aiguille de la seringue et le filtrer à travers des filtres de 0,22 μm dans des tubes de 50 ml. À ce stade, le volume surnageant devrait être d’environ 30 mL.
REMARQUE : Si une quantité importante d’impureté est encore visible après la centrifugation de 12 000 × g, il est nécessaire de répéter l’étape de centrifugation à 12 000 × g pendant 30 min à 4 °C. Le non-respect de cette consigne peut entraîner une perte importante de VEB en raison de l’obstruction des pores pendant la filtration.
4. Centrifugation à ultra-haute vitesse
- Nettoyez le rotor et le godet en les essuyant avec de l’alcool à 75 % (v/v) pour éliminer toute contamination résiduelle.
- Placez un tube d’ultracentrifugation de 38,5 ml dans le porte-tube.
REMARQUE : Sélectionnez le tube d’ultracentrifugation approprié en fonction du volume d’échantillon. Évitez les rayons ultraviolets et les réactifs chimiques inappropriés pour la stérilisation des tubes centrifuges, comme indiqué dans le manuel du produit. - Transvaser environ 30 mL du surnageant fécal filtré de l’étape 3.7 dans le tube d’ultracentrifugation.
- Remplissez le tube d’ultracentrifugation avec environ 8 mL de PBS, en laissant un espace de 3 mm par rapport à l’ouverture du tube.
- Placez les deux tubes d’ultracentrifugation avec les échantillons dans des seaux d’ultracentrifugation opposés, par exemple, le seau 1 correspond à 4 (1-4), 2-5, 3-6.
- Ajustez le poids des deux seaux avec PBS pour obtenir un poids total à moins de ± 0,005 g.
- Installez tous les godets sur le rotor, que les tubes soient chargés ou non.
- Lancer le vide et centrifuger les échantillons à 160 000 × g pendant 70 min à 4 °C.
- Relâchez le vide de la chambre et ouvrez la porte une fois que Ready (Prêt) s’affiche sur la page d’accueil de l’instrument.
- Retirez le rotor de l’ultracentrifugeuse.
- Déplacez les godets du rotor vers le rack et récupérez les tubes à l’aide d’une pince.
- Jetez le surnageant, qui contiendra des pastilles brunes visibles au fond.
- Remettre les pastilles en suspension à plusieurs reprises à l’aide d’une pipette de 1 000 μL avec 1 mL de PBS prérefroidi (4 °C) jusqu’à ce qu’elles soient complètement suspendues. Remplissez le tube avec environ 37 mL de PBS, en laissant un espace de 3 mm à partir de l’ouverture.
- Effectuez une autre ultracentrifugation en suivant les étapes 4.5 à 4.11 à 160 000 × g pendant 70 min à 4 °C pour éliminer les composants contaminants partiellement attachés des parois du tube.
- Jetez le surnageant, retournez les deux tubes d’ultracentrifugation pendant 5 min et éliminez toute solution restante sur la paroi intérieure avec des essuie-glaces.
REMARQUE : Le nettoyage de la paroi intérieure minimise les interférences dues à la contamination résiduelle adhérant à la paroi du tube d’ultracentrifugation. Choisissez des essuie-glaces qui n’influenceront pas l’analyse du BEV, notamment en ce qui concerne la taille des particules. - Remettre les pastilles en suspension dans chaque tube en les pipetant de haut en bas avec 1,2 mL de PBS pré-refroidi (4 °C) à l’aide d’une pipette de 1 000 μL.
- Transférez 1,2 mL de la solution PBS/BEV d’un tube d’ultracentrifugation vers un microtube propre de 1,5 mL.
POINT DE PAUSE : La solution PBS/BEV recueillie à partir d’un tube d’ultracentrifugation peut passer à l’étape 6. Conservez la solution de l’autre tube à -80 °C.
5. Préparation de la solution pour la centrifugation à gradient de densité
- Préparation d’un tampon HEPES de 0,02 M
- Mélanger 0,477 g de poudre HEPES et 0,8 g de NaCl avec 90 mL d’eau déminéralisée autoclavée.
- Ajustez le pH à 7,2 en ajoutant 1 M d’hydroxyde de sodium (NaOH). Porter le volume à 100 mL avec de l’eau déminéralisée et filtrer la solution à travers des membranes PES de 0,22 μm.
ATTENTION : L’hydroxyde de sodium est un alcali caustique puissant. Les opérateurs doivent le manipuler et le préparer soigneusement dans une sorbonne.
- Préparation du tampon de gradient de densité
- Calculer le volume requis de chaque tampon de gradient de densité en fonction du nombre de tubes d’ultracentrifugation pour la centrifugation par gradient de densité (étape 6) (Dans ce protocole, les volumes des solutions de gradient de 60 %, 50 %, 40 %, 20 % et 10 % étaient respectivement de 2,5 mL, 3 mL, 6 mL, 6 ml et 6 mL).
- Pour la préparation d’une solution de travail d’iodixanol à 50 % (p/v), mélanger le tampon HEPES à 0,02 M et la solution mère d’iodixanol à 60 % (p/v) dans un rapport volumique de 1 :5 (0,5 mL :2,5 mL).
REMARQUE : Utilisez une seringue jetable de 20 ml pour prélever la solution mère d’iodixanol et éviter d’introduire de l’air. - Pour préparer des tampons d’iodixanol avec des concentrations différentes, combiner la solution de travail d’iodixanol à 50 % de l’étape 5.2.2 avec le tampon HEPES obtenu à l’étape 5.1 à l’aide d’une pipette de 1 000 μL selon les proportions indiquées dans le tableau 1.
REMARQUE : Effectuez l’étape 5 sur un banc ultra-propre avec les lumières éteintes. Conservez la solution mère d’iodixanol ouverte au réfrigérateur à 4 °C pour éviter la croissance bactérienne. Conservez la solution d’iodixanol et le tampon HEPES à l’abri de la lumière.
6. Mise en place d’un système de centrifugation à gradient de densité
- Mode DGC de haut en bas
- Combiner 500 μL de solution PBS/BEV isolée de l’étape 4 avec 3 mL de PBS. Mélangez délicatement les solutions à l’aide d’une pipette de 1 000 μL pour obtenir 3,5 mL de solution PBS/BEV.
- Placez un tube d’ultracentrifugation de 31 mL sur une plaque de mousse percée de trous et étiquetez-le comme « ↓ ».
- Ajouter verticalement 3 mL de la solution d’iodixanol à 50 % au fond du tube à l’aide d’une pipette de 1 000 μL.
- Inclinez le tube à un angle de 70° et positionnez un support de tube ou un autre support légèrement au-dessus du niveau de la plaque de mousse, sous l’ouverture du tube.
- Ajouter 3 mL de solution d’iodixanol à 40 % par-dessus la solution d’iodixanol à 50 % à l’aide d’une pipette de 1 000 μL.
- Ajouter 3 mL de solution d’iodixanol à 20 % par-dessus la solution d’iodixanol à 40 % à l’aide d’une pipette de 1 000 μL.
- Ajouter 3 mL de solution d’iodixanol à 10 % par-dessus la solution d’iodixanol à 20 % à l’aide d’une pipette de 1 000 μL.
- Ajouter 3,5 mL de solution PBS/BEV de l’étape 6.1.1 au-dessus de la solution d’iodixanol à 10 % à l’aide d’une pipette de 1 000 μL.
- Remettez délicatement les tubes en position verticale.
REMARQUE : Après le pipetage, la stratification doit être visible.
- Mode DGC ascendant
- Placez un tube d’ultracentrifugation de 31 mL sur une plaque de mousse percée de trous et étiquetez-le comme « ↑ ».
- Ajouter verticalement 2,5 mL de la solution mère d’iodixanol à 60 % au fond du tube. Mélangez-le délicatement avec 500 μL de solution PBS/BEV isolée de l’étape 4 à l’aide d’une pipette de 1 000 μL pour obtenir 3 mL de solution d’iodixanol/BEV à 50 %.
- Inclinez le tube à un angle de 70° et positionnez un support de tube ou un autre support légèrement au-dessus du niveau de la plaque de mousse, sous l’ouverture du tube.
- Ajouter 3 mL de la solution d’iodixanol à 40 % par-dessus la solution d’iodixanol/VEB à 50 % à l’aide d’une pipette de 1 000 μL.
- Ajouter 3 mL de la solution d’iodixanol à 20 % par-dessus la solution d’iodixanol à 40 % à l’aide d’une pipette de 1000 μL.
- Ajouter 3 mL de la solution d’iodixanol à 10 % par-dessus la solution d’iodixanol à 20 % à l’aide d’une pipette de 1000 μL.
- Ajouter 3,5 mL de PBS sur la solution d’iodixanol à 10 % à l’aide d’une pipette de 1 000 μL.
- Remettez délicatement les tubes en position verticale.
- À ce stade, il restait 200 μL de la suspension obtenue à l’étape 4.17, qui peut être analysée ultérieurement sous la forme d’un groupe nommé « UC ».
REMARQUE : Lors du transfert des solutions à l’étape 6, gardez toujours la pointe de la pipette contre la paroi du tube d’ultracentrifugation perpendiculaire à l’axe du tube.
7. Centrifugation à gradient de densité et collecte de fractions
- Ajustez le poids des deux tubes avec du PBS pour obtenir un poids total inférieur à ± 0,005 g.
- Placez les tubes dans les seaux selon l’étape 4.5 et soumettez-les à une centrifugation à 160 000 × g pendant 7 h à 4 °C.
- Prélever les fractions à l’aide d’une pipette (1000 μL) de haut en bas contre la paroi latérale dans l’ordre suivant : 3 mL, 2 mL, 1 mL, 1 mL, 1 mL, 1 mL, 1 mL, 1 mL, 1 mL, 1,5 ml et 3 mL dans un tube d’ultracentrifugation de 38,5 mL.
REMARQUE : Maintenez la ligne de visée au même niveau que la surface du liquide. - Effectuer une ultracentrifugation pour chaque fraction obtenue à l’étape 7.3 selon l’étape 4 à 160 000 × g pendant 70 min à 4 °C.
- Retirez le surnageant et inversez les tubes d’ultracentrifugation pendant 5 min.
- Remettre les pastilles en suspension dans 200 μL de PBS pré-refroidi (4 °C) à l’aide d’une pipette de 200 μL.
- Transférez la solution PBS/BEV dans un microtube propre de 1,5 ml.
- Étiquetez les fractions de F1 à F10 et analysez-les en fonction de l’étape 8.
POINT DE PAUSE : Si les échantillons obtenus à l’étape 7.8 ne peuvent pas être traités immédiatement, conservez-les à -80 °C.
8. Caractérisation et analyse quantitative des fractions collectées
- Déterminer les valeurs d’absorbance (OD 340 nm) de chaque fraction à l’aide d’un détecteur de microplaques avec une commande à blanc pour calculer leur densité correspondante.
REMARQUE : Remplacez la solution PBS/BEV (étapes 6.1.1 et 6.2.2) par PBS pour établir un contrôle vide.- Préparer 100 μL de solution d’iodixanol à 0 %, 5 %, 10 %, 12,5 % et 20 % diluée par 0,02 M HEPES à base de solution mère à 50 % (étape 5.2.2) comme étalons, correspondant à des densités de 1,0058 g/mL, 1,0318 g/mL, 1,058 g/mL, 1,0708 g/mL et 1,111 g/mL, respectivement.
- Ajouter 50 μL de chaque fraction du témoin à blanc (préparé à l’étape 7.3) et 50 μL de chaque solution étalon (préparée à l’étape 8.1.1) pour dupliquer les puits d’une plaque à 96 puits.
- Réglez la longueur d’onde sur 340 nm, mesurez la densité optique du point final et calculez la densité de chaque fraction.
- Identifiez F4-F9 comme la plage de fractions BEV en fonction de leur densité.
- Déterminer la concentration en protéines des fractions du VEB à l’aide du dosage de l’acide bicinchoninique (BCA).
- Diluer dix fois la substance dans le PBS fourni par le fabricant pour préparer une solution protéique standard à 0,5 μg/μL.
- Ajouter la solution protéique étalon (préparée à l’étape 8.2.1) avec des volumes variables selon les instructions du réactif, et compléter chaque puits d’une plaque à 96 puits avec du PBS jusqu’à un volume total de 20 μL.
- Ajouter 20 μL des échantillons préparés à l’étape 7.8 et les échantillons laissés après la CU définie à l’étape 6.2.9 dans chaque puits.
- Mélanger les réactifs A et B dans un rapport de 50 :1 et transférer 200 μL dans chaque puits.
- Incuber l’assiette au bain-marie à 37 °C pendant 30 min.
- Mesurer la valeur d’absorbance à l’aide d’un lecteur de microplaques, calculer la concentration en protéines (μg/μL) et déterminer la teneur en protéines (μg) des échantillons en fonction de la courbe standard (x : densité optique ; y : concentration en protéines) générée à partir des valeurs des solutions étalons diluées à l’étape 8.2.2.
- Caractériser les fractions de VEB définies à l’étape 8.1.4 à l’aide de la microscopie électronique à transmission (MET) pour vérifier la présence de VEB. Toutes les procédures ci-dessous doivent être effectuées sur la glace.
- Appliquer 10 μL de chaque fraction F4-F9 isolée de l’étape 7.8 et les échantillons laissés après la CU définie à l’étape 6.2.9 sur les grilles de cuivre supportées par Formvar/Carbon pendant 20 min, et éponger avec du papier filtre.
- Rincez les échantillons avec 100 μL de PBS trois fois pendant 1 minute chacun, puis épongez avec du papier filtre.
- Fixez les échantillons avec 100 μL de glutaraldéhyde à 1 % (p/v) pendant 5 min et épongez avec du papier filtre.
- Lavez les grilles avec 100 μL de PBS dix fois pendant 2 min chacune, et épongez avec du papier filtre.
- Teindre les grilles avec 50 μL d’acétate d’uranyle à 1,5 % (p/v) pendant 10 min et éponger avec du papier filtre.
ATTENTION : L’acétate d’uranyle est radioactif et extrêmement toxique lorsqu’il est en contact avec la peau ou inhalé. Manipulez les solutions contenant de l’acétate d’uranyle dans une sorbonne et suivez les mesures de sécurité appropriées. - Transférez les grilles sur une goutte de méthylcellulose à 1 % (p/v) pendant 5 min et épongez avec du papier filtre.
