Summary
Este estudio describe un método para aislar y purificar vesículas extracelulares bacterianas (BEV) enriquecidas a partir de heces humanas mediante centrifugación en gradiente de densidad (DGC), identifica las características físicas de los BEV a partir de la morfología, el tamaño de partícula y la concentración, y discute las posibles aplicaciones del enfoque DGC en la investigación clínica y científica.
Abstract
Las vesículas extracelulares bacterianas (BEV) son nanovesículas derivadas de bacterias que desempeñan un papel activo en la comunicación bacteria-bacteria y bacteria-huésped, transfiriendo moléculas bioactivas como proteínas, lípidos y ácidos nucleicos heredados de la bacteria parental. Los BEV derivados de la microbiota intestinal tienen efectos en el tracto gastrointestinal y pueden llegar a órganos distantes, lo que tiene importantes implicaciones para la fisiología y la patología. Las investigaciones teóricas que exploran los tipos, las cantidades y las funciones de los BEV derivados de las heces humanas son cruciales para comprender la secreción y la función de los BEV de la microbiota intestinal. Estas investigaciones también requieren una mejora en la estrategia actual para aislar y purificar los BEV.
Este estudio optimizó el proceso de aislamiento y purificación de BEV mediante el establecimiento de dos modos de centrifugación en gradiente de densidad (DGC): Top-down y Bottom-up. La distribución enriquecida de los BEV se determinó en las fracciones 6 a 8 (F6-F8). La efectividad del enfoque se evaluó en función de la morfología de las partículas, el tamaño, la concentración y el contenido de proteínas. Se calcularon las tasas de recuperación de partículas y proteínas, y se analizó la presencia de marcadores específicos para comparar la recuperación y pureza de los dos modos de DGC. Los resultados indicaron que el modo de centrifugación de arriba hacia abajo tenía niveles de contaminación más bajos y lograba una tasa de recuperación y pureza similar a la del modo de abajo hacia arriba. Un tiempo de centrifugación de 7 h fue suficiente para alcanzar una concentración fecal de BEV de 108/mg.
Además de las heces, este método podría aplicarse a otros tipos de fluidos corporales con la modificación adecuada de acuerdo con las diferencias en los componentes y la viscosidad. En conclusión, este protocolo detallado y fiable facilitaría el aislamiento y la purificación estandarizados de los BEV y, por lo tanto, sentaría las bases para el posterior análisis multiómico y experimentos funcionales.
Introduction
El intestino es ampliamente reconocido como el órgano que alberga las comunidades microbianas más abundantes en el cuerpo humano, con más del 90% de las bacterias involucradas en la colonización y multiplicación 1,2. Numerosas pruebas han demostrado que la microbiota intestinal modula el microambiente intestinal y, al mismo tiempo, interactúa con la disfunción en órganos distantes, principalmente a través de una barrera intestinal alterada 3,4. Cada vez hay más pruebas que indican una correlación entre el desequilibrio de la microbiota intestinal y la progresión de la enfermedad inflamatoria intestinal (EII)5,6, así como de los trastornos cognitivos a través del eje intestino-cerebro 5,6,7,8. Las vesículas extracelulares bacterianas (BEV) producidas por bacterias desempeñan un papel importante en estos procesos patológicos.
Los BEV son partículas a nanoescala que encapsulan derivados bacterianos, con diámetros que oscilan entre 20 y 400 nm. Se ha demostrado que facilitan las interacciones entre las bacterias y sus organismos huéspedes 9,10. A pesar de su invisibilidad, estas partículas han atraído cada vez más la atención de los investigadores debido a sus amplias aplicaciones prospectivas como biomarcadores de diagnóstico, dianas terapéuticas y vehículos de administración de fármacos11. Las heces humanas, que a menudo se utilizan como muestras biológicas para estudiar los BEV, procedentes principalmente de bacterias intestinales, contienen una mezcla compleja de agua, bacterias, lípidos, proteínas, residuos de alimentos no digeridos y células epiteliales exfoliadas, entre otros. La intrincada composición fecal plantea desafíos para el aislamiento y la pureza de los BEV, lo que impide un análisis exhaustivo, objetivo y realista de los BEV. Por lo tanto, las estrategias efectivas para minimizar la interferencia de los componentes contaminantes y mejorar el rendimiento de los BEV se han convertido en cuestiones críticas que merecen atención inmediata.
Las estrategias de aislamiento existentes se basan en gran medida en técnicas como la centrifugación de ultra alta velocidad (CU), la centrifugación en gradiente de densidad (DGC) y la cromatografía de exclusión por tamaño (SEC)12,13,14,15,16,17. Actualmente, el DGC es uno de los métodos más aplicados en el campo de la separación de BEV, que abarca dos modos de sedimentación flotante, "Top-down" y "Bottom-up", que están determinados por la posición de carga inicial de la muestra. Estas metodologías diferencian las vesículas extracelulares (VE) de otros componentes en función de las disparidades de tamaño y densidad, lo que produce tasas variables de pureza y recuperación. Investigaciones anteriores han indicado que las estrategias de enfoque único son insuficientes para separar adecuadamente las VE de las proteínas solubles en muestras de fluidos corporales, como la lipoproteína en sangre18 y la proteína Tamm-Horsfall en orina19. Además, la distribución del tamaño de las vesículas extracelulares eucariotas (EEV) a menudo se superpone con la de los BEV, lo que requiere más mejoras metodológicas para optimizar el rendimiento de los BEV. En consecuencia, el avance en el estudio de los BEV depende del desarrollo de metodologías eficaces de separación y purificación. En particular, Tulkens et al 15 emplearon una estrategia biofísica ortogonal para separar los BEV fecales de los EEV, en la que el tiempo de centrifugación de un modo DGC de abajo hacia arriba fue de hasta18 h. Por el contrario, este estudio lo redujo a 7 h, ahorrando en gran medida el tiempo de ultracentrifugación en gradiente y simplificando el proceso.
En el presente estudio, aislamos y purificamos BEV fecales empleando dos modos DGC en condiciones de tampón optimizadas, después de enriquecer BEV con un rango de velocidades de centrifugación diferenciales, de baja a extremadamente alta velocidad. Las evaluaciones basadas en la morfología, el tamaño de partícula y la concentración indicaron un rendimiento encomiable con este método mejorado. Este estudio podría servir como base para futuras investigaciones, extendiendo sus aplicaciones a un dominio más amplio y ofreciendo información sobre la heterogeneidad de los BEV dentro del cuerpo humano. También contribuye a la estandarización de las técnicas de separación y análisis de BEV.
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Protocol
El Comité de Ética del Hospital de Nanfang, de la Universidad Médica del Sur, sancionó este estudio, que fue realizado con el consentimiento informado de los participantes. Todos los métodos empleados en este documento se adhirieron a las pautas operativas estándar proporcionadas por los Estándares Internacionales del Microbioma Humano (IHMS: http://www.microbiome-standards.org/). Todos los procedimientos posteriores de manipulación de líquidos debían llevarse a cabo dentro de una cabina de bioseguridad o en un banco ultralimpio.
1. Recogida y alícuota de muestras fecales
- Distribuya una muestra de heces, una bolsa sellada y una caja helada, y proporcione instrucciones completas a los participantes sobre cómo obtener y conservar las muestras.
- Indique a cada participante que recoja su muestra fecal utilizando el muestreador provisto y que la transporte al laboratorio a una temperatura de 4 °C dentro de un período de 24 horas.
- Una vez recibido en el laboratorio, utilice una cuchara estéril para alícuota menos de 3,5 g de heces en un tubo de centrífuga de 50 ml previamente pesado. Anote el peso de la muestra fecal en el tubo para los procedimientos posteriores de pretratamiento.
PUNTO DE PAUSA: Si el procesamiento inmediato de las muestras no es factible, asigne la muestra para su almacenamiento a largo plazo a -80 °C después de la anotación adecuada.
2. Preparación de la muestra de heces
- Enfríe 500 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 4 °C. Filtre el PBS preenfriado a través de un filtro de polietersulfona (PES) de 0,22 μm con una jeringa de 50 ml en diez tubos de centrifugación de 50 ml.
- Coloque dos tubos de 50 ml sobre hielo, cada uno con 3,5 g de muestras fecales. Agregue 35 ml de PBS a cada tubo.
NOTA: Calcule la cantidad requerida de PBS para la disolución de heces, asegurando una concentración máxima de muestra del 10% (p/v). Si procesa muestras adicionales, emplee más tubos según sea necesario. - Agitar las muestras a 300 rpm durante 2 h a 4 °C, o colocarlas durante 8 h al menos a 4 °C hasta que las heces estén completamente suspendidas visiblemente.
3. Centrifugación de velocidad diferencial
- Enfríe la centrífuga refrigerada de alta velocidad a 4 °C.
- Ajustar el peso de los dos tubos que contienen las muestras preparadas en el paso 2.3 con PBS hasta alcanzar un peso total de 0,1 g.
- Centrifugar las muestras a 3.000 × g durante 20 min a 4 °C.
- Pipetear con cuidado el sobrenadante en dos tubos de centrífuga limpios de 50 ml, dejando aproximadamente 1 ml por encima del gránulo. Utilice una pipeta Pasteur de plástico desechable para este proceso.
- Ajuste el peso de los dos tubos con PBS para alcanzar un peso total de ± 0,1 g.
- Centrifugar el sobrenadante transferido a 12.000 × g durante 30 min a 4 °C.
- Aspire el sobrenadante con una jeringa de 20 ml, retire la aguja de la jeringa y filtre a través de filtros de 0,22 μm en tubos de 50 ml. En este punto, el volumen del sobrenadante debe ser de aproximadamente 30 mL.
NOTA: Si sigue siendo visible una cantidad significativa de impurezas después de la centrifugación de 12.000 × g, es necesario repetir el paso de centrifugación a 12.000 × g durante 30 min a 4 °C. Si no lo hace, puede resultar en una pérdida significativa de BEV debido a la obstrucción de los poros durante la filtración.
4. Centrifugación de ultra alta velocidad
- Limpie el rotor y el cucharón limpiándolos con alcohol al 75% (v/v) para eliminar cualquier contaminación residual.
- Coloque un tubo de ultracentrífuga de 38,5 ml en el soporte del tubo.
NOTA: Seleccione el tubo de ultracentrífuga adecuado en función del volumen de la muestra. Evite la radiación ultravioleta y los reactivos químicos inadecuados para esterilizar tubos centrífugos como se indica en el manual del producto. - Transfiera aproximadamente 30 ml del sobrenadante fecal filtrado del paso 3.7 al tubo de ultracentrífuga.
- Llene el tubo de ultracentrífuga con aproximadamente 8 ml de PBS, dejando un espacio de 3 mm desde la abertura del tubo.
- Coloque los dos tubos de ultracentrífuga con las muestras en cubos de ultracentrifugación opuestos, por ejemplo, el cubo 1 corresponde a 4 (1-4), 2-5, 3-6.
- Ajuste el peso de los dos cubos con PBS para lograr un peso total de ± 0,005 g.
- Instale todos los cucharones en el rotor, independientemente de si los tubos están cargados.
- Iniciar el vacío y centrifugar las muestras a 160.000 × g durante 70 min a 4 °C.
- Suelte el vacío de la cámara y abra la puerta una vez que se muestre Listo en la página de inicio del instrumento.
- Retire el rotor de la ultracentrífuga.
- Mueva los cubos del rotor a la rejilla y recupere los tubos con una pinza.
- Deseche el sobrenadante, que contendrá gránulos marrones visibles en la parte inferior.
- Vuelva a suspender los gránulos pipeándolos repetidamente hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 1.000 μL con 1 ml de PBS preenfriado (4 °C) hasta que estén completamente suspendidos. Llene el tubo con aproximadamente 37 ml de PBS, dejando un espacio de 3 mm desde la abertura.
- Realice otra ultracentrifugación siguiendo los pasos 4.5-4.11 a 160.000 × g durante 70 min a 4 °C para eliminar los componentes contaminantes parcialmente adheridos de las paredes del tubo.
- Deseche el sobrenadante, invierta los dos tubos de ultracentrífuga durante 5 minutos y limpie cualquier resto de solución en la pared interna con limpiaparabrisas.
NOTA: La limpieza de la pared interior minimiza la interferencia de la contaminación residual adherida a la pared del tubo de ultracentrífuga. Elija limpiaparabrisas que no influyan en el análisis de BEV, especialmente en lo que respecta al tamaño de las partículas. - Vuelva a suspender los gránulos en cada tubo pipeteándolos hacia arriba y hacia abajo con 1,2 ml de PBS preenfriado (4 °C) con una pipeta de 1.000 μl.
- Transfiera 1,2 ml de la solución de PBS/BEV de un tubo de ultracentrífuga a un microtubo limpio de 1,5 ml.
PUNTO DE PAUSA: La solución PBS/BEV recolectada de un tubo de ultracentrífuga puede continuar con el Paso 6. Almacenar la solución del otro tubo a -80 °C.
5. Preparación de la solución para la centrifugación en gradiente de densidad
- Preparación de tampón HEPES de 0,02 M
- Combine 0,477 g de polvo HEPES y 0,8 g de NaCl con 90 ml de agua desionizada esterilizada en autoclave.
- Ajuste el pH a 7,2 añadiendo 1 M de hidróxido de sodio (NaOH). Lleve el volumen a 100 ml con agua desionizada y filtre la solución a través de membranas de PES de 0,22 μm.
PRECAUCIÓN: El hidróxido de sodio es un álcali cáustico fuerte. Los operarios deben manipularlo y prepararlo cuidadosamente en una vitrina de gases.
- Preparación del tampón de gradiente de densidad
- Calcule el volumen requerido de cada tampón de gradiente de densidad en función del número de tubos de ultracentrífuga para la centrifugación en gradiente de densidad (Paso 6) (en este protocolo, los volúmenes para las soluciones de gradiente de 60%, 50%, 40%, 20% y 10% fueron de 2,5 ml, 3 ml, 6 ml, 6 ml y 6 ml, respectivamente).
- Para la preparación de una solución de trabajo de yodixanol al 50 % (p/v), mezcle el tampón HEPES 0,02 M y la solución madre de yodixanol al 60 % (p/v) en una proporción de volumen de 1:5 (0,5 ml: 2,5 ml).
NOTA: Utilice una jeringa desechable de 20 ml para extraer la solución madre de yodixanol y evite introducir aire. - Para preparar tampones de yodixanol con diferentes concentraciones, combine la solución de trabajo de yodixanol al 50% del paso 5.2.2 con el tampón HEPES obtenido en el paso 5.1 utilizando una pipeta de 1.000 μL de acuerdo con las proporciones mostradas en la Tabla 1.
NOTA: Realice el paso 5 en un banco ultralimpio con las luces apagadas. Conservar la solución madre de yodixanol abierta en el frigorífico a 4 °C para evitar el crecimiento bacteriano. Mantenga la solución de yodixanol y el tampón HEPES protegidos de la luz.
