Summary
Questo studio descrive un metodo per isolare e purificare le vescicole extracellulari batteriche (BEV) arricchite da feci umane tramite centrifugazione a gradiente di densità (DGC), identifica le caratteristiche fisiche dei BEV dalla morfologia, dalla dimensione delle particelle e dalla concentrazione e discute le potenziali applicazioni dell'approccio DGC nella ricerca clinica e scientifica.
Abstract
Le vescicole extracellulari batteriche (BEV) sono nanovescicole derivate da batteri che svolgono un ruolo attivo nella comunicazione batterio-batterio e batterio-ospite, trasferendo molecole bioattive come proteine, lipidi e acidi nucleici ereditati dai batteri genitori. I BEV derivati dal microbiota intestinale hanno effetti all'interno del tratto gastrointestinale e possono raggiungere organi distanti, con conseguenti implicazioni significative per la fisiologia e la patologia. Le indagini teoriche che esplorano i tipi, le quantità e i ruoli dei BEV derivati dalle feci umane sono fondamentali per comprendere la secrezione e la funzione dei BEV dal microbiota intestinale. Queste indagini richiedono anche un miglioramento dell'attuale strategia per l'isolamento e la purificazione dei BEV.
Questo studio ha ottimizzato il processo di isolamento e purificazione dei BEV stabilendo due modalità di centrifugazione a gradiente di densità (DGC): Top-down e Bottom-up. La distribuzione arricchita dei BEV è stata determinata nelle frazioni da 6 a 8 (F6-F8). L'efficacia dell'approccio è stata valutata in base alla morfologia delle particelle, alle dimensioni, alla concentrazione e al contenuto proteico. Sono stati calcolati i tassi di recupero di particelle e proteine ed è stata analizzata la presenza di marcatori specifici per confrontare il recupero e la purezza delle due modalità DGC. I risultati hanno indicato che la modalità di centrifugazione top-down aveva livelli di contaminazione più bassi e raggiungeva un tasso di recupero e una purezza simili a quelli della modalità bottom-up. Un tempo di centrifugazione di 7 ore è stato sufficiente per raggiungere una concentrazione fecale di BEV di 108/mg.
Oltre alle feci, questo metodo potrebbe essere applicato ad altri tipi di fluidi corporei con opportune modifiche in base alle differenze nei componenti e nella viscosità. In conclusione, questo protocollo dettagliato e affidabile faciliterebbe l'isolamento e la purificazione standardizzati dei BEV e, quindi, getterebbe le basi per le successive analisi multi-omiche e gli esperimenti funzionali.
Introduction
L'intestino è ampiamente riconosciuto come l'organo che ospita le comunità microbiche più abbondanti nel corpo umano, con oltre il 90% dei batteri coinvolti nella colonizzazione e moltiplicazione 1,2. Numerose evidenze hanno dimostrato che il microbiota intestinale modula il microambiente intestinale e contemporaneamente interagisce con la disfunzione in organi distanti, principalmente attraverso una barriera intestinale compromessa 3,4. Prove crescenti indicano una correlazione tra lo squilibrio del microbiota intestinale e la progressione della malattia infiammatoria intestinale (IBD)5,6, nonché i disturbi cognitivi attraverso l'asse intestino-cervello 5,6,7,8. Le vescicole extracellulari batteriche (BEV) prodotte dai batteri svolgono un ruolo significativo in questi processi patologici.
I BEV sono particelle su scala nanometrica che incapsulano derivati batterici, con diametri compresi tra 20 e 400 nm. È stato dimostrato che facilitano le interazioni tra i batteri e i loro organismi ospiti 9,10. Nonostante la loro invisibilità, queste particelle hanno attirato una crescente attenzione da parte dei ricercatori a causa delle loro ampie applicazioni come biomarcatori diagnostici, bersagli terapeutici e veicoli di somministrazione di farmaci11. Le feci umane, spesso utilizzate come campioni biologici per lo studio dei BEV, provenienti prevalentemente da batteri intestinali, contengono una complessa miscela di acqua, batteri, lipidi, proteine, residui di cibo non digerito e cellule epiteliali esfoliate, tra gli altri. L'intricata composizione fecale pone sfide all'isolamento e alla purezza dei BEV, impedendo così un'analisi completa, obiettiva e realistica dei BEV. Pertanto, le strategie efficaci per ridurre al minimo le interferenze dovute alla contaminazione dei componenti e migliorare la resa dei BEV sono emerse come questioni critiche che meritano un'attenzione immediata.
Le strategie di isolamento esistenti si basano in gran parte su tecniche come la centrifugazione ad altissima velocità (UC), la centrifugazione a gradiente di densità (DGC) e la cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC)12,13,14,15,16,17. Attualmente, il DGC è uno dei metodi più ampiamente applicati nel campo della separazione dei BEV, che comprende due modalità di sedimentazione-galleggiamento, "Top-down" e "Bottom-up", che sono determinate dalla posizione di carico iniziale del campione. Queste metodologie differenziano le vescicole extracellulari (EV) da altri componenti in base alle disparità di dimensioni e densità, producendo velocità di purezza e recupero variabili. Ricerche precedenti hanno indicato che le strategie ad approccio singolo sono insufficienti per separare adeguatamente le vescicole extracellulari dalle proteine solubili nei campioni di fluidi corporei, come la lipoproteina nel sangue18 e la proteina Tamm-Horsfall nelle urine19. Inoltre, la distribuzione dimensionale delle vescicole extracellulari eucariotiche (EEV) spesso si sovrappone a quella dei BEV, rendendo quindi necessari ulteriori miglioramenti metodologici per ottimizzare la resa dei BEV. Di conseguenza, l'avanzamento dello studio dei BEV dipende dallo sviluppo di metodologie efficaci di separazione e purificazione. In particolare, Tulkens et al. 15 hanno impiegato una strategia biofisica ortogonale per separare i BEV fecali dagli EEV, in cui il tempo di centrifugazione di una modalità DGC dal basso verso l'alto era fino a18 ore. Al contrario, questo studio lo ha ridotto a 7 ore, risparmiando notevolmente il tempo di ultracentrifugazione a gradiente e semplificando il processo.
Nel presente studio, abbiamo isolato e purificato BEV fecali impiegando due modalità DGC in condizioni tampone ottimizzate, dopo aver arricchito i BEV con una gamma di velocità di centrifugazione differenziali, da bassa a altissima velocità. Le valutazioni basate sulla morfologia, la dimensione delle particelle e la concentrazione hanno indicato prestazioni encomiabili con questo metodo avanzato. Questo studio potrebbe fungere da base per la ricerca futura, estendendo le sue applicazioni a un dominio più ampio e offrendo approfondimenti sull'eterogeneità dei BEV all'interno del corpo umano. Contribuisce inoltre alla standardizzazione delle tecniche di separazione e analisi dei BEV.
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Protocol
Il Comitato Etico del Nanfang Hospital, Southern Medical University, ha approvato questo studio, che è stato condotto con il consenso informato dei partecipanti. Tutti i metodi utilizzati nel presente documento sono conformi alle linee guida operative standard fornite dagli standard internazionali del microbioma umano (IHMS: http://www.microbiome-standards.org/). Tutte le successive procedure di manipolazione dei liquidi dovevano essere eseguite all'interno di una cabina di biosicurezza o di un banco ultra-pulito.
1. Raccolta e aliquotazione di campioni fecali
- Distribuire un campionatore di feci, un sacchetto sigillato e una scatola ghiacciata e fornire istruzioni complete ai partecipanti su come procurarsi e conservare i campioni.
- Istruire ogni partecipante a raccogliere il proprio campione fecale utilizzando il campionatore fornito e a trasportarlo in laboratorio a una temperatura di 4 °C entro una finestra di 24 ore.