- Conservez les grilles séchées à l’air dans un environnement sombre et sans poussière jusqu’à l’observation.
- Capturez des images et analysez-les à l’aide d’un MET.
- Caractériser les fractions BEV définies à l’étape 8.1.4 à l’aide de l’analyse de suivi des nanoparticules (NTA) pour compter le nombre de particules.
- Calibrer le système à l’aide de particules de polystyrène de 110 nm.
- Lavez le bassin d’échantillons à l’aide de PBS.
- Diluer les échantillons provenant de différentes fractions acquises à l’étape 7.8 et les échantillons laissés après la CU définie à l’étape 6.2.9 à une concentration comprise entre 105 et 109 particules/mL, avec une concentration optimisée de 10à 7 particules/mL.
- Enregistrez et analysez à 11 positions avec trois réplications, en maintenant la température autour de 23-30 °C.
- Analyser la teneur en protéines des échantillons par coloration au bleu brillant de Coomassie (CBBS) et Western blot (WB).
- Diluer les échantillons de VEB provenant de différentes fractions obtenues à l’étape 7.8 et les échantillons laissés après la CU définie à l’étape 6.2.9 à l’aide de PBS et d’un tampon de chargement de 5 × jusqu’à une concentration finale de 0,5 ou 1 μg/μL, si une quantification est nécessaire, en veillant à ce que la charge de l’échantillon soit suffisante de 20 μL (10 μg ou 20 μg) de chaque puits à l’étape 8.5.2. Faites bouillir les échantillons à 95 °C pendant 10 min.
- Assemblez le gel de polyacrylamide préfabriqué dans le réservoir d’électrophorèse et transférez les échantillons dans les puits.
- Effectuer une électrophorèse verticale avec les paramètres suivants : 160 V pendant 50 min.
- Colorez le gel dans une solution bleu brillant Coomassie pendant 1 h, rincez à l’eau déminéralisée jusqu’à ce que le fond bleu s’éclaircisse et capturez des images avec un appareil photo.
- Effectuer des procédures de transfert de protéines pour d’autres gels avec les paramètres suivants : 400 mA pendant 20 min.
- Bloquer les membranes buvards avec une solution BSA à 5 % (p/v) pendant 1 h à température ambiante.
- Lavez les membranes dans un tampon TBST trois fois pendant 5 min chacune.
- Incuber les membranes avec des anticorps primaires (marqueurs BEV : LPS, OmpA, LTA ; Marqueurs EEV : CD63, CD9, TSG-101, Syntenin, Integrine β1 ; Autres marqueurs de contamination : Flagellin, Calnexin) pendant 8-12 h à 4 °C.
- Lavez les membranes dans un tampon TBST trois fois pendant 10 min chacune.
- Incuber les membranes avec des anticorps secondaires pendant 1 h à température ambiante.
- Effectuez l’étape 8.5.9.
- Développer le buvard à l’aide d’un appareil de chimiluminescence.
- Remplacer la solution PBS/BEV (étapes 6.1.1 et 6.2.2) par des BEV d’Escherichia coli afin d’établir un contrôle positif (voir le tableau des matériaux pour la procédure d’isolement des E. coli-BEV bruts) et effectuer toutes les expériences ci-dessus pour caractériser les BEV.
POINT DE PAUSE : Déterminer F6-F8 comme la distribution des fractions enrichies en VEB en fonction des résultats de la caractérisation décrite ci-dessus pour les VEB fécaux, et utiliser cette plage réduite pour l’analyse subséquente.
- Calculer les taux de récupération en termes de particules et de protéines pour évaluer l’efficacité des deux modes DGC. Les résultats ci-dessous sont présentés sous forme de pourcentages.
- Calculez les taux de récupération des particules en mode descendant : nombre total de particules dans F6-F8/particules après UC défini à l’étape 6.2.9.
- Calculez les taux de récupération des particules en mode ascendant : nombre total de particules dans F6-F8/particules après UC défini à l’étape 6.2.9.
- Calculer les taux de récupération des protéines en mode Top-down : teneurs totales en protéines F6-F8 (μg)/teneur en protéines après CU définies à l’étape 6.2.9 (μg).
- Calculer les taux de récupération des protéines en mode ascendant : teneurs totales en protéines F6-F8 (μg)/teneur en protéines après CU définies à l’étape 6.2.9 (μg).
- Calculez le rapport particule/protéine pour évaluer la pureté traditionnellement définie de la CU et des deux modes DGC, et les résultats ci-dessous ont tous été présentés sous forme de pourcentages.
- Rapport particules/protéines après UC défini à l’étape 6.2.9 : particules après UC/teneur en protéines après UC (μg).
- Rapport particules/protéines en mode Top-down : particules totales en F6-F8/teneur en protéines en F6-F8 (μg).
- Rapport particules/protéines en mode ascendant : nombre total de particules en F6-F8/teneur en protéines en F6-F8 (μg).
- Sélectionnez le mode de centrifugation le plus approprié (le mode descendant a été sélectionné dans le protocole) pour la purification des matières fécales par VEB et l’analyse future.
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Representative Results
Déterminer la distribution des fractions enrichies en VEB
Pour déterminer la distribution des fractions enrichies en vésicules extracellulaires bactériennes (VEB), un témoin à blanc a été établi pour mesurer les valeurs d’absorbance à OD 340 nm, et la densité de chaque fraction a été calculée sur la base des mesures et des lignes directrices sur l’iodixanol (étape 8.1). Le tableau 2 présente les résultats de densité, démontrant que les fractions F4 à F9 présentaient des densités dans la gamme généralement associée aux vésicules extracellulaires. Cette constatation suggère que la majorité des VEB ont été isolés dans ces fractions, ce qui a conduit à la définition de F4-F9 comme étant la fourchette approximative pour les VEB. La microscopie électronique à transmission (MET) a été utilisée pour caractériser les caractéristiques morphologiques des VEB fécaux isolés, comme le montre la figure 1 , dans les fractions F4-F9. Les images TEM (Figure 2) ont révélé la présence de structures classiques en forme de coupe, caractéristiques des BEV. L’analyse de suivi des nanoparticules (NTA) et le dosage de l’acide bicinchoninique (BCA) ont été effectués pour déterminer le nombre de particules et la concentration en protéines, respectivement, ce qui a permis une évaluation plus approfondie des taux de récupération et de la pureté. La figure 3 montre les concentrations de protéines et de particules pour chaque fraction, ce qui indique que F6 et F7 présentaient les concentrations les plus élevées, suivies de F5 et F8. Par la suite, la coloration au bleu brillant de Coomassie (CBBS) et le western blot (WB) ont été effectués pour fournir une analyse globale des protéines. Les résultats de la CBBS étaient cohérents avec les résultats de la concentration en protéines, F6 et F7 présentant les bandes les plus intenses (Figure 4). Pour confirmer la distribution des VEB, des vésicules extracellulaires dérivées d’Escherichia coli ont été utilisées comme témoins positifs (définies à l’étape 8.5.13). Les procédures d’isolement et de purification ont suivi les étapes décrites dans le tableau des matériaux et les sections du protocole susmentionnées (étapes 3 et 4). L’analyse WB a en outre confirmé la présence de la protéine A de la membrane externe (OmpA), un composant majeur de la membrane externe des bactéries et un marqueur spécifique des BEV, dans les fractions F6-F8. Sur la base de ces résultats, les fractions F6-F8 ont été définies comme des fractions enrichies en VEB pouvant faire l’objet d’expériences et d’analyses ultérieures.
Vérification de la plage de présentation des composants brouilleurs
Les vésicules extracellulaires eucaryotes (VEE), qui possèdent une taille et une densité similaires à celles des VEB, ont été identifiées comme une interférence majeure dans l’analyse des VEB. Pour remédier à ce problème, trois protéines EEV ont été sondées dans les fractions 5 à 8 à partir des modes Top-down et Bottom-up, avec des temps de centrifugation de 7 h et 15 h. CD63, une protéine transmembranaire associée à l’EEV, a été principalement détectée dans F5, tandis que le marqueur BEV LPS a été enrichi dans les fractions 6 et 7. Cette tendance a été observée dans les deux modes, bien que le mode ascendant ait montré une légère bande de CD63-EEV dans F7. Cependant, d’autres marqueurs EEV, CD9 et TSG-101, n’ont pas montré de signaux visibles dans ces fractions, quels que soient les modes ou les temps de centrifugation. Dans le cadre d’une expérience indépendante, des anticorps ciblant la synténine et l’intégrine β1 ont été utilisés pour vérifier l’enrichissement de marqueurs protéiques distincts inhérents aux EEV dans les fractions 5 à 8. La synténine a été détectée de manière proéminente dans F5, en particulier dans le cadre de l’approche descendante, tandis que la présence d’intégrine β1 a été discernée dans F6 (Figure 5). Afin d’évaluer plus en détail la présence de particules interférentes, des lipoprotéines de basse densité marquées au Dil (Dil-LDL) ont été introduites dans le système de gradient de densité, et l’intensité de fluorescence a été mesurée dans toutes les fractions. Dans le mode Top-down, les fractions 1-4 présentaient des valeurs de fluorescence relativement plus élevées, tandis que dans le mode Bottom-up, c’était F1-F6 qui affichait des intensités plus élevées (Figure 6).
Évaluer les taux de récupération et la pureté de deux modes de DGC à partir de la concentration, de la taille des particules et des marqueurs des VEB
Après avoir identifié les fractions F6-F8 comme des fractions enrichies en VEB, les taux de récupération et la pureté des deux modes de centrifugation à gradient de densité (DGC) ont été évalués. Les tailles de particules des fractions enrichies en VEB obtenues à partir du mode descendant, du mode ascendant et de l’ultracentrifugation (UC) seules ont été comparées. Les tailles de particules observées dans les deux modes de centrifugation variaient de 90 à 300 nm, ce qui correspond au diamètre défini des BEV (Figure 7). Ensuite, les taux de récupération des particules et des protéines des deux modes ont été calculés en fonction des concentrations de particules et de protéines avant et après la DGC (tableau 3 et figure 8). Notamment, le mode ascendant a présenté des taux de récupération plus élevés que l’autre mode. Dans un groupe expérimental distinct, la récupération des protéines dans les deux modes a été évaluée à des temps de centrifugation différents de 7 h et 15 h. Il est important de noter qu’il n’y avait pas de différence statistiquement significative dans la teneur en protéines dans les fractions F6-F8 après DGC entre les deux temps de centrifugation, quel que soit le mode de gradient utilisé (Figure 9). Le rapport particule/protéine a été calculé pour fournir une évaluation approximative de la pureté dans les deux modes. Les données n’indiquaient aucune différence significative de pureté entre les modes. De plus, la coloration au bleu brillant de Coomassie (CBBS) et le western blot (WB) ont été effectués pour comparer davantage la pureté, en se concentrant sur trois marqueurs BEV (LPS, OmpA et LTA), un marqueur EEV (CD63) et deux marqueurs contaminants (Calnexin, Flagellin). Les résultats ont démontré une réduction partielle des substances interférentes après la DGC, le LPS et l’OmpA montrant une présence plus importante dans les deux modes DGC par rapport à la CU seule (Figure 10).
Figure 1 : Schéma de fonctionnement de l’isolement et de la purification des VEB. Abréviations : BEV = vésicules extracellulaires bactériennes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Images TEM représentatives des fractions du BEV. (A) Images TEM de BEV isolés après une CU. (B) Images TEM de VEB isolés après la DGC en utilisant le mode Top-down. (C) Images TEM de BEV isolés après DGC en utilisant le mode ascendant. Toutes les images ont été présentées à une échelle cohérente de 200 nm. Abréviations : TEM = microscope électronique à transmission ; VEB = vésicules extracellulaires bactériennes ; UC = ultracentrifugation ; DGC = centrifugation à gradient de densité. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Concentration en protéines et en particules des fractions BEV après les modes DGC descendants et ascendants. La concentration en protéines des fractions du VEB a été déterminée à l’aide de BCA et est représentée par les barres grises. La concentration en particules a été mesurée à l’aide de NTA et est représentée par les barres bleues. Abréviations : BEV = vésicule extracellulaire bactérienne ; DGC = centrifugation à gradient de densité ; BCA = dosage de l’acide bicinchoninique ; NTA = analyse de suivi des nanoparticules. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Détermination des fractions enrichies en VEB. (A) Le CBBS a été effectué pour déterminer les fractions enrichies en VEB fécales en mode descendant et ascendant. (B) Les VE dérivés d’Escherichia coli ont été isolés, purifiés et utilisés comme témoins positifs dans la WB pour confirmer la présence et la distribution des BEV. OmpA : Protéine membranaire externe A, un marqueur du VEB. Abréviations : BEV = vésicule extracellulaire bactérienne ; CBBS = coloration bleu brillant de Coomassie ; EV = vésicules extracellulaires ; WB = Western blot. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Confirmation de la distribution de l’EEV. Analyse Western blot des fractions 5 à 8 obtenue à partir des modes DGC Top-down et Bottom-up avec des durées d’ultracentrifugation à gradient de densité différentes, 7 h (A) et 15 h (B). Un essai indépendant portant sur F5 à F8 résultant d’une période de centrifugation de 7 h a été réalisé, comme démontré en (C) et (D). Les marqueurs sélectionnés comprenaient ceux associés aux VEB (LPS) et aux VEE (CD63, CD9, TSG-101, Synténine, Intégrine β1). Abréviations : DGC = centrifugation à gradient de densité ; BEV = vésicule extracellulaire bactérienne ; EEV = vésicule extracellulaire eucaryote. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Distribution des lipoprotéines de basse densité. Des lipoprotéines de basse densité marquées au dil (Dil-LDL), considérées comme un marqueur de contamination, ont été ajoutées à une concentration de 10 μg au système de gradient dans les modes descendant et ascendant. Dil-LDL a remplacé la solution PBS/BEV (étapes 6.1.1 et 6.2.2) pour établir un modèle de détection. L’intensité de fluorescence de chaque fraction a été mesurée à l’aide d’un détecteur de microplaques avec une longueur d’onde d’excitation/émission de 549/565 nm. Abréviation : BEV = vésicule extracellulaire bactérienne. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Granulométrie des fractions enrichies en VEB. (A) Distribution granulométrique des VEB bruts obtenus après CU. (B) Distribution granulométrique des fractions enrichies en VEB (F6-F8) obtenues à l’aide du mode de centrifugation à gradient de densité descendante (DGC). (C) La distribution granulométrique des fractions enrichies en VEB (F6-F8) a été obtenue en utilisant le mode DGC ascendant. NTA a été entrepris pour quantifier les dimensions des particules. Les facteurs de dilution utilisés pour les panels (A-C) étaient de 10 000, 2 000 et 5 000, en conséquence, les résultats suivants étant calibrés. Abréviations : BEV = vésicule extracellulaire bactérienne ; UC = ultracentrifugation ; DGC = centrifugation à gradient de densité ; NTA = analyse de suivi des nanoparticules. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 8 : Taux de récupération des protéines et des particules des modes DGC descendants et ascendants. (A) Taux de récupération des protéines des deux modes calculés comme le rapport de la concentration en protéines après et avant DGC (UC). (B) Les taux de récupération des particules des deux modes sont calculés par le rapport de la concentration de particules après et avant DGC (UC). (C) Rapports particules/protéines des modes UC, Top-down et Bottom-up. L±'analyse statistique a été réalisée à l’aide d’un test t bilatéral non apparié pour les panels A et B, et d’une analyse de variance à un facteur (ANOVA) avec le test post hoc de Tukey pour le panel C. Aucune différence significative n’a été observée. Abréviations : DGC = centrifugation à gradient de densité ; UC = ultracentrifugation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 9 : Comparaison de la récupération des protéines basée sur les modes DGC Top-down et Bottom-up en utilisant différents temps d’ultracentrifugation associés à la densité. Les taux de récupération des protéines dans les fractions F6-F8 obtenus par ultracentrifugation de gradient pendant 7 h et 15 h ont été évalués dans des expériences indépendantes utilisant les modes Top-down et Bottom-up. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± MEB. L’analyse statistique a été réalisée à l’aide d’une analyse de variance à deux facteurs (ANOVA) avec le test de différence la moins significative de Fisher. Aucune différence significative n’a été observée. Abréviations : DGC = centrifugation à gradient de densité. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 10 : Évaluation de la pureté des modes DGC descendants et ascendants. (A) Le CBBS a été réalisé pour comparer la distribution des protéines des modes UC, Top-down et Bottom-up. (B) La WB a été réalisée pour évaluer la pureté des modes UC, Top-down et Bottom-up. Calnexine : marqueur protéique associé au réticulum endoplasmique ; Flagelline, marqueur protéique contaminant par les bactéries. CD63 : marqueur protéique transmembranaire des vésicules extracellulaires eucaryotes ; LTA : marqueur du VEB provenant de bactéries à Gram positif ; LPS, OmpA : marqueurs BEV de bactéries à Gram négatif. Abréviations : DGC = centrifugation à gradient de densité ; UC = ultracentrifugation ; CBBS = coloration au bleu brillant de Coomassie ; WB = Western blot. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Concentration de la solution d’iodixanol (%) | Tampon HEPES de 0,02 m | Solution de travail à 50 % d’iodixanol |
| 40 | 1 | 4 |
| 20 | 3 | 2 |
| 10 | 4 | 1 |
Tableau 1 : Ratios pour la préparation des tampons de gradient de densité de l’iodixanol. Le tableau indiquait le rapport entre 0,02 M de tampon HEPES et 50 % de solution de travail d’iodixanol pour obtenir une certaine concentration de solution d’iodixanol.
| F1 (en anglais seulement) | F2 | F3 (en anglais seulement) | F4 (en anglais seulement) | F5 | F6 | F7 | F8 | F9 | F10 | |
| Densité (g/mL) | 1.023 | 1.038 | 1.049 | 1.062 | 1.074 | 1.098 | 1.144 | 1.185 | 1.239 | 1.293 |
Tableau 2 : Densité du système de centrifugation à gradient de densité à base d’iodixanol. Le tableau montrait la densité de chaque fraction dans un système de centrifugation à gradient de densité à base d’iodixanol. Contrôle à blanc : système de gradient basé sur PBS.
| Mode de haut en bas | Mode ascendant | |
| Taux de récupération des particules (%) | 24.08 | 35.69 |
| Taux de récupération des protéines (%) | 24.5 | 32.45 |
Tableau 3 : Taux de récupération des particules et des protéines de deux modes. Le tableau montre les taux de récupération des particules et des protéines des modes Top-down et Bottom-up (Figure 8).
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Discussion
Les vésicules extracellulaires bactériennes (VEB) sont des nanoparticules bicouches lipidiques sécrétées par les bactéries, transportant une richesse de protéines, de lipides, d’acides nucléiques et d’autres molécules bioactives, contribuant à la médiation des effets fonctionnels des bactéries20. Il a été prouvé que les VEB dérivés de l’intestin sont impliqués dans le développement de maladies, telles que les maladies inflammatoires de l’intestin, la maladie de Crohn et le cancer colorectal, et affectent également le métabolisme général et interviennent dans les fonctions cognitives altérées 4,16,17,20,21,22,23,24,25,26 . À l’heure actuelle, l’obtention d’informations biologiques complètes et objectives sur les VEB d’origine bactérienne intestinale à partir de spécimens et de matières fécales humaines est encore limitée par une série de facteurs, parmi lesquels la première et la plus importante question clé est de savoir comment isoler les VEB de l’environnement hôte complexe.
Les principales méthodes d’isolement des VEB, telles que l’ultracentrifugation (UC), la centrifugation à gradient de densité (DGC) et la chromatographie d’exclusion de taille (SEC)13,14,15,16,17, présentent à la fois des avantages et des inconvénients. La difficulté d’éliminer certaines substances interférentes et l’absence de procédures d’exploitation cohérentes, qui nuisent sérieusement à une analyse plus réaliste et plus complète des VEB, demeurent des défis pour le processus de séparation. Pour atténuer les effets indésirables des interférences, de nombreuses études 15,27,28 ont combiné deux ou plusieurs des méthodes ci-dessus pour obtenir la séparation des BEV, en particulier des fluides corporels, mais les procédures complexes ont tendance à affecter la stabilité des résultats. Pour les VEB, la différence de densité avec d’autres contaminants (p. ex., agrégats de protéines, composants lipidiques, vésicules extracellulaires eucaryotes (VEE)15) peut devenir un moyen d’isolement spécifique de nos jours.
À l’heure actuelle, l’iodixanol est apparu comme le milieu privilégié pour la séparation par gradient de densité des VE, remplaçant le saccharose en raison de ses propriétés isotoniques. Ces propriétés contribuent à préserver la morphologie des VE et facilitent l’estimation de la densité pour chaque fraction29. Conformément à Tulkens et al15, notre étude a adopté une concentration identique pour le système DGC, en utilisant l’iodixanol à 50 % (p/v), 40 % (p/v), 20 % (p/v), 10 % (p/v) et 0 % de gradient de concentration. L’étape initiale a consisté à utiliser un tampon HEPES pour préparer diverses concentrations de solutions d’iodixanol. Par rapport au tampon Tris (-EDTA)-saccharose, une concentration appropriée de tampon HEPES assure la stabilité du pH à long terme dans le système de centrifugation, grâce à ses propriétés intrinsèques. Dans le même temps, un tampon PBS stérile a été utilisé dans la couche supérieure du système de centrifugation, non seulement pour se prémunir contre une contamination potentielle par les bactéries et leurs métabolites pendant la préparation de la solution, mais aussi pour maintenir la cohérence du tampon de l’échantillon avant et après la DGC. Il s’agissait de remettre la pastille en suspension avec un tampon PBS après la CU et de remplacer l’iodixanol par du PBS après la DGC, facilitant ainsi une analyse comparative des résultats. De plus, le volume de chaque couche de gradient dans le système DGC a été calibré à 3 mL, 3 mL, 3 mL, 3 mL et 3,5 mL pour des solutions d’iodixanol à 50 %, 40 %, 20 %, 10 % et 0 % (couche PBS) respectivement. Cette stratégie permet d’établir une plage de densité relativement plus large (1,02 à 1,30 g/mL), ce qui pourrait améliorer la séparation des VEB des autres éléments interférents, rendant ainsi les gradients applicables à d’autres fluides corporels présentant une contamination complexe.