6. Establecimiento de un sistema de centrifugación en gradiente de densidad
- Modo DGC de arriba hacia abajo
- Combine 500 μL de solución de PBS/BEV aislada del Paso 4 con 3 mL de PBS. Mezcle suavemente las soluciones con una pipeta de 1.000 μL para obtener 3,5 ml de solución de PBS/BEV.
- Coloque un tubo de ultracentrífuga de 31 ml en una placa de espuma con agujeros y etiquételo como "↓".
- Agregue verticalmente 3 ml de la solución de yodixanol al 50% en el fondo del tubo con una pipeta de 1.000 μl.
- Incline el tubo en un ángulo de 70° y coloque un soporte para tubos u otro soporte ligeramente por encima del nivel de la placa de espuma, por debajo de la abertura del tubo.
- Añadir 3 ml de solución de yodixanol al 40 % sobre la solución de yodixanol al 50 % con una pipeta de 1.000 μl.
- Añadir 3 ml de solución de yodixanol al 20 % sobre la solución de yodixanol al 40 % con una pipeta de 1.000 μl.
- Añadir 3 ml de solución de yodixanol al 10% sobre la solución de yodixanol al 20% con una pipeta de 1.000 μl.
- Añadir 3,5 ml de solución de PBS/BEV del paso 6.1.1 a la solución de yodixanol al 10 % con una pipeta de 1.000 μl.
- Vuelva a colocar suavemente los tubos en posición vertical.
NOTA: Después del pipeteo, la estratificación debe ser visible.
- Modo DGC ascendente
- Coloque un tubo de ultracentrífuga de 31 ml en una placa de espuma con agujeros y etiquételo como "↑".
- Agregue verticalmente 2.5 ml de la solución madre de yodixanol al 60% en el fondo del tubo. Mezclar suavemente con 500 μL de solución de PBS/BEV aislada del Paso 4 utilizando una pipeta de 1.000 μL para obtener 3 mL de solución de yodixanol/BEV al 50%.
- Incline el tubo en un ángulo de 70° y coloque un soporte para tubos u otro soporte ligeramente por encima del nivel de la placa de espuma, por debajo de la abertura del tubo.
- Añadir 3 ml de la solución de yodixanol al 40 % sobre la solución de yodixanol/BEV al 50 % con una pipeta de 1.000 μl.
- Añadir 3 ml de la solución de yodixanol al 20 % sobre la solución de yodixanol al 40 % con una pipeta de 1000 μl.
- Añadir 3 ml de la solución de yodixanol al 10 % sobre la solución de yodixanol al 20 % con una pipeta de 1000 μl.
- Añadir 3,5 ml de PBS sobre la solución de yodixanol al 10% con una pipeta de 1.000 μl.
- Vuelva a colocar suavemente los tubos en posición vertical.
- En este punto, quedaban 200 μL de la suspensión obtenida en el Paso 4.17, que pueden ser analizados posteriormente como un grupo denominado "CU".
NOTA: Al transferir soluciones en el paso 6, mantenga siempre la punta de la pipeta contra la pared del tubo de ultracentrífuga perpendicular al eje del tubo.
7. Centrifugación en gradiente de densidad y recolección de fracciones
- Ajuste el peso de los dos tubos con PBS para lograr un peso total dentro de ± 0,005 g.
- Colocar los tubos en los cubos según el paso 4.5 y someterlos a centrifugación a 160.000 × g durante 7 h a 4 °C.
- Recoja las fracciones con una pipeta (1000 μL) de arriba a abajo contra la pared lateral en el siguiente orden: 3 ml, 2 ml, 1 ml, 1 ml, 1 ml, 1 ml, 1 ml, 1 ml, 1 ml, 1 ml, 1,5 ml y 3 ml en un tubo de ultracentrífuga de 38,5 ml.
NOTA: Mantenga la línea de visión al mismo nivel que la superficie del líquido. - Realizar la ultracentrifugación para cada fracción obtenida en el paso 7.3 de acuerdo con el paso 4 a 160.000 × g durante 70 min a 4 °C.
- Retire el sobrenadante e invierta los tubos de ultracentrífuga durante 5 min.
- Vuelva a suspender los gránulos en 200 μL de PBS preenfriado (4 °C) con una pipeta de 200 μL.
- Transfiera la solución de PBS/BEV a un microtubo limpio de 1,5 ml.
- Etiquete las fracciones de F1 a F10 y analícelas en función del paso 8.
PUNTO DE PAUSA: Si las muestras obtenidas en el paso 7.8 no se pueden procesar inmediatamente, guárdelas a -80 °C.
8. Caracterización y análisis cuantitativo de las fracciones recogidas
- Determinar los valores de absorbancia (OD 340 nm) de cada fracción utilizando un detector de microplacas con un control de blanco para calcular su densidad correspondiente.
NOTA: Reemplace la solución PBS/BEV (Paso 6.1.1 y Paso 6.2.2) con PBS para establecer un control en blanco.- Preparar 100 μl de solución de yodixanol al 0%, 5%, 10%, 12,5% y 20% diluida en 0,02 M HEPES a base de solución madre al 50% (Paso 5.2.2) como estándares, correspondientes a densidades de 1,0058 g/ml, 1,0318 g/ml, 1,058 g/ml, 1,0708 g/ml y 1,111 g/ml, respectivamente.
- Agregue 50 μL de cada fracción del control en blanco (preparado en el Paso 7.3) y 50 μL de cada solución patrón (preparada en el Paso 8.1.1) a los pocillos duplicados de una placa de 96 pocillos.
- Establezca la longitud de onda en 340 nm, mida la densidad óptica del punto final y calcule la densidad de cada fracción.
- Identifique F4-F9 como el rango de fracciones BEV en función de su densidad.
- Determinar la concentración de proteínas de las fracciones del BEV mediante el ensayo de ácido bicinconínico (BCA).
- Diluir la sustancia diez veces en PBS proporcionado por el fabricante para preparar una solución proteica patrón de 0,5 μg/μL.
- Añadir la solución proteica patrón (preparada en el paso 8.2.1) con volúmenes variables de acuerdo con las instrucciones del reactivo, y complementar cada pocillo de una placa de 96 pocillos con PBS hasta un volumen total de 20 μL.
- Añadir a cada pocillo 20 μL de las muestras preparadas en el paso 7.8 y las muestras que quedan después de la UC definida en el paso 6.2.9.
- Mezcle los reactivos A y B en una proporción de 50:1 y transfiera 200 μL a cada pocillo.
- Incubar la placa en un baño de agua a 37 °C durante 30 min.
- Mida el valor de absorbancia utilizando un lector de microplacas, calcule la concentración de proteínas (μg/μL) y determine el contenido de proteínas (μg) de las muestras basándose en la curva patrón (x: densidad óptica; y: concentración de proteínas) generada a partir de los valores de las soluciones patrón diluidas en el paso 8.2.2.
- Caracterizar las fracciones de BEV definidas en el paso 8.1.4 utilizando microscopía electrónica de transmisión (TEM) para verificar la presencia de BEV. Todos los procedimientos que se indican a continuación deben realizarse con hielo.
- Aplique 10 μL de cada fracción F4-F9 aislada del paso 7.8 y las muestras que queden después de la UC definida en el paso 6.2.9 sobre rejillas de cobre soportadas por Formvar/Carbon durante 20 min, y seque con papel de filtro.
- Enjuague las muestras con 100 μL de PBS tres veces durante 1 minuto cada una y séquelas con papel de filtro.