- Al ricevimento in laboratorio, utilizzare un cucchiaio sterile per aliquotare meno di 3,5 g di feci in una provetta da centrifuga da 50 ml prepesata. Annotare il peso del campione fecale sulla provetta per le successive procedure di pretrattamento.
PUNTO DI PAUSA: Se l'elaborazione immediata dei campioni non è possibile, assegnare il campione per la conservazione a lungo termine a -80 °C dopo un'opportuna annotazione.
2. Preparazione del campione di feci
- Raffreddare 500 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) a 4 °C. Filtrare il PBS pre-raffreddato attraverso un filtro in polietersulfone (PES) da 0,22 μm utilizzando una siringa da 50 mL in dieci provette da centrifugazione da 50 mL.
- Posizionare due provette da 50 ml sul ghiaccio, ciascuna contenente 3,5 g di campioni fecali. Aggiungere 35 mL di PBS a ciascuna provetta.
NOTA: Calcolare la quantità necessaria di PBS per la dissoluzione delle feci, garantendo una concentrazione massima del campione del 10% (p/v). Se si elaborano campioni aggiuntivi, utilizzare più provette secondo necessità. - Agitare i campioni a 300 giri/min per 2 ore a 4 °C, oppure posizionarli per 8 ore almeno a 4 °C fino a quando le feci sono completamente sospese a vista.
3. Centrifugazione a velocità differenziale
- Raffreddare la centrifuga refrigerata ad alta velocità a 4 °C.
- Regolare il peso delle due provette contenenti i campioni preparati al punto 2.3 con PBS per raggiungere un peso totale di 0,1 g.
- Centrifugare i campioni a 3.000 × g per 20 minuti a 4 °C.
- Pipettare con cura il surnatante in due provette da centrifuga pulite da 50 mL, lasciando circa 1 mL sopra il pellet. Utilizzare una pipetta Pasteur in plastica usa e getta per questo processo.
- Regolare il peso dei due tubi con PBS per raggiungere un peso totale entro ± 0,1 g.
- Centrifugare il surnatante trasferito a 12.000 × g per 30 minuti a 4 °C.
- Aspirare il surnatante utilizzando una siringa da 20 mL, rimuovere l'ago della siringa e filtrarlo attraverso filtri da 0,22 μm in provette da 50 mL. A questo punto, il volume del surnatante dovrebbe essere di circa 30 ml.
NOTA: Se dopo la centrifugazione di 12.000 × g è ancora visibile una quantità significativa di impurità, è necessario ripetere la fase di centrifugazione a 12.000 × g per 30 minuti a 4 °C. La mancata osservanza di questa precauzione può comportare una perdita significativa di BEV a causa dell'ostruzione dei pori durante la filtrazione.
4. Centrifugazione ad altissima velocità
- Pulire il rotore e la benna strofinandoli con alcol al 75% (v/v) per eliminare qualsiasi contaminazione residua.
- Posizionare una provetta per ultracentrifuga da 38,5 mL nel supporto della provetta.
NOTA: Selezionare la provetta per ultracentrifuga appropriata in base al volume del campione. Evitare radiazioni ultraviolette e reagenti chimici non idonei per la sterilizzazione delle provette centrifughe come indicato nel manuale del prodotto. - Trasferire circa 30 mL del surnatante fecale filtrato dalla fase 3.7 nella provetta per ultracentrifuga.
- Riempire la provetta dell'ultracentrifuga con circa 8 mL di PBS, lasciando uno spazio di 3 mm dall'apertura della provetta.
- Posizionare le due provette per ultracentrifuga con i campioni in secchi di ultracentrifugazione opposti, ad esempio, il secchio 1 corrisponde a 4 (1-4), 2-5, 3-6.
- Regolare il peso dei due secchi con PBS per ottenere un peso totale entro ± 0,005 g.
- Installare tutte le benne sul rotore, indipendentemente dal fatto che i tubi siano caricati.
- Avviare il vuoto e centrifugare i campioni a 160.000 × g per 70 minuti a 4 °C.
- Rilasciare il vuoto della camera e aprire lo sportello una volta visualizzato Ready (Pronto) sulla pagina Home dello strumento.
- Rimuovere il rotore dall'ultracentrifuga.
- Spostare le benne dal rotore alla rastrelliera e recuperare le provette utilizzando una pinza.
- Scartare il surnatante, che conterrà pellet marroni visibili sul fondo.
- Risospendere i pellet pipettandoli ripetutamente su e giù utilizzando una pipetta da 1.000 μL con 1 mL di PBS preraffreddato (4 °C) fino alla completa sospensione. Riempire la provetta con circa 37 mL di PBS, lasciando uno spazio di 3 mm dall'apertura.
- Eseguire un'altra ultracentrifugazione seguendo i passaggi 4.5-4.11 a 160.000 × g per 70 minuti a 4 °C per rimuovere i componenti contaminanti parzialmente attaccati dalle pareti del tubo.
- Scartare il surnatante, capovolgere le due provette dell'ultracentrifuga per 5 minuti ed eliminare la soluzione rimanente sulla parete interna con i tergicristalli.
NOTA: La pulizia della parete interna riduce al minimo l'interferenza della contaminazione residua che aderisce alla parete della provetta dell'ultracentrifuga. Scegliere tergicristalli che non influenzino l'analisi BEV, in particolare per quanto riguarda la dimensione delle particelle. - Risospendere i pellet in ciascuna provetta pipettandoli su e giù con 1,2 mL di PBS pre-raffreddato (4 °C) utilizzando una pipetta da 1.000 μL.
- Trasferire 1,2 mL della soluzione PBS/BEV da una provetta per ultracentrifuga a una microprovetta pulita da 1,5 mL.
PUNTO DI PAUSA: La soluzione PBS/BEV raccolta da una provetta per ultracentrifuga può procedere alla fase 6. Conservare la soluzione dall'altra provetta a -80 °C.
5. Preparazione della soluzione per la centrifugazione a gradiente di densità
- Preparazione del tampone HEPES da 0,02 M
- Combinare 0,477 g di polvere HEPES e 0,8 g di NaCl con 90 mL di acqua deionizzata sterilizzata in autoclave.
- Regolare il pH a 7,2 aggiungendo 1 M di idrossido di sodio (NaOH). Portare il volume a 100 mL con acqua deionizzata e filtrare la soluzione attraverso membrane in PES da 0,22 μm.
ATTENZIONE: L'idrossido di sodio è un forte alcali caustico. Gli operatori devono maneggiarlo e prepararlo con cura in una cappa chimica.
- Preparazione del tampone del gradiente di densità
- Calcolare il volume richiesto di ciascun tampone a gradiente di densità in base al numero di provette per ultracentrifuga per la centrifugazione a gradiente di densità (fase 6) (in questo protocollo, i volumi per le soluzioni a gradiente al 60%, 50%, 40%, 20% e 10% erano rispettivamente di 2,5 mL, 3 mL, 6 mL, 6 mL e 6 mL).
- Per la preparazione di una soluzione di lavoro di iodixanolo al 50% (p/v), miscelare il tampone HEPES 0,02 M e la soluzione madre di iodixanolo al 60% (p/v) in un rapporto di volume di 1:5 (0,5 mL:2,5 mL).
NOTA: Utilizzare una siringa monouso da 20 ml per prelevare la soluzione madre di iodixanolo ed evitare di introdurre aria. - Per preparare tamponi di iodixanolo con diverse concentrazioni, combinare la soluzione di lavoro di iodixanolo al 50% della fase 5.2.2 con la soluzione di lavoro HEPES ottenuta nella fase 5.1 utilizzando una pipetta da 1.000 μL secondo le proporzioni indicate nella tabella 1.
NOTA: Eseguire il passaggio 5 su un banco ultra pulito con le luci spente. Conservare la soluzione madre di iodixanolo aperta in frigorifero a 4 °C per prevenire la crescita batterica. Tenere la soluzione di iodixanolo e il tampone HEPES al riparo dalla luce.
