Summary
Bu çalışma, yoğunluk gradyanlı santrifüjleme (DGC) yoluyla insan dışkısından zenginleştirilmiş bakteriyel hücre dışı vezikülleri (BEV'ler) izole etmek ve saflaştırmak için bir yöntemi açıklamakta, BEV'lerin fiziksel özelliklerini morfoloji, partikül boyutu ve konsantrasyondan tanımlamakta ve DGC yaklaşımının klinik ve bilimsel araştırmalardaki potansiyel uygulamalarını tartışmaktadır.
Abstract
Bakteriyel hücre dışı veziküller (BEV'ler), ana bakterilerden miras alınan proteinler, lipitler ve nükleik asitler gibi biyoaktif molekülleri aktaran, bakteri-bakteri ve bakteri-konakçı iletişiminde aktif rol oynayan bakterilerden türetilen nanoveziküllerdir. Bağırsak mikrobiyotasından türetilen BEV'lerin gastrointestinal sistem içinde etkileri vardır ve uzak organlara ulaşabilir, bu da fizyoloji ve patoloji için önemli etkilere neden olur. İnsan dışkısından elde edilen BEV'lerin türlerini, miktarlarını ve rollerini araştıran teorik araştırmalar, bağırsak mikrobiyotasından BEV'lerin salgılanmasını ve işlevini anlamak için çok önemlidir. Bu araştırmalar aynı zamanda BEV'leri izole etmek ve saflaştırmak için mevcut stratejide bir iyileştirme gerektirmektedir.
Bu çalışma, iki yoğunluk gradyanlı santrifüj (DGC) modu oluşturarak BEV'lerin izolasyon ve saflaştırma sürecini optimize etti: Yukarıdan aşağıya ve Aşağıdan yukarıya. BEV'lerin zenginleştirilmiş dağılımı 6 ila 8 (F6-F8) fraksiyonlarında belirlendi. Yaklaşımın etkinliği, partikül morfolojisi, boyutu, konsantrasyonu ve protein içeriğine göre değerlendirildi. Partikül ve protein geri kazanım oranları hesaplandı ve iki DGC modunun geri kazanımını ve saflığını karşılaştırmak için spesifik belirteçlerin varlığı analiz edildi. Sonuçlar, Yukarıdan aşağıya santrifüj modunun daha düşük kontaminasyon seviyelerine sahip olduğunu ve Aşağıdan yukarıya modelinkine benzer bir geri kazanım oranı ve saflığa ulaştığını gösterdi. 108 / mg'lık bir fekal BEV konsantrasyonu elde etmek için 7 saatlik bir santrifüj süresi yeterliydi.
Bu yöntem, dışkı dışında, bileşenlerdeki ve viskozitedeki farklılıklara göre uygun modifikasyonla diğer vücut sıvısı tiplerine de uygulanabilir. Sonuç olarak, bu ayrıntılı ve güvenilir protokol, BEV'lerin standartlaştırılmış izolasyonunu ve saflaştırılmasını kolaylaştıracak ve böylece sonraki multi-omik analiz ve fonksiyonel deneyler için bir temel oluşturacaktır.
Introduction
Bağırsak, insan vücudunda en bol bulunan mikrobiyal toplulukları barındıran organ olarak kabul edilmektedir ve bakterilerin %90'ından fazlası kolonizasyon ve çoğalmadarol oynar 1,2. Kapsamlı kanıtlar, bağırsak mikrobiyotasının bağırsak mikroçevresini modüle ettiğini ve aynı zamanda, öncelikle bozulmuş bir bağırsak bariyeri 3,4 yoluyla uzak organlardaki işlev bozukluğu ile etkileşime girdiğini göstermiştir. Artan kanıtlar, bağırsak mikrobiyotasının dengesizliği ile inflamatuar bağırsak hastalığının (IBD) ilerlemesi arasında bir ilişki olduğunu göstermektedir5,6 ve ayrıca bağırsak-beyin ekseni 5,6,7,8 yoluyla bilişsel bozukluklar. Bakteriler tarafından üretilen bakteriyel hücre dışı veziküller (BEV'ler) bu patolojik süreçlerde önemli rol oynar.
BEV'ler, çapları 20 ila 400 nm arasında değişen, bakteri türevlerini kapsülleyen nano ölçekli parçacıklardır. Bakteriler ve konakçı organizmalar arasındaki etkileşimleri kolaylaştırdıkları gösterilmiştir 9,10. Görünmez olmalarına rağmen, bu parçacıklar, tanısal biyobelirteçler, terapötik hedefler ve ilaç dağıtım araçları olarak ileriye dönük geniş uygulamaları nedeniyle araştırmacıların artan ilgisini çekmiştir11. Ağırlıklı olarak bağırsak bakterilerinden elde edilen BEV'leri incelemek için genellikle biyonumune olarak kullanılan insan dışkısı, diğerleri arasında su, bakteri, lipitler, proteinler, sindirilmemiş gıda artıkları ve pul pul dökülmüş epitel hücrelerinin karmaşık bir karışımını içerir. Karmaşık dışkı bileşimi, BEV'lerin izolasyonu ve saflığı için zorluklar yaratır ve böylece BEV'lerin kapsamlı, objektif ve gerçekçi bir analizini engeller. Bu nedenle, kirletici bileşenlerden kaynaklanan paraziti en aza indirmek ve BEV'lerin verimini artırmak için etkili stratejiler, derhal ilgilenilmesi gereken kritik konular olarak ortaya çıkmıştır.
Mevcut izolasyon stratejileri büyük ölçüde ultra yüksek hızlı santrifüjleme (UC), yoğunluk gradyanlı santrifüjleme (DGC) ve boyut dışlama kromatografisi (SEC) gibi tekniklere dayanmaktadır12,13,14,15,16,17. Şu anda DGC, numunenin ilk yükleme konumu tarafından belirlenen "Yukarıdan aşağıya" ve "Aşağıdan yukarıya" olmak üzere iki sedimantasyon-yüzer modu kapsayan, BEV ayırma alanında en yaygın olarak uygulanan yöntemlerden biridir. Bu metodolojiler, hücre dışı vezikülleri (EV'ler) boyut ve yoğunluk eşitsizliklerine dayalı olarak diğer bileşenlerden ayırarak değişken saflık ve geri kazanım oranları sağlar. Önceki araştırmalar, EV'leri kandakilipoprotein 18 ve idrardaki Tamm-Horsfall proteini19 gibi vücut sıvısı örneklerinde çözünür proteinlerden yeterince ayırmak için tek yaklaşımlı stratejilerin yetersiz olduğunu göstermiştir. Ek olarak, ökaryotik hücre dışı veziküllerin (EEV'ler) boyut dağılımı genellikle BEV'lerinkiyle örtüşür ve bu nedenle BEV verimini optimize etmek için daha fazla metodolojik geliştirme gerektirir. Sonuç olarak, BEV'lerin çalışmasını ilerletmek, etkili ayırma ve saflaştırma metodolojilerinin geliştirilmesine bağlıdır. Özellikle, Tulkens ve ark.15, fekal BEV'leri EEV'lerden ayırmak için ortogonal bir biyofiziksel strateji kullandılar, burada Aşağıdan yukarıya DGC modunun santrifüjleme süresi 18 saate kadardı. Buna karşılık, bu çalışma bunu 7 saate düşürdü, gradyan-ultrasantrifüj süresinden büyük ölçüde tasarruf sağladı ve süreci basitleştirdi.
Bu çalışmada, BEV'leri düşükten aşırı yüksek hıza kadar bir dizi diferansiyel santrifüj hızıyla zenginleştirdikten sonra, optimize edilmiş tampon koşulları altında iki DGC modu kullanan fekal BEV'leri izole ettik ve saflaştırdık. Morfolojiye, partikül boyutuna ve konsantrasyona dayalı değerlendirmeler, bu gelişmiş yöntemle övgüye değer bir performans gösterdi. Bu çalışma, gelecekteki araştırmalar için temel oluşturabilir, uygulamalarını daha geniş bir alana genişletebilir ve insan vücudundaki BEV'lerin heterojenliği hakkında fikir verebilir. Ayrıca BEV ayırma ve analiz tekniklerinin standardizasyonuna da katkıda bulunur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Güney Tıp Üniversitesi Nanfang Hastanesi Etik Kurulu, katılımcıların bilgilendirilmiş onamıyla yürütülen bu çalışmayı onayladı. Burada kullanılan tüm yöntemler, Uluslararası İnsan Mikrobiyom Standartları (IHMS: http://www.microbiome-standards.org/) tarafından sağlanan standart çalışma yönergelerine bağlı kalmıştır. Sonraki tüm sıvı işleme prosedürlerinin bir biyogüvenlik kabini veya ultra temiz bir tezgah içinde gerçekleştirilmesi zorunlu kılındı.
1. Dışkı örneklerinin toplanması ve alıntılanması
- Bir dışkı örnekleyici, kapalı bir torba ve bir buzlu kutu dağıtın ve katılımcılara örneklerin nasıl temin edileceği ve korunacağı konusunda kapsamlı talimatlar verin.
- Her katılımcıya, sağlanan örnekleyiciyi kullanarak dışkı örneğini toplamasını ve 24 saatlik bir pencere içinde 4 °C sıcaklıkta laboratuvara taşımasını söyleyin.
- Laboratuvarda alındıktan sonra, önceden tartılmış 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne 3,5 g'dan daha az dışkıyı ayırmak için steril bir kaşık kullanın. Sonraki ön işlem prosedürleri için dışkı örneğinin ağırlığını tüp üzerine not edin.