- Fijar las muestras con 100 μL de glutaraldehído al 1% (p/v) durante 5 min y secar con papel de filtro.
- Lave las rejillas con 100 μL de PBS diez veces durante 2 minutos cada una y séquelas con papel de filtro.
- Tiñir las rejillas con 50 μL de acetato de uranilo al 1,5% (p/v) durante 10 minutos y secar con papel de filtro.
PRECAUCIÓN: El acetato de uranilo es radiactivo y extremadamente tóxico cuando entra en contacto con la piel o se inhala. Manipule las soluciones con acetato de uranilo en una vitrina de gases y siga las medidas de seguridad adecuadas. - Transfiera las rejillas a una gota de metilcelulosa al 1% (p/v) durante 5 minutos y seque con papel de filtro.
- Guarde las rejillas secadas al aire en un ambiente oscuro y libre de polvo hasta su observación.
- Captura imágenes y analízalas con un TEM.
- Caracterice las fracciones de BEV definidas en el paso 8.1.4 utilizando el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) para contar el número de partículas.
- Calibrar el sistema utilizando partículas de poliestireno de 110 nm.
- Lave el grupo de muestras con PBS.
- Diluir las muestras de las diferentes fracciones adquiridas en el paso 7.8 y las muestras dejadas después de la UC definida en el paso 6.2.9 a una concentración en el rango de 105-10 9 partículas/ml, con una concentración optimizada de 10a 7 partículas/ml.
- Registre y analice en 11 posiciones con tres repeticiones, manteniendo la temperatura alrededor de 23-30 °C.
- Analizar el contenido proteico de las muestras mediante tinción azul brillante de Coomassie (CBBS) y Western blot (WB).
- Diluir las muestras de BEV de diferentes fracciones obtenidas en el paso 7.8 y las muestras que quedan después de la CU definida en el paso 6.2.9 utilizando PBS y tampón de carga de 5 × hasta una concentración final de 0,5 ó 1 μg/μl, si es necesaria la cuantificación, asegurando una carga de muestra suficiente de 20 μl (10 μg o 20 μg) de cada pocillo en el paso 8.5.2. Hervir las muestras a 95 °C durante 10 min.
- Ensamble el gel de poliacrilamida prefabricado en el tanque de electroforesis y transfiera las muestras a los pocillos.
- Realice electroforesis vertical con los siguientes parámetros: 160 V durante 50 min.
- Tiñir el gel en la solución azul brillante de Coomassie durante 1 h, enjuagar con agua desionizada hasta que el fondo azul se aclare y capturar imágenes con una cámara.
- Realizar procedimientos de transferencia de proteínas para otros geles con los siguientes parámetros: 400 mA durante 20 min.
- Bloquee las membranas secantes con una solución de BSA al 5% (p/v) durante 1 h a temperatura ambiente.
- Lave las membranas en tampón TBST tres veces durante 5 minutos cada una.
- Incubar las membranas con anticuerpos primarios (marcadores BEV: LPS, OmpA, LTA; Marcadores EEV: CD63, CD9, TSG-101, Sintenina, Integrina β1; Otros marcadores de contaminación: flagelina, calnexina) durante 8-12 h a 4 °C.
- Lave las membranas en tampón TBST tres veces durante 10 minutos cada una.
- Incubar las membranas con anticuerpos secundarios durante 1 h a temperatura ambiente.
- Realice el paso 8.5.9.
- Desarrollar la transferencia utilizando un aparato de quimioluminiscencia.
- Sustituir la solución de PBS/BEV (Pasos 6.1.1 y 6.2.2) por BEV de Escherichia coli para establecer un control positivo (véase la Tabla de Materiales para el procedimiento de aislamiento de E. coli-BEV cruda), y realizar todos los experimentos anteriores para caracterizar los BEV.
PUNTO DE PAUSA: Determine F6-F8 como la distribución de las fracciones enriquecidas con BEV en función de los resultados de la caracterización descrita anteriormente para BEV fecales, y utilice este rango reducido para el análisis posterior.
- Calcule las tasas de recuperación en términos de partículas y proteínas para evaluar la eficiencia de los dos modos DGC. Los resultados a continuación se presentan como porcentajes.
- Calcule las tasas de recuperación de partículas en el modo Top-down: partículas totales en F6-F8/partículas después de UC definidas en el paso 6.2.9.
- Calcule las tasas de recuperación de partículas en el modo Bottom-up: partículas totales en F6-F8/partículas después de UC definidas en el Paso 6.2.9.
- Calcule las tasas de recuperación de proteínas en el modo Top-down: contenido total de proteínas en F6-F8 (μg)/contenido de proteínas después de CU definido en el Paso 6.2.9 (μg).
- Calcule las tasas de recuperación de proteínas en el modo ascendente: contenido total de proteínas en F6-F8 (μg)/contenido de proteínas después de CU definido en el paso 6.2.9 (μg).
- Se calculó la relación partícula/proteína para evaluar la pureza tradicionalmente definida de la UC y los dos modos DGC, y los resultados a continuación se presentaron como porcentajes.
- Relación partícula/proteína después de la CU definida en el paso 6.2.9: partículas después de la CU/contenido de proteína después de la CU (μg).
- Relación partícula/proteína en el modo Top-down: total de partículas en F6-F8/contenido de proteína en F6-F8 (μg).
- Relación partícula/proteína en el modo Bottom-up: partículas totales en F6-F8/contenido de proteína en F6-F8 (μg).
- Seleccione el modo de centrifugación más adecuado (se seleccionó el modo de arriba hacia abajo en el protocolo) para la purificación de BEV fecal y el análisis futuro.
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Representative Results
Determinar la distribución de las fracciones enriquecidas con BEV
Para determinar la distribución de las fracciones enriquecidas con vesículas extracelulares bacterianas (BEV), se estableció un control en blanco para medir los valores de absorbancia a DO 340 nm, y se calculó la densidad de cada fracción en función de las mediciones y las directrices de yodixanol (Paso 8.1). En la Tabla 2 se presentan los resultados de densidad, demostrando que las fracciones F4 a F9 exhibieron densidades dentro del rango típicamente asociado con vesículas extracelulares. Este hallazgo sugirió que la mayoría de los BEV estaban aislados en estas fracciones, lo que llevó a la definición de F4-F9 como el rango aproximado para los BEV. Se empleó microscopía electrónica de transmisión (TEM) para caracterizar las características morfológicas de los BEV fecales aislados como se muestra en la Figura 1 en las fracciones F4-F9. Las imágenes TEM (Figura 2) revelaron la presencia de estructuras clásicas en forma de copa, que son características de los BEV. Se realizó un análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) y un ensayo de ácido bicinconínico (BCA) para determinar el número de partículas y la concentración de proteínas, respectivamente, lo que permitió una evaluación adicional de las tasas de recuperación y la pureza. La Figura 3 muestra las concentraciones de proteínas y partículas para cada fracción, lo que indica que F6 y F7 exhibieron las concentraciones más altas, seguidas de F5 y F8. Posteriormente, se realizó la tinción con azul brillante de Coomassie (CBBS) y la Western blot (WB) para proporcionar un análisis global de la proteína. Los resultados de CBBS fueron consistentes con los hallazgos de concentración de proteínas, siendo F6 y F7 las bandas más intensas (Figura 4). Para confirmar la distribución de los BEV, se emplearon vesículas extracelulares derivadas de Escherichia coli como control positivo (definido en el Paso 8.5.13). Los procedimientos de aislamiento y purificación siguieron los pasos descritos en la Tabla de Materiales y las secciones de protocolo antes mencionadas (Pasos 3, 4). El análisis de WB confirmó además la presencia de la proteína A de la membrana externa (OmpA), un componente importante de la membrana externa de las bacterias y un marcador específico para los BEV, en las fracciones F6-F8. Sobre la base de estos resultados, las fracciones F6-F8 se definieron como fracciones enriquecidas con BEV adecuadas para experimentos y análisis posteriores.