6. Realizzazione di un sistema di centrifugazione a gradiente di densità
- Modalità DGC dall'alto verso il basso
- Combinare 500 μL di soluzione di PBS/BEV isolata dalla fase 4 con 3 mL di PBS. Miscelare delicatamente le soluzioni utilizzando una pipetta da 1.000 μL per ottenere 3,5 mL di soluzione PBS/BEV.
- Posizionare una provetta per ultracentrifuga da 31 mL su una piastra di schiuma forata ed etichettarla come "↓".
- Aggiungere verticalmente 3 mL della soluzione di iodixanolo al 50% sul fondo della provetta utilizzando una pipetta da 1.000 μL.
- Inclinare il tubo a un angolo di 70° e posizionare un supporto per tubo o un altro supporto leggermente al di sopra del livello della piastra di schiuma, sotto l'apertura del tubo.
- Aggiungere 3 mL di soluzione di iodixanolo al 40% sopra la soluzione di iodixanolo al 50% utilizzando una pipetta da 1.000 μL.
- Aggiungere 3 mL di soluzione di iodixanolo al 20% sopra la soluzione di iodixanolo al 40% utilizzando una pipetta da 1.000 μL.
- Aggiungere 3 mL di soluzione di iodixanolo al 10% sopra la soluzione di iodixanolo al 20% utilizzando una pipetta da 1.000 μL.
- Aggiungere 3,5 mL di soluzione PBS/BEV del passaggio 6.1.1 sopra la soluzione di iodixanolo al 10% utilizzando una pipetta da 1.000 μL.
- Riportare delicatamente i tubi in posizione verticale.
NOTA: Dopo il pipettaggio, la stratificazione deve essere visibile.
- Modalità DGC dal basso verso l'alto
- Posizionare una provetta per ultracentrifuga da 31 ml su una piastra di schiuma forata ed etichettarla come "↑".
- Aggiungere verticalmente 2,5 mL della soluzione madre di iodixanolo al 60% sul fondo della provetta. Miscelare delicatamente con 500 μL di soluzione PBS/BEV isolata dalla fase 4 utilizzando una pipetta da 1.000 μL per ottenere 3 mL di soluzione di iodixanolo/BEV al 50%.
- Inclinare il tubo a un angolo di 70° e posizionare un supporto per tubo o un altro supporto leggermente al di sopra del livello della piastra di schiuma, sotto l'apertura del tubo.
- Aggiungere 3 mL della soluzione di iodixanolo al 40% sopra la soluzione di iodixanolo/BEV al 50% utilizzando una pipetta da 1.000 μL.
- Aggiungere 3 mL della soluzione di iodixanolo al 20% sopra la soluzione di iodixanolo al 40% utilizzando una pipetta da 1000 μL.
- Aggiungere 3 mL della soluzione di iodixanolo al 10% sopra la soluzione di iodixanolo al 20% utilizzando una pipetta da 1000 μL.
- Aggiungere 3,5 mL di PBS sopra la soluzione di iodixanolo al 10% utilizzando una pipetta da 1.000 μL.
- Riportare delicatamente i tubi in posizione verticale.
- A questo punto sono rimasti 200 μL della sospensione ottenuta nella fase 4.17, che può essere analizzata successivamente come un gruppo chiamato "UC".
NOTA: Quando si trasferiscono le soluzioni nella fase 6, tenere sempre il puntale della pipetta contro la parete della provetta per ultracentrifuga perpendicolare all'asse della provetta.
7. Centrifugazione a gradiente di densità e raccolta delle frazioni
- Regolare il peso dei due tubi con PBS per ottenere un peso totale entro ± 0,005 g.
- Mettere le provette nei secchi secondo il passaggio 4.5 e sottoporle a centrifugazione a 160.000 × g per 7 ore a 4 °C.
- Raccogliere le frazioni utilizzando un pipettatore (1000 μL) dall'alto verso il basso contro la parete laterale nel seguente ordine: 3 mL, 2 mL, 1 mL, 1 mL, 1 mL, 1 mL, 1 mL, 1 mL, 1 mL, 1,5 mL e 3 mL in una provetta per ultracentrifuga da 38,5 mL.
NOTA: Mantenere la linea di vista allo stesso livello della superficie del liquido. - Eseguire l'ultracentrifugazione per ciascuna frazione ottenuta nella fase 7.3 secondo la fase 4 a 160.000 × g per 70 minuti a 4 °C.
- Rimuovere il surnatante e capovolgere le provette dell'ultracentrifuga per 5 min.
- Risospendere i pellet in 200 μL di PBS pre-raffreddato (4 °C) utilizzando una pipetta da 200 μL.
- Trasferire la soluzione PBS/BEV in una microprovetta pulita da 1,5 mL.
- Etichettare le frazioni da F1 a F10 e analizzarle in base al passaggio 8.
PUNTO DI PAUSA: Se i campioni ottenuti al punto 7.8 non possono essere processati immediatamente, conservarli a -80 °C.
8. Caratterizzazione e analisi quantitativa delle frazioni raccolte
- Determinare i valori di assorbanza (OD 340 nm) di ciascuna frazione utilizzando un rivelatore per micropiastre con un controllo in bianco per calcolare la densità corrispondente.
NOTA: Sostituire la soluzione PBS/BEV (passaggio 6.1.1 e passaggio 6.2.2) con PBS per stabilire un controllo vuoto.- Preparare 100 μL ciascuno di soluzione di iodixanolo allo 0%, 5%, 10%, 12,5% e 20% diluita da HEPES 0,02 M a base di soluzione madre al 50% (passaggio 5.2.2) come standard, corrispondenti a densità rispettivamente di 1,0058 g/mL, 1,0318 g/mL, 1,058 g/mL, 1,0708 g/mL e 1,111 g/mL.
- Aggiungere 50 μL di ciascuna frazione dal controllo in bianco (preparato nella fase 7.3) e 50 μL di ciascuna soluzione standard (preparata nella fase 8.1.1) ai pozzetti duplicati di una piastra a 96 pozzetti.
- Impostare la lunghezza d'onda su 340 nm, misurare la densità ottica del punto finale e calcolare la densità di ciascuna frazione.
- Identifica F4-F9 come l'intervallo di frazioni BEV in base alla loro densità.
- Determinare la concentrazione proteica delle frazioni BEV utilizzando il saggio dell'acido bicinchoninico (BCA).
- Diluire la sostanza dieci volte in PBS fornito dal produttore per preparare una soluzione proteica standard da 0,5 μg/μL.
- Aggiungere la soluzione proteica standard (preparata nella fase 8.2.1) con volumi variabili secondo le istruzioni del reagente e integrare ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti con PBS fino a un volume totale di 20 μL.
- Aggiungere 20 μL dei campioni preparati nella fase 7.8 e i campioni rimasti dopo la UC definita nella fase 6.2.9 in ciascun pozzetto.
- Miscelare i reagenti A e B in un rapporto di 50:1 e trasferire 200 μL in ciascun pozzetto.
- Incubare la piastra a bagnomaria a 37 °C per 30 min.
- Misurare il valore di assorbanza utilizzando un lettore per micropiastre, calcolare la concentrazione proteica (μg/μL) e determinare il contenuto proteico (μg) dei campioni in base alla curva standard (x: densità ottica; y: concentrazione proteica) generata dai valori delle soluzioni standard diluite al punto 8.2.2.
- Caratterizzare le frazioni di BEV definite nel passaggio 8.1.4 utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) per verificare la presenza di BEV. Tutte le procedure riportate di seguito devono essere eseguite su ghiaccio.
- Applicare 10 μL di ciascuna frazione F4-F9 isolata del passaggio 7.8 e i campioni rimasti dopo l'UC definito nel passaggio 6.2.9 su griglie di rame supportate da formvar/carbonio per 20 minuti e tamponare con carta da filtro.
- Sciacquare i campioni con 100 μL di PBS tre volte per 1 minuto ciascuno e tamponare con carta da filtro.
- Fissare i campioni con 100 μL di glutaraldeide all'1% (p/v) per 5 minuti e tamponare con carta da filtro.
- Lavare le griglie con 100 μL di PBS dieci volte per 2 minuti ciascuna e tamponare con carta da filtro.
- Colorare le griglie con 50 μL di acetato di uranile all'1,5% (p/v) per 10 minuti e tamponare con carta da filtro.
ATTENZIONE: L'acetato di uranile è radioattivo ed estremamente tossico se a contatto con la pelle o inalato. Maneggiare soluzioni con acetato di uranile in una cappa chimica e seguire le misure di sicurezza appropriate. - Trasferire le griglie su una goccia di metilcellulosa all'1% (p/v) per 5 minuti e tamponare con carta da filtro.
- Conservare le griglie essiccate all'aria in un ambiente buio e privo di polvere fino all'osservazione.
- Acquisisci immagini e analizzale utilizzando un TEM.
- Caratterizzare le frazioni BEV definite nel passaggio 8.1.4 utilizzando l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) per contare il numero di particelle.
- Calibrare il sistema utilizzando particelle di polistirene da 110 nm.
- Lavare il pool di campioni utilizzando PBS.
- Diluire i campioni delle diverse frazioni acquisite nella fase 7.8 e i campioni rimasti dopo la UC definita nella fase 6.2.9 a una concentrazione compresa tra 105 e 109 particelle/mL, con una concentrazione ottimizzata di 107 particelle/mL.
- Registra e analizza in 11 posizioni con tre repliche, mantenendo la temperatura intorno ai 23-30 °C.
- Analizzare il contenuto proteico dei campioni mediante colorazione blu brillante di Coomassie (CBBS) e western blotting (WB).
- Diluire i campioni BEV delle diverse frazioni ottenute nella fase 7.8 e i campioni rimasti dopo la UC definita nella fase 6.2.9 utilizzando PBS e tampone di carico a 5 × a una concentrazione finale di 0,5 o 1 μg/μL, se è necessaria la quantificazione, garantendo un carico sufficiente del campione di 20 μL (10 μg o 20 μg) di ciascun pozzetto nella fase 8.5.2. Far bollire i campioni a 95 °C per 10 min.
- Assemblare il gel di poliacrilammide prefabbricato nel serbatoio di elettroforesi e trasferire i campioni nei pozzetti.
- Eseguire l'elettroforesi verticale con i seguenti parametri: 160 V per 50 min.
- Colorare il gel nella soluzione blu brillante di Coomassie per 1 ora, risciacquare in acqua deionizzata fino a quando lo sfondo blu non si schiarisce e catturare le immagini con una fotocamera.
- Eseguire procedure di blotting proteico per altri gel con i seguenti parametri: 400 mA per 20 min.
- Bloccare le membrane di blotting con una soluzione di BSA al 5% (p/v) per 1 ora a temperatura ambiente.
- Lavare le membrane nel tampone TBST tre volte per 5 minuti ciascuna.
- Incubare le membrane con anticorpi primari (marcatori BEV: LPS, OMPA, LTA; Marcatori EEV: CD63, CD9, TSG-101, Sintenina, Integrina β1; Altri marcatori di contaminazione: Flagellina, Calnexina) per 8-12 ore a 4 °C.
- Lavare le membrane nel tampone TBST tre volte per 10 minuti ciascuna.
- Incubare le membrane con anticorpi secondari per 1 ora a temperatura ambiente.
- Eseguire il passaggio 8.5.9.
- Sviluppare il blotting utilizzando un apparecchio a chemiluminescenza.
- Sostituire la soluzione di PBS/BEV (passaggio 6.1.1 e passaggio 6.2.2) con BEV di Escherichia coli per stabilire un controllo positivo (vedere la tabella dei materiali per la procedura di isolamento dei BEV grezzi di E. coli) e condurre tutti gli esperimenti di cui sopra per la caratterizzazione dei BEV.
PUNTO DI PAUSA: Determinare F6-F8 come distribuzione delle frazioni arricchite con BEV in base ai risultati della caratterizzazione sopra descritta per i BEV fecali e utilizzare questo intervallo ristretto per l'analisi successiva.
- Calcolare i tassi di recupero in termini di particelle e proteine per valutare l'efficienza delle due modalità DGC. I risultati riportati di seguito sono presentati in percentuale.
- Calcolare i tassi di recupero delle particelle in modalità Top-down: particelle totali in F6-F8/particelle dopo UC definite al punto 6.2.9.
- Calcolare i tassi di recupero delle particelle in modalità Bottom-up: particelle totali in F6-F8/particelle dopo UC definite al punto 6.2.9.
- Calcolare i tassi di recupero delle proteine in modalità Top-down: contenuto proteico totale in F6-F8 (μg)/contenuto proteico dopo UC definito nel passaggio 6.2.9 (μg).
- Calcolare i tassi di recupero delle proteine in modalità Bottom-up: contenuto proteico totale in F6-F8 (μg)/contenuto proteico dopo UC definito al punto 6.2.9 (μg).
- Calcolando il rapporto particelle/proteine per valutare la purezza tradizionalmente definita di UC e delle due modalità DGC, i risultati riportati di seguito sono stati tutti presentati in percentuale.
- Rapporto particelle/proteine dopo UC definito al punto 6.2.9: particelle dopo UC/contenuto proteico dopo UC (μg).
- Rapporto particelle/proteine in modalità Top-down: particelle totali in F6-F8/contenuto proteico in F6-F8 (μg).
- Rapporto particelle/proteine in modalità Bottom-up: particelle totali in F6-F8/contenuto proteico in F6-F8 (μg).
- Selezionare la modalità di centrifugazione più adatta (la modalità top-down è stata selezionata nel protocollo) per la purificazione del BEV fecale e l'analisi futura.
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Representative Results
Determinare la distribuzione delle frazioni arricchite con BEV
Per determinare la distribuzione delle frazioni arricchite con vescicole extracellulari batteriche (BEV), è stato stabilito un controllo in bianco per misurare i valori di assorbanza a OD 340 nm e la densità di ciascuna frazione è stata calcolata in base alle misurazioni e alle linee guida sullo iodixanolo (Fase 8.1). La Tabella 2 presenta i risultati della densità, dimostrando che le frazioni da F4 a F9 hanno mostrato densità all'interno dell'intervallo tipicamente associato alle vescicole extracellulari. Questa scoperta ha suggerito che la maggior parte dei BEV è stata isolata in queste frazioni, portando alla definizione di F4-F9 come l'intervallo approssimativo per i BEV. La microscopia elettronica a trasmissione (TEM) è stata impiegata per caratterizzare le caratteristiche morfologiche dei BEV fecali isolati, come mostrato nella Figura 1 nelle frazioni F4-F9. Le immagini TEM (Figura 2) hanno rivelato la presenza di strutture classiche a forma di coppa, che sono caratteristiche dei BEV. L'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) e il saggio dell'acido bicinchoninico (BCA) sono stati condotti per determinare rispettivamente il numero di particelle e la concentrazione di proteine, consentendo un'ulteriore valutazione dei tassi di recupero e della purezza. La Figura 3 mostra le concentrazioni di proteine e particelle per ciascuna frazione, indicando che F6 e F7 hanno mostrato le concentrazioni più elevate, seguite da F5 e F8. Successivamente, sono state eseguite la colorazione blu brillante di Coomassie (CBBS) e il western blotting (WB) per fornire un'analisi complessiva delle proteine. I risultati del CBBS sono stati coerenti con i risultati della concentrazione proteica, con F6 e F7 che hanno mostrato le bande più intense (Figura 4). Per confermare la distribuzione dei BEV, sono state impiegate vescicole extracellulari derivate da Escherichia coli come controllo positivo (definito al punto 8.5.13). Le procedure di isolamento e purificazione hanno seguito le fasi descritte nella Tabella dei Materiali e nelle suddette sezioni del protocollo (Fasi 3, 4). L'analisi WB ha inoltre confermato la presenza della proteina A della membrana esterna (OmpA), un componente importante della membrana esterna dei batteri e un marcatore specifico per i BEV, nelle frazioni F6-F8. Sulla base di questi risultati, le frazioni F6-F8 sono state definite come frazioni arricchite di BEV adatte per esperimenti e analisi successive.
Verifica del range di presentazione delle componenti interferenziali
Le vescicole extracellulari eucariotiche (EEV), che possiedono dimensioni e densità simili a quelle dei BEV, sono state identificate come una delle principali interferenze nell'analisi dei BEV. Per affrontare questo problema, tre proteine EEV sono state sondate nelle frazioni 5-8 da entrambe le modalità Top-down e Bottom-up, con tempi di centrifugazione di 7 h e 15 h. CD63, una proteina transmembrana associata a EEV, è stata rilevata prevalentemente in F5, mentre il marcatore BEV LPS è stato arricchito nelle frazioni 6-7. Questo modello è stato osservato in entrambe le modalità, anche se la modalità Bottom-up ha mostrato un leggero banding di CD63-EEV in F7. Tuttavia, altri marcatori EEV, CD9 e TSG-101, non hanno mostrato segnali visibili in queste frazioni indipendentemente dalle modalità o dai tempi di centrifugazione. In un'impresa sperimentale indipendente, sono stati impiegati anticorpi mirati alla sintenina e all'integrina β1 per accertare l'arricchimento di marcatori proteici distinti inerenti agli EEV nelle frazioni 5-8. La sintenina è stata rilevata in modo prominente all'interno di F5, in particolare nell'ambito dell'approccio top-down, mentre la presenza di integrina β1 è stata individuata all'interno di F6 (Figura 5). Per valutare ulteriormente la presenza di particelle interferenti, la lipoproteina a bassa densità marcata con Dil (Dil-LDL) è stata introdotta nel sistema del gradiente di densità e l'intensità della fluorescenza è stata misurata su tutte le frazioni. Nella modalità Top-down, le frazioni 1-4 hanno mostrato valori di fluorescenza relativamente più elevati, mentre nella modalità Bottom-up, sono state F1-F6 a mostrare intensità più elevate (Figura 6).
Valutare i tassi di recupero e la purezza di due modalità DGC dalla concentrazione, dalla dimensione delle particelle e dai marcatori dei BEV
Dopo aver identificato le frazioni F6-F8 come frazioni arricchite con BEV, sono stati valutati i tassi di recupero e la purezza delle due modalità di centrifugazione a gradiente di densità (DGC). Sono state confrontate le dimensioni delle particelle delle frazioni arricchite con BEV ottenute dalla modalità Top-down, dalla modalità Bottom-up e dall'ultracentrifugazione (UC). Le dimensioni delle particelle osservate in entrambe le modalità di centrifugazione variavano da 90 a 300 nm, in linea con il diametro definito dei BEV (Figura 7). Successivamente, i tassi di recupero di particelle e proteine delle due modalità sono stati calcolati in base alle concentrazioni di particelle e proteine prima e dopo la DGC (Tabella 3 e Figura 8). In particolare, la modalità Bottom-up ha mostrato tassi di recupero più elevati rispetto all'altra modalità. In un gruppo sperimentale separato, il recupero proteico nelle due modalità è stato valutato a diversi tempi di centrifugazione di 7 h e 15 h. È importante sottolineare che non c'è stata alcuna differenza statisticamente significativa nel contenuto proteico all'interno delle frazioni F6-F8 dopo DGC tra i due tempi di centrifugazione, indipendentemente dalla modalità di gradiente utilizzata (Figura 9). Il rapporto particelle/proteine è stato calcolato per fornire una valutazione approssimativa della purezza nelle due modalità. I dati non hanno indicato differenze significative nella purezza tra le modalità. Inoltre, sono state eseguite la colorazione blu brillante di Coomassie (CBBS) e il western blotting (WB) per confrontare ulteriormente la purezza, concentrandosi su tre marcatori BEV (LPS, OmpA e LTA), un marcatore EEV (CD63) e due marcatori contaminanti (Calnexin, Flagellina). I risultati hanno dimostrato una parziale riduzione delle sostanze interferenti dopo DGC, con LPS e OmpA che mostrano una presenza più prominente in entrambe le modalità DGC rispetto alla sola UC (Figura 10).
Figura 1: Flusso di lavoro schematico per l'isolamento e la purificazione dei BEV. Abbreviazioni: BEV = vescicole extracellulari batteriche. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Immagini TEM rappresentative delle frazioni BEV. (A) Immagini TEM di BEV isolati dopo UC. (B) Immagini TEM di BEV isolati dopo DGC utilizzando la modalità Top-down. (C) Immagini TEM di BEV isolate dopo DGC utilizzando la modalità Bottom-up. Tutte le immagini sono state presentate su una scala coerente di 200 nm. Abbreviazioni: TEM = microscopio elettronico a trasmissione; BEV = vescicole extracellulari batteriche; UC = ultracentrifugazione; DGC = centrifugazione a gradiente di densità. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Concentrazione di proteine e particelle delle frazioni BEV dopo le modalità DGC top-down e bottom-up. La concentrazione proteica delle frazioni BEV è stata determinata utilizzando BCA ed è rappresentata dalle barre grigie. La concentrazione di particelle è stata misurata utilizzando NTA ed è rappresentata dalle barre blu. Abbreviazioni: BEV = vescicola extracellulare batterica; DGC = centrifugazione a gradiente di densità; BCA = saggio dell'acido bicinchoninico; NTA = analisi di tracciamento delle nanoparticelle. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Determinazione delle frazioni arricchite con BEV. (A) Il CBBS è stato eseguito per determinare le frazioni arricchite con BEV fecali sia in modalità top-down che bottom-up. (B) Le vescicole extracellulari derivate da Escherichia coli sono state isolate, purificate e utilizzate come controllo positivo nel WB per confermare la presenza e la distribuzione di BEV. OmpA: proteina A della membrana esterna, un marcatore BEV. Abbreviazioni: BEV = vescicola extracellulare batterica; CBBS = colorazione blu brillante di coomassie; EVs = vescicole extracellulari; WB = western blotting. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Conferma della distribuzione dell'EEV. Analisi Western blot delle frazioni 5-8 ottenute dalle modalità DGC Top-down e Bottom-up con diverse durate di ultracentrifugazione in gradiente di densità, 7 h (A) e 15 h (B). È stato eseguito uno studio indipendente incentrato su F5 a F8 risultanti da un periodo di centrifugazione di 7 ore, come dimostrato in (C) e (D). I marcatori selezionati includevano quelli associati a BEV (LPS) e EEV (CD63, CD9, TSG-101, Syntenin, Integrin β1). Abbreviazioni: DGC = centrifugazione a gradiente di densità; BEV = vescicola extracellulare batterica; EEV = vescicola extracellulare eucariotica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Distribuzione delle lipoproteine a bassa densità. La lipoproteina a bassa densità marcata con Dil (Dil-LDL), considerata un marcatore di contaminazione, è stata aggiunta a una concentrazione di 10 μg al sistema di gradiente sia in modalità Top-down che Bottom-up. Dil-LDL ha sostituito la soluzione PBS/BEV (passaggio 6.1.1 e passaggio 6.2.2) per stabilire un modello di rilevamento. L'intensità di fluorescenza di ciascuna frazione è stata misurata utilizzando un rivelatore a micropiastre con una lunghezza d'onda di eccitazione/emissione di 549/565 nm. Abbreviazione: BEV = vescicola extracellulare batterica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Dimensioni delle particelle delle frazioni arricchite con BEV. (A) Distribuzione granulometrica dei BEV grezzi ottenuti dopo UC. (B) Distribuzione granulometrica delle frazioni arricchite con BEV (F6-F8) ottenuta utilizzando la modalità di centrifugazione a gradiente di densità top-down (DGC). (C) La distribuzione granulometrica delle frazioni arricchite con BEV (F6-F8) è stata ottenuta utilizzando la modalità DGC dal basso verso l'alto. L'NTA è stato intrapreso per quantificare le dimensioni delle particelle. I fattori di diluizione impiegati per i pannelli (A-C) sono stati 10.000, 2.000 e 5.000, di conseguenza, con i risultati conseguenti calibrati. Abbreviazioni: BEV = vescicola extracellulare batterica; UC = ultracentrifugazione; DGC = centrifugazione a gradiente di densità; NTA = analisi di tracciamento delle nanoparticelle. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Tassi di recupero di proteine e particelle delle modalità DGC top-down e bottom-up. (A) Tassi di recupero proteico delle due modalità calcolati come rapporto tra la concentrazione proteica dopo e prima della DGC (UC). (B) I tassi di recupero delle particelle delle due modalità sono calcolati in base al rapporto tra la concentrazione di particelle dopo e prima della DGC (UC). (C) Rapporti particella/proteina delle modalità UC, Top-down e Bottom-up. I dati sono presentati come media ± SEM. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando un test t a due code, non accoppiato, per i pannelli A e B, e un'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) con test post-hoc Tukey per il pannello C. Non sono state osservate differenze significative. Abbreviazioni: DGC = centrifugazione a gradiente di densità; UC = ultracentrifugazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 9: Confronto del recupero proteico basato sulle modalità DGC top-down e bottom-up utilizzando diversi tempi di ultracentrifugazione associati alla densità. I tassi di recupero delle proteine nelle frazioni F6-F8 ottenute dall'ultracentrifugazione a gradiente per 7 h e 15 h sono stati valutati in esperimenti indipendenti utilizzando sia la modalità Top-down che Bottom-up. I dati sono presentati come media ± SEM. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando l'analisi bidirezionale della varianza (ANOVA) con il test delle differenze meno significative di Fisher. Non sono state osservate differenze significative. Abbreviazioni: DGC = centrifugazione a gradiente di densità. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 10: Valutazione della purezza delle modalità DGC top-down e bottom-up. (A) CBBS è stato condotto per confrontare la distribuzione delle proteine delle modalità UC, top-down e bottom-up. (B) WB è stato condotto per valutare la purezza delle modalità UC, Top-down e Bottom-up. Calnexina: marcatore proteico associato al reticolo endoplasmatico; Flagellina, marcatore proteico contaminante dai batteri. CD63: marcatore proteico transmembrana per vescicole extracellulari eucariotiche; LTA: marcatore BEV da batteri gram-positivi; LPS, OmpA: marcatori BEV da batteri gram-negativi. Abbreviazioni: DGC = centrifugazione a gradiente di densità; UC = ultracentrifugazione; CBBS = colorazione Coomassie Brilliant Blue; WB = western blotting. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Concentrazione della soluzione di iodixanolo (%) | Buffer HEPES da 0,02 M | Soluzione di lavoro al 50% di iodixanolo |
| 40 | 1 | 4 |
| 20 | 3 | 2 |
| 10 | 4 | 1 |
Tabella 1: Rapporti per la preparazione di tamponi in gradiente di densità dello iodiolo. La tabella ha fornito il rapporto tra 0,02 M di tampone HEPES e soluzione di lavoro di iodixanolo al 50% per ottenere una certa concentrazione di soluzione di iodixanolo.
| F1 | F2 (F2) | F3 (F3) | F4 (F4) | F5 (F5) | F6 (F6) | F7 (F7) | F8 (F8) | F9 (F9) | F10 | |
| Densità (g/mL) | 1.023 | 1.038 | 1.049 | 1.062 | 1.074 | 1.098 | 1.144 | 1.185 | 1.239 | 1.293 |
Tabella 2: La densità del sistema di centrifugazione a gradiente di densità a base di iodiolo. La tabella mostrava la densità di ciascuna frazione in un sistema di centrifugazione a gradiente di densità a base di iodiosanolo. Controllo del vuoto: sistema di gradiente basato su PBS.
| Modalità dall'alto verso il basso | Modalità dal basso verso l'alto | |
| Tasso di recupero delle particelle (%) | 24.08 | 35.69 |
| Tasso di recupero delle proteine (%) | 24.5 | 32.45 |
Tabella 3: I tassi di recupero di particelle e proteine di due modalità. La tabella mostra i tassi di recupero di particelle e proteine delle modalità Top-down e Bottom-up (Figura 8).
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Discussion
Le vescicole extracellulari batteriche (BEV) sono nanoparticelle a doppio strato lipidico secrete dai batteri, che trasportano una ricchezza di proteine, lipidi, acidi nucleici e altre molecole bioattive, contribuendo a mediare gli effetti funzionali dei batteri20. È stato verificato che i BEV derivati dall'intestino sono coinvolti nello sviluppo di malattie, come la malattia infiammatoria intestinale, il morbo di Crohn e il cancro del colon-retto, e influenzano anche il metabolismo generale e mediano la compromissione della funzione cognitiva 4,16,17,20,21,22,23,24,25,26 . Attualmente, l'ottenimento di informazioni biologiche complete e oggettive sui BEV di origine batterica intestinale da campioni umani-feci è ancora vincolato da una serie di fattori, tra i quali il primo e più importante problema chiave è come isolare i BEV dal complesso ambiente ospite.
I principali metodi di isolamento dei BEV, come l'ultracentrifugazione (UC), la centrifugazione a gradiente di densità (DGC) e la cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC)13,14,15,16,17, presentano sia vantaggi che svantaggi. La difficoltà di rimuovere alcune sostanze interferenti e la mancanza di procedure operative coerenti, che compromettono seriamente un'analisi più realistica e completa dei BEV, rimangono sfide per il processo di separazione. Per alleviare gli effetti indesiderati delle interferenze, molti studi 15,27,28 hanno combinato due o più dei metodi di cui sopra per ottenere la separazione dei BEV, in particolare dai fluidi corporei, ma procedure complesse tendono a influenzare la stabilità dei risultati. Per i BEV, la differenza di densità con altri contaminanti (ad esempio, aggregati proteici, componenti lipidici, vescicole extracellulari eucariotiche (EEV)15) può diventare un mezzo specifico di isolamento al giorno d'oggi.
Attualmente, lo iodixanolo è emerso come il mezzo preferito per la separazione del gradiente di densità delle vescicole extracellulari, sostituendo il saccarosio grazie alle sue proprietà isotoniche. Queste proprietà contribuiscono a preservare la morfologia delle EV e a facilitare la stima della densità per ogni frazione29. In linea con Tulkens et al 15, il nostro studio ha adottato una concentrazione identica per il sistema DGC, utilizzando strati di gradiente di concentrazione al 50% (p/v), 40% (p/v), 20% (p/v),10% (p/v) e 0%. La fase iniziale prevedeva l'uso del tampone HEPES per preparare varie concentrazioni di soluzioni di iodixanolo. Rispetto al tampone Tris (-EDTA)-saccarosio, un'adeguata concentrazione di tampone HEPES garantisce la stabilità del pH a lungo termine all'interno del sistema di centrifugazione, grazie alle sue proprietà intrinseche. Allo stesso tempo, il tampone PBS sterile è stato impiegato nello strato superiore del sistema di centrifugazione, non solo per proteggersi da potenziali contaminazioni da parte di batteri e loro metaboliti durante la preparazione della soluzione, ma anche per mantenere la consistenza del tampone del campione prima e dopo la DGC. Ciò ha comportato la risospensione del pellet con tampone PBS dopo UC e la sostituzione di iodixanolo con PBS dopo DGC, facilitando così un'analisi comparativa dei risultati. Inoltre, il volume di ogni strato di gradiente all'interno del sistema DGC è stato calibrato su 3 mL, 3 mL, 3 mL, 3 mL e 3,5 mL rispettivamente per soluzioni di iodixanolo al 50%, 40%, 20%, 10% e 0% (strato PBS). Questa strategia aiuta a stabilire un intervallo di densità relativamente più ampio (1,02-1,30 g/mL), migliorando potenzialmente la separazione dei BEV da altri elementi interferenti, rendendo così i gradienti applicabili ad altri fluidi corporei con contaminazione complessa.
È importante sottolineare che alcune fasi del protocollo sono cruciali. In particolare, il fattore di diluizione descritto nella fase 2.2, in cui 1 g di campioni fecali viene miscelato con un minimo di 10 mL di PBS, è fondamentale per prevenire la sovrasaturazione e conservare le risorse sperimentali. In queste condizioni, la concentrazione di particelle e proteine generalmente aumenta proporzionalmente alla massa fecale in un campione, assumendo che le altre caratteristiche fecali siano costanti. Se necessario, è possibile intraprendere ulteriori analisi che considerino fattori come la consistenza, le lipoproteine o il contenuto ematico. Durante il passaggio 3.4, è necessario prestare attenzione per evitare di versare direttamente la soluzione, in quanto ciò potrebbe disturbare il pellet, causando potenzialmente l'ostruzione della membrana del filtro da 0,22 μm da parte di granuli più grandi. Se il filtro si satura rapidamente (ad esempio, se meno di 10 mL passano attraverso un filtro), si consiglia un'ulteriore fase di centrifugazione a 12.000 × g . Nel contesto della centrifugazione a gradiente di densità, la preparazione precisa delle soluzioni a gradiente è un prerequisito per risultati affidabili. Inoltre, un'attenta manipolazione del tubo durante la stratificazione delle soluzioni superiori a bassa densità è essenziale per evitare l'interruzione della stratificazione e qualsiasi bolla deve essere eliminata mediante un attento pipettaggio. Infine, quando si aspirano le frazioni, è importante aspirarle meticolosamente lungo la parete del tubo, evitando qualsiasi sovra o sottoaspirazione che potrebbe portare a una distribuzione imprecisa del BEV. L'osservazione regolare del livello del liquido e una pratica coerente possono aiutare a mitigare questo problema.
Questo studio ha determinato le frazioni arricchite con BEV (F6-F8) utilizzando più metodi di caratterizzazione e ha esplorato due distinte modalità di ultracentrifugazione a gradiente: Top-down e Bottom-up. Attraverso la misurazione della concentrazione di proteine e particelle in F4-F8 (Figura 3) e confrontando i tassi di recupero e la purezza (Figura 8 e Figura 10), è stato osservato che la modalità di centrifugazione dal basso verso l'alto ha prodotto valori rilevati più elevati sia a livello di proteine che di particelle rispetto al metodo alternativo per isolare e purificare i BEV da campioni fecali. Questa osservazione implica diversi processi dinamici. È stata avanzata l'ipotesi che le nanoparticelle extracellulari non vescicolari (NVEP)29, come le lipoproteine, con densità inferiore rispetto ai BEV, potrebbero non raggiungere le loro densità galleggianti se i campioni sono caricati dal basso (Figura 6), causando potenzialmente un tasso di recupero gonfiato, anche dopo 15 ore di DGC (Figura 9). Questa osservazione richiede di considerare se sia applicabile la definizione di purezza tradizionale, basata sul rapporto tra particelle e proteine. Inoltre, vale la pena notare che gli EEV hanno mostrato preponderanza all'interno di F5, mentre i BEV sono stati rilevati in modo prominente in F6-F7 (Figura 4 e Figura 5). In particolare, questa differenziazione è apparsa accentuata quando si adotta la modalità Top-down. Pertanto, questa modalità potrebbe essere più adatta a questo protocollo. Tuttavia, è essenziale evidenziare la presenza di integrina β1 all'interno di F6, che potenzialmente indica l'eterogeneità intrinseca tra gli EEV. Quando si applica questo metodo ad altri fluidi corporei come sangue e urina, i ricercatori dovrebbero considerare le caratteristiche uniche dei campioni. Il tempo di centrifugazione definito in questo protocollo è di 7 ore, significativamente inferiore alla durata citata in altri studi, che può arrivare fino a 18 ore. Rispetto al recupero proteico con una durata di 15 ore eseguito nello stesso modello in questo studio (Figura 9), questo tempo sembra sufficiente per ottenere la purezza di separazione richiesta. In queste condizioni operative, il recupero delle particelle in modalità Top-down ha raggiunto fino a 10 8 (4,5 × 10 7-1,5 × 108) per milligrammo di feci, in linea con i rapporti precedenti (1011 BEV per grammo di feci umide)15,29,30. Infine, le misurazioni della densità di ciascuna frazione dal controllo in bianco hanno confermato che la densità dei BEV variava da 1,09 a 1,19 g/mL, il che è coerente con la ricerca precedente.
Questo metodo, sebbene efficace, presenta un limite dovuto all'impatto delle diete, della funzione intestinale e di altri fattori sulla composizione fecale. Queste variabili possono alterare la consistenza fecale, influenzando potenzialmente l'abbondanza batterica e il recupero del BEV. Pertanto, è fondamentale standardizzare l'isolamento e la purificazione dei BEV31,32, con aggiustamenti effettuati in base alla valutazione delle caratteristiche fecali. La ricerca futura dovrebbe concentrarsi sull'identificazione di uno standard per normalizzare la produzione di BEV, simile alla creatinina urinaria o alla velocità del flusso urinario. Tale parametro di riferimento potrebbe migliorare la valutazione metodologica e chiarire il legame tra i BEV fecali e lo stato fisiologico e patologico dell'organismo. Inoltre, la forte associazione tra BEV fecali e varie malattie sottolinea il loro significativo potenziale clinico. Tuttavia, il tempo di centrifugazione previsto da questo protocollo non soddisfa la richiesta di test più convenienti e veloci come richiesto dai medici. Pertanto, sono necessarie ulteriori indagini per determinare se tempi di centrifugazione più brevi, forse inferiori a 3 ore, possono produrre risultati equivalenti. Sono inoltre necessarie ulteriori esplorazioni per comprendere gli eventi che si verificano in entrambe le modalità di centrifugazione. Sebbene si ipotizzi che i componenti non vescicolari siano più arricchiti in F6-F8 in modalità Bottom-up, la raffinazione delle concentrazioni del gradiente può rivelarsi utile nell'identificazione di sottotipi aggiuntivi con funzioni specifiche.