Il est important de souligner que certaines étapes du protocole sont cruciales. Notamment, le facteur de dilution décrit à l’étape 2.2, où 1 g d’échantillons fécaux est mélangé à un minimum de 10 mL de PBS, est essentiel pour prévenir la sursaturation et conserver les ressources expérimentales. Dans ces conditions, la concentration de particules et de protéines augmente généralement proportionnellement à la masse fécale dans un échantillon, en supposant que les autres caractéristiques fécales sont constantes. Si nécessaire, une analyse plus approfondie tenant compte de facteurs tels que la consistance, les lipoprotéines ou le contenu sanguin peut être entreprise. Au cours de l’étape 3.4, il faut faire preuve de prudence pour éviter de verser directement la solution, car cela pourrait perturber la pastille et provoquer l’obstruction de granulés plus gros sur la membrane du filtre de 0,22 μm. Si le filtre devient rapidement saturé (par exemple, si moins de 10 mL passent à travers un filtre), une étape de centrifugation supplémentaire à 12 000 × g est conseillée. Dans le cadre de la centrifugation par gradient de densité, une préparation précise des solutions de gradient est une condition préalable à la fiabilité des résultats. De plus, une manipulation minutieuse du tube lors de la superposition des solutions supérieures de faible densité est essentielle pour éviter la perturbation de la stratification, et toute bulle doit être éliminée par un pipetage attentif. Enfin, lors de l’aspiration des fractions, il est important de les aspirer méticuleusement le long de la paroi du tube, en évitant toute suraspiration ou sous-aspiration qui pourrait entraîner une distribution inexacte du VEB. L’observation régulière du niveau de liquide et une pratique cohérente peuvent aider à atténuer ce problème.
Cette étude a permis de déterminer les fractions enrichies en VEB (F6-F8) à l’aide de plusieurs méthodes de caractérisation et d’explorer deux modes distincts d’ultracentrifugation à gradient : Top-down et Bottom-up. En mesurant la concentration en protéines et en particules dans F4-F8 (figure 3) et en comparant les taux de récupération et la pureté (figure 8 et figure 10), il a été observé que le mode de centrifugation ascendante a donné des valeurs détectées plus élevées aux niveaux de protéines et de particules que la méthode alternative d’isolement et de purification des VEB à partir d’échantillons fécaux. Cette observation implique différents processus dynamiques. Une hypothèse a été proposée selon laquelle les nanoparticules extracellulaires non vésiculaires (NVEP)29, telles que les lipoprotéines, dont la densité est inférieure à celle des VEB, pourraient ne pas atteindre leur densité de flottabilité si les échantillons sont chargés par le bas (Figure 6), ce qui pourrait entraîner un taux de récupération gonflé, même après 15 h de DGC (Figure 9). Cette observation nécessite d’examiner si la définition traditionnelle de la pureté, basée sur le rapport entre les particules et les protéines, est applicable. De plus, il convient de noter que les VEE présentaient une prépondérance dans F5, tandis que les VEB étaient détectés de manière proéminente dans F6-F7 (Figure 4 et Figure 5). Notamment, cette différenciation semble s’accentuer lors de l’adoption du mode Top-down. Par conséquent, ce mode peut être plus adapté à ce protocole. Cependant, il est essentiel de mettre en évidence la présence de l’intégrine β1 au sein de F6, ce qui pourrait signifier l’hétérogénéité intrinsèque entre les EEV. Lorsqu’ils appliquent cette méthode à d’autres fluides corporels tels que le sang et l’urine, les chercheurs doivent tenir compte des caractéristiques uniques des échantillons. Le temps de centrifugation défini dans ce protocole est de 7 h, ce qui est nettement inférieur à la durée citée dans d’autres études, qui peut aller jusqu’à 18 h. Comparé à la récupération des protéines d’une durée de 15 heures exécutée selon le même schéma dans cette étude (Figure 9), ce temps semble suffisant pour atteindre la pureté de séparation requise. Dans ces conditions de fonctionnement, la récupération des particules en mode descendant a atteint jusqu’à 10 8 (4,5 × 10 7-1,5 × 108) par milligramme de matières fécales, ce qui correspond aux rapports précédents (10à 11 VEB par gramme de selles humides)15,29,30. Enfin, les mesures de densité de chaque fraction du témoin à blanc ont confirmé que la densité des VEB variait de 1,09 à 1,19 g/mL, ce qui est conforme aux recherches antérieures.
Cette méthode, bien qu’efficace, présente une limitation en raison de l’impact des régimes alimentaires, de la fonction intestinale et d’autres facteurs sur la composition fécale. Ces variables peuvent altérer la consistance fécale, ce qui peut avoir une incidence sur l’abondance bactérienne et le rétablissement du VEB. Par conséquent, il est crucial de normaliser l’isolement et la purification des VEB31,32, en apportant des ajustements en fonction de l’évaluation des caractéristiques fécales. Les recherches futures devraient se concentrer sur l’identification d’une norme pour normaliser le rendement du VEB, semblable à la créatinine urinaire ou au débit urinaire. Un tel point de référence pourrait améliorer l’évaluation méthodologique et mettre en lumière le lien entre les VEB fécaux et l’état physiologique et pathologique de l’organisme. De plus, la forte association entre les VEB fécaux et diverses maladies souligne leur potentiel clinique important. Cependant, le temps de centrifugation stipulé dans ce protocole ne répond pas à la demande de tests plus pratiques et plus rapides exigée par les cliniciens. Par conséquent, des recherches plus approfondies sont nécessaires pour déterminer si des temps de centrifugation plus courts, peut-être moins de 3 h, peuvent donner des résultats équivalents. Une exploration plus approfondie est également nécessaire pour comprendre les événements qui se produisent dans les deux modes de centrifugation. Bien qu’il soit postulé que les composants non vésiculaires sont plus enrichis en F6-F8 en mode ascendant, le raffinage des concentrations de gradient peut s’avérer bénéfique pour identifier d’autres sous-types ayant des fonctions spécifiques.