DURAKLAMA NOKTASI: Numunelerin hemen işlenmesi mümkün değilse, numuneyi uygun notasyondan sonra -80 °C'de uzun süreli depolama için tahsis edin.
2. Dışkı numunesi hazırlama
- 500 mL fosfat tamponlu salini (PBS) 4 °C'de soğutun. Önceden soğutulmuş PBS'yi 50 mL'lik bir şırınga kullanarak 0,22 μm Polietersülfon (PES) filtresinden on adet 50 mL'lik santrifüj tüpüne filtreleyin.
- Her biri 3,5 g dışkı örneği içeren iki adet 50 mL'lik tüpü buz üzerine yerleştirin. Her tüpe 35 mL PBS ekleyin.
NOT: Dışkı çözünmesi için gerekli PBS miktarını hesaplayın ve maksimum numune konsantrasyonunun %10 (a/h) olmasını sağlayın. Ek numuneler işliyorsanız, gerektiğinde daha fazla tüp kullanın. - S'yi çalkalayınamps 300 rpm'de 2 °C'de 4 saat veya dışkı tamamen görünür şekilde tamamen süspanse olana kadar en az 4 °C'de 8 saat yerleştirin.
3. Diferansiyel hızlı santrifüjleme
- Yüksek hızlı soğutmalı santrifüjü 4 °C'ye soğutun.
- Adım 2.3'te hazırlanan numuneleri içeren iki tüpün ağırlığını PBS ile toplam 0.1 g ağırlığa ulaşacak şekilde ayarlayın.
- Numuneleri 3.000 × g'da 4 °C'de 20 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı, peletin yaklaşık 1 mL üzerinde bırakacak şekilde iki temiz 50 mL santrifüj tüpüne dikkatlice pipetleyin. Bu işlem için tek kullanımlık plastik bir Pasteur pipeti kullanın.
- Toplam ağırlığa ± 0,1 g içinde ulaşmak için PBS ile iki tüpün ağırlığını ayarlayın.
- Transfer edilen süpernatanı 12.000 × g'da 4 ° C'de 30 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı 20 mL'lik bir şırınga kullanarak aspire edin, şırınga iğnesini çıkarın ve 0.22 μm filtrelerden 50 mL'lik tüplere süzün. Bu noktada, süpernatan hacmi yaklaşık 30 mL olmalıdır.
NOT: 12.000 × g santrifüjlemeden sonra hala önemli miktarda kirlilik görünüyorsa, santrifüj adımını 12.000 × g'da 4 °C'de 30 dakika tekrarlamak gerekir. Bunun yapılmaması, filtrasyon sırasında gözenek tıkanması nedeniyle önemli bir BEV kaybına neden olabilir.
4. Ultra yüksek hızlı santrifüjleme
- Kalan kontaminasyonu ortadan kaldırmak için rotoru ve kovayı %75 (h/h) alkolle silerek temizleyin.
- Tüp tutucuya 38.5 mL'lik bir ultrasantrifüj tüpü yerleştirin.
NOT: Numune hacmine göre uygun ultrasantrifüj tüpünü seçin. Ürün kılavuzunda belirtildiği gibi santrifüj tüpleri sterilize etmek için ultraviyole radyasyondan ve uygun olmayan kimyasal reaktiflerden kaçının. - Filtrelenmiş fekal süpernatantın yaklaşık 30 mL'sini Adım 3.7'den ultrasantrifüj tüpüne aktarın.
- Ultrasantrifüj tüpünü, tüpün açıklığından 3 mm boşluk bırakarak yaklaşık 8 mL PBS ile doldurun.
- İki ultrasantrifüj tüpünü numunelerle birlikte karşılıklı ultrasantrifüj kovalarına yerleştirin, örneğin kova 1, 4 (1-4), 2-5, 3-6'ya karşılık gelir.
- Toplam ağırlığı ± 0,005 g olacak şekilde PBS ile iki kovanın ağırlığını ayarlayın.
- Boruların yüklü olup olmadığına bakılmaksızın tüm kovaları rotora takın.
- Vakumu başlatın ve numuneleri 160.000 × g'da 4 °C'de 70 dakika santrifüjleyin.
- Hazne vakumunu serbest bırakın ve cihazın Ana sayfasında Hazır görüntülendiğinde kapıyı açın.
- Rotoru ultrasantrifüjden çıkarın.
- Kovaları rotordan rafa taşıyın ve bir pense kullanarak boruları alın.
- Altta görünür kahverengi topaklar içerecek olan süpernatanı atın.
- Peletleri, tamamen askıya alınana kadar 1 mL önceden soğutulmuş (4 °C) PBS ile 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak tekrar tekrar yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin. Tüpü yaklaşık 37 mL PBS ile doldurun ve açıklıktan 3 mm boşluk bırakın.
- Kısmen bağlı kirletici bileşenleri tüp duvarlarından çıkarmak için 4.5 ° C'de 4.11 dakika boyunca 160,000 × g'da 4-4 adımlarını izleyerek başka bir ultrasantrifüjleme gerçekleştirin.
- Süpernatanı atın, iki ultrasantrifüj tüpünü 5 dakika ters çevirin ve iç duvarda kalan çözeltiyi silecekler ile temizleyin.
NOT: İç duvarın temizlenmesi, ultrasantrifüj tüpü duvarına yapışan artık kontaminasyondan kaynaklanan paraziti en aza indirir. Özellikle partikül boyutu ile ilgili olarak BEV analizini etkilemeyecek silecekleri seçin. - 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak 1,2 mL önceden soğutulmuş (4 °C) PBS ile yukarı ve aşağı pipetleyerek her tüpteki peletleri yeniden süspanse edin.
- 1.2 mL PBS / BEV çözeltisini bir ultrasantrifüj tüpünden temiz bir 1.5 mL mikrotüpe aktarın.
DURAKLAMA NOKTASI: Bir ultrasantrifüj tüpünden toplanan PBS/BEV çözeltisi Adım 6'ya geçebilir. Diğer tüpteki çözeltiyi -80 °C'de saklayın.
5. Yoğunluk gradyanlı santrifüjleme için çözelti hazırlama
- 0,02 M HEPES tamponunun hazırlanması
- 0.477 g HEPES tozu ve 0.8 g NaCl'yi 90 mL otoklavlanmış deiyonize su ile birleştirin.
- 1 M sodyum hidroksit (NaOH) ekleyerek pH'ı 7,2'ye ayarlayın. Deiyonize su ile hacmi 100 mL'ye getirin ve çözeltiyi 0.22 μm PES membranlarından süzün.
DİKKAT: Sodyum hidroksit güçlü bir kostik alkalidir. Operatörler bunu bir çeker ocakta dikkatli bir şekilde tutmalı ve hazırlamalıdır.
- Yoğunluk gradyan tamponunun hazırlanması
- Yoğunluk gradyanlı santrifüjleme için ultrasantrifüj tüplerinin sayısına bağlı olarak her bir yoğunluk gradyan tamponunun gerekli hacmini hesaplayın (Adım 6) (Bu protokolde, %60, %50, %40, %20 ve %10 gradyan çözeltileri için hacimler sırasıyla 2.5 mL, 3 mL, 6 mL, 6 mL ve 6 mL idi).
- % 50 (a / h) iyodiksanol çalışma çözeltisinin hazırlanması için, 0.02 M HEPES tamponunu ve% 60 (a / h) iyodiksanol stok çözeltisini 1: 5 (0.5 mL: 2.5 mL) hacim oranında karıştırın.
NOT: İodiksanol stok çözeltisini geri çekmek ve hava girmesini önlemek için tek kullanımlık 20 mL'lik bir şırınga kullanın. - Farklı konsantrasyonlarda iyodiksanol tamponları hazırlamak için, Adım 5.2.2'deki %50 iyodiksanol çalışma solüsyonunu, Tablo 1'de gösterilen oranlara göre 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak Adım 5.1'de elde edilen HEPES tamponu ile birleştirin.
NOT: Adım 5'i ışıklar kapalıyken ultra temiz bir tezgahta gerçekleştirin. Bakteri üremesini önlemek için açılmış iyodiksanol stok çözeltisini buzdolabında 4 °C'de saklayın. İodiksanol çözeltisini ve HEPES tamponunu ışıktan koruyun.
6. Yoğunluk gradyanlı santrifüj sisteminin kurulması
- Yukarıdan aşağıya DGC modu
- Adım 4'ten izole edilen 500 μL PBS / BEV çözeltisini 3 mL PBS ile birleştirin. 3,5 mL PBS/BEV çözeltisi elde etmek için çözeltileri 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak nazikçe karıştırın.
- 31 mL'lik bir ultrasantrifüj tüpünü delikli bir köpük plaka üzerine yerleştirin ve "↓" olarak etiketleyin.
- 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak tüpün dibine dikey olarak 3 mL% 50 iyodiksanol çözeltisi ekleyin.
- Tüpü 70°'lik bir açıyla eğin ve köpük plaka seviyesinin biraz üstüne, tüpün açıklığının altına bir tüp tutucu veya başka bir destek yerleştirin.
- 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak %50 iyodiksanol çözeltisinin üzerine 3 mL %40 iyodiksanol çözeltisi ekleyin.
- 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak% 40 iyodiksanol çözeltisinin üzerine 3 mL% 20 iyodiksanol çözeltisi ekleyin.
- 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak %20 iyodiksanol çözeltisinin üzerine 3 mL %10 iyodiksanol çözeltisi ekleyin.
- 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak% 10 iyodiksanol çözeltisinin üzerine Adım 6.1.1'den 3,5 mL PBS / BEV çözeltisi ekleyin.
- Tüpleri yavaşça dik konuma getirin.
NOT: Pipetlemeden sonra tabakalaşma görünür olmalıdır.
- Aşağıdan yukarıya DGC modu
- Delikli bir köpük plaka üzerine 31 mL'lik bir ultrasantrifüj tüpü yerleştirin ve "↑" olarak etiketleyin.
- Tüpün dibine dikey olarak 2.5 mL% 60 iyodiksanol stok çözeltisi ekleyin. 3 mL %50 iyodiksanol/BEV çözeltisi elde etmek için 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak Adım 4'ten izole edilen 500 μL PBS/BEV çözeltisi ile hafifçe karıştırın.
- Tüpü 70°'lik bir açıyla eğin ve köpük plaka seviyesinin biraz üstüne, tüpün açıklığının altına bir tüp tutucu veya başka bir destek yerleştirin.
- 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak %50 iyodiksanol/BEV çözeltisinin üzerine 3 mL %40 iyodiksanol çözeltisi ekleyin.
- 1000 μL'lik bir pipet kullanarak %40 iyodiksanol çözeltisinin üzerine 3 mL %20 iyodiksanol çözeltisi ekleyin.
- 1000 μL'lik bir pipet kullanarak% 20 iyodiksanol çözeltisinin üzerine% 10 iyodiksanol çözeltisinden 3 mL ekleyin.
- 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak% 10 iyodiksanol çözeltisinin üzerine 3,5 mL PBS ekleyin.
- Tüpleri yavaşça dik konuma getirin.
- Bu noktada, Adım 4.17'de elde edilen süspansiyonun 200 μL'si kaldı ve bu daha sonra "UC" adlı bir grup olarak analiz edilebilir.
NOT: Adım 6'da çözeltileri aktarırken, pipet ucunu her zaman tüpün eksenine dik olarak ultrasantrifüj tüpü duvarına karşı tutun.
7. Yoğunluk gradyan santrifüjleme ve fraksiyon toplama
- Toplam ağırlığı ± 0,005 g olacak şekilde PBS ile iki tüpün ağırlığını ayarlayın.
- Tüpleri Adım 4.5'e göre kovalara yerleştirin ve 4 °C'de 7 saat boyunca 160.000 × g'da santrifüjlemeye tabi tutun.
- Fraksiyonları bir pipetleyici (1000 μL) kullanarak yukarıdan aşağıya yan duvara şu sırayla toplayın: 3 mL, 2 mL, 1 mL, 1 mL, 1 mL, 1 mL, 1 mL, 1.5 mL ve 3 mL, 38.5 mL'lik bir ultrasantrifüj tüpünde.
NOT: Görüş hattını sıvı yüzeyiyle aynı seviyede tutun. - Adım 4'e göre Adım 7.3'te elde edilen her fraksiyon için 160.000 × g'da 4 ° C'de 70 dakika boyunca ultrasantrifüjleme gerçekleştirin.
- Süpernatanı çıkarın ve ultrasantrifüj tüplerini 5 dakika boyunca ters çevirin.
- Peletleri 200 μL'lik bir pipet kullanarak 200 μL önceden soğutulmuş (4 °C) PBS'de yeniden süspanse edin.
- PBS/BEV çözeltisini temiz bir 1,5 mL mikrotüpe aktarın.
- F1'den F10'a kadar olan kesirleri etiketleyin ve Adım 8'e göre analiz edin.
DURAKLAMA NOKTASI: Adım 7.8'de elde edilen numuneler hemen işlenemiyorsa, -80 °C'de saklayın.
8. Toplanan kesirlerin karakterizasyonu ve kantitatif analizi
- Karşılık gelen yoğunluklarını hesaplamak için boş kontrollü bir mikroplaka dedektörü kullanarak her bir fraksiyonun absorbans değerlerini (OD 340 nm) belirleyin.
NOT: Boş bir kontrol oluşturmak için PBS/BEV çözümünü (Adım 6.1.1 ve Adım 6.2.2) PBS ile değiştirin.- Sırasıyla 1.0058 g/mL, 1.0318 g/mL, 1.058 g/mL, 1.0708 g/mL ve 1.111 g/mL yoğunluklara karşılık gelen standartlar olarak %50 stok çözeltisine (Adım 5.2.2) dayalı olarak 0,%5, %10, %12,5 ve %20 iyodiksanol çözeltisinin her biri 100 μL hazırlayın.
- 96 oyuklu bir plakanın kuyucuklarını çoğaltmak için boş kontrolden (Adım 7.3'te hazırlanan) her fraksiyondan 50 μL ve her standart çözeltiden (Adım 8.1.1'de hazırlanan) 50 μL ekleyin.
- Dalga boyunu 340 nm'ye ayarlayın, uç nokta optik yoğunluğunu ölçün ve her bir fraksiyonun yoğunluğunu hesaplayın.
- F4-F9'u yoğunluklarına göre BEV kesirlerinin aralığı olarak tanımlayın.
- Bikinkoninik asit tahlili (BCA) kullanarak BEV fraksiyonlarının protein konsantrasyonunu belirleyin.
- 0.5 μg / μL standart protein çözeltisi hazırlamak için üretici tarafından sağlanan PBS'deki maddeyi on kat seyreltin.
- Reaktif talimatlarına göre değişen hacimlerde standart protein çözeltisini (Adım 8.2.1'de hazırlanan) ekleyin ve 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğunu PBS ile toplam 20 μL hacme tamamlayın.
- Her bir kuyucuğa Adım 7.8'de hazırlanan numunelerden 20 μL ve Adım 6.2.9'da tanımlanan UC'den sonra kalan numuneler ilave edilir.
- A ve B reaktiflerini 50:1 oranında karıştırın ve her bir oyuğa 200 μL aktarın.
- Plakayı 37 °C su banyosunda 30 dakika inkübe edin.
- Bir mikroplaka okuyucu kullanarak absorbans değerini ölçün, protein konsantrasyonunu (μg/μL) hesaplayın ve Adım 8.2.2'de seyreltilmiş standart çözeltilerin değerlerinden üretilen standart eğriye (x: optik yoğunluk; y: protein konsantrasyonu) dayalı olarak numunelerin protein içeriğini (μg) belirleyin.
- BEV'lerin varlığını doğrulamak için transmisyon elektron mikroskobu (TEM) kullanarak Adım 8.1.4'te tanımlanan BEV fraksiyonlarını karakterize edin. Aşağıdaki tüm işlemler buz üzerinde yapılmalıdır.
- Adım 7.8'den izole edilen her bir F4-F9 fraksiyonundan 10 μL uygulayın ve Adım 6.2.9'da tanımlanan UC'den sonra kalan numuneleri 20 dakika boyunca Formvar/Karbon destekli bakır ızgaralara uygulayın ve filtre kağıdı ile kurulayın.
- Numuneleri 100 μL PBS ile her biri 1 dakika boyunca üç kez durulayın ve filtre kağıdı ile kurulayın.
- Numuneleri 100 μL %1 (a/h) glutaraldehit ile 5 dakika sabitleyin ve filtre kağıdı ile kurulayın.
- Izgaraları 100 μL PBS ile her biri 2 dakika boyunca on kez yıkayın ve filtre kağıdı ile kurulayın.
- Izgaraları 50 μL% 1.5 (a / h) uranil asetat ile 10 dakika boyayın ve filtre kağıdı ile kurulayın.
DİKKAT: Uranil asetat radyoaktiftir ve cilt ile temas ettiğinde veya solunduğunda son derece toksiktir. Uranil asetat içeren çözeltileri bir çeker ocakta tutun ve uygun güvenlik önlemlerini alın. - Izgaraları 5 dakika boyunca %1 (a/h) metilselüloz damlasına aktarın ve filtre kağıdı ile kurulayın.
- Havayla kurutulmuş ızgaraları gözlemleyene kadar karanlık, tozsuz bir ortamda saklayın.
- Görüntüleri yakalayın ve bir TEM kullanarak analiz edin.
- Partikül sayısını saymak için nanopartikül izleme analizi (NTA) kullanarak Adım 8.1.4'te tanımlanan BEV fraksiyonlarını karakterize edin.
- Sistemi 110 nm polistiren parçacıkları kullanarak kalibre edin.
- Numune havuzunu PBS kullanarak yıkayın.
- Adım 7.8'de elde edilen farklı fraksiyonlardan alınan numuneleri ve Adım 6.2.9'da tanımlanan UC'den sonra kalan numuneleri, optimize edilmiş 107 partikül / mL konsantrasyonla 105-10 9 partikül / mL aralığında bir konsantrasyona seyreltin.
- Sıcaklığı 23-30 °C civarında tutarak üç çoğaltma ile 11 konumda kaydedin ve analiz edin.
- Örneklerin protein içeriklerini coomassie parlak mavi boyama (CBBS) ve batı lekeleme (WB) ile analiz edin.
- Adım 7.8'de elde edilen farklı fraksiyonlardan BEV numunelerini ve Adım 6.2.9'da tanımlanan UC'den sonra kalan numuneleri, PBS ve 5 × yükleme tamponu kullanarak 0.5 veya 1 μg/μL'lik bir nihai konsantrasyona seyreltin, miktar tayini gerekiyorsa, Adım 8.5.2'de her bir kuyucuktan 20 μL (10 μg veya 20 μg) yeterli numune yüklemesi sağlayın. Numuneleri 95 °C'de 10 dakika kaynatın.
- Prefabrike poliakrilamid jeli elektroforez tankına monte edin ve numuneleri kuyucuklara aktarın.
- Aşağıdaki parametrelerle dikey elektroforez yapın: 50 dakika boyunca 160 V.
- Jeli Coomassie parlak mavi solüsyonunda 1 saat boyayın, mavi arka plan aydınlanana kadar deiyonize suda durulayın ve bir kamera ile görüntü yakalayın.
- Aşağıdaki parametrelerle diğer jeller için protein lekeleme prosedürleri uygulayın: 20 dakika boyunca 400 mA.
- Kurutma membranlarını oda sıcaklığında 1 saat boyunca %5 (a/h) BSA çözeltisi ile bloke edin.
- Membranları TBST tamponunda her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
- Membranları primer antikorlarla inkübe edin (BEV belirteçleri: LPS, OmpA, LTA; EEV belirteçleri: CD63, CD9, TSG-101, Syntenin, Integrin β1; Diğer kontaminasyon belirteçleri: Flagellin, Calnexin) 4 ° C'de 8-12 saat.
- Membranları TBST tamponunda her biri 10 dakika boyunca üç kez yıkayın.
- Membranları oda sıcaklığında 1 saat boyunca ikincil antikorlarla inkübe edin.
- Adım 8.5.9'u gerçekleştirin.
- Bir kemilüminesans aparatı kullanarak lekelemeyi geliştirin.
- Pozitif bir kontrol oluşturmak için PBS/BEV çözeltisini (Adım 6.1.1 ve Adım 6.2.2) Escherichia coli'den elde edilen BEV'lerle değiştirin (ham E. coli-BEV'leri izole etme prosedürü için Malzeme Tablosuna bakın) ve BEV'leri karakterize etmek için yukarıdaki tüm deneyleri gerçekleştirin.
DURAKLAMA NOKTASI: Fekal BEV'ler için yukarıda açıklanan karakterizasyonun sonuçlarına dayalı olarak FEV ile zenginleştirilmiş fraksiyonların dağılımı olarak F6-F8'i belirleyin ve sonraki analizler için bu daraltılmış aralığı kullanın.
- İki DGC modunun verimliliğini değerlendirmek için geri kazanım oranlarını parçacıklar ve proteinler açısından hesaplayın. Aşağıdaki sonuçlar yüzde olarak sunulmuştur.
- Yukarıdan aşağıya modda parçacıkların geri kazanım oranlarını hesaplayın: F6-F8'deki toplam parçacıklar/Adım 6.2.9'da tanımlanan UC'den sonraki parçacıklar.
- Aşağıdan yukarıya modda parçacıkların geri kazanım oranlarını hesaplayın: F6-F8'deki toplam parçacıklar/Adım 6.2.9'da tanımlanan UC'den sonraki parçacıklar.
- Yukarıdan aşağıya modda proteinlerin geri kazanım oranlarını hesaplayın: F6-F8'deki toplam protein içeriği (μg)/Adım 6.2.9'da (μg) tanımlanan UC'den sonraki protein içeriği.
- Aşağıdan yukarıya modda proteinlerin geri kazanım oranlarını hesaplayın: F6-F8'deki toplam protein içeriği (μg)/Adım 6.2.9'da (μg) tanımlanan UC'den sonraki protein içeriği.
- UC ve iki DGC modunun geleneksel olarak tanımlanan saflığını değerlendirmek için parçacık/protein oranını hesaplayın ve aşağıdaki sonuçların tümü yüzde olarak sunulmuştur.
- Adım 6.2.9'da tanımlanan UC'den sonra parçacık/protein oranı: UC'den sonra partiküller/UC'den sonra protein içeriği (μg).
- Yukarıdan aşağıya modda parçacık/protein oranı: F6-F8'deki toplam parçacık/F6-F8'deki protein içeriği (μg).
- Aşağıdan yukarıya modda parçacık/protein oranı: F6-F8'deki toplam parçacık/F6-F8'deki protein içeriği (μg).
- Fekal BEV saflaştırması ve gelecekteki analizler için en uygun santrifüj modunu (protokolde yukarıdan aşağıya mod seçilmiştir) seçin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
BEV ile zenginleştirilmiş fraksiyonların dağılımını belirleyin
Bakteriyel hücre dışı veziküllerin (BEV'ler) zenginleştirilmiş fraksiyonlarının dağılımını belirlemek için, OD 340 nm'deki absorbans değerlerini ölçmek için boş bir kontrol kuruldu ve her fraksiyonun yoğunluğu ölçümlere ve iyodiksanol yönergelerine göre hesaplandı (Adım 8.1). Tablo 2 , F4 ila F9 fraksiyonlarının, tipik olarak hücre dışı veziküllerle ilişkili aralıkta yoğunluklar sergilediğini gösteren yoğunluk sonuçlarını sunmaktadır. Bu bulgu, BEV'lerin çoğunluğunun bu fraksiyonlarda izole edildiğini ve F4-F9'un BEV'ler için kaba aralık olarak tanımlanmasına yol açtığını göstermiştir. Şekil 1'de F4-F9 fraksiyonlarında gösterildiği gibi izole edilen fekal BEV'lerin morfolojik özelliklerini karakterize etmek için transmisyon elektron mikroskobu (TEM) kullanıldı. TEM görüntüleri (Şekil 2), BEV'lerin karakteristiği olan klasik çanak şeklindeki yapıların varlığını ortaya koymuştur. Sırasıyla partikül sayısını ve protein konsantrasyonunu belirlemek için nanopartikül izleme analizi (NTA) ve bikinkoninik asit testi (BCA) yapıldı ve geri kazanım oranlarının ve saflığın daha fazla değerlendirilmesine izin verildi. Şekil 3 , her bir fraksiyon için protein ve partikül konsantrasyonlarını gösterir, bu da F6 ve F7'nin en yüksek konsantrasyonları sergilediğini, ardından F5 ve F8'in geldiğini gösterir. Daha sonra, genel bir protein analizi sağlamak için Coomassie parlak mavi boyama (CBBS) ve western blotlama (WB) yapıldı. CBBS'nin sonuçları, protein konsantrasyonu bulguları ile tutarlıydı ve F6 ve F7 en yoğun bantları gösterdi (Şekil 4). BEV'lerin dağılımını doğrulamak için, Escherichia coli'den türetilen hücre dışı veziküller pozitif kontrol olarak kullanıldı (Adım 8.5.13'te tanımlanmıştır). İzolasyon ve saflaştırma prosedürleri, Malzeme Tablosunda ve yukarıda belirtilen protokol bölümlerinde (Adım 3, 4) açıklanan adımları izlemiştir. WB analizi ayrıca, bakterilerin dış zarının önemli bir bileşeni ve BEV'ler için spesifik bir belirteç olan dış zar proteini A'nın (OmpA) F6-F8 fraksiyonlarında varlığını doğruladı. Bu sonuçlara dayanarak, F6-F8 kesirleri, sonraki deneyler ve analizler için uygun BEV ile zenginleştirilmiş kesirler olarak tanımlanmıştır.
Girişim bileşenlerinin sunum aralığının doğrulanması
BEV'lerle benzer boyut ve yoğunluğa sahip ökaryotik hücre dışı veziküller (EEV'ler), BEV'lerin analizinde önemli bir girişim olarak tanımlanmıştır. Bunu ele almak için, üç EEV proteini, 7 saat ve 15 saatlik santrifüj süreleri ile hem Yukarıdan aşağıya hem de Aşağıdan yukarıya modlardan 5-8 fraksiyonlarında incelendi. Bu model her iki modda da gözlendi, ancak Aşağıdan yukarıya modu F7'de CD63-EEV'lerin hafif bantlanmasını sergiledi. Bununla birlikte, diğer EEV belirteçleri, CD9 ve TSG-101, modlara veya santrifüjleme sürelerine bakılmaksızın bu fraksiyonlarda görünür sinyaller göstermedi. Bağımsız bir deneysel girişimde, Syntenin ve Integrin β1'i hedefleyen antikorlar, 5-8 fraksiyonları boyunca EEV'lere özgü farklı protein belirteçlerinin zenginleşmesini tespit etmek için kullanıldı. Syntenin, özellikle Yukarıdan aşağıya yaklaşım altında, F5 içinde belirgin bir şekilde tespit edilirken, Integrin β1'in varlığı F6 içinde fark edildi (Şekil 5). Enterferans yapan partiküllerin varlığını daha fazla değerlendirmek için, yoğunluk gradyan sistemine Dil-etiketli düşük yoğunluklu lipoprotein (Dil-LDL) dahil edildi ve tüm fraksiyonlarda floresan yoğunluğu ölçüldü. Yukarıdan aşağıya modda, 1-4 arasındaki kesirler nispeten daha yüksek floresan değerleri sergilerken, Aşağıdan yukarıya modda, daha yüksek yoğunluklar gösteren F1-F6 idi (Şekil 6).
Konsantrasyon, partikül boyutu ve BEV'lerin belirteçlerinden iki DGC modunun geri kazanım oranlarını ve saflığını değerlendirin
F6-F8 fraksiyonları BEV ile zenginleştirilmiş fraksiyonlar olarak tanımlandıktan sonra, iki yoğunluk gradyanlı santrifüjleme (DGC) modunun geri kazanım oranları ve saflığı değerlendirildi. Yukarıdan aşağıya moddan, Aşağıdan yukarıya moddan ve tek başına ultrasantrifüjden (UC) elde edilen BEV ile zenginleştirilmiş fraksiyonların partikül boyutları karşılaştırıldı. Her iki santrifüj modunda gözlemlenen partikül boyutları, BEV'lerin tanımlanmış çapı ile uyumlu olarak 90 ila 300 nm arasında değişmiştir (Şekil 7). Daha sonra, iki modun partikül ve protein geri kazanım oranları, DGC'den önceki ve sonraki partikül ve protein konsantrasyonlarına göre hesaplanmıştır (Tablo 3 ve Şekil 8). Özellikle, Aşağıdan yukarıya modu, diğer moda kıyasla daha yüksek kurtarma oranları sergiledi. Ayrı bir deney grubunda, iki moddaki protein geri kazanımı, 7 saat ve 15 saatlik farklı santrifüj sürelerinde değerlendirildi. Önemli olarak, kullanılan gradyan modundan bağımsız olarak, iki santrifüj süresi arasında DGC'den sonra F6-F8 fraksiyonları içindeki protein içeriğinde istatistiksel olarak anlamlı bir fark yoktu (Şekil 9). Parçacık/protein oranı, iki moddaki saflığın kabaca bir değerlendirmesini sağlamak için hesaplandı. Veriler, modlar arasında saflıkta önemli bir fark olmadığını gösterdi. Ek olarak, saflığı daha fazla karşılaştırmak için üç BEV markörü (LPS, OmpA ve LTA), bir EEV markörü (CD63) ve iki kirletici marköre (Calnexin, Flagellin) odaklanarak Coomassie parlak mavi boyama (CBBS) ve batı lekeleme (WB) gerçekleştirildi. Sonuçlar, DGC'den sonra enterferans yapan maddelerin kısmi bir azaldığını gösterdi, LPS ve OmpA, tek başına UC'ye kıyasla her iki DGC modunda daha belirgin bir varlık gösterdi (Şekil 10).
Şekil 1: BEV'lerin izolasyonu ve saflaştırılmasının şematik iş akışı. Kısaltmalar: BEV'ler = bakteriyel hücre dışı veziküller. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: BEV kesirlerinin temsili TEM görüntüleri. (A) UC'den sonra izole edilen BEV'lerin TEM görüntüleri. (B) Yukarıdan aşağıya modu kullanılarak DGC'den sonra izole edilen BEV'lerin TEM görüntüleri. (C) Aşağıdan yukarıya modu kullanılarak DGC'den sonra izole edilen BEV'lerin TEM görüntüleri. Tüm görüntüler 200 nm'lik tutarlı bir ölçekte sunuldu. Kısaltmalar: TEM = transmisyon elektron mikroskobu; BEV'ler = bakteriyel hücre dışı veziküller; UC = ultrasantrifüjleme; DGC = yoğunluk gradyan santrifüjleme. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Yukarıdan aşağıya ve Aşağıdan yukarıya DGC modlarından sonra BEV fraksiyonlarının protein ve partikül konsantrasyonu. BEV fraksiyonlarının protein konsantrasyonu BCA kullanılarak belirlendi ve gri çubuklarla temsil edildi. Partikül konsantrasyonu NTA kullanılarak ölçüldü ve mavi çubuklarla temsil edildi. Kısaltmalar: BEV = bakteriyel hücre dışı vezikül; DGC = yoğunluk gradyan santrifüjleme; BCA = bikinkoninik asit tayini; NTA = nanopartikül izleme analizi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: BEV ile zenginleştirilmiş fraksiyonların belirlenmesi. (A) Hem Yukarıdan aşağıya hem de Aşağıdan yukarıya modlarında fekal BEV'lerle zenginleştirilmiş fraksiyonları belirlemek için CBBS yapıldı. (B) Escherichia coli'den türetilen EV'ler izole edildi, saflaştırıldı ve BEV'lerin varlığını ve dağılımını doğrulamak için WB'de pozitif bir kontrol olarak kullanıldı. OmpA: Dış zar proteini A, bir BEV belirteci. Kısaltmalar: BEV = bakteriyel hücre dışı vezikül; CBBS = coomassie parlak mavi boyama; EV'ler = hücre dışı veziküller; WB = batı lekeleme. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: EEV dağılımının doğrulanması. Farklı yoğunluk gradyanlı ultrasantrifüj süreleri, 7 saat (A) ve 15 saat (B) ile Yukarıdan aşağıya ve Aşağıdan yukarıya DGC modlarından elde edilen 5-8 fraksiyonlarının Western blot analizi. (C) ve (D)'de gösterildiği gibi, 7 saatlik bir santrifüj periyodundan kaynaklanan F5 ila F8'e odaklanan bağımsız bir çalışma yürütülmüştür. Seçilen belirteçler BEV'ler (LPS) ve EEV'ler (CD63, CD9, TSG-101, Syntenin, Integrin β1) ile ilişkili olanları içeriyordu. Kısaltmalar: DGC = yoğunluk gradyan santrifüjleme; BEV = bakteriyel hücre dışı vezikül; EEV = ökaryotik hücre dışı vezikül. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Düşük yoğunluklu lipoproteinin dağılımı. Bir kontaminasyon belirteci olarak kabul edilen Dil-etiketli düşük yoğunluklu lipoprotein (Dil-LDL), hem Yukarıdan aşağıya hem de Aşağıdan yukarıya modlarında gradyan sistemine 10 μg'lık bir konsantrasyonda eklendi. Dil-LDL, bir algılama modeli oluşturmak için PBS/BEV çözümünün (Adım 6.1.1 ve Adım 6.2.2) yerini aldı. Her bir fraksiyonun floresan yoğunluğu, 549/565 nm uyarma/emisyon dalga boyuna sahip bir mikroplaka detektörü kullanılarak ölçüldü. Kısaltma: BEV = bakteriyel hücre dışı vezikül. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: BEV ile zenginleştirilmiş fraksiyonların parçacık boyutları. (A) UC'den sonra elde edilen ham BEV'lerin partikül boyutu dağılımı. (B) Yukarıdan aşağıya yoğunluk gradyan santrifüjleme (DGC) modu kullanılarak elde edilen BEV ile zenginleştirilmiş fraksiyonların (F6-F8) partikül boyutu dağılımı. (C) BEV ile zenginleştirilmiş fraksiyonların (F6-F8) partikül boyutu dağılımı, Aşağıdan yukarıya DGC modu kullanılarak elde edilmiştir. Parçacıkların boyutlarını ölçmek için NTA yapıldı. Paneller (AC) için kullanılan seyreltme faktörleri 10.000, 2.000 ve 5.000 idi ve buna bağlı olarak ortaya çıkan sonuçlar kalibre edildi. Kısaltmalar: BEV = bakteriyel hücre dışı vezikül; UC = ultrasantrifüjleme; DGC = yoğunluk gradyan santrifüjleme; NTA = nanopartikül izleme analizi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: Yukarıdan aşağıya ve Aşağıdan yukarıya DGC modlarının protein ve partikül geri kazanım oranları. (A) İki modun protein geri kazanım oranları, DGC'den (UC) sonra ve önce protein konsantrasyonunun oranı olarak hesaplanır. (B) İki modun partikül geri kazanım oranları, DGC (UC) öncesi ve sonrası partikül konsantrasyonu oranı ile hesaplanır. (C) UC, Yukarıdan aşağıya ve Aşağıdan yukarıya modlarının parçacık/protein oranları. Veriler ortalama ± SEM olarak sunulmuştur. İstatistiksel analiz, A ve B panelleri için iki kuyruklu, eşleşmemiş t-testi ve C paneli için Tukey post hoc testi ile tek yönlü varyans analizi (ANOVA) kullanılarak yapıldı. Önemli bir fark gözlenmedi. Kısaltmalar: DGC = yoğunluk gradyan santrifüjleme; UC = ultrasantrifüjleme. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 9: Farklı yoğunlukla ilişkili ultrasantrifüjleme süreleri kullanılarak Yukarıdan aşağıya ve Aşağıdan yukarıya DGC modlarına dayalı protein geri kazanımının karşılaştırılması. 7 saat ve 15 saat boyunca gradyan ultrasantrifüjlemeden elde edilen F6-F8 fraksiyonlarındaki protein geri kazanım oranları, hem Yukarıdan aşağıya hem de Aşağıdan yukarıya modları kullanılarak bağımsız deneylerde değerlendirildi. Veriler ortalama ± SEM olarak sunulmuştur. İstatistiksel analiz, iki yönlü varyans analizi (ANOVA) ve Fisher'in en az anlamlı fark testi kullanılarak yapıldı. Önemli bir fark gözlenmedi. Kısaltmalar: DGC = yoğunluk gradyan santrifüjü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 10: Yukarıdan aşağıya ve Aşağıdan yukarıya DGC modlarının saflık değerlendirmesi. (A) CBBS, UC, Yukarıdan aşağıya ve Aşağıdan yukarıya modlarının protein dağılımını karşılaştırmak için yapılmıştır. (B) WB, UC, Yukarıdan aşağıya ve Aşağıdan yukarıya modlarının saflığını değerlendirmek için yapılmıştır. Calnexin: endoplazmik retikulum ile ilişkili protein belirteci; Flagellin, bakterilerden kirletici protein belirteci. CD63: ökaryotik hücre dışı veziküller için transmembran protein belirteci; LTA: Gram pozitif bakterilerden BEV'ler belirteci; LPS, OmpA: Gram negatif bakterilerden BEV belirteçleri. Kısaltmalar: DGC = yoğunluk gradyan santrifüjleme; UC = ultrasantrifüjleme; CBBS = Coomassie Parlak Mavi boyama; WB = batı lekeleme. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| İodiksanol çözeltisi konsantrasyonu (%) | 0,02 M HEPES tamponu | % 50 İodiksanol çalışma çözümü |
| 40 | 1 | 4 |
| 20 | 3 | 2 |
| 10 | 4 | 1 |
Tablo 1: İodiksanol yoğunluk gradyan tamponlarının hazırlanması için oranlar. Tablo, belirli bir konsantrasyonda iyodiksanol çözeltisi elde etmek için 0.02 M HEPES tamponu ve% 50 iyodiksanol çalışma çözeltisi oranını sağlamıştır.
| F1 Turnuvası | F2 (İngilizce) | F3 Sertifikası | F4 (İngilizce) | F5 | F6 | F7 | F8 (İngilizce) | F9 (İngilizce) | F10 Serisi | |
| Yoğunluk (g/mL) | 1.023 | 1.038 | 1.049 | 1.062 | 1.074 | 1.098 | 1.144 | 1.185 | 1.239 | 1.293 |
Tablo 2: İodiksanol bazlı yoğunluk gradyanlı santrifüj sisteminin yoğunluğu. Tablo, iyodiksanol bazlı bir yoğunluk gradyan santrifüj sistemindeki her bir fraksiyonun yoğunluğunu gösterdi. Boş kontrol: PBS tabanlı gradyan sistemi.
| Yukarıdan aşağıya modu | Aşağıdan yukarıya modu | |
| Partikül geri kazanım oranı (%) | 24.08 | 35.69 |
| Protein geri kazanım oranı (%) | 24.5 | 32.45 |
Tablo 3: İki modun partikül ve protein geri kazanım oranları. Tablo, Yukarıdan aşağıya ve Aşağıdan yukarıya modların partikül ve protein geri kazanım oranlarını göstermiştir (Şekil 8).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bakteriyel hücre dışı veziküller (BEV'ler), bakteriler tarafından salgılanan, çok sayıda protein, lipit, nükleik asit ve diğer biyoaktif molekülleri taşıyan, bakterilerin fonksiyonel etkilerine aracılık etmeye katkıda bulunan lipid-çift katmanlı nanopartiküllerdir20. Bağırsaktan elde edilen BEV'lerin inflamatuar bağırsak hastalığı, Crohn hastalığı ve kolorektal kanser gibi hastalıkların gelişiminde rol oynadığı ve ayrıca genel metabolizmayı etkilediği ve bozulmuş bilişsel işleve aracılık ettiği doğrulanmıştır 4,16,17,20,21,22,23,24,25,26 . Şu anda, insan örneklerinden ve dışkısından bağırsak bakteri kaynaklı BEV'ler hakkında tam ve objektif biyolojik bilgi elde etmek, aralarında ilk ve en önemli kilit konunun BEV'lerin karmaşık konakçı ortamdan nasıl izole edileceği olduğu bir dizi faktör tarafından kısıtlanmaktadır.
Ultrasantrifüj (UC), yoğunluk gradyanlı santrifüjleme (DGC) ve boyut dışlama kromatografisi (SEC)13,14,15,16,17 gibi BEV'leri izole etmenin ana yöntemleri hem olumlu hem de olumsuz yönlere sahiptir. Enterferans yapan bazı maddelerin uzaklaştırılmasındaki zorluk ve tutarlı işletim prosedürlerinin olmaması, BEV'lerin daha gerçekçi ve kapsamlı bir analizini ciddi şekilde etkileyen, ayırma işlemi için zorluklar olmaya devam etmektedir. Girişimlerin istenmeyen etkilerini hafifletmek için, birçok çalışma 15,27,28, BEV'lerin, özellikle vücut sıvılarından ayrılmasını sağlamak için yukarıdaki yöntemlerden iki veya daha fazlasını birleştirmiştir, ancak karmaşık prosedürler sonuçların stabilitesini etkileme eğilimindedir. BEV'ler için, diğer kirleticilerle (örneğin, protein agregatları, lipid bileşenleri, ökaryotik hücre dışı veziküller (EEV'ler)15) yoğunluk farkı, günümüzde spesifik bir izolasyon aracı haline gelebilir.
Halen, iyodiksanol, izotonik özellikleri nedeniyle sakarozun yerini alarak, EV'lerin yoğunluk gradyan ayrımı için tercih edilen ortam olarak ortaya çıkmıştır. Bu özellikler, EV morfolojisinin korunmasına ve her bir fraksiyon29 için yoğunluk tahmininin kolaylaştırılmasına katkıda bulunur. Tulkens ve ark. 15 ile uyumlu olarak, çalışmamız% 50 (a / v),% 40 (a / v),% 20 (a / v),%10 (a / v) ve% 0 konsantrasyon gradyan katmanlarında iyodiksanol kullanarak DGC sistemi için aynı konsantrasyonu benimsemiştir. İlk adım, çeşitli konsantrasyonlarda iyodiksanol çözeltileri hazırlamak için HEPES tamponunun kullanılmasını içeriyordu. Tris (-EDTA)-sükroz tamponu ile karşılaştırıldığında, uygun bir HEPES tamponu konsantrasyonu, kendine özgü özellikleri sayesinde santrifüj sistemi içinde uzun süreli pH stabilitesi sağlar. Aynı zamanda, santrifüj sisteminin üst katmanında, yalnızca çözelti hazırlama sırasında bakteriler ve metabolitleri tarafından potansiyel kontaminasyona karşı koruma sağlamak için değil, aynı zamanda DGC öncesi ve sonrası numune tampon tutarlılığını korumak için steril PBS tamponu kullanıldı. Bu, UC'yi takiben peletin PBS tamponu ile yeniden süspanse edilmesini ve DGC'den sonra iyodiksanolün PBS ile değiştirilmesini ve böylece sonuçların karşılaştırmalı bir analizini kolaylaştırmayı içeriyordu. Ayrıca, DGC sistemi içindeki her bir gradyan katmanının hacmi, sırasıyla% 50,% 40,% 20,% 10 ve% 0 (PBS katmanı) iyodiksanol çözeltileri için 3 mL, 3 mL, 3 mL, 3 mL ve 3.5 mL'ye kalibre edildi. Bu strateji, nispeten daha geniş bir yoğunluk aralığı (1.02-1.30 g/mL) oluşturmaya yardımcı olur, potansiyel olarak BEV'lerin diğer enterferans yapan elemanlardan ayrılmasını arttırır, böylece gradyanları karmaşık kontaminasyona sahip diğer vücut sıvılarına uygulanabilir hale getirir.
Protokolün bazı aşamalarının çok önemli olduğunu vurgulamak önemlidir. Özellikle, 1 g dışkı örneğinin minimum 10 mL PBS ile karıştırıldığı Adım 2.2'de özetlenen seyreltme faktörü, aşırı doygunluğun önlenmesi ve deneysel kaynakların korunması için çok önemlidir. Bu koşullar altında, partikül ve protein konsantrasyonu, diğer dışkı özelliklerinin sabit olduğu varsayılarak, genellikle bir numunedeki dışkı kütlesi ile orantılı olarak artar. Gerekirse, tutarlılık, lipoprotein veya kan içeriği gibi faktörleri göz önünde bulundurarak daha fazla analiz yapılabilir. Adım 3.4 sırasında, peleti bozabileceğinden ve potansiyel olarak daha büyük granüllerin 0.22 μm filtrenin membranını tıkamasına neden olabileceğinden, çözeltinin doğrudan dökülmesinden kaçınmak için dikkatli olunmalıdır. Filtre hızla doygun hale gelirse (örneğin, bir filtreden 10 mL'den az geçerse), 12.000 × g'da ek bir santrifüj adımı önerilir. Yoğunluk gradyanlı santrifüjleme bağlamında, gradyan çözeltilerinin hassas bir şekilde hazırlanması, güvenilir sonuçlar için bir ön koşuldur. Ek olarak, tabakalaşmanın bozulmasını önlemek için üst düşük yoğunluklu çözeltileri katmanlarken tüpün dikkatli bir şekilde manipüle edilmesi çok önemlidir ve dikkatli pipetleme ile kabarcıklar ortadan kaldırılmalıdır. Son olarak, fraksiyonları aspire ederken, yanlış BEV dağılımına yol açabilecek herhangi bir aşırı veya eksik aspirasyondan kaçınarak, bunları tüp duvarı boyunca titizlikle çekmek önemlidir. Sıvı seviyesinin düzenli olarak gözlemlenmesi ve tutarlı uygulama bu sorunun hafifletilmesine yardımcı olabilir.
Bu çalışma, çoklu karakterizasyon yöntemleri kullanarak BEV ile zenginleştirilmiş fraksiyonları (F6-F8) belirledi ve iki farklı gradyan ultrasantrifüj modunu araştırdı: Yukarıdan aşağıya ve Aşağıdan yukarıya. F4-F8'deki protein ve partikül konsantrasyonunun ölçülmesi (Şekil 3) ve geri kazanım oranları ile saflığın karşılaştırılması (Şekil 8 ve Şekil 10) yoluyla, Aşağıdan yukarıya santrifüjleme modunun, dışkı örneklerinden BEV'lerin izole edilmesi ve saflaştırılmasında alternatif yönteme göre hem protein hem de partikül seviyelerinde daha yüksek tespit edilen değerler verdiği gözlemlenmiştir. Bu gözlem farklı dinamik süreçleri ima eder. BEV'lerden daha düşük yoğunluğa sahip lipoproteinler gibi veziküler hücre dışı nanopartiküllerin (NVEP'ler)29, numuneler alttan yüklenirse yüzdürme yoğunluklarına ulaşamayabilir (Şekil 6), 15 saatlik DGC'den sonra bile potansiyel olarak şişirilmiş bir geri kazanım oranına neden olabilir (Şekil 9). Bu gözlem, parçacıkların proteinlere oranına dayanan geleneksel saflık tanımının uygulanabilir olup olmadığının değerlendirilmesini gerektirir. Ayrıca, EEV'lerin F5 içinde baskınlık sergilediğini, BEV'lerin ise F6-F7'de belirgin bir şekilde tespit edildiğini belirtmekte fayda var (Şekil 4 ve Şekil 5). Özellikle, bu farklılaşma, Yukarıdan aşağıya modu benimserken vurgulanmış gibi görünüyordu. Bu nedenle, bu mod bu protokol için daha uygun olabilir. Bununla birlikte, potansiyel olarak EEV'ler arasındaki içsel heterojenliği ifade eden F6 içinde Integrin β1'in varlığını vurgulamak önemlidir. Bu yöntemi kan ve idrar gibi diğer vücut sıvılarına uygularken, araştırmacılar örneklerin benzersiz özelliklerini göz önünde bulundurmalıdır. Bu protokolde tanımlanan santrifüj süresi 7 saattir ve diğer çalışmalarda belirtilen süreden önemli ölçüde daha azdır ve bu süre 18 saate kadar çıkabilir. Bu çalışmada aynı modelde yürütülen 15 saatlik bir süre ile protein geri kazanımı ile karşılaştırıldığında (Şekil 9), bu süre gerekli ayırma saflığını elde etmek için yeterli görünmektedir. Bu çalışma koşulları altında, Yukarıdan aşağıya modda partikül geri kazanımı, önceki raporlarla uyumlu olarak (ıslak dışkı gramı başına 1011 BEV) miligram dışkı başına 10 8'e (4,5 × 10 7-1,5 ×10 8) ulaştı15,29,30. Son olarak, boş kontrolden alınan her bir fraksiyonun yoğunluk ölçümleri, BEV'lerin yoğunluğunun 1.09-1.19 g/mL arasında değiştiğini doğruladı, bu da daha önceki araştırmalarla tutarlıdır.
Bu yöntem, etkili olmasına rağmen, diyetlerin, bağırsak fonksiyonunun ve diğer faktörlerin dışkı bileşimi üzerindeki etkisinden dolayı bir sınırlama sunar. Bu değişkenler dışkı kıvamını değiştirebilir, potansiyel olarak bakteri bolluğunu ve BEV iyileşmesini etkileyebilir. Bu nedenle, dışkı özelliklerinin değerlendirilmesine dayalı olarak yapılan ayarlamalarla BEV'lerin31,32'nin izolasyonunu ve saflaştırılmasını standartlaştırmak çok önemlidir. Gelecekteki araştırmalar, idrar kreatinin veya idrar akış hızına benzer şekilde BEV verimini normalleştirmek için bir standart belirlemeye odaklanmalıdır. Böyle bir kıyaslama, metodolojik değerlendirmeyi geliştirebilir ve dışkı BEV'leri ile vücudun fizyolojik ve patolojik durumu arasındaki bağlantıyı aydınlatabilir. Ayrıca, fekal BEV'ler ile çeşitli hastalıklar arasındaki güçlü ilişki, önemli klinik potansiyellerinin altını çizmektedir. Bununla birlikte, bu protokolde öngörülen santrifüj süresi, klinisyenlerin ihtiyaç duyduğu daha rahat ve daha hızlı test talebini karşılamamaktadır. Bu nedenle, belki de 3 saatten daha kısa santrifüj sürelerinin eşdeğer sonuçlar verip veremeyeceğini belirlemek için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır. Her iki santrifüj modunda meydana gelen olayları anlamak için daha fazla araştırmaya da ihtiyaç vardır. Veziküler olmayan bileşenlerin Aşağıdan yukarıya modda F6-F8'de daha zengin olduğu varsayılsa da, gradyan konsantrasyonlarının rafine edilmesi, belirli işlevlere sahip ek alt tiplerin belirlenmesinde faydalı olabilir.
Bu çalışma, DGC kullanılarak BEV'lerin insan dışkısından izolasyonunu ve saflaştırılmasını başarıyla göstermiştir. Strateji, kan, idrar ve tükürük gibi diğer biyolojik örneklere uygulama sözü vererek, araştırmacılara BEV'lerin gizli bilgilerini ortaya çıkarmak için etkili bir yaklaşım sağlayarak potansiyel olarak klinik uygulamaları ilerletiyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çatışan hiçbir çıkar beyan etmemektedir.
Acknowledgments
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'nın (82230080) Anahtar projesi olan Seçkin Genç Akademisyenler için Ulusal Bilim Fonu (82025024) tarafından desteklenmiştir;Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı (2021YFA1300604); Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81871735, 82272438 ve 82002245); Seçkin Genç Akademisyenler için Guangdong Doğa Bilimleri Fonu (2023B1515020058); Guangdong Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (2021A1515011639); Çin'deki Shandong Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı'nın Büyük Devlet Temel Araştırma Geliştirme Programı (ZR2020ZD11); Doktora Sonrası Bilim Vakfı (2022M720059); Güney Tıp Üniversitesi, Nanfang Hastanesi'nin Üstün Gençlik Geliştirme Programı (2022J001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 % (w/v) glutaraldehyde (prepared from 2.5 % stock solution in deionized water) | ACMEC | AP1126 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.3 |
| 1 % (w/v) methylcellulose (prepared from original powder in deionized water) | Sigma-Aldrich | M7027 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.6 |
| 1.5 % (w/v) uranyl acetate (prepared from original powder in deionized water) | Polysciences | 21447-25 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.5 |
| 1000 μL, 200 μL, 10 μL Pipette | KIRGEN | KG1313, KG1212, KG1011 | Transfer the solution |
| 5 % (w/v) bovine serum albumin solution (prepared from the original powder in TBST buffer) | Fdbio science | FD0030 | Used in western blotting for blocking at Step 8.5.6 |
| 5 × loading buffer | Fdbio science | FD006 | Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5.1 |
| 75 % (v/v) alcohol | LIRCON | LIRCON-500 mL | Surface disinfection |
| 96-well plate | Rar | A8096 | Measure the absorbance values |
| Anti-Calnexin antibody | Abcam | ab92573 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-CD63 antibody | Abcam | ab134045 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-CD9 antibody | Abcam | ab236630 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-Flagellin antibody | Sino Biological | 40067-MM06 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-Integrin beta 1 antibody | Abcam | ab30394 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-LPS antibody | Thermo Fisher | MA1-83152 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-LTA antibody | Thermo Fisher | MA1-7402 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-OmpA antibody | CUSABIO | CSB-PA359226ZA01EOD, https://www.cusabio.com/ | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-Syntenin antibody | Abcam | ab133267 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-TSG101 antibody | Abcam | ab125011 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Autoclave | ZEALWAY | GR110DP | Sterilization for supplies and mediums used in the experiment |
| Balance | Mettler Toledo | AL104 | Balance the tube sample-loaded with PBS |
| Bicinchoninic acid assay | Fdbio science | FD2001 | Measure protein content of BEVs at Step 8.2 |
| BioRender | BioRender | https://app.biorender.com | Make the schematic workflow of BEVs isolation and purification showed in Figure 1 |
| Biosafety cabinet | Haier | HR1200- II B2 | Peform the procedures about feces sample handling |
| Centrifuge 5810 R; Rotor F-34-6-38 | Eppendorf | 5805000092; 5804727002, adapter: 5804774000 | Preprocess for BEVs (Step 3) |
| Chemiluminescence Apparatus | BIO-OI | OI600SE-MF | Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12 |
| Cytation 5 | BioTek | F01 | Microplate detector for measuring the absorbance (Step 8.1) and fluorescence (Figure 6) values |
| Dil-labled low density lipoprotein | ACMEC | AC12038 | Definition of distribution of interfering components |
| Electrophoresis equipment | Bio-rad | 1658033 | Used in western blotting for protein separation and transfer at Step 8.5.2, 8.5.3, 8.5.5 |
| Enhanced Chemiluminescence kit HRP | Fdbio science | FD8020 | Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12 |
| Escherichia coli | American Type Culture Collection | ATCC8739 | Isolate BEVs as a positive control. Protocol: Dissolve 25 g of the LB powder in 1 L deionized water, and autoclave. Transfer the 800 μL of preserved Escherichia coli into the medium. Cultivate at 37 °C in the incubator shaker. Then centrifuge at 3, 000 × g for 20 min at 4 °C, 12, 000 × g for 30 min at 4 °C, filter the supernatant through 0.22 μm membrane, and perform ultra-speed centrifugation at 160, 000 × g for 70 min at 4 °C. Pellet defined as crude BEVs from Escherichia coli was suspended in 1.2 mL PBS (Step 3, 4). |
| Falcon tubes 50 mL | KIRGEN | KG2811 | Preprocess for BEVs (Step 3) |
| Feto Protein Staining Buffer | Absci | ab.001.50 | Coomassie brilliant blue staining at Step 8.5.4 |
| Filter paper | Biosharp | BS-TFP-070B | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 (Blotting the solution) |
| Formvar/Carbon supported copper grids | Sigma-Aldrich | TEM-FCF200CU50 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 |
| HEPES powder | Meilunbio | MB6078 | Prepare iodixanol buffers with different concentrations for density gradient centrifugation |