Questo studio ha dimostrato con successo l'isolamento e la purificazione dei BEV dalle feci umane utilizzando DGC. La strategia è promettente per l'applicazione ad altri campioni biologici, come sangue, urina e saliva, fornendo ai ricercatori un approccio efficace per scoprire le informazioni nascoste dei BEV, facendo potenzialmente progredire le applicazioni cliniche.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Science Fund for Distinguished Young Scholars (82025024); il progetto Key della National Natural Science Foundation of China (82230080); il National Key R&D Program of China (2021YFA1300604); la Fondazione Nazionale Cinese per le Scienze Naturali (81871735, 82272438 e 82002245); Fondo di scienze naturali del Guangdong per giovani studiosi illustri (2023B1515020058); la Fondazione per le scienze naturali della provincia del Guangdong (2021A1515011639); il Major State Basic Research Development Program della Natural Science Foundation della provincia di Shandong in Cina (ZR2020ZD11); la Fondazione per la scienza post-dottorato (2022M720059); l'eccezionale programma di sviluppo dei giovani dell'ospedale di Nanfang, Southern Medical University (2022J001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 % (w/v) glutaraldehyde (prepared from 2.5 % stock solution in deionized water) | ACMEC | AP1126 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.3 |
| 1 % (w/v) methylcellulose (prepared from original powder in deionized water) | Sigma-Aldrich | M7027 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.6 |
| 1.5 % (w/v) uranyl acetate (prepared from original powder in deionized water) | Polysciences | 21447-25 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.5 |
| 1000 μL, 200 μL, 10 μL Pipette | KIRGEN | KG1313, KG1212, KG1011 | Transfer the solution |
| 5 % (w/v) bovine serum albumin solution (prepared from the original powder in TBST buffer) | Fdbio science | FD0030 | Used in western blotting for blocking at Step 8.5.6 |
| 5 × loading buffer | Fdbio science | FD006 | Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5.1 |
| 75 % (v/v) alcohol | LIRCON | LIRCON-500 mL | Surface disinfection |
| 96-well plate | Rar | A8096 | Measure the absorbance values |
| Anti-Calnexin antibody | Abcam | ab92573 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-CD63 antibody | Abcam | ab134045 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-CD9 antibody | Abcam | ab236630 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-Flagellin antibody | Sino Biological | 40067-MM06 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-Integrin beta 1 antibody | Abcam | ab30394 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-LPS antibody | Thermo Fisher | MA1-83152 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-LTA antibody | Thermo Fisher | MA1-7402 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-OmpA antibody | CUSABIO | CSB-PA359226ZA01EOD, https://www.cusabio.com/ | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-Syntenin antibody | Abcam | ab133267 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-TSG101 antibody | Abcam | ab125011 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Autoclave | ZEALWAY | GR110DP | Sterilization for supplies and mediums used in the experiment |
| Balance | Mettler Toledo | AL104 | Balance the tube sample-loaded with PBS |
| Bicinchoninic acid assay | Fdbio science | FD2001 | Measure protein content of BEVs at Step 8.2 |
| BioRender | BioRender | https://app.biorender.com | Make the schematic workflow of BEVs isolation and purification showed in Figure 1 |
| Biosafety cabinet | Haier | HR1200- II B2 | Peform the procedures about feces sample handling |
| Centrifuge 5810 R; Rotor F-34-6-38 | Eppendorf | 5805000092; 5804727002, adapter: 5804774000 | Preprocess for BEVs (Step 3) |
| Chemiluminescence Apparatus | BIO-OI | OI600SE-MF | Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12 |
| Cytation 5 | BioTek | F01 | Microplate detector for measuring the absorbance (Step 8.1) and fluorescence (Figure 6) values |
| Dil-labled low density lipoprotein | ACMEC | AC12038 | Definition of distribution of interfering components |
| Electrophoresis equipment | Bio-rad | 1658033 | Used in western blotting for protein separation and transfer at Step 8.5.2, 8.5.3, 8.5.5 |
| Enhanced Chemiluminescence kit HRP | Fdbio science | FD8020 | Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12 |
| Escherichia coli | American Type Culture Collection | ATCC8739 | Isolate BEVs as a positive control. Protocol: Dissolve 25 g of the LB powder in 1 L deionized water, and autoclave. Transfer the 800 μL of preserved Escherichia coli into the medium. Cultivate at 37 °C in the incubator shaker. Then centrifuge at 3, 000 × g for 20 min at 4 °C, 12, 000 × g for 30 min at 4 °C, filter the supernatant through 0.22 μm membrane, and perform ultra-speed centrifugation at 160, 000 × g for 70 min at 4 °C. Pellet defined as crude BEVs from Escherichia coli was suspended in 1.2 mL PBS (Step 3, 4). |
| Falcon tubes 50 mL | KIRGEN | KG2811 | Preprocess for BEVs (Step 3) |
| Feto Protein Staining Buffer | Absci | ab.001.50 | Coomassie brilliant blue staining at Step 8.5.4 |
| Filter paper | Biosharp | BS-TFP-070B | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 (Blotting the solution) |
| Formvar/Carbon supported copper grids | Sigma-Aldrich | TEM-FCF200CU50 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 |
| HEPES powder | Meilunbio | MB6078 | Prepare iodixanol buffers with different concentrations for density gradient centrifugation |
| HRP AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Fdbio science | FDM007 | Western blotting (Secondary Antibody) |
| HRP AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Fdbio science | FDR007 | Western blotting (Secondary Antibody) |
| Incubator shaker | Qiangwen | DHZ-L | Cultivate Escherichia coli |
| Kimwipes™ Delicate Task Wipes | Kimtech Science | 34155 | Wipe the inner wall of the ultracentrifuge tube at Step 4.15 |
| LB broth | Hopebio | HB0128 | Cultivate Escherichia coli |
| Low temperature freezer (-80 °C) | Haier | DW-86L338J | Store the samples |
| Methanol | Alalddin | M116118 | Used in western blotting for activating PVDF membrane at Step 8.5.5 |
| Micro tubes 1.5 mL | KIRGEN | KG2211 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
| Micro tubes 2 mL | KIRGEN | KG2911 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
| Micro tubes 5 mL | BBI | F610888-0001 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
| Microplate reader | Thermo Fisher | Multiskan MK3 | Measure protein content of BEVs at Step 8.2 |
| Millipore filter 0.22 μm | Merck millipore | SLGP033RB | Filtration sterilization; Material: polyethersulfone, PES |
| NaCl | GHTECH | 1.01307.040 | Density gradient centrifugation solution |
| NaOH | GHTECH | 1.01394.068 | Density gradient centrifugation solution (pH adjustment) |
| Optima™ XPN-100 | Beckman Coulter | A94469 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
| OptiPrep™ | Serumwerk Bernburg AG | 1893 | Density gradient centrifugation stock solution |
| Orbital Shaker | Youning | CS-100 | Dissolve feces at Step 2 |
| Phosphate buffered saline | Procell | PB180327 | Dissolve feces at Step 2 |
| Pipettor | Eppendorf | 3120000267, 3120000259 | Transfer the solution |
| Plastic pasteur pipette | ABCbio | ABC217003-4 | Remove supernatant in preprocessing at Step 3.4 |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes | Millipore | ISEQ00010, IPVH00010 | Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5 |
| Prefabricated polyacrylamide gel, 4–20% 15 Wells | ACE | F15420Gel | Used in western blotting for protein separation at Step 8.5.2, 8.5.3 |
| Primary antibody diluent | Fdbio science | FD0040 | Used in western blotting at Step 8.5.8 |
| Protein ladder | Fdbio science | FD0672 | Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5 |
| Rapid protein blotting solution | UBIO | UW0500 | Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5 |
| Rotor SW 32 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 369650 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
| Syringe 20 mL, 50 mL | Jetway | ZSQ-20ML, YCXWJZSQ-50 mL | Transfer buffers amd remove supernatant in preprocessing |
| TBS powder | Fdbio science | FD1021 | Used in western blotting at Step 8.5 |
| Transmission electron microscope (TEM) | Hitachi | H-7650 | Morphological observation for BEVs at Step 8.3 |
| Tween-20 | Fdbio science | FD0020 | Used in western blotting at Step 8.5 |
| Ultracentrifuge tube | Beckman | 326823, 355642 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
| Ultra-clean bench | AIRTECH | SW-CJ-2FD | Peform the procedures about liquid handling |
| Water bath | Bluepard | CU600 | Used for measuring protein content of BEVs at Step 8.2.5 |
| ZetaView | Particle Metrix | S/N 21-734, Software ZetaView (version 8.05.14 SP7) | Nanoparticle tracking analysis (NTA) for measuring the particle size and concentrarion of BEVs at Step 8.4 |
References
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