Summary
تصف هذه الدراسة طريقة لعزل وتنقية الحويصلات البكتيرية خارج الخلية (BEVs) المخصبة من البراز البشري عن طريق الطرد المركزي المتدرج الكثافة (DGC) ، وتحدد الخصائص الفيزيائية ل BEVs من التشكل وحجم الجسيمات والتركيز ، وتناقش التطبيقات المحتملة لنهج DGC في البحث السريري والعلمي.
Abstract
الحويصلات البكتيرية خارج الخلية (BEVs) هي حويصلات نانوية مشتقة من البكتيريا التي تلعب دورا نشطا في التواصل بين البكتيريا والبكتيريا والبكتيريا المضيفة ، حيث تنقل الجزيئات النشطة بيولوجيا مثل البروتينات والدهون والأحماض النووية الموروثة من البكتيريا الأم. BEVs المشتقة من ميكروبيوتا الأمعاء لها تأثيرات داخل الجهاز الهضمي ويمكن أن تصل إلى أعضاء بعيدة ، مما يؤدي إلى آثار كبيرة على علم وظائف الأعضاء وعلم الأمراض. تعد التحقيقات النظرية التي تستكشف أنواع وكميات وأدوار BEVs المشتقة من البراز البشري ضرورية لفهم إفراز ووظيفة BEVs من ميكروبات الأمعاء. تتطلب هذه التحقيقات أيضا تحسين الاستراتيجية الحالية لعزل وتنقية BEVs.
قامت هذه الدراسة بتحسين عملية عزل وتنقية BEVs من خلال إنشاء وضعين للطرد المركزي المتدرج الكثافة (DGC): من أعلى إلى أسفل ومن أسفل إلى أعلى. تم تحديد التوزيع المخصب للخلايا الكهربائية في الكسور من 6 إلى 8 (F6-F8). تم تقييم فعالية النهج بناء على مورفولوجيا الجسيمات والحجم والتركيز ومحتوى البروتين. تم حساب معدلات استرداد الجسيمات والبروتين ، وتم تحليل وجود علامات محددة لمقارنة استعادة ونقاء وضعي DGC. أشارت النتائج إلى أن وضع الطرد المركزي من أعلى إلى أسفل كان له مستويات تلوث أقل وحقق معدل استرداد ونقاء مماثل لمعدل الطرد من أسفل إلى أعلى. كان وقت الطرد المركزي البالغ 7 ساعات كافيا لتحقيق تركيز BEV برازي يبلغ 108 / ملغ.
بصرف النظر عن البراز ، يمكن تطبيق هذه الطريقة على أنواع سوائل الجسم الأخرى مع التعديل المناسب وفقا للاختلافات في المكونات واللزوