Summary
В этом исследовании описывается метод выделения и очистки бактериальных внеклеточных везикул (БЭВ), обогащенных из фекалий человека с помощью центрифугирования с градиентом плотности (ДГК), определяются физические характеристики БЭВ с точки зрения морфологии, размера частиц и концентрации, а также обсуждаются потенциальные применения подхода ДГК в клинических и научных исследованиях.
Abstract
Бактериальные внеклеточные везикулы (БЭВ) — это нановезикулы, полученные из бактерий, которые играют активную роль в коммуникации бактерии-бактерии и бактерии-хозяина, перенося биологически активные молекулы, такие как белки, липиды и нуклеиновые кислоты, унаследованные от родительских бактерий. БЭВ, полученные из микробиоты кишечника, оказывают воздействие на желудочно-кишечный тракт и могут достигать отдаленных органов, что приводит к значительным последствиям для физиологии и патологии. Теоретические исследования, изучающие типы, количества и роль БЭВ, полученных из фекалий человека, имеют решающее значение для понимания секреции и функции БЭВ из микробиоты кишечника. Эти исследования также требуют совершенствования существующей стратегии по изоляции и очистке БЭВ.
В этом исследовании оптимизирован процесс изоляции и очистки электромобилей путем установления двух режимов центрифугирования с градиентом плотности (DGC): сверху вниз и снизу вверх. Обогащенное распределение БЭВ определяли во фракциях от 6 до 8 (F6-F8). Эффективность подхода оценивалась на основе морфологии частиц, размера, концентрации и содержания белка. Были рассчитаны скорости извлечения частиц и белков, а также проанализировано наличие специфических маркеров для сравнения восстановления и чистоты двух режимов ДГК. Результаты показали, что режим центрифугирования «Сверху вниз» имеет более низкие уровни загрязнения и обеспечивает скорость восстановления и чистоту, аналогичные режиму «Снизу вверх». Время центрифугирования 7 ч было достаточным для достижения концентрации фекальных БЭВ 108/мг.
Помимо фекалий, этот метод может быть применен и к другим типам жидкостей организма с соответствующей модификацией в соответствии с различиями в компонентах и вязкости. В заключение, этот подробный и надежный протокол облегчит стандартизированную изоляцию и очистку БЭВ и, таким образом, заложит основу для последующего мультиомиксного анализа и функциональных экспериментов.
Introduction
Кишечник широко признан органом, содержащим самые многочисленные микробные сообщества в организме человека, причем более 90% бактерий участвуют в колонизации и размножении 1,2. Обширные данные свидетельствуют о том, что микробиота кишечника модулирует микроокружение кишечника и одновременно взаимодействует с дисфункцией отдаленных органов, в первую очередь через нарушение кишечного барьера 3,4. Появляется все больше данных, указывающих на корреляцию между дисбалансом микробиоты кишечника и прогрессированием воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК)5,6, а также когнитивных нарушений через ось кишечник-мозг 5,6,7,8. Бактериальные внеклеточные везикулы (БЭВ), продуцируемые бактериями, играют значительную роль в этих патологических процессах.
БЭВ представляют собой наноразмерные частицы, инкапсулирующие производные бактерий, диаметром от 20 до 400 нм. Было продемонстрировано, что они облегчают взаимодействие между бактериями и их организмами-хозяевами 9,10. Несмотря на свою невидимость, эти частицы привлекают все большее внимание исследователей из-за их предполагаемого широкого применения в качестве диагностических биомаркеров, терапевтических мишеней и средств доставки лекарств11. Человеческие фекалии, часто используемые в качестве биологических образцов для изучения БЭВ, в основном полученные из кишечных бактерий, содержат сложную смесь воды, бактерий, липидов, белков, непереваренных остатков пищи и отслоившихся эпителиальных клеток. Сложный состав фекалий создает проблемы для изоляции и чистоты БЭВ, тем самым препятствуя всестороннему, объективному и реалистичному анализу БЭВ. Таким образом, эффективные стратегии минимизации помех от загрязняющих компонентов и повышения производительности электромобилей стали критически важными проблемами, требующими немедленного внимания.
Существующие стратегии изоляции в значительной степени основаны на таких методах, как сверхвысокоскоростное центрифугирование (UC), центрифугирование с градиентом плотности (DGC) и эксклюзионная хроматография (SEC)12,13,14,15,16,17. В настоящее время ДГК является одним из наиболее широко применяемых методов в области разделения БЭВ, охватывающим два седиментационно-плавающих режима, «сверху-вниз» и «снизу-вверх», которые определяются начальным положением загрузки образца. Эти методы позволяют дифференцировать внеклеточные везикулы (ВВ) от других компонентов на основе различий в размерах и плотности, обеспечивая различную чистоту и скорость восстановления. Предыдущие исследования показали, что стратегии однократного подхода недостаточны для адекватного отделения ВВ от растворимых белков в образцах биологических жидкостей, таких как липопротеин в крови18 и белок Тамма-Хорсфолла в моче19. Кроме того, распределение по размерам эукариотических внеклеточных везикул (ВЭВ) часто пересекается с распределением БЭВ, что обуславливает необходимость дальнейших методологических усовершенствований для оптимизации выхода БЭВ. Следовательно, дальнейшее изучение БЭВ зависит от разработки эффективных методологий сепарации и очистки. Примечательно, что Tulkens et al.15 использовали ортогональную биофизическую стратегию для отделения фекальных БЭВ от ВЭЭ, в которой время центрифугирования в режиме ДГК «снизу вверх» составляло до 18 ч. В отличие от этого, это исследование сократило его до 7 ч, что значительно сэкономило время градиентно-ультрацентрифугирования и упростило процесс.
В настоящем исследовании мы выделили и очистили фекальные БЭВ с использованием двух режимов ДГК в оптимизированных буферных условиях после обогащения БЭВ диапазоном дифференциальных скоростей центрифугирования, от низкой до чрезвычайно высокой. Оценки, основанные на морфологии, размере частиц и концентрации, показали похвальную эффективность этого усовершенствованного метода. Это исследование может послужить основой для будущих исследований, расширяя его применение в более широкой области и предлагая понимание гетерогенности БЭВ в организме человека. Это также способствует стандартизации методов разделения и анализа электромобилей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Комитет по этике больницы Наньфан Южного медицинского университета санкционировал это исследование, которое проводилось с информированного согласия участников. Все методы, используемые в настоящем документе, соответствуют стандартным операционным рекомендациям, предоставленным Международными стандартами микробиома человека (IHMS: http://www.microbiome-standards.org/). Все последующие процедуры по работе с жидкостями должны выполняться в шкафу биобезопасности или на сверхчистом стенде.
1. Сбор и аликвотирование проб фекалий
- Раздайте пробоотборник кала, запечатанный пакет и коробку со льдом, а также предоставьте участникам подробные инструкции о том, как получить и сохранить образцы.
- Проинструктируйте каждого участника собрать образец фекалий с помощью предоставленного пробоотборника и транспортировать его в лабораторию при температуре 4 °C в течение 24 часов.
- При поступлении в лабораторию используйте стерильную ложку для аликвотирования менее 3,5 г кала в предварительно взвешенную центрифужную пробирку объемом 50 мл. Отметьте вес образца фекалий на пробирке для последующих процедур предварительной обработки.
ТОЧКА ПАУЗЫ: Если немедленная обработка образцов невозможна, выделите образец для длительного хранения при температуре -80 °C после соответствующей записи.
2. Подготовка образцов кала
- Охладите 500 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) при температуре 4 °C. Отфильтруйте предварительно охлажденный PBS через фильтр из полиэфирсульфона (PES) 0,22 мкм с помощью шприца объемом 50 мл в десять центрифугирующих пробирок по 50 мл.
- Положите на лед две пробирки по 50 мл, каждая из которых содержит 3,5 г образцов фекалий. Добавьте 35 мл PBS в каждую пробирку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рассчитайте необходимое количество PBS для растворения фекалий, обеспечив максимальную концентрацию образца 10% (w/v). При обработке дополнительных образцов при необходимости используйте больше пробирок. - Встряхните образцы при 300 об/мин в течение 2 ч при 4 °C или поместите их на 8 ч по крайней мере при 4 °C до тех пор, пока кал полностью не станет полностью взвешенным.