| HRP AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Fdbio science | FDM007 | Western blotting (Secondary Antibody) |
| HRP AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Fdbio science | FDR007 | Western blotting (Secondary Antibody) |
| Incubator shaker | Qiangwen | DHZ-L | Cultivate Escherichia coli |
| Kimwipes™ Delicate Task Wipes | Kimtech Science | 34155 | Wipe the inner wall of the ultracentrifuge tube at Step 4.15 |
| LB broth | Hopebio | HB0128 | Cultivate Escherichia coli |
| Low temperature freezer (-80 °C) | Haier | DW-86L338J | Store the samples |
| Methanol | Alalddin | M116118 | Used in western blotting for activating PVDF membrane at Step 8.5.5 |
| Micro tubes 1.5 mL | KIRGEN | KG2211 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
| Micro tubes 2 mL | KIRGEN | KG2911 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
| Micro tubes 5 mL | BBI | F610888-0001 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
| Microplate reader | Thermo Fisher | Multiskan MK3 | Measure protein content of BEVs at Step 8.2 |
| Millipore filter 0.22 μm | Merck millipore | SLGP033RB | Filtration sterilization; Material: polyethersulfone, PES |
| NaCl | GHTECH | 1.01307.040 | Density gradient centrifugation solution |
| NaOH | GHTECH | 1.01394.068 | Density gradient centrifugation solution (pH adjustment) |
| Optima™ XPN-100 | Beckman Coulter | A94469 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
| OptiPrep™ | Serumwerk Bernburg AG | 1893 | Density gradient centrifugation stock solution |
| Orbital Shaker | Youning | CS-100 | Dissolve feces at Step 2 |
| Phosphate buffered saline | Procell | PB180327 | Dissolve feces at Step 2 |
| Pipettor | Eppendorf | 3120000267, 3120000259 | Transfer the solution |
| Plastic pasteur pipette | ABCbio | ABC217003-4 | Remove supernatant in preprocessing at Step 3.4 |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes | Millipore | ISEQ00010, IPVH00010 | Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5 |
| Prefabricated polyacrylamide gel, 4–20% 15 Wells | ACE | F15420Gel | Used in western blotting for protein separation at Step 8.5.2, 8.5.3 |
| Primary antibody diluent | Fdbio science | FD0040 | Used in western blotting at Step 8.5.8 |
| Protein ladder | Fdbio science | FD0672 | Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5 |
| Rapid protein blotting solution | UBIO | UW0500 | Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5 |
| Rotor SW 32 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 369650 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
| Syringe 20 mL, 50 mL | Jetway | ZSQ-20ML, YCXWJZSQ-50 mL | Transfer buffers amd remove supernatant in preprocessing |
| TBS powder | Fdbio science | FD1021 | Used in western blotting at Step 8.5 |
| Transmission electron microscope (TEM) | Hitachi | H-7650 | Morphological observation for BEVs at Step 8.3 |
| Tween-20 | Fdbio science | FD0020 | Used in western blotting at Step 8.5 |
| Ultracentrifuge tube | Beckman | 326823, 355642 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
| Ultra-clean bench | AIRTECH | SW-CJ-2FD | Peform the procedures about liquid handling |
| Water bath | Bluepard | CU600 | Used for measuring protein content of BEVs at Step 8.2.5 |
| ZetaView | Particle Metrix | S/N 21-734, Software ZetaView (version 8.05.14 SP7) | Nanoparticle tracking analysis (NTA) for measuring the particle size and concentrarion of BEVs at Step 8.4 |
References
- Costello, E. K., et al. Bacterial community variation in human body habitats across space and time. Science. 326 (5960), 1694-1697 (2009).
- Greenhalgh, K., Meyer, K. M., Aagaard, K. M., Wilmes, P. The human gut microbiome in health: establishment and resilience of microbiota over a lifetime. Environmental Microbiology. 18 (7), 2103-2116 (2016).
- de Vos, W. M., Tilg, H., Van Hul, M., Cani, P. D. Gut microbiome and health: mechanistic insights. Gut. 71 (5), 1020-1032 (2022).
- Zhou, P., Yang, D., Sun, D., Zhou, Y. Gut microbiome: New biomarkers in early screening of colorectal cancer. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 36 (5), 24359 (2022).
- Paik, D., et al. Human gut bacteria produce Τ(Η)17-modulating bile acid metabolites. Nature. 603 (7903), 907-912 (2022).
- Parada Venegas, D., et al. Short chain fatty acids (SCFAs)-mediated gut epithelial and immune regulation and its relevance for inflammatory bowel diseases. Frontiers in Immunology. 10, 277 (2019).
- Jiang, C., Li, G., Huang, P., Liu, Z., Zhao, B. The Gut microbiota and Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 58 (1), 1-15 (2017).
- Morais, L. H., Schreiber, H. L. t, Mazmanian, S. K. The gut microbiota-brain axis in behaviour and brain disorders. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 241-255 (2021).
- Kim, J. H., Lee, J., Park, J., Gho, Y. S. Gram-negative and Gram-positive bacterial extracellular vesicles. Seminars in Cell and Developmental Biology. 40, 97-104 (2015).
- Toyofuku, M., Nomura, N., Eberl, L. Types and origins of bacterial membrane vesicles. Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 13-24 (2019).
- Xie, J., Li, Q., Haesebrouck, F., Van Hoecke, L., Vandenbroucke, R. E. The tremendous biomedical potential of bacterial extracellular vesicles. Trends in Biotechnology. 40 (10), 1173-1194 (2022).
- Coumans, F. A. W., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).
- Northrop-Albrecht, E. J., Taylor, W. R., Huang, B. Q., Kisiel, J. B., Lucien, F. Assessment of extracellular vesicle isolation methods from human stool supernatant. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (4), 12208 (2022).
- Park, Y. E., et al. Microbial changes in stool, saliva, serum, and urine before and after anti-TNF-α therapy in patients with inflammatory bowel diseases. Scientific Reports. 12 (1), 6359 (2022).
- Tulkens, J., De Wever, O., Hendrix, A. Analyzing bacterial extracellular vesicles in human body fluids by orthogonal biophysical separation and biochemical characterization. Nature Protocols. 15 (1), 40-67 (2020).
- Tulkens, J., et al. Increased levels of systemic LPS-positive bacterial extracellular vesicles in patients with intestinal barrier dysfunction. Gut. 69 (1), 191-193 (2020).
- Kang, C. S., et al. Extracellular vesicles derived from gut microbiota, especially Akkermansia muciniphila, protect the progression of dextran sulfate sodium-induced colitis. PloS one. 8 (10), 76520 (2013).
- Simonsen, J. B. What are we looking at? Extracellular vesicles, lipoproteins, or both. Circulation Research. 121 (8), 920-922 (2017).
- Correll, V. L., et al. Optimization of small extracellular vesicle isolation from expressed prostatic secretions in urine for in-depth proteomic analysis. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12184 (2022).
- Liang, X., et al. Gut bacterial extracellular vesicles: important players in regulating intestinal microenvironment. Gut Microbes. 14 (1), 2134689 (2022).
- Alberti, G., et al. Extracellular vesicles derived from gut microbiota in inflammatory bowel disease and colorectal cancer. Biomedical papers of the Medical Faculty of the University Palacky, Olomouc, Czech Republic. 165 (3), 233-240 (2021).
- Díez-Sainz, E., Milagro, F. I., Riezu-Boj, J. I., Lorente-Cebrián, S. Effects of gut microbiota-derived extracellular vesicles on obesity and diabetes and their potential modulation through diet. Journal of Physiology and Biochemistry. 78 (2), 485-499 (2022).
- Lajqi, T., et al. Gut microbiota-derived small extracellular vesicles endorse memory-like inflammatory responses in murine neutrophils. Biomedicines. 10 (2), 442 (2022).
- Lee, K. E., et al. The extracellular vesicle of gut microbial Paenalcaligenes hominis is a risk factor for vagus nerve-mediated cognitive impairment. Microbiome. 8 (1), 107 (2020).
- Villard, A., Boursier, J., Andriantsitohaina, R. Bacterial and eukaryotic extracellular vesicles and nonalcoholic fatty liver disease: new players in the gut-liver axis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 320 (4), G485-G495 (2021).
- Wei, S., et al. Outer membrane vesicles enhance tau phosphorylation and contribute to cognitive impairment. Journal of Cellular Physiology. 235 (5), 4843-4855 (2020).
- Bitto, N. J., Kaparakis-Liaskos, M. Methods of bacterial membrane vesicle production, purification, quantification, and examination of their immunogenic functions. Methods in Molecular Biology. 2523, 43-61 (2022).
- Stentz, R., Miquel-Clopés, A., Carding, S. R. Production, isolation, and characterization of bioengineered bacterial extracellular membrane vesicles derived from Bacteroides thetaiotaomicron and their use in vaccine development. Methods in Molecular Biology. 2414, 171-190 (2022).
- Zhang, Q., Jeppesen, D. K., Higginbotham, J. N., Franklin, J. L., Coffey, R. J. Comprehensive isolation of extracellular vesicles and nanoparticles. Nature Protocols. 18 (5), 1462-1487 (2023).
- Iwai, K., Minamisawa, T., Suga, K., Yajima, Y., Shiba, K. Isolation of human salivary extracellular vesicles by iodixanol density gradient ultracentrifugation and their characterizations. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 30829 (2016).
- Vandeputte, D., et al. Stool consistency is strongly associated with gut microbiota richness and composition, enterotypes and bacterial growth rates. Gut. 65 (1), 57-62 (2016).
- Wen, M., et al. Bacterial extracellular vesicles: A position paper by the Microbial Vesicles Task Force of the Chinese Society of Extracellular Vesicles. Interdisciplinary Medicine. 1, 12046 (2023).