Verificación de la gama de presentación de los componentes de interferencia
Las vesículas extracelulares eucariotas (EEV), que poseen un tamaño y densidad similares a los BEV, se identificaron como una interferencia importante en el análisis de BEV. Para abordar esto, se probaron tres proteínas EEV en las fracciones 5-8 de los modos Top-down y Bottom-up, con tiempos de centrifugación de 7 h y 15 h. CD63, una proteína transmembrana asociada a EEV, se detectó predominantemente en F5, mientras que el marcador BEV LPS se enriqueció en las fracciones 6-7. Este patrón se observó en ambos modos, aunque el modo ascendente exhibió un ligero anillamiento de CD63-EEV en F7. Sin embargo, otros marcadores EEV, CD9 y TSG-101, no mostraron señales visibles en estas fracciones, independientemente de los modos o tiempos de centrifugación. En una empresa experimental independiente, se emplearon anticuerpos dirigidos a la sintenina y a la integrina β1 para determinar el enriquecimiento de distintos marcadores proteicos inherentes a los EEV en las fracciones 5-8. La sintenina se detectó de manera prominente dentro de F5, particularmente bajo el ámbito del enfoque Top-down, mientras que la presencia de integrina β1 se discernió dentro de F6 (Figura 5). Para evaluar aún más la presencia de partículas interferentes, se introdujo lipoproteína de baja densidad marcada con Dil (Dil-LDL) en el sistema de gradiente de densidad y se midió la intensidad de fluorescencia en todas las fracciones. En el modo de arriba hacia abajo, las fracciones 1-4 exhibieron valores de fluorescencia relativamente más altos, mientras que en el modo de abajo hacia arriba, fueron F1-F6 las que mostraron intensidades más altas (Figura 6).
Evaluar las tasas de recuperación y la pureza de dos modos de DGC a partir de la concentración, el tamaño de partícula y los marcadores de BEV
Después de identificar las fracciones F6-F8 como fracciones enriquecidas con BEV, se evaluaron las tasas de recuperación y la pureza de los dos modos de centrifugación en gradiente de densidad (DGC). Se compararon los tamaños de partícula de las fracciones enriquecidas con BEV obtenidos a partir del modo Top-down, el modo Bottom-up y la ultracentrifugación (UC) sola. Los tamaños de partícula observados en ambos modos de centrifugación oscilaron entre 90 y 300 nm, alineándose con el diámetro definido de los BEV (Figura 7). A continuación, se calcularon las tasas de recuperación de partículas y proteínas de los dos modos en función de las concentraciones de partículas y proteínas antes y después de la DGC (Tabla 3 y Figura 8). En particular, el modo ascendente exhibió tasas de recuperación más altas en comparación con el otro modo. En un grupo experimental separado, se evaluó la recuperación de proteínas en los dos modos a diferentes tiempos de centrifugación de 7 h y 15 h. Es importante destacar que no hubo diferencias estadísticamente significativas en el contenido de proteínas dentro de las fracciones F6-F8 después de DGC entre los dos tiempos de centrifugación, independientemente del modo de gradiente utilizado (Figura 9). La relación partícula/proteína se calculó para proporcionar una evaluación aproximada de la pureza en los dos modos. Los datos no indicaron diferencias significativas en la pureza entre los modos. Además, se realizó la tinción con azul brillante de Coomassie (CBBS) y la transferencia de Western (WB) para comparar aún más la pureza, centrándose en tres marcadores BEV (LPS, OmpA y LTA), un marcador EEV (CD63) y dos marcadores contaminantes (calnexina, flagelina). Los resultados demostraron una reducción parcial de las sustancias interferentes después de la DGC, con LPS y OmpA mostrando una presencia más prominente en ambos modos de DGC en comparación con la CU sola (Figura 10).
Figura 1: Flujo de trabajo esquemático de aislamiento y purificación de BEV. Abreviaturas: BEVs = vesículas extracelulares bacterianas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imágenes TEM representativas de fracciones BEV. (A) Imágenes TEM de BEVs aislados después de CU. (B) Imágenes TEM de BEV aislados después de DGC utilizando el modo Top-down. (C) Imágenes TEM de BEV aislados después de DGC utilizando el modo Bottom-up. Todas las imágenes se presentaron a una escala consistente de 200 nm. Abreviaturas: TEM = microscopio electrónico de transmisión; BEVs = vesículas extracelulares bacterianas; UC = ultracentrifugación; DGC = centrifugación en gradiente de densidad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Concentración de proteínas y partículas de las fracciones de BEV después de los modos DGC de arriba hacia abajo y de abajo hacia arriba. La concentración proteica de las fracciones de BEV se determinó mediante BCA y está representada por las barras grises. La concentración de partículas se midió mediante NTA y está representada por las barras azules. Abreviaturas: BEV = vesícula extracelular bacteriana; DGC = centrifugación en gradiente de densidad; BCA = ensayo de ácido bicinconínico; NTA = análisis de seguimiento de nanopartículas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Determinación de fracciones enriquecidas con BEV. (A) Se realizó CBBS para determinar las fracciones enriquecidas con BEV fecales tanto en modo Top-down como Bottom-up. (B) Los VE derivados de Escherichia coli se aislaron, purificaron y utilizaron como control positivo en WB para confirmar la presencia y distribución de BEV. OmpA: Proteína A de la membrana externa, un marcador BEV. Abreviaturas: BEV = vesícula extracelular bacteriana; CBBS = tinción azul brillante de Coomassie; EV = vesículas extracelulares; WB = Western blot. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Confirmación de la distribución de EEV. Análisis de Western blot de las fracciones 5-8 obtenido a partir de los modos DGC Top-down y Bottom-up con diferentes duraciones de ultracentrifugación en gradiente de densidad, 7 h (A) y 15 h (B). Se llevó a cabo un ensayo independiente centrado en F5 a F8 resultante de un período de centrifugación de 7 horas, como se demuestra en (C) y (D). Los marcadores seleccionados incluyeron los asociados con BEV (LPS) y EEV (CD63, CD9, TSG-101, Syntenin, Integrin β1). Abreviaturas: DGC = centrifugación en gradiente de densidad; BEV = vesícula extracelular bacteriana; EEV = vesícula extracelular eucariota. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Distribución de la lipoproteína de baja densidad. La lipoproteína de baja densidad marcada con Dil (Dil-LDL), considerada un marcador de contaminación, se añadió a una concentración de 10 μg al sistema de gradiente tanto en el modo de arriba hacia abajo como en el de abajo hacia arriba. Dil-LDL sustituyó a la solución PBS/BEV (Paso 6.1.1 y Paso 6.2.2) para establecer un modelo de detección. La intensidad de fluorescencia de cada fracción se midió utilizando un detector de microplacas con una longitud de onda de excitación/emisión de 549/565 nm. Abreviatura: BEV = vesícula extracelular bacteriana. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Tamaños de partícula de las fracciones enriquecidas con BEV. (A) Distribución del tamaño de partícula de los BEV crudos obtenidos después de la UC. (B) Distribución del tamaño de partícula de las fracciones enriquecidas con BEV (F6-F8) obtenida utilizando el modo de centrifugación en gradiente de densidad descendente (DGC). (C) La distribución del tamaño de partícula de las fracciones enriquecidas con BEV (F6-F8) se obtuvo utilizando el modo DGC de abajo hacia arriba. Se llevó a cabo una NTA para cuantificar las dimensiones de las partículas. Los factores de dilución empleados para los paneles (A-C) fueron 10.000, 2.000 y 5.000, respectivamente, con los resultados resultantes calibrados. Abreviaturas: BEV = vesícula extracelular bacteriana; UC = ultracentrifugación; DGC = centrifugación en gradiente de densidad; NTA = análisis de seguimiento de nanopartículas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Tasas de recuperación de proteínas y partículas de los modos DGC de arriba hacia abajo y de abajo hacia arriba. (A) Tasas de recuperación de proteínas de los dos modos calculadas como la relación entre la concentración de proteínas después y antes de DGC (UC). (B) Las tasas de recuperación de partículas de los dos modos se calculan mediante la relación entre la concentración de partículas después y antes de DGC (UC). (C) Proporciones de partículas/proteínas de los modos UC, Top-down y Bottom-up. Los datos se presentan como media ± SEM. El análisis estadístico se realizó mediante una prueba t no apareada de dos colas para los paneles A y B, y un análisis de varianza de una vía (ANOVA) con la prueba post hoc de Tukey para el panel C. No se observaron diferencias significativas. Abreviaturas: DGC = centrifugación en gradiente de densidad; UC = ultracentrifugación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9: Comparación de la recuperación de proteínas basada en los modos DGC de arriba hacia abajo y de abajo hacia arriba utilizando diferentes tiempos de ultracentrifugación asociados a la densidad. Las tasas de recuperación de proteínas en las fracciones F6-F8 obtenidas de la ultracentrifugación en gradiente durante 7 h y 15 h se evaluaron en experimentos independientes utilizando los modos Top-down y Bottom-up. Los datos se presentan como media ± SEM. El análisis estadístico se realizó mediante análisis de varianza de dos vías (ANOVA) con la prueba de diferencias mínimas significativas de Fisher. No se observaron diferencias significativas. Abreviaturas: DGC = centrifugación en gradiente de densidad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 10: Evaluación de la pureza de los modos DGC de arriba hacia abajo y de abajo hacia arriba. (A) Se realizó CBBS para comparar la distribución de proteínas de los modos UC, Top-down y Bottom-up. (B) Se realizó WB para evaluar la pureza de los modos UC, Top-down y Bottom-up. Calnexina: marcador proteico asociado al retículo endoplásmico; Flagelina, marcador proteico contaminante de bacterias. CD63: marcador proteico transmembrana de vesículas extracelulares eucariotas; LTA: Marcador BEVs de bacterias grampositivas; LPS, OmpA: Marcadores BEVs de bacterias gramnegativas. Abreviaturas: DGC = centrifugación en gradiente de densidad; UC = ultracentrifugación; CBBS = tinción azul brillante de Coomassie; WB = Western blot. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Concentración de la solución de yodixanol (%) | Búfer HEPES de 0,02 M | Solución de trabajo de yodixanol al 50% |
| 40 | 1 | 4 |
| 20 | 3 | 2 |
| 10 | 4 | 1 |
Tabla 1: Ratios para la preparación de tampones de gradiente de densidad de yodixanol. La tabla proporciona la proporción de 0,02 M de tampón HEPES y solución de trabajo de yodixanol al 50% para obtener una cierta concentración de solución de yodixanol.
| F1 | F2 | F3 | F4 | F5 | F6 | F7 | F8 | F9 | F10 | |
| Densidad (g/mL) | 1.023 | 1.038 | 1.049 | 1.062 | 1.074 | 1.098 | 1.144 | 1.185 | 1.239 | 1.293 |
Tabla 2: Densidad del sistema de centrifugación en gradiente de densidad basado en yodixanol. La tabla mostró la densidad de cada fracción en un sistema de centrifugación en gradiente de densidad basado en yodixanol. Control de piezas en bruto: sistema de gradiente basado en PBS.
| Modo de arriba hacia abajo | Modo ascendente | |
| Tasa de recuperación de partículas (%) | 24.08 | 35.69 |
| Tasa de recuperación proteica (%) | 24.5 | 32.45 |
Tabla 3: Tasas de recuperación de partículas y proteínas de dos modos. La tabla mostró las tasas de recuperación de partículas y proteínas de los modos Top-down y Bottom-up (Figura 8).
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Discussion
Las vesículas extracelulares bacterianas (BEV) son nanopartículas de bicapa lipídica secretadas por bacterias, portadoras de una gran cantidad de proteínas, lípidos, ácidos nucleicos y otras moléculas bioactivas, que contribuyen a mediar los efectos funcionales de las bacterias20. Se ha comprobado que los BEV derivados del intestino están implicados en el desarrollo de enfermedades, como la enfermedad inflamatoria intestinal, la enfermedad de Crohn y el cáncer colorrectal, y también afectan al metabolismo general y median el deterioro de la función cognitiva 4,16,17,20,21,22,23,24,25,26 . En la actualidad, la obtención de información biológica completa y objetiva sobre los BEV de origen bacteriano a partir de especímenes-heces humanas sigue estando limitada por una serie de factores, entre los cuales la primera y más importante cuestión clave es cómo aislar los BEV del complejo entorno del huésped.
Los principales métodos de aislamiento de BEV, como la ultracentrifugación (UC), la centrifugación en gradiente de densidad (DGC) y la cromatografía de exclusión por tamaño (SEC)13,14,15,16,17, tienen ventajas y desventajas. La dificultad para eliminar algunas sustancias interferentes y la falta de procedimientos operativos coherentes, que afectan gravemente a un análisis más realista y exhaustivo de los BEV, siguen siendo retos para el proceso de separación. Para aliviar los efectos indeseables de las interferencias, muchos estudios 15,27,28 han combinado dos o más de los métodos anteriores para lograr la separación de los BEV, particularmente de los fluidos corporales, pero los procedimientos complejos tienden a afectar la estabilidad de los resultados. En el caso de los BEV, la diferencia de densidad con otros contaminantes (p. ej., agregados de proteínas, componentes lipídicos, vesículas extracelulares eucariotas (EEV)15) puede convertirse en un medio específico de aislamiento en la actualidad.
En la actualidad, el yodixanol se ha convertido en el medio preferido para la separación en gradiente de densidad de los vehículos eléctricos, sustituyendo a la sacarosa debido a sus propiedades isotónicas. Estas propiedades contribuyen a preservar la morfología del EV y a facilitar la estimación de la densidad para cada fracción29. En consonancia con Tulkens et al 15, nuestro estudio adoptó una concentración idéntica para el sistema DGC, utilizando yodixanol en capas de gradiente de concentración del 50% (p/v), 40% (p/v), 20% (p/v),10% (p/v) y 0%. El paso inicial implicó el uso de tampón HEPES para preparar varias concentraciones de soluciones de yodixanol. En comparación con el tampón Tris (-EDTA)-sacarosa, una concentración adecuada de tampón HEPES garantiza la estabilidad del pH a largo plazo dentro del sistema de centrifugación, gracias a sus propiedades intrínsecas. Al mismo tiempo, se empleó un tampón PBS estéril en la capa superior del sistema de centrifugación, no solo para proteger contra la posible contaminación por bacterias y sus metabolitos durante la preparación de la solución, sino también para mantener la consistencia del tampón de la muestra antes y después de la DGC. Esto implicó resuspender el gránulo con tampón PBS después de la CU y reemplazar el yodixanol con PBS después de DGC, lo que facilitó un análisis comparativo de los resultados. Además, el volumen de cada capa de gradiente dentro del sistema DGC se calibró a 3 mL, 3 mL, 3 mL, 3 mL y 3,5 mL para soluciones de yodixanol al 50%, 40%, 20%, 10% y 0% (capa de PBS) respectivamente. Esta estrategia ayuda a establecer un rango de densidad relativamente más amplio (1,02-1,30 g/mL), lo que podría mejorar la separación de los BEV de otros elementos interferentes, lo que hace que los gradientes sean aplicables a otros fluidos corporales con contaminación compleja.