3. Центрифугирование с дифференциальной скоростью
- Охладите высокоскоростную охлаждаемую центрифугу до 4 °C.
- Отрегулируйте вес двух пробирок, содержащих образцы, подготовленные на шаге 2.3, с помощью PBS до достижения общего веса 0,1 г.
- Центрифугируют образцы при 3 000 × г в течение 20 мин при 4 °C.
- Осторожно пипетируйте надосадочную жидкость в две чистые центрифужные пробирки объемом 50 мл, оставляя примерно 1 мл над гранулой. Используйте для этого процесса одноразовую пластиковую пипетку Пастера.
- Отрегулируйте вес двух пробирок с помощью PBS, чтобы общий вес не ± 0,1 г.
- Центрифугируют перенесенную надосадочную жидкость при 12 000 × г в течение 30 мин при 4 °С.
- Аспирировать надосадочную жидкость с помощью шприца объемом 20 мл, извлечь иглу шприца и отфильтровать ее через фильтры 0,22 мкм в пробирки по 50 мл. На этом этапе объем надосадочной жидкости должен составлять примерно 30 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если после центрифугирования 12 000 × г все еще видно значительное количество примесей, необходимо повторить стадию центрифугирования при 12 000 × г в течение 30 мин при 4 °C. Несоблюдение этого требования может привести к значительной потере электромобилей из-за закупорки пор во время фильтрации.
4. Сверхскоростное центрифугирование
- Очистите ротор и ковш, протерев их 75% спиртом, чтобы удалить остаточные загрязнения.
- Поместите ультрацентрифужную пробирку объемом 38,5 мл в держатель пробирки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите подходящую ультрацентрифужную пробирку в зависимости от объема образца. Избегайте ультрафиолетового излучения и неподходящих химических реагентов для стерилизации центробежных пробирок, как указано в руководстве по эксплуатации. - Перелейте примерно 30 мл отфильтрованной фекальной надосадочной жидкости из этапа 3.7 в ультрацентрифужную пробирку.
- Наполните пробирку с ультрацентрифугой примерно 8 мл PBS, оставляя зазор 3 мм от отверстия пробирки.
- Поместите две ультрацентрифужные пробирки с образцами в противоположные ультрацентрифугирующие ведра, например, ведро 1 соответствует 4 (1-4), 2-5, 3-6.
- Отрегулируйте вес двух ведер с помощью PBS, чтобы общий вес не ± 0,005 г.
- Установите все ковши на ротор, независимо от того, загружены ли трубы.
- Запустите вакуум и центрифугируйте образцы при 160 000 × г в течение 70 мин при 4 °C.
- Отпустите вакуум камеры и откройте дверцу, как только на главной странице прибора отобразится сообщение Готово.
- Снимите ротор с ультрацентрифуги.
- Переместите ведра с ротора на стойку и извлеките трубки с помощью кусачек.
- Выбросьте надосадочную жидкость, которая будет содержать видимые коричневые гранулы на дне.
- Ресуспендируйте гранулы, многократно пипетируя их вверх и вниз с помощью пипетки объемом 1 000 мкл с 1 мл предварительно охлажденного (4 °C) PBS до полного суспензии. Наполните пробирку примерно 37 мл PBS, оставляя зазор 3 мм от отверстия.
- Выполните еще одно ультрацентрифугирование в соответствии с шагами 4.5-4.11 при 160 000 × г в течение 70 мин при 4 °C, чтобы удалить частично присоединенные загрязняющие компоненты со стенок пробирки.
- Выбросьте надосадочную жидкость, переверните две ультрацентрифужные пробирки на 5 минут и удалите остатки раствора с внутренней стенки с помощью стеклоочистителей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Очистка внутренней стенки сводит к минимуму помехи от остаточного загрязнения, прилипшего к стенке пробирки ультрацентрифуги. Выбирайте стеклоочистители, которые не будут влиять на анализ BEV, особенно в отношении размера частиц. - Ресуспендируйте гранулы в каждой пробирке, пипетируя их вверх и вниз 1,2 мл предварительно охлажденного (4 °C) PBS с помощью пипетки на 1 000 мкл.
- Перелейте 1,2 мл раствора PBS/BEV из одной ультрацентрифужной пробирки в чистую микропробирку объемом 1,5 мл.
ТОЧКА ПАУЗЫ: Раствор PBS/BEV, собранный из одной ультрацентрифужной пробирки, может перейти к шагу 6. Храните раствор из другой пробирки при температуре -80 °C.
5. Приготовление раствора для центрифугирования с градиентом плотности
- Приготовление 0,02 м буфера HEPES
- Смешайте 0,477 г порошка HEPES и 0,8 г NaCl с 90 мл автоклавной деионизированной воды.
- Отрегулируйте pH до 7,2, добавив 1 М гидроксид натрия (NaOH). Довести объем до 100 мл деионизированной водой и отфильтровать раствор через мембраны PES 0,22 мкм.
ВНИМАНИЕ: Гидроксид натрия является сильной едкой щелочью. Операторы должны бережно обращаться с ним и подготавливать его в вытяжном шкафу.
- Приготовление буфера градиента плотности
- Рассчитайте необходимый объем каждого буфера градиента плотности исходя из количества ультрацентрифужных пробирок для центрифугирования градиента плотности (шаг 6) (в этом протоколе объемы для 60%, 50%, 40%, 20% и 10% градиентных растворов составляли 2,5 мл, 3 мл, 6 мл, 6 мл и 6 мл соответственно).
- Для приготовления 50%-ного (массового) рабочего раствора йодиксанола смешают 0,02-миллионный буфер HEPES и 60%-ный (массовый/объемный) исходный раствор йодиксанола в объемном соотношении 1:5 (0,5 мл:2,5 мл).
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте одноразовый шприц объемом 20 мл для удаления исходного раствора йодиксанола и избегайте введения воздуха. - Для приготовления йодиксаноловых буферов с различными концентрациями смешайте 50%-ный рабочий раствор йодиксанола из стадии 5.2.2 с буфером HEPE, полученным на стадии 5.1, с помощью пипетки объемом 1 000 мкл в соответствии с пропорциями, указанными в таблице 1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаг 5 на ультрачистом столе с выключенным светом. Открытый исходный раствор йодиксанола хранить в холодильнике при температуре 4 °C, чтобы предотвратить рост бактерий. Храните раствор йодиксанола и буфер HEPES в защищенном от света месте.
6. Создание системы градиентного центрифугирования плотности
- Нисходящий режим DGC
- Смешайте 500 мкл раствора PBS/BEV, выделенного на этапе 4, с 3 мл PBS. Осторожно перемешайте растворы с помощью пипетки на 1 000 мкл, чтобы получить 3,5 мл раствора PBS/BEV.
- Поместите ультрацентрифужную пробирку объемом 31 мл на пенопластовую пластину с отверстиями и пометьте ее как «↓».
- Вертикально добавьте 3 мл 50% раствора йодиксанола на дно пробирки с помощью пипетки на 1 000 мкл.
- Наклоните трубку под углом 70° и расположите держатель трубки или другую опору немного выше уровня пенопластовой пластины, ниже отверстия трубки.
- Добавьте 3 мл 40% раствора йодиксанола поверх 50% раствора йодиксанола с помощью пипетки на 1000 мкл.
- Добавьте 3 мл 20% раствора йодиксанола поверх 40% раствора йодиксанола с помощью пипетки объемом 1 000 мкл.
- Добавьте 3 мл 10% раствора йодиксанола поверх 20% раствора йодиксанола с помощью пипетки на 1000 мкл.
- Добавьте 3,5 мл раствора PBS/BEV из этапа 6.1.1 поверх 10% раствора йодиксанола с помощью пипетки объемом 1 000 мкл.
- Аккуратно верните трубки в вертикальное положение.
ПРИМЕЧАНИЕ: После пипетирования должно быть видно расслоение.
- Восходящий режим DGC
- Поместите ультрацентрифужную пробирку объемом 31 мл на пенопластовую пластину с отверстиями и обозначьте ее как «↑».
- Вертикально добавьте 2,5 мл 60% раствора йодиксанола на дно пробирки. Осторожно смешайте его с 500 мкл раствора PBS/BEV, выделенного на этапе 4, с помощью пипетки на 1 000 мкл для получения 3 мл 50% раствора йодиксанола/БЭВ.
- Наклоните трубку под углом 70° и расположите держатель трубки или другую опору немного выше уровня пенопластовой пластины, ниже отверстия трубки.
- Добавьте 3 мл 40% раствора йодиксанола поверх 50% раствора йодиксанола/БЭВ с помощью пипетки объемом 1 000 мкл.
- Добавьте 3 мл 20% раствора йодиксанола поверх 40% раствора йодиксанола с помощью пипетки на 1000 мкл.
- Добавьте 3 мл 10% раствора йодиксанола поверх 20% раствора йодиксанола с помощью пипетки на 1000 мкл.
- Добавьте 3,5 мл PBS поверх 10% раствора йодиксанола с помощью пипетки объемом 1000 мкл.
- Аккуратно верните трубки в вертикальное положение.
- К этому моменту осталось 200 мкл суспензии, полученной на стадии 4.17, которую впоследствии можно проанализировать как группу, названную «UC».
ПРИМЕЧАНИЕ: При переносе растворов на шаге 6 всегда держите наконечник пипетки напротив стенки пробирки ультрацентрифуги перпендикулярно оси пробирки.
7. Градиентное центрифугирование и сбор фракций
- Отрегулируйте вес двух пробирок с помощью PBS, чтобы достичь общего веса в пределах ± 0,005 г.
- Поместите пробирки в ведра в соответствии с шагом 4.5 и подвергните их центрифугированию при 160 000 × г в течение 7 ч при 4 °C.
- Соберите фракции с помощью пипетки (1000 мкл) сверху вниз у боковой стенки в следующем порядке: 3 мл, 2 мл, 1 мл, 1 мл, 1 мл, 1 мл, 1 мл, 1 мл, 1,5 мл и 3 мл в ультрацентрифужную пробирку объемом 38,5 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за тем, чтобы линия прямой видимости находилась на том же уровне, что и поверхность жидкости. - Проводят ультрацентрифугирование для каждой фракции, полученной на стадии 7.3, согласно стадии 4 при 160 000 × г в течение 70 мин при 4 °С.
- Удалите надосадочную жидкость и переверните пробирки ультрацентрифуги на 5 минут.
- Ресуспендант гранул в 200 мкл предварительно охлажденного (4 °C) PBS с помощью пипетки на 200 мкл.
- Перелейте раствор PBS/BEV в чистую микропробирку объемом 1,5 мл.
- Разметьте дроби от F1 до F10 и проанализируйте их на основе шага 8.
ТОЧКА ПАУЗЫ: Если образцы, полученные на этапе 7.8, не могут быть обработаны немедленно, храните их при температуре -80 °C.
8. Характеристика и количественный анализ собранных фракций
- Определите значения поглощения (наружный диаметр 340 нм) каждой фракции с помощью микропланшетного детектора с пустым регулятором для расчета их соответствующей плотности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Замените решение PBS/BEV (шаги 6.1.1 и 6.2.2) на PBS, чтобы установить пустой элемент управления.- Готовят по 100 мкл 0%, 5%, 10%, 12,5% и 20% раствора йодиксанола, разбавленного 0,02 М HEPES на основе 50% исходного раствора (этап 5.2.2) в качестве стандартов, соответствующих плотностям 1,0058 г/мл, 1,0318 г/мл, 1,058 г/мл, 1,0708 г/мл и 1,111 г/мл соответственно.
- Добавляют по 50 мкл каждой фракции из контрольной заготовки (приготовленной на стадии 7.3) и 50 мкл каждого стандартного раствора (приготовленного на стадии 8.1.1) для дублирования лунок 96-луночного планшета.
- Установите длину волны 340 нм, измерьте оптическую плотность конечной точки и вычислите плотность каждой фракции.
- Определите F4-F9 как диапазон фракций BEV на основе их плотности.
- Определите концентрацию белка фракций БЭВ с помощью анализа бицинхониновой кислоты (BCA).
- Разбавьте вещество в десять раз в PBS, предусмотренном производителем, для приготовления стандартного белкового раствора 0,5 мкг/мкл.
- Добавьте стандартный белковый раствор (приготовленный на этапе 8.2.1) с различными объемами в соответствии с инструкциями по реагенту и добавьте каждую лунку 96-луночного планшета PBS до общего объема 20 мкл.
- Добавьте в каждую лунку по 20 мкл образцов, подготовленных на стадии 7.8, и образцов, оставшихся после ЯК, определенных на стадии 6.2.9.
- Смешайте реагенты А и В в соотношении 50:1, и перенесите по 200 мкл в каждую лунку.
- Инкубируйте планшет на водяной бане с температурой 37 °C в течение 30 минут.
- Измерьте значение абсорбции с помощью микропланшетного ридера, рассчитайте концентрацию белка (мкг/мкл) и определите содержание белка (мкг) в образцах на основе стандартной кривой (x: оптическая плотность; y: концентрация белка), полученной из значений стандартных растворов, разбавленных на этапе 8.2.2.
- Охарактеризовать фракции БЭВ, определенные на шаге 8.1.4, с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) для проверки наличия БЭВ. Все нижеперечисленные процедуры следует выполнять на льду.
- Нанести по 10 мкл каждой выделенной фракции F4-F9 из стадии 7.8 и образцов, оставшихся после ЯК, определенных в шаге 6.2.9, на медные сетки на основе Formvar/Carbon в течение 20 минут и промокнуть фильтровальной бумагой.
- Промойте образцы 100 мкл PBS три раза по 1 минуте и промокните фильтровальной бумагой.
- Зафиксируйте образцы 100 мкл 1%-ного (массового) глутарового альдегида в течение 5 мин и промокните фильтровальной бумагой.
- Промойте решетки 100 мкл PBS десять раз по 2 минуты и промокните фильтровальной бумагой.
- Окрасьте решетки 50 мкл 1,5% (по массе) уранилацетата в течение 10 минут и промокните фильтровальной бумагой.
ВНИМАНИЕ: Уранилацетат радиоактивен и чрезвычайно токсичен при контакте с кожей или вдыхании. Работайте с растворами с уранилацетатом в вытяжном шкафу и соблюдайте соответствующие меры безопасности. - Переложите сетки на 1%-ную (массовую) каплю метилцеллюлозы на 5 минут и промокните фильтровальной бумагой.
- Храните высушенные на воздухе решетки в темном, непыльном месте до наблюдения.
- Захват изображений и их анализ с помощью ПЭМ.
- Охарактеризуйте фракции BEV, определенные на шаге 8.1.4, с помощью анализа отслеживания наночастиц (NTA) для подсчета количества частиц.
- Откалибруйте систему, используя частицы полистирола с длиной волны 110 нм.
- Промойте пулу с пробами с помощью PBS.
- Разбавляют пробы из различных фракций, полученных на стадии 7.8, и образцы, оставшиеся после ЯК, определенного на стадии 6.2.9, до концентрации в диапазоне 105-10 9 частиц/мл с оптимизированной концентрацией 107 частиц/мл.
- Запись и анализ в 11 положениях с тремя повторениями, поддерживая температуру около 23-30 °C.
- Анализ содержания белка в образцах методом окрашивания кумасси бриллиантовым синим цветом (CBBS) и вестерн-блоттингом (WB).
- Разбавляют образцы БЭВ из различных фракций, полученных на стадии 7.8, и образцы, оставшиеся после ЯК, определенных на стадии 6.2.9, с помощью PBS и 5 × загрузочного буфера до конечной концентрации 0,5 или 1 мкг/мкл, если требуется количественное определение, обеспечивая достаточную загрузку образца в 20 мкл (10 мкг или 20 мкг) каждой лунки на стадии 8.5.2. Образцы кипятят при температуре 95 °C в течение 10 мин.
- Соберите готовый полиакриламидный гель в резервуар для электрофореза и перенесите образцы в лунки.
- Проводят вертикальный электрофорез со следующими параметрами: 160 В в течение 50 мин.
- Окрасьте гель в растворе Coomassie brilliant blue в течение 1 ч, промойте в деионизированной воде до тех пор, пока синий фон не посветлеет, и сделайте снимки на камеру.
- Проводят процедуры протеинового блоттинга для других гелей со следующими параметрами: 400 мА в течение 20 мин.
- Заблокируйте промокательные мембраны 5%-ным раствором BSA в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Промойте мембраны в буфере TBST три раза по 5 минут каждый.
- Инкубируют мембраны с первичными антителами (маркеры БЭВ: ЛПС, ОМПА, ЛТА; маркеры ЭРВ: CD63, CD9, TSG-101, синтенин, интегрин β1; Другие маркеры загрязнения: Флагеллин, Кальнексин) в течение 8-12 ч при 4 °C.
- Промыть мембраны в буфере TBST три раза по 10 мин каждый.
- Инкубируют мембраны со вторичными антителами в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Выполните шаг 8.5.9.
- Разработайте блоттинг с помощью хемилюминесцентного аппарата.
- Замените раствор PBS/BEV (этап 6.1.1 и этап 6.2.2) на БЭВ из Escherichia coli для установления положительного контроля (см. Таблицу материалов для процедуры выделения сырых E. coli-BEV) и проведите все вышеуказанные эксперименты для определения характеристик БЭВ.
ТОЧКА ПАУЗЫ: Определите F6-F8 как распределение фракций, обогащенных БЭВ, на основе результатов описанной выше характеристики фекальных БЭВ и используйте этот суженный диапазон для последующего анализа.
- Рассчитайте скорость восстановления в пересчете на частицы и белки, чтобы оценить эффективность двух режимов DGC. Результаты ниже представлены в процентном соотношении.
- Рассчитайте скорость восстановления частиц в режиме Top-down: общее количество частиц в F6-F8/частиц после UC, определенное на шаге 6.2.9.
- Рассчитайте скорость восстановления частиц в режиме «снизу вверх»: общее количество частиц в F6-F8/частиц после UC, определенное на шаге 6.2.9.
- Рассчитайте скорость восстановления белков в нисходящем режиме: общее содержание белка в F6-F8 (мкг)/содержание белка после ЯК, определенное на шаге 6.2.9 (мкг).
- Рассчитайте скорость восстановления белков в режиме «Снизу вверх»: общее содержание белка в F6-F8 (мкг)/содержание белка после ЯК, определенное в шаге 6.2.9 (мкг).
- Рассчитайте соотношение частиц/белков для оценки чистоты, традиционно определяемой для UC и двух режимов DGC, и все приведенные ниже результаты были представлены в процентах.
- Соотношение частиц/белков после ЯК определено в шаге 6.2.9: частицы после ЯК/содержание белка после ЯК (мкг).
- Соотношение частиц/белков в нисходящем режиме: общее количество частиц в F6-F8/содержание белка в F6-F8 (мкг).
- Соотношение частиц/белок в режиме «снизу вверх»: общее количество частиц в F6-F8/содержание белка в F6-F8 (мкг).
- Выберите наиболее подходящий режим центрифугирования (в протоколе был выбран режим сверху вниз) для очистки фекальных БЭВ и последующего анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Определение распределения фракций, обогащенных BEV
Для определения распределения фракций, обогащенных внеклеточными везикулами бактерий (БЭВ), был установлен холостой контроль для измерения значений абсорбции при ОД 340 нм, а плотность каждой фракции рассчитывалась на основе измерений и рекомендаций по йодиксанолу (шаг 8.1). В таблице 2 представлены результаты измерения плотности, демонстрирующие, что фракции от F4 до F9 показали плотность в диапазоне, обычно связанном с внеклеточными везикулами. Этот вывод позволил предположить, что большинство электромобилей были изолированы в этих фракциях, что привело к определению F4-F9 как приблизительного диапазона для электромобилей. С помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) были охарактеризованы морфологические особенности фекальных БЭВ, выделенных во фракциях F4-F9, как показано на рисунке 1 . На ПЭМ-изображениях (рис. 2) выявлено наличие классических чашеобразных структур, характерных для БЭВ. Для определения количества частиц и концентрации белка были проведены анализ отслеживания наночастиц (NTA) и анализ бисинхониновой кислоты (BCA) соответственно, что позволило дополнительно оценить скорость извлечения и чистоту. На рисунке 3 показаны концентрации белка и частиц для каждой фракции, что указывает на то, что F6 и F7 показали самые высокие концентрации, за ними следуют F5 и F8. Затем были проведены окрашивание по шкале Кумасси (CBBS) и вестерн-блоттинг (WB) для обеспечения общего анализа белка. Результаты CBBS согласуются с данными о концентрации белка, при этом F6 и F7 демонстрируют наиболее интенсивные полосы (рис. 4). Для подтверждения распределения БЭВ в в качестве положительного контроля использовали внеклеточные везикулы, полученные из Escherichia coli (см. определение в шаге 8.5.13). Процедуры изоляции и очистки выполнялись в соответствии с этапами, описанными в Таблице материалов и вышеупомянутых разделах протокола (шаги 3, 4). Анализ WB также подтвердил наличие белка внешней мембраны А (OmpA), основного компонента внешней мембраны бактерий и специфического маркера для БЭВ, во фракциях F6-F8. На основании этих результатов фракции F6-F8 были определены как фракции, обогащенные BEV, пригодные для последующих экспериментов и анализа.
Проверка диапазона представления интерференционных составляющих
Эукариотические внеклеточные везикулы (ВЭВ), которые обладают тем же размером и плотностью, что и БЭВ, были идентифицированы как основная помеха при анализе БЭВ. Чтобы решить эту проблему, три белка EEV были исследованы во фракциях 5-8 как в режиме «сверху вниз», так и в режиме «снизу вверх» со временем центрифугирования 7 ч и 15 ч. CD63, трансмембранный белок, ассоциированный с ВВ, был преимущественно обнаружен в F5, в то время как маркер БЭВ ЛПС был обогащен фракциями 6-7. Эта закономерность наблюдалась в обоих режимах, хотя в режиме «снизу вверх» наблюдалась небольшая полосчатость CD63-EEV в F7. Однако другие маркеры EEV, CD9 и TSG-101, не показывали видимых сигналов в этих фракциях, независимо от режимов или времени центрифугирования. В независимом экспериментальном исследовании антитела, нацеленные на синтенин и интегрин β1, были использованы для определения обогащения различных белковых маркеров, присущих ВЭЭ, в фракциях 5-8. Синтенин был обнаружен в пределах F5, особенно в рамках нисходящего подхода, в то время как присутствие интегрина β1 было обнаружено в пределах F6 (рис. 5). Для дальнейшей оценки присутствия интерферирующих частиц в систему градиента плотности вводили меченый Дилом липопротеин низкой плотности (Дил-ЛПНП) и измеряли интенсивность флуоресценции по всем фракциям. В нисходящем режиме фракции 1-4 показали относительно более высокие значения флуоресценции, в то время как в восходящем режиме F1-F6 показали более высокую интенсивность (рис. 6).
Оценка скорости извлечения и чистоты двух режимов DGC по концентрации, размеру частиц и маркерам BEV
После идентификации фракций F6-F8 как фракций, обогащенных BEV, были оценены коэффициенты извлечения и чистота двух режимов центрифугирования с градиентом плотности (DGC). Сравнивались размеры частиц фракций, обогащенных BEV, полученных только в режиме «Сверху вниз», «Снизу вверх» и только при ультрацентрифугировании (УК). Наблюдаемые размеры частиц в обоих режимах центрифугирования варьировались от 90 до 300 нм, что соответствует определенному диаметру БЭВ (рис. 7). Затем были рассчитаны скорости извлечения частиц и белков в двух режимах на основе концентраций частиц и белков до и после ДГК (таблица 3 и рисунок 8). Примечательно, что режим «снизу вверх» показал более высокие показатели восстановления по сравнению с другим режимом. В отдельной экспериментальной группе оценивали извлечение белка в двух режимах при разном времени центрифугирования 7 ч и 15 ч. Важно отметить, что не было статистически значимой разницы в содержании белка во фракциях F6-F8 после ДГК между двумя временами центрифугирования, независимо от используемого градиентного режима (рис. 9). Соотношение частиц/белков было рассчитано для приблизительной оценки чистоты в двух режимах. Данные не показали существенной разницы в чистоте между режимами. Кроме того, для дальнейшего сравнения чистоты были проведены окрашивание по шкале Кумасси (CBBS) и вестерн-блоттинг (WB) с акцентом на три маркера БЭВ (ЛПС, ОМПА и ЛТА), один маркер ЭВ (CD63) и два контаминирующих маркера (Calnexin, Flagellin). Результаты продемонстрировали частичное снижение интерферирующих веществ после ДГК, при этом ЛПС и Омпа показали более заметное присутствие в обоих режимах ДГК по сравнению с ЯК по отдельности (рис. 10).
Рисунок 1: Схематический рабочий процесс изоляции и очистки электромобилей. Сокращения: БЭВ = бактериальные внеклеточные везикулы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Репрезентативные ПЭМ-изображения фракций BEV. (A) ПЭМ-изображения БЭВ, выделенных после ЯК. (B) ПЭМ-изображения электромобилей, изолированных после ДГК, с использованием нисходящего режима. (C) ПЭМ-изображения БЭВ, изолированных после ДГК, в режиме «снизу вверх». Все изображения были представлены в согласованном масштабе 200 нм. Сокращения: ПЭМ = просвечивающий электронный микроскоп; БЭВ = внеклеточные пузырьки бактерий; UC = ультрацентрифугирование; DGC = центрифугирование с градиентом плотности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Концентрация белка и частиц фракций БЭВ после режимов ДГК «Сверху вниз» и «Снизу вверх». Концентрация белка фракций БЭВ определялась с помощью BCA и представлена серыми столбцами. Концентрация частиц была измерена с помощью NTA и представлена синими столбцами. Сокращения: БЭВ = бактериальный внеклеточный везикул; DGC = центрифугирование с градиентом плотности; BCA = анализ бицинхониновой кислоты; NTA = анализ отслеживания наночастиц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Определение фракций, обогащенных BEV. (A) CBBS была проведена для определения фракций, обогащенных фекальными БЭВ как в режиме «сверху вниз», так и в режиме «снизу вверх». (B) ВВ, полученные из Escherichia coli , были выделены, очищены и использованы в качестве положительного контроля в ВБ для подтверждения присутствия и распространения БЭВ. OmpA: Белок внешней мембраны А, маркер БЭВ. Сокращения: БЭВ = бактериальный внеклеточный везикул; CBBS = окрашивание кумасси в блестящий синий цвет; ВВ = внеклеточные везикулы; WB = вестерн-блоттинг. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Подтверждение распределения EEV. Вестерн-блоттинг-анализ фракций 5-8, полученных в режимах DGC «Сверху вниз» и «Снизу вверх» с различной длительностью ультрацентрифугирования градиента плотности, 7 ч (А) и 15 ч (В). Было проведено независимое исследование, посвященное F5-F8 в результате 7-часового периода центрифугирования, как показано в (C) и (D). Выбранные маркеры включали маркеры, ассоциированные с БЭВ (ЛПС) и ВЭЭ (CD63, CD9, TSG-101, Syntenin, Integrin β1). Сокращения: DGC = центрифугирование с градиентом плотности; БЭВ = бактериальный внеклеточный везикул; ВЭЛ = внеклеточный везикула эукариот. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Распределение липопротеидов низкой плотности. Меченый дилом липопротеин низкой плотности (Дил-ЛПНП), считающийся маркером контаминации, добавляли в градиентной системе в концентрации 10 мкг как в нисходящем, так и в восходящем режимах. Dil-LDL заменил решение PBS/BEV (этапы 6.1.1 и 6.2.2) для создания модели обнаружения . Интенсивность флуоресценции каждой фракции измеряли с помощью микропланшетного детектора с длиной волны возбуждения/излучения 549/565 нм. Аббревиатура: БЭВ = бактериальный внеклеточный пузырь. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Размеры частиц фракций, обогащенных BEV. (A) Гранулометрический состав сырых БЭВ, полученных после УК. (B) Распределение частиц фракций, обогащенных BEV (F6-F8), по размерам, полученное в режиме центрифугирования с градиентом плотности сверху вниз (DGC). (C) Гранулометрический состав фракций, обогащенных BEV (F6-F8), был получен с использованием режима Bottom-up DGC. NTA была предпринята для количественной оценки размеров частиц. Коэффициенты разбавления, используемые для панелей (A-C), составляли 10 000, 2 000 и 5 000 соответственно, с последующими результатами, откалиброванными. Сокращения: БЭВ = бактериальный внеклеточный везикул; UC = ультрацентрифугирование; DGC = центрифугирование с градиентом плотности; NTA = анализ отслеживания наночастиц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 8: Скорость извлечения белка и частиц в режимах DGC «сверху вниз» и «снизу вверх». (A) Скорость восстановления белка в двух режимах, рассчитанная как отношение концентрации белка после и до ДГК (ЯК). (B) Скорость извлечения частиц в обоих режимах рассчитывается по соотношению концентраций частиц после и до ДГК (UC). (C) Соотношение частиц/белков в UC, нисходящем и восходящем режимах. ±Статистический анализ был выполнен с использованием двустороннего непарного t-критерия для панелей А и В и однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с использованием критерия Тьюки post hoc для панели С. Существенных различий не наблюдалось. Сокращения: DGC = центрифугирование с градиентом плотности; UC = ультрацентрифугирование. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 9: Сравнение извлечения белка на основе нисходящего и восходящего режимов DGC с использованием различных времен ультрацентрифугирования, связанных с плотностью. Скорость извлечения белка во фракциях F6-F8, полученных градиентным ультрацентрифугированием в течение 7 ч и 15 ч, оценивали в независимых экспериментах с использованием режимов «сверху вниз» и «снизу вверх». Данные представлены в виде среднего ± SEM. Статистический анализ проводили с использованием двухфакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с критерием наименьшей значимой разницы Фишера. Существенных различий не наблюдалось. Сокращения: DGC = центрифугирование с градиентом плотности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 10: Оценка чистоты нисходящего и восходящего режимов DGC . (A) CBBS был проведен для сравнения распределения белков в UC, Top-down и Bottom-up. (B) WB был проведен для оценки чистоты UC, нисходящего и восходящего режимов. Кальнексин: эндоплазматический ретикулум-ассоциированный белковый маркер; Флагеллин, загрязняющий белковый маркер от бактерий. CD63: трансмембранный белковый маркер внеклеточных везикул эукариот; LTA: маркер БЭВ грамположительных бактерий; ЛПС, Омпа: маркеры БЭВ грамотрицательных бактерий. Сокращения: DGC = центрифугирование с градиентом плотности; UC = ультрацентрифугирование; CBBS = окрашивание Coomassie Brilliant Blue; WB = вестерн-блоттинг. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
| Концентрация раствора йодиксанола (%) | 0,02 м буфер HEPES | 50% рабочий раствор йодиксанола |
| 40 | 1 | 4 |
| 20 | 3 | 2 |
| 10 | 4 | 1 |
Таблица 1: Соотношения для приготовления буферов градиента плотности йодиксанола. В таблице приведено соотношение 0,02 М буфера HEPES и 50% рабочего раствора йодиксанола для получения определенной концентрации раствора йодиксанола.
| Ф1 | Ф2 | Ф3 | Ф4 | Ф5 | Ф6 | Ф7 | Ф8 | Ф9 | Ф10 | |
| Плотность (г/мл) | 1.023 | 1.038 | 1.049 | 1.062 | 1.074 | 1.098 | 1.144 | 1.185 | 1.239 | 1.293 |
Таблица 2: Плотность градиентной центрифугированной системы на основе йодиксанола. В таблице показана плотность каждой фракции в градиентной центрифугированной системе на основе йодиксанола. Управление бланком: градиентная система на основе PBS.
| Нисходящий режим | Восходящий режим | |
| Скорость извлечения частиц (%) | 24.08 | 35.69 |
| Коэффициент извлечения белка (%) | 24.5 | 32.45 |
Таблица 3: Скорости извлечения частиц и белков при двух режимах. В таблице приведены скорости извлечения частиц и белков в режимах «Сверху вниз» и «Снизу вверх» (рис. 8).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Бактериальные внеклеточные везикулы (БЭВ) представляют собой липидно-бислойные наночастицы, секретируемые бактериями, несущие множество белков, липидов, нуклеиновых кислот и других биологически активных молекул, способствующих опосредованию функциональных эффектов бактерий20. Было подтверждено, что БЭВ, полученные из кишечника, участвуют в развитии таких заболеваний, как воспалительные заболевания кишечника, болезнь Крона и колоректальный рак, а также влияют на общий метаболизм и опосредуют нарушение когнитивных функций 4,16,17,20,21,22,23,24,25,26 . В настоящее время получение полной и объективной биологической информации о БЭВ кишечного происхождения бактерий из образцов-фекалий человека по-прежнему сдерживается рядом факторов, среди которых первым и главным ключевым вопросом является выделение БЭВ из сложной среды хозяина.
Основные методы выделения БЭВ, такие как ультрацентрифугирование (UC), центрифугирование с градиентом плотности (DGC) и эксклюзионная хроматография (SEC)13,14,15,16,17, имеют как положительные, так и отрицательные стороны. Трудности с удалением некоторых мешающих веществ и отсутствие последовательных рабочих процедур, серьезно влияющих на более реалистичный и всесторонний анализ БЭВ, остаются проблемами для процесса разделения. Чтобы смягчить нежелательные эффекты интерференции, во многих исследованиях 15,27,28 сочетались два или более из вышеперечисленных методов для достижения отделения БЭВ, особенно из жидкостей организма, но сложные процедуры, как правило, влияют на стабильность результатов. Для БЭВ разница в плотности с другими загрязняющими веществами (например, белковыми агрегатами, липидными компонентами, эукариотическими внеклеточными везикулами (ВЭВ)15) в настоящее время может стать специфическим средством выделения.
В настоящее время йодиксанол стал предпочтительной средой для разделения ВВ по градиенту плотности, заменив сахарозу благодаря своим изотоническим свойствам. Эти свойства способствуют сохранению морфологии ЭВ и облегчению оценки плотности для каждой фракции29. В соответствии с Tulkens et al. 15, в нашем исследовании была принята идентичная концентрация для системы DGC, используя йодиксанол в слоях градиента концентрации 50% (по массе), 40% (по массе), 20% (по массе), 10% (по весу) и 0%. Начальный этап включал в себя использование буфера HEPES для приготовления растворов йодиксанола различных концентраций. По сравнению с трис-(-ЭДТА)-сахарозным буфером, соответствующая концентрация буфера HEPES обеспечивает долгосрочную стабильность pH в системе центрифугирования благодаря своим внутренним свойствам. Одновременно стерильный буфер PBS использовался на верхнем слое системы центрифугирования не только для защиты от потенциального загрязнения бактериями и их метаболитами во время приготовления раствора, но и для поддержания консистенции буфера образца до и после ДГХ. Это включало ресуспендирование гранулы с буфером PBS после ЯК и замену йодиксанола на PBS после ДГК, что облегчало сравнительный анализ результатов. Кроме того, объем каждого градиентного слоя в системе DGC был откалиброван до 3 мл, 3 мл, 3 мл, 3 мл и 3,5 мл для 50%, 40%, 20%, 10% и 0% (слой PBS) растворов йодиксанола соответственно. Эта стратегия помогает установить относительно более широкий диапазон плотности (1,02-1,30 г/мл), потенциально улучшая отделение БЭВ от других мешающих элементов, тем самым делая градиенты применимыми к другим жидкостям организма со сложным загрязнением.
Важно подчеркнуть, что некоторые этапы протокола имеют решающее значение. Примечательно, что коэффициент разбавления, описанный на этапе 2.2, при котором 1 г образцов фекалий смешивается с минимум 10 мл PBS, имеет решающее значение для предотвращения перенасыщения и сохранения экспериментальных ресурсов. В этих условиях концентрация частиц и белков обычно увеличивается пропорционально массе фекалий в образце, при условии, что другие характеристики фекалий постоянны. При необходимости может быть проведен дальнейший анализ с учетом таких факторов, как консистенция, липопротеин или содержание в крови. На этапе 3.4 следует соблюдать осторожность, чтобы избежать прямого выливания раствора, так как это может повредить гранулу, что может привести к тому, что более крупные гранулы засорят мембрану фильтра 0,22 мкм. Если фильтр быстро насыщается (например, если через фильтр проходит менее 10 мл), рекомендуется провести дополнительную стадию центрифугирования при 12 000 × г . В контексте центрифугирования с градиентом плотности прецизионное приготовление градиентных растворов является необходимым условием для получения надежных результатов. Кроме того, необходимо осторожно манипулировать пробиркой при нанесении верхних слоев растворов низкой плотности, чтобы предотвратить нарушение стратификации, и любые пузырьки должны быть удалены путем тщательного пипетирования. Наконец, при аспирации фракций важно тщательно отсасывать их вдоль стенки трубки, избегая чрезмерной или недостаточной аспирации, которая может привести к нетточному распределению BEV. Регулярное наблюдение за уровнем жидкости и последовательная практика могут помочь смягчить эту проблему.
В этом исследовании были определены фракции, обогащенные BEV (F6-F8), с использованием нескольких методов характеризации и изучены два различных градиентных режима ультрацентрифугирования: сверху вниз и снизу вверх. При измерении концентрации белка и частиц в F4-F8 (Рисунок 3) и сравнении скорости извлечения и чистоты (Рисунок 8 и Рисунок 10) было замечено, что режим центрифугирования «Снизу вверх» дает более высокие значения обнаруженных значений как на уровне белка, так и на уровне частиц, чем альтернативный метод выделения и очистки БЭВ из образцов фекалий. Это наблюдение предполагает различные динамические процессы. Была выдвинута гипотеза о том, что невезикулярные внеклеточные наночастицы (НВЭП)29, такие как липопротеины, с более низкой плотностью, чем БЭВ, могут не достигать своей плавучей плотности, если образцы находятся при нижней загрузке (рис. 6), что потенциально может привести к завышенной скорости восстановления даже после 15 ч ДГК (рис. 9). Это наблюдение требует рассмотрения вопроса о том, применимо ли традиционное определение чистоты, основанное на соотношении частиц и белков. Кроме того, стоит отметить, что в F5 преобладали ВРЭ, в то время как БЭВ были обнаружены в F6-F7 (рис. 4 и рис. 5). Примечательно, что эта дифференциация, по-видимому, была подчеркнута при переходе на режим сверху вниз. Следовательно, этот режим может быть более подходящим для данного протокола. Тем не менее, важно подчеркнуть присутствие интегрина β1 в F6, что потенциально указывает на внутреннюю гетерогенность среди ВЭЭ. Применяя этот метод к другим жидкостям организма, таким как кровь и моча, исследователи должны учитывать уникальные особенности образцов. Время центрифугирования, определенное в этом протоколе, составляет 7 ч, что значительно меньше, чем продолжительность, указанная в других исследованиях, которая может достигать 18 ч. По сравнению с восстановлением белка с 15-часовой продолжительностью, выполненным по той же схеме в этом исследовании (рис. 9), это время представляется достаточным для достижения требуемой чистоты разделения. В этих рабочих условиях извлечение частиц в режиме «сверху вниз» достигало 10,8 (4,5 × 10,7-1,5 × 10,8) на миллиграмм кала, что соответствует предыдущим отчетам (10,11 БЭВ на грамм влажного стула)15,29,30. Наконец, измерения плотности каждой фракции из контрольной пластины подтвердили, что плотность БЭВ варьировалась от 1,09 до 1,19 г/мл, что согласуется с более ранними исследованиями.
Этот метод, хотя и эффективен, имеет ограничения из-за влияния диеты, функции кишечника и других факторов на состав кала. Эти переменные могут изменять консистенцию фекалий, потенциально влияя на численность бактерий и восстановление БЭВ. Поэтому крайне важно стандартизировать выделение и очистку БЭВ31,32 с корректировками, вносимыми на основе оценки характеристик фекалий. Будущие исследования должны быть сосредоточены на определении стандарта нормализации выхода БЭВ, сродни креатинину мочи или скорости потока мочи. Такой ориентир мог бы улучшить методологическую оценку и пролить свет на связь между фекальными БЭВ и физиологическим и патологическим состоянием организма. Кроме того, сильная связь между фекальными БЭВ и различными заболеваниями подчеркивает их значительный клинический потенциал. Однако время центрифугирования, предусмотренное в этом протоколе, не удовлетворяет потребности в более удобном и быстром тестировании, как того требуют клиницисты. Поэтому необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить, может ли более короткое время центрифугирования, возможно, менее 3 ч, дать эквивалентные результаты. Кроме того, необходимы дальнейшие исследования, чтобы понять события, происходящие в обоих режимах центрифугирования. Хотя постулируется, что невезикулярные компоненты более обогащены F6-F8 в режиме «снизу вверх», уточнение градиентных концентраций может оказаться полезным для выявления дополнительных подтипов со специфическими функциями.
Это исследование успешно продемонстрировало выделение и очистку БЭВ из фекалий человека с помощью ДГК. Эта стратегия перспективна для применения к другим биологическим образцам, таким как кровь, моча и слюна, предоставляя исследователям эффективный подход к раскрытию скрытой информации о БЭВ, потенциально продвигая клиническое применение.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Работа выполнена при поддержке Национального научного фонда для выдающихся молодых ученых (82025024); Ключевой проект Национального фонда естественных наук Китая (82230080); Национальная программа ключевых исследований и разработок Китая (2021YFA1300604); Национальный фонд естественных наук Китая (81871735, 82272438 и 82002245); Гуандунский фонд естественных наук для выдающихся молодых ученых (2023B1515020058); Фонд естественных наук провинции Гуандун (2021A1515011639); Крупная государственная программа развития фундаментальных исследований Фонда естественных наук провинции Шаньдун в Китае (ZR2020ZD11); Научный фонд постдокторантуры (2022M720059); Программа развития выдающейся молодежи больницы Наньфан Южного медицинского университета (2022J001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 % (w/v) glutaraldehyde (prepared from 2.5 % stock solution in deionized water) | ACMEC | AP1126 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.3 |
| 1 % (w/v) methylcellulose (prepared from original powder in deionized water) | Sigma-Aldrich | M7027 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.6 |
| 1.5 % (w/v) uranyl acetate (prepared from original powder in deionized water) | Polysciences | 21447-25 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.5 |
| 1000 μL, 200 μL, 10 μL Pipette | KIRGEN | KG1313, KG1212, KG1011 | Transfer the solution |
| 5 % (w/v) bovine serum albumin solution (prepared from the original powder in TBST buffer) | Fdbio science | FD0030 | Used in western blotting for blocking at Step 8.5.6 |
| 5 × loading buffer | Fdbio science | FD006 | Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5.1 |
| 75 % (v/v) alcohol | LIRCON | LIRCON-500 mL | Surface disinfection |
| 96-well plate | Rar | A8096 | Measure the absorbance values |
| Anti-Calnexin antibody | Abcam | ab92573 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-CD63 antibody | Abcam | ab134045 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-CD9 antibody | Abcam | ab236630 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-Flagellin antibody | Sino Biological | 40067-MM06 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-Integrin beta 1 antibody | Abcam | ab30394 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-LPS antibody | Thermo Fisher | MA1-83152 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-LTA antibody | Thermo Fisher | MA1-7402 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-OmpA antibody | CUSABIO | CSB-PA359226ZA01EOD, https://www.cusabio.com/ | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-Syntenin antibody | Abcam | ab133267 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-TSG101 antibody | Abcam | ab125011 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Autoclave | ZEALWAY | GR110DP | Sterilization for supplies and mediums used in the experiment |
| Balance | Mettler Toledo | AL104 | Balance the tube sample-loaded with PBS |
| Bicinchoninic acid assay | Fdbio science | FD2001 | Measure protein content of BEVs at Step 8.2 |
| BioRender | BioRender | https://app.biorender.com | Make the schematic workflow of BEVs isolation and purification showed in Figure 1 |
| Biosafety cabinet | Haier | HR1200- II B2 | Peform the procedures about feces sample handling |
| Centrifuge 5810 R; Rotor F-34-6-38 | Eppendorf | 5805000092; 5804727002, adapter: 5804774000 | Preprocess for BEVs (Step 3) |
| Chemiluminescence Apparatus | BIO-OI | OI600SE-MF | Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12 |
| Cytation 5 | BioTek | F01 | Microplate detector for measuring the absorbance (Step 8.1) and fluorescence (Figure 6) values |
| Dil-labled low density lipoprotein | ACMEC | AC12038 | Definition of distribution of interfering components |
| Electrophoresis equipment | Bio-rad | 1658033 | Used in western blotting for protein separation and transfer at Step 8.5.2, 8.5.3, 8.5.5 |
| Enhanced Chemiluminescence kit HRP | Fdbio science | FD8020 | Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12 |
| Escherichia coli | American Type Culture Collection | ATCC8739 | Isolate BEVs as a positive control. Protocol: Dissolve 25 g of the LB powder in 1 L deionized water, and autoclave. Transfer the 800 μL of preserved Escherichia coli into the medium. Cultivate at 37 °C in the incubator shaker. Then centrifuge at 3, 000 × g for 20 min at 4 °C, 12, 000 × g for 30 min at 4 °C, filter the supernatant through 0.22 μm membrane, and perform ultra-speed centrifugation at 160, 000 × g for 70 min at 4 °C. Pellet defined as crude BEVs from Escherichia coli was suspended in 1.2 mL PBS (Step 3, 4). |
| Falcon tubes 50 mL | KIRGEN | KG2811 | Preprocess for BEVs (Step 3) |
| Feto Protein Staining Buffer | Absci | ab.001.50 | Coomassie brilliant blue staining at Step 8.5.4 |
| Filter paper | Biosharp | BS-TFP-070B | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 (Blotting the solution) |
| Formvar/Carbon supported copper grids | Sigma-Aldrich | TEM-FCF200CU50 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 |
| HEPES powder | Meilunbio | MB6078 | Prepare iodixanol buffers with different concentrations for density gradient centrifugation |
| HRP AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Fdbio science | FDM007 | Western blotting (Secondary Antibody) |
| HRP AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Fdbio science | FDR007 | Western blotting (Secondary Antibody) |
| Incubator shaker | Qiangwen | DHZ-L | Cultivate Escherichia coli |
| Kimwipes™ Delicate Task Wipes | Kimtech Science | 34155 | Wipe the inner wall of the ultracentrifuge tube at Step 4.15 |
| LB broth | Hopebio | HB0128 | Cultivate Escherichia coli |
| Low temperature freezer (-80 °C) | Haier | DW-86L338J | Store the samples |
| Methanol | Alalddin | M116118 | Used in western blotting for activating PVDF membrane at Step 8.5.5 |
| Micro tubes 1.5 mL | KIRGEN | KG2211 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
| Micro tubes 2 mL | KIRGEN | KG2911 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
| Micro tubes 5 mL | BBI | F610888-0001 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
| Microplate reader | Thermo Fisher | Multiskan MK3 | Measure protein content of BEVs at Step 8.2 |
| Millipore filter 0.22 μm | Merck millipore | SLGP033RB | Filtration sterilization; Material: polyethersulfone, PES |
| NaCl | GHTECH | 1.01307.040 | Density gradient centrifugation solution |
| NaOH | GHTECH | 1.01394.068 | Density gradient centrifugation solution (pH adjustment) |
| Optima™ XPN-100 | Beckman Coulter | A94469 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
| OptiPrep™ | Serumwerk Bernburg AG | 1893 | Density gradient centrifugation stock solution |
| Orbital Shaker | Youning | CS-100 | Dissolve feces at Step 2 |
| Phosphate buffered saline | Procell | PB180327 | Dissolve feces at Step 2 |
| Pipettor | Eppendorf | 3120000267, 3120000259 | Transfer the solution |
| Plastic pasteur pipette | ABCbio | ABC217003-4 | Remove supernatant in preprocessing at Step 3.4 |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes | Millipore | ISEQ00010, IPVH00010 | Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5 |
| Prefabricated polyacrylamide gel, 4–20% 15 Wells | ACE | F15420Gel | Used in western blotting for protein separation at Step 8.5.2, 8.5.3 |
| Primary antibody diluent | Fdbio science | FD0040 | Used in western blotting at Step 8.5.8 |
| Protein ladder | Fdbio science | FD0672 | Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5 |
| Rapid protein blotting solution | UBIO | UW0500 | Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5 |
| Rotor SW 32 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 369650 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
| Syringe 20 mL, 50 mL | Jetway | ZSQ-20ML, YCXWJZSQ-50 mL | Transfer buffers amd remove supernatant in preprocessing |
| TBS powder | Fdbio science | FD1021 | Used in western blotting at Step 8.5 |
| Transmission electron microscope (TEM) | Hitachi | H-7650 | Morphological observation for BEVs at Step 8.3 |
| Tween-20 | Fdbio science | FD0020 | Used in western blotting at Step 8.5 |
| Ultracentrifuge tube | Beckman | 326823, 355642 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
| Ultra-clean bench | AIRTECH | SW-CJ-2FD | Peform the procedures about liquid handling |
| Water bath | Bluepard | CU600 | Used for measuring protein content of BEVs at Step 8.2.5 |
| ZetaView | Particle Metrix | S/N 21-734, Software ZetaView (version 8.05.14 SP7) | Nanoparticle tracking analysis (NTA) for measuring the particle size and concentrarion of BEVs at Step 8.4 |
References
- Costello, E. K., et al. Bacterial community variation in human body habitats across space and time. Science. 326 (5960), 1694-1697 (2009).