Cette étude a démontré avec succès l’isolement et la purification des VEB à partir de matières fécales humaines à l’aide de DGC. La stratégie est prometteuse pour une application à d’autres échantillons biologiques, tels que le sang, l’urine et la salive, offrant aux chercheurs une approche efficace pour découvrir les informations cachées des VEB, ce qui pourrait faire progresser les applications cliniques.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le National Science Fund for Distinguished Young Scholars (82025024) ; le projet clé de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82230080) ; le Programme national de R-D clé de la Chine (2021YFA1300604) ; la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (81871735, 82272438 et 82002245) ; Fonds des sciences naturelles du Guangdong pour les jeunes chercheurs distingués (2023B1515020058) ; la Fondation des sciences naturelles de la province du Guangdong (2021A1515011639) ; le Programme de développement de la recherche fondamentale de la Fondation des sciences naturelles de la province du Shandong en Chine (ZR2020ZD11) ; la Fondation des sciences postdoctorales (2022M720059) ; le programme de développement exceptionnel des jeunes de l’hôpital de Nanfang, Université médicale du Sud (2022J001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 % (w/v) glutaraldehyde (prepared from 2.5 % stock solution in deionized water) | ACMEC | AP1126 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.3 |
| 1 % (w/v) methylcellulose (prepared from original powder in deionized water) | Sigma-Aldrich | M7027 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.6 |
| 1.5 % (w/v) uranyl acetate (prepared from original powder in deionized water) | Polysciences | 21447-25 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.5 |
| 1000 μL, 200 μL, 10 μL Pipette | KIRGEN | KG1313, KG1212, KG1011 | Transfer the solution |
| 5 % (w/v) bovine serum albumin solution (prepared from the original powder in TBST buffer) | Fdbio science | FD0030 | Used in western blotting for blocking at Step 8.5.6 |
| 5 × loading buffer | Fdbio science | FD006 | Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5.1 |
| 75 % (v/v) alcohol | LIRCON | LIRCON-500 mL | Surface disinfection |
| 96-well plate | Rar | A8096 | Measure the absorbance values |
| Anti-Calnexin antibody | Abcam | ab92573 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-CD63 antibody | Abcam | ab134045 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-CD9 antibody | Abcam | ab236630 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-Flagellin antibody | Sino Biological | 40067-MM06 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-Integrin beta 1 antibody | Abcam | ab30394 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-LPS antibody | Thermo Fisher | MA1-83152 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-LTA antibody | Thermo Fisher | MA1-7402 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-OmpA antibody | CUSABIO | CSB-PA359226ZA01EOD, https://www.cusabio.com/ | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-Syntenin antibody | Abcam | ab133267 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-TSG101 antibody | Abcam | ab125011 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Autoclave | ZEALWAY | GR110DP | Sterilization for supplies and mediums used in the experiment |
| Balance | Mettler Toledo | AL104 | Balance the tube sample-loaded with PBS |
| Bicinchoninic acid assay | Fdbio science | FD2001 | Measure protein content of BEVs at Step 8.2 |
| BioRender | BioRender | https://app.biorender.com | Make the schematic workflow of BEVs isolation and purification showed in Figure 1 |
| Biosafety cabinet | Haier | HR1200- II B2 | Peform the procedures about feces sample handling |
| Centrifuge 5810 R; Rotor F-34-6-38 | Eppendorf | 5805000092; 5804727002, adapter: 5804774000 | Preprocess for BEVs (Step 3) |
| Chemiluminescence Apparatus | BIO-OI | OI600SE-MF | Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12 |
| Cytation 5 | BioTek | F01 | Microplate detector for measuring the absorbance (Step 8.1) and fluorescence (Figure 6) values |
| Dil-labled low density lipoprotein | ACMEC | AC12038 | Definition of distribution of interfering components |
| Electrophoresis equipment | Bio-rad | 1658033 | Used in western blotting for protein separation and transfer at Step 8.5.2, 8.5.3, 8.5.5 |
| Enhanced Chemiluminescence kit HRP | Fdbio science | FD8020 | Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12 |
| Escherichia coli | American Type Culture Collection | ATCC8739 | Isolate BEVs as a positive control. Protocol: Dissolve 25 g of the LB powder in 1 L deionized water, and autoclave. Transfer the 800 μL of preserved Escherichia coli into the medium. Cultivate at 37 °C in the incubator shaker. Then centrifuge at 3, 000 × g for 20 min at 4 °C, 12, 000 × g for 30 min at 4 °C, filter the supernatant through 0.22 μm membrane, and perform ultra-speed centrifugation at 160, 000 × g for 70 min at 4 °C. Pellet defined as crude BEVs from Escherichia coli was suspended in 1.2 mL PBS (Step 3, 4). |
| Falcon tubes 50 mL | KIRGEN | KG2811 | Preprocess for BEVs (Step 3) |
| Feto Protein Staining Buffer | Absci | ab.001.50 | Coomassie brilliant blue staining at Step 8.5.4 |
| Filter paper | Biosharp | BS-TFP-070B | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 (Blotting the solution) |
| Formvar/Carbon supported copper grids | Sigma-Aldrich | TEM-FCF200CU50 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 |
| HEPES powder | Meilunbio | MB6078 | Prepare iodixanol buffers with different concentrations for density gradient centrifugation |
| HRP AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Fdbio science | FDM007 | Western blotting (Secondary Antibody) |
| HRP AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Fdbio science | FDR007 | Western blotting (Secondary Antibody) |
| Incubator shaker | Qiangwen | DHZ-L | Cultivate Escherichia coli |
| Kimwipes™ Delicate Task Wipes | Kimtech Science | 34155 | Wipe the inner wall of the ultracentrifuge tube at Step 4.15 |
| LB broth | Hopebio | HB0128 | Cultivate Escherichia coli |
| Low temperature freezer (-80 °C) | Haier | DW-86L338J | Store the samples |
| Methanol | Alalddin | M116118 | Used in western blotting for activating PVDF membrane at Step 8.5.5 |
| Micro tubes 1.5 mL | KIRGEN | KG2211 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
| Micro tubes 2 mL | KIRGEN | KG2911 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
| Micro tubes 5 mL | BBI | F610888-0001 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
| Microplate reader | Thermo Fisher | Multiskan MK3 | Measure protein content of BEVs at Step 8.2 |
| Millipore filter 0.22 μm | Merck millipore | SLGP033RB | Filtration sterilization; Material: polyethersulfone, PES |
| NaCl | GHTECH | 1.01307.040 | Density gradient centrifugation solution |
| NaOH | GHTECH | 1.01394.068 | Density gradient centrifugation solution (pH adjustment) |
| Optima™ XPN-100 | Beckman Coulter | A94469 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
| OptiPrep™ | Serumwerk Bernburg AG | 1893 | Density gradient centrifugation stock solution |
| Orbital Shaker | Youning | CS-100 | Dissolve feces at Step 2 |
| Phosphate buffered saline | Procell | PB180327 | Dissolve feces at Step 2 |
| Pipettor | Eppendorf | 3120000267, 3120000259 | Transfer the solution |
| Plastic pasteur pipette | ABCbio | ABC217003-4 | Remove supernatant in preprocessing at Step 3.4 |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes | Millipore | ISEQ00010, IPVH00010 | Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5 |
| Prefabricated polyacrylamide gel, 4–20% 15 Wells | ACE | F15420Gel | Used in western blotting for protein separation at Step 8.5.2, 8.5.3 |
| Primary antibody diluent | Fdbio science | FD0040 | Used in western blotting at Step 8.5.8 |
| Protein ladder | Fdbio science | FD0672 | Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5 |
| Rapid protein blotting solution | UBIO | UW0500 | Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5 |
| Rotor SW 32 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 369650 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
| Syringe 20 mL, 50 mL | Jetway | ZSQ-20ML, YCXWJZSQ-50 mL | Transfer buffers amd remove supernatant in preprocessing |
| TBS powder | Fdbio science | FD1021 | Used in western blotting at Step 8.5 |
| Transmission electron microscope (TEM) | Hitachi | H-7650 | Morphological observation for BEVs at Step 8.3 |
| Tween-20 | Fdbio science | FD0020 | Used in western blotting at Step 8.5 |
| Ultracentrifuge tube | Beckman | 326823, 355642 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
| Ultra-clean bench | AIRTECH | SW-CJ-2FD | Peform the procedures about liquid handling |
| Water bath | Bluepard | CU600 | Used for measuring protein content of BEVs at Step 8.2.5 |
| ZetaView | Particle Metrix | S/N 21-734, Software ZetaView (version 8.05.14 SP7) | Nanoparticle tracking analysis (NTA) for measuring the particle size and concentrarion of BEVs at Step 8.4 |
References
- Costello, E. K., et al. Bacterial community variation in human body habitats across space and time. Science. 326 (5960), 1694-1697 (2009).
- Greenhalgh, K., Meyer, K. M., Aagaard, K. M., Wilmes, P. The human gut microbiome in health: establishment and resilience of microbiota over a lifetime. Environmental Microbiology. 18 (7), 2103-2116 (2016).
- de Vos, W. M., Tilg, H., Van Hul, M., Cani, P. D. Gut microbiome and health: mechanistic insights. Gut. 71 (5), 1020-1032 (2022).
- Zhou, P., Yang, D., Sun, D., Zhou, Y. Gut microbiome: New biomarkers in early screening of colorectal cancer. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 36 (5), 24359 (2022).
- Paik, D., et al. Human gut bacteria produce Τ(Η)17-modulating bile acid metabolites. Nature. 603 (7903), 907-912 (2022).
- Parada Venegas, D., et al. Short chain fatty acids (SCFAs)-mediated gut epithelial and immune regulation and its relevance for inflammatory bowel diseases. Frontiers in Immunology. 10, 277 (2019).
- Jiang, C., Li, G., Huang, P., Liu, Z., Zhao, B. The Gut microbiota and Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 58 (1), 1-15 (2017).
- Morais, L. H., Schreiber, H. L. t, Mazmanian, S. K. The gut microbiota-brain axis in behaviour and brain disorders. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 241-255 (2021).
- Kim, J. H., Lee, J., Park, J., Gho, Y. S. Gram-negative and Gram-positive bacterial extracellular vesicles. Seminars in Cell and Developmental Biology. 40, 97-104 (2015).
- Toyofuku, M., Nomura, N., Eberl, L. Types and origins of bacterial membrane vesicles. Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 13-24 (2019).
- Xie, J., Li, Q., Haesebrouck, F., Van Hoecke, L., Vandenbroucke, R. E. The tremendous biomedical potential of bacterial extracellular vesicles. Trends in Biotechnology. 40 (10), 1173-1194 (2022).
- Coumans, F. A. W., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).
- Northrop-Albrecht, E. J., Taylor, W. R., Huang, B. Q., Kisiel, J. B., Lucien, F. Assessment of extracellular vesicle isolation methods from human stool supernatant. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (4), 12208 (2022).
- Park, Y. E., et al. Microbial changes in stool, saliva, serum, and urine before and after anti-TNF-α therapy in patients with inflammatory bowel diseases. Scientific Reports. 12 (1), 6359 (2022).
- Tulkens, J., De Wever, O., Hendrix, A. Analyzing bacterial extracellular vesicles in human body fluids by orthogonal biophysical separation and biochemical characterization. Nature Protocols. 15 (1), 40-67 (2020).
- Tulkens, J., et al. Increased levels of systemic LPS-positive bacterial extracellular vesicles in patients with intestinal barrier dysfunction. Gut. 69 (1), 191-193 (2020).
- Kang, C. S., et al. Extracellular vesicles derived from gut microbiota, especially Akkermansia muciniphila, protect the progression of dextran sulfate sodium-induced colitis. PloS one. 8 (10), 76520 (2013).
- Simonsen, J. B. What are we looking at? Extracellular vesicles, lipoproteins, or both. Circulation Research. 121 (8), 920-922 (2017).
- Correll, V. L., et al. Optimization of small extracellular vesicle isolation from expressed prostatic secretions in urine for in-depth proteomic analysis. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12184 (2022).
- Liang, X., et al. Gut bacterial extracellular vesicles: important players in regulating intestinal microenvironment. Gut Microbes. 14 (1), 2134689 (2022).
- Alberti, G., et al. Extracellular vesicles derived from gut microbiota in inflammatory bowel disease and colorectal cancer. Biomedical papers of the Medical Faculty of the University Palacky, Olomouc, Czech Republic. 165 (3), 233-240 (2021).
- Díez-Sainz, E., Milagro, F. I., Riezu-Boj, J. I., Lorente-Cebrián, S. Effects of gut microbiota-derived extracellular vesicles on obesity and diabetes and their potential modulation through diet. Journal of Physiology and Biochemistry. 78 (2), 485-499 (2022).
- Lajqi, T., et al. Gut microbiota-derived small extracellular vesicles endorse memory-like inflammatory responses in murine neutrophils. Biomedicines. 10 (2), 442 (2022).
- Lee, K. E., et al. The extracellular vesicle of gut microbial Paenalcaligenes hominis is a risk factor for vagus nerve-mediated cognitive impairment. Microbiome. 8 (1), 107 (2020).
- Villard, A., Boursier, J., Andriantsitohaina, R. Bacterial and eukaryotic extracellular vesicles and nonalcoholic fatty liver disease: new players in the gut-liver axis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 320 (4), G485-G495 (2021).
- Wei, S., et al. Outer membrane vesicles enhance tau phosphorylation and contribute to cognitive impairment. Journal of Cellular Physiology. 235 (5), 4843-4855 (2020).
- Bitto, N. J., Kaparakis-Liaskos, M. Methods of bacterial membrane vesicle production, purification, quantification, and examination of their immunogenic functions. Methods in Molecular Biology. 2523, 43-61 (2022).
- Stentz, R., Miquel-Clopés, A., Carding, S. R. Production, isolation, and characterization of bioengineered bacterial extracellular membrane vesicles derived from Bacteroides thetaiotaomicron and their use in vaccine development. Methods in Molecular Biology. 2414, 171-190 (2022).
- Zhang, Q., Jeppesen, D. K., Higginbotham, J. N., Franklin, J. L., Coffey, R. J. Comprehensive isolation of extracellular vesicles and nanoparticles. Nature Protocols. 18 (5), 1462-1487 (2023).
- Iwai, K., Minamisawa, T., Suga, K., Yajima, Y., Shiba, K. Isolation of human salivary extracellular vesicles by iodixanol density gradient ultracentrifugation and their characterizations. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 30829 (2016).
- Vandeputte, D., et al. Stool consistency is strongly associated with gut microbiota richness and composition, enterotypes and bacterial growth rates. Gut. 65 (1), 57-62 (2016).
- Wen, M., et al. Bacterial extracellular vesicles: A position paper by the Microbial Vesicles Task Force of the Chinese Society of Extracellular Vesicles. Interdisciplinary Medicine. 1, 12046 (2023).