Es importante recalcar que algunas etapas del protocolo son cruciales. En particular, el factor de dilución descrito en el Paso 2.2, en el que se mezcla 1 g de muestras fecales con un mínimo de 10 ml de PBS, es fundamental para prevenir la sobresaturación y conservar los recursos experimentales. En estas condiciones, la concentración de partículas y proteínas generalmente aumenta proporcionalmente con la masa fecal en una muestra, asumiendo que otras características fecales son constantes. Si es necesario, se pueden realizar análisis adicionales teniendo en cuenta factores como la consistencia, la lipoproteína o el contenido sanguíneo. Durante el paso 3.4, se debe tener precaución para evitar verter directamente la solución, ya que esto puede perturbar el gránulo y hacer que los gránulos más grandes obstruyan la membrana del filtro de 0,22 μm. Si el filtro se satura rápidamente (por ejemplo, si pasan menos de 10 ml a través de un filtro), se recomienda un paso de centrifugación adicional a 12.000 × g . En el contexto de la centrifugación en gradiente de densidad, la preparación precisa de las soluciones en gradiente es un requisito previo para obtener resultados fiables. Además, es esencial una manipulación cuidadosa del tubo al colocar las soluciones superiores de baja densidad para evitar la interrupción de la estratificación, y cualquier burbuja debe eliminarse mediante un pipeteo cuidadoso. Por último, al aspirar las fracciones, es importante extraerlas meticulosamente a lo largo de la pared del tubo, evitando cualquier aspiración excesiva o insuficiente que pueda dar lugar a una distribución inexacta del BEV. La observación regular del nivel de líquido y la práctica constante pueden ayudar a mitigar este problema.
Este estudio determinó las fracciones enriquecidas con BEV (F6-F8) utilizando múltiples métodos de caracterización y exploró dos modos distintos de ultracentrifugación en gradiente: de arriba hacia abajo y de abajo hacia arriba. A través de la medición de la concentración de proteínas y partículas en F4-F8 (Figura 3) y la comparación de las tasas de recuperación y pureza (Figura 8 y Figura 10), se observó que el modo de centrifugación ascendente arrojó valores detectados más altos tanto a nivel de proteínas como de partículas que el método alternativo para aislar y purificar BEV de muestras fecales. Esta observación implica diferentes procesos dinámicos. Se planteó la hipótesis de que las nanopartículas extracelulares no vesiculares (NVEPs)29, como las lipoproteínas, con menor densidad que los BEV, podrían no alcanzar sus densidades de flotabilidad si las muestras se cargan en el fondo (Figura 6), lo que podría causar una tasa de recuperación inflada, incluso después de 15 h de DGC (Figura 9). Esta observación requiere considerar si la definición tradicional de pureza, basada en la proporción de partículas a proteínas, es aplicable. Además, vale la pena señalar que los EEV exhibieron preponderancia dentro de F5, mientras que los BEV se detectaron de manera prominente en F6-F7 (Figura 4 y Figura 5). Cabe destacar que esta diferenciación pareció acentuarse al adoptar el modo Top-down. Por lo tanto, este modo puede ser más adecuado para este protocolo. Sin embargo, es esencial destacar la presencia de la integrina β1 dentro de F6, lo que podría significar la heterogeneidad intrínseca entre los EEV. Al aplicar este método a otros fluidos corporales como la sangre y la orina, los investigadores deben tener en cuenta las características únicas de las muestras. El tiempo de centrifugación definido en este protocolo es de 7 h, significativamente menor que la duración citada en otros estudios, que puede llegar a ser de hasta 18 h. Cuando se compara con la recuperación de proteínas con una duración de 15 h ejecutada en el mismo patrón en este estudio (Figura 9), este tiempo parece suficiente para lograr la pureza de separación requerida. En estas condiciones de operación, la recuperación de partículas en el modo Top-down alcanzó hasta 10 8 (4,5 × 10 7-1,5 × 108) por miligramo de heces, alineándose con informes anteriores (1011 BEV por gramo de heces húmedas)15,29,30. Por último, las mediciones de densidad de cada fracción del control en blanco confirmaron que la densidad de los BEV oscilaba entre 1,09 y 1,19 g/mL, lo que es consistente con investigaciones anteriores.
Este método, aunque efectivo, presenta una limitación debido al impacto de las dietas, la función intestinal y otros factores en la composición fecal. Estas variables pueden alterar la consistencia fecal, afectando potencialmente la abundancia bacteriana y la recuperación del BEV. Por lo tanto, es crucial estandarizar el aislamiento y la purificación de los BEV31,32, con ajustes realizados en función de la evaluación de las características fecales. La investigación futura debe centrarse en identificar un estándar para normalizar el rendimiento del BEV, similar a la creatinina de orina o la tasa de flujo de orina. Este punto de referencia podría mejorar la evaluación metodológica e iluminar el vínculo entre los BEV fecales y el estado fisiológico y patológico del cuerpo. Además, la fuerte asociación entre los BEV fecales y diversas enfermedades subraya su importante potencial clínico. Sin embargo, el tiempo de centrifugación estipulado en este protocolo no satisface la demanda de pruebas más convenientes y rápidas como las que requieren los médicos. Por lo tanto, se necesita más investigación para determinar si los tiempos de centrifugación más cortos, tal vez menos de 3 h, pueden producir resultados equivalentes. También se necesita una mayor exploración para comprender los eventos que ocurren en ambos modos de centrifugación. Aunque se postula que los componentes no vesiculares están más enriquecidos en F6-F8 en el modo de abajo hacia arriba, refinar las concentraciones de gradiente puede resultar beneficioso para identificar subtipos adicionales con funciones específicas.
Este estudio demostró con éxito el aislamiento y la purificación de BEV a partir de heces humanas utilizando DGC. La estrategia es prometedora para su aplicación a otros especímenes biológicos, como sangre, orina y saliva, lo que proporciona a los investigadores un enfoque eficaz para descubrir la información oculta de los BEV, lo que podría avanzar en las aplicaciones clínicas.