- Greenhalgh, K., Meyer, K. M., Aagaard, K. M., Wilmes, P. The human gut microbiome in health: establishment and resilience of microbiota over a lifetime. Environmental Microbiology. 18 (7), 2103-2116 (2016).
- de Vos, W. M., Tilg, H., Van Hul, M., Cani, P. D. Gut microbiome and health: mechanistic insights. Gut. 71 (5), 1020-1032 (2022).
- Zhou, P., Yang, D., Sun, D., Zhou, Y. Gut microbiome: New biomarkers in early screening of colorectal cancer. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 36 (5), 24359 (2022).
- Paik, D., et al. Human gut bacteria produce Τ(Η)17-modulating bile acid metabolites. Nature. 603 (7903), 907-912 (2022).
- Parada Venegas, D., et al. Short chain fatty acids (SCFAs)-mediated gut epithelial and immune regulation and its relevance for inflammatory bowel diseases. Frontiers in Immunology. 10, 277 (2019).
- Jiang, C., Li, G., Huang, P., Liu, Z., Zhao, B. The Gut microbiota and Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 58 (1), 1-15 (2017).
- Morais, L. H., Schreiber, H. L. t, Mazmanian, S. K. The gut microbiota-brain axis in behaviour and brain disorders. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 241-255 (2021).
- Kim, J. H., Lee, J., Park, J., Gho, Y. S. Gram-negative and Gram-positive bacterial extracellular vesicles. Seminars in Cell and Developmental Biology. 40, 97-104 (2015).
- Toyofuku, M., Nomura, N., Eberl, L. Types and origins of bacterial membrane vesicles. Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 13-24 (2019).
- Xie, J., Li, Q., Haesebrouck, F., Van Hoecke, L., Vandenbroucke, R. E. The tremendous biomedical potential of bacterial extracellular vesicles. Trends in Biotechnology. 40 (10), 1173-1194 (2022).
- Coumans, F. A. W., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).
- Northrop-Albrecht, E. J., Taylor, W. R., Huang, B. Q., Kisiel, J. B., Lucien, F. Assessment of extracellular vesicle isolation methods from human stool supernatant. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (4), 12208 (2022).
- Park, Y. E., et al. Microbial changes in stool, saliva, serum, and urine before and after anti-TNF-α therapy in patients with inflammatory bowel diseases. Scientific Reports. 12 (1), 6359 (2022).
- Tulkens, J., De Wever, O., Hendrix, A. Analyzing bacterial extracellular vesicles in human body fluids by orthogonal biophysical separation and biochemical characterization. Nature Protocols. 15 (1), 40-67 (2020).
- Tulkens, J., et al. Increased levels of systemic LPS-positive bacterial extracellular vesicles in patients with intestinal barrier dysfunction. Gut. 69 (1), 191-193 (2020).
- Kang, C. S., et al. Extracellular vesicles derived from gut microbiota, especially Akkermansia muciniphila, protect the progression of dextran sulfate sodium-induced colitis. PloS one. 8 (10), 76520 (2013).
- Simonsen, J. B. What are we looking at? Extracellular vesicles, lipoproteins, or both. Circulation Research. 121 (8), 920-922 (2017).
- Correll, V. L., et al. Optimization of small extracellular vesicle isolation from expressed prostatic secretions in urine for in-depth proteomic analysis. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12184 (2022).
- Liang, X., et al. Gut bacterial extracellular vesicles: important players in regulating intestinal microenvironment. Gut Microbes. 14 (1), 2134689 (2022).
- Alberti, G., et al. Extracellular vesicles derived from gut microbiota in inflammatory bowel disease and colorectal cancer. Biomedical papers of the Medical Faculty of the University Palacky, Olomouc, Czech Republic. 165 (3), 233-240 (2021).
- Díez-Sainz, E., Milagro, F. I., Riezu-Boj, J. I., Lorente-Cebrián, S. Effects of gut microbiota-derived extracellular vesicles on obesity and diabetes and their potential modulation through diet. Journal of Physiology and Biochemistry. 78 (2), 485-499 (2022).
- Lajqi, T., et al. Gut microbiota-derived small extracellular vesicles endorse memory-like inflammatory responses in murine neutrophils. Biomedicines. 10 (2), 442 (2022).
- Lee, K. E., et al. The extracellular vesicle of gut microbial Paenalcaligenes hominis is a risk factor for vagus nerve-mediated cognitive impairment. Microbiome. 8 (1), 107 (2020).
- Villard, A., Boursier, J., Andriantsitohaina, R. Bacterial and eukaryotic extracellular vesicles and nonalcoholic fatty liver disease: new players in the gut-liver axis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 320 (4), G485-G495 (2021).
- Wei, S., et al. Outer membrane vesicles enhance tau phosphorylation and contribute to cognitive impairment. Journal of Cellular Physiology. 235 (5), 4843-4855 (2020).
- Bitto, N. J., Kaparakis-Liaskos, M. Methods of bacterial membrane vesicle production, purification, quantification, and examination of their immunogenic functions. Methods in Molecular Biology. 2523, 43-61 (2022).
- Stentz, R., Miquel-Clopés, A., Carding, S. R. Production, isolation, and characterization of bioengineered bacterial extracellular membrane vesicles derived from Bacteroides thetaiotaomicron and their use in vaccine development. Methods in Molecular Biology. 2414, 171-190 (2022).
- Zhang, Q., Jeppesen, D. K., Higginbotham, J. N., Franklin, J. L., Coffey, R. J. Comprehensive isolation of extracellular vesicles and nanoparticles. Nature Protocols. 18 (5), 1462-1487 (2023).
- Iwai, K., Minamisawa, T., Suga, K., Yajima, Y., Shiba, K. Isolation of human salivary extracellular vesicles by iodixanol density gradient ultracentrifugation and their characterizations. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 30829 (2016).
- Vandeputte, D., et al. Stool consistency is strongly associated with gut microbiota richness and composition, enterotypes and bacterial growth rates. Gut. 65 (1), 57-62 (2016).
- Wen, M., et al. Bacterial extracellular vesicles: A position paper by the Microbial Vesicles Task Force of the Chinese Society of Extracellular Vesicles. Interdisciplinary Medicine. 1, 12046 (2023).