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Disclosures
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo contó con el apoyo del Fondo Nacional de Ciencias para Jóvenes Académicos Distinguidos (82025024); el proyecto Key de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82230080); el Programa Nacional Clave de Investigación y Desarrollo de China (2021YFA1300604); la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81871735, 82272438 y 82002245); Fondo de Ciencias Naturales de Guangdong para Jóvenes Académicos Distinguidos (2023B1515020058); la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Guangdong (2021A1515011639); el Programa Estatal de Desarrollo de la Investigación Básica de la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Shandong (ZR2020ZD11); la Fundación de Ciencias Postdoctorales (2022M720059); el Plan de Desarrollo de Jóvenes Sobresalientes del Hospital de Nanfang, Universidad Médica del Sur (2022J001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 % (w/v) glutaraldehyde (prepared from 2.5 % stock solution in deionized water) | ACMEC | AP1126 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.3 |
| 1 % (w/v) methylcellulose (prepared from original powder in deionized water) | Sigma-Aldrich | M7027 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.6 |
| 1.5 % (w/v) uranyl acetate (prepared from original powder in deionized water) | Polysciences | 21447-25 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.5 |
| 1000 μL, 200 μL, 10 μL Pipette | KIRGEN | KG1313, KG1212, KG1011 | Transfer the solution |
| 5 % (w/v) bovine serum albumin solution (prepared from the original powder in TBST buffer) | Fdbio science | FD0030 | Used in western blotting for blocking at Step 8.5.6 |
| 5 × loading buffer | Fdbio science | FD006 | Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5.1 |
| 75 % (v/v) alcohol | LIRCON | LIRCON-500 mL | Surface disinfection |
| 96-well plate | Rar | A8096 | Measure the absorbance values |
| Anti-Calnexin antibody | Abcam | ab92573 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-CD63 antibody | Abcam | ab134045 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-CD9 antibody | Abcam | ab236630 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-Flagellin antibody | Sino Biological | 40067-MM06 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-Integrin beta 1 antibody | Abcam | ab30394 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-LPS antibody | Thermo Fisher | MA1-83152 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-LTA antibody | Thermo Fisher | MA1-7402 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-OmpA antibody | CUSABIO | CSB-PA359226ZA01EOD, https://www.cusabio.com/ | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-Syntenin antibody | Abcam | ab133267 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-TSG101 antibody | Abcam | ab125011 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Autoclave | ZEALWAY | GR110DP | Sterilization for supplies and mediums used in the experiment |
| Balance | Mettler Toledo | AL104 | Balance the tube sample-loaded with PBS |
| Bicinchoninic acid assay | Fdbio science | FD2001 | Measure protein content of BEVs at Step 8.2 |
| BioRender | BioRender | https://app.biorender.com | Make the schematic workflow of BEVs isolation and purification showed in Figure 1 |
| Biosafety cabinet | Haier | HR1200- II B2 | Peform the procedures about feces sample handling |
| Centrifuge 5810 R; Rotor F-34-6-38 | Eppendorf | 5805000092; 5804727002, adapter: 5804774000 | Preprocess for BEVs (Step 3) |
| Chemiluminescence Apparatus | BIO-OI | OI600SE-MF | Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12 |
| Cytation 5 | BioTek | F01 | Microplate detector for measuring the absorbance (Step 8.1) and fluorescence (Figure 6) values |
| Dil-labled low density lipoprotein | ACMEC | AC12038 | Definition of distribution of interfering components |
| Electrophoresis equipment | Bio-rad | 1658033 | Used in western blotting for protein separation and transfer at Step 8.5.2, 8.5.3, 8.5.5 |
| Enhanced Chemiluminescence kit HRP | Fdbio science | FD8020 | Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12 |
| Escherichia coli | American Type Culture Collection | ATCC8739 | Isolate BEVs as a positive control. Protocol: Dissolve 25 g of the LB powder in 1 L deionized water, and autoclave. Transfer the 800 μL of preserved Escherichia coli into the medium. Cultivate at 37 °C in the incubator shaker. Then centrifuge at 3, 000 × g for 20 min at 4 °C, 12, 000 × g for 30 min at 4 °C, filter the supernatant through 0.22 μm membrane, and perform ultra-speed centrifugation at 160, 000 × g for 70 min at 4 °C. Pellet defined as crude BEVs from Escherichia coli was suspended in 1.2 mL PBS (Step 3, 4). |
| Falcon tubes 50 mL | KIRGEN | KG2811 | Preprocess for BEVs (Step 3) |
| Feto Protein Staining Buffer | Absci | ab.001.50 | Coomassie brilliant blue staining at Step 8.5.4 |
| Filter paper | Biosharp | BS-TFP-070B | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 (Blotting the solution) |
| Formvar/Carbon supported copper grids | Sigma-Aldrich | TEM-FCF200CU50 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 |
| HEPES powder | Meilunbio | MB6078 | Prepare iodixanol buffers with different concentrations for density gradient centrifugation |
| HRP AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Fdbio science | FDM007 | Western blotting (Secondary Antibody) |
| HRP AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Fdbio science | FDR007 | Western blotting (Secondary Antibody) |
| Incubator shaker | Qiangwen | DHZ-L | Cultivate Escherichia coli |
| Kimwipes™ Delicate Task Wipes | Kimtech Science | 34155 | Wipe the inner wall of the ultracentrifuge tube at Step 4.15 |
| LB broth | Hopebio | HB0128 | Cultivate Escherichia coli |
| Low temperature freezer (-80 °C) | Haier | DW-86L338J | Store the samples |
| Methanol | Alalddin | M116118 | Used in western blotting for activating PVDF membrane at Step 8.5.5 |
| Micro tubes 1.5 mL | KIRGEN | KG2211 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
| Micro tubes 2 mL | KIRGEN | KG2911 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
| Micro tubes 5 mL | BBI | F610888-0001 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
| Microplate reader | Thermo Fisher | Multiskan MK3 | Measure protein content of BEVs at Step 8.2 |
| Millipore filter 0.22 μm | Merck millipore | SLGP033RB | Filtration sterilization; Material: polyethersulfone, PES |
| NaCl | GHTECH | 1.01307.040 | Density gradient centrifugation solution |
| NaOH | GHTECH | 1.01394.068 | Density gradient centrifugation solution (pH adjustment) |
| Optima™ XPN-100 | Beckman Coulter | A94469 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
| OptiPrep™ | Serumwerk Bernburg AG | 1893 | Density gradient centrifugation stock solution |
| Orbital Shaker | Youning | CS-100 | Dissolve feces at Step 2 |
| Phosphate buffered saline | Procell | PB180327 | Dissolve feces at Step 2 |
| Pipettor | Eppendorf | 3120000267, 3120000259 | Transfer the solution |
| Plastic pasteur pipette | ABCbio | ABC217003-4 | Remove supernatant in preprocessing at Step 3.4 |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes | Millipore | ISEQ00010, IPVH00010 | Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5 |
| Prefabricated polyacrylamide gel, 4–20% 15 Wells | ACE | F15420Gel | Used in western blotting for protein separation at Step 8.5.2, 8.5.3 |
| Primary antibody diluent | Fdbio science | FD0040 | Used in western blotting at Step 8.5.8 |
| Protein ladder | Fdbio science | FD0672 | Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5 |
| Rapid protein blotting solution | UBIO | UW0500 | Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5 |
| Rotor SW 32 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 369650 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
| Syringe 20 mL, 50 mL | Jetway | ZSQ-20ML, YCXWJZSQ-50 mL | Transfer buffers amd remove supernatant in preprocessing |
| TBS powder | Fdbio science | FD1021 | Used in western blotting at Step 8.5 |
| Transmission electron microscope (TEM) | Hitachi | H-7650 | Morphological observation for BEVs at Step 8.3 |
| Tween-20 | Fdbio science | FD0020 | Used in western blotting at Step 8.5 |
| Ultracentrifuge tube | Beckman | 326823, 355642 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
| Ultra-clean bench | AIRTECH | SW-CJ-2FD | Peform the procedures about liquid handling |
| Water bath | Bluepard | CU600 | Used for measuring protein content of BEVs at Step 8.2.5 |
| ZetaView | Particle Metrix | S/N 21-734, Software ZetaView (version 8.05.14 SP7) | Nanoparticle tracking analysis (NTA) for measuring the particle size and concentrarion of BEVs at Step 8.4 |
References
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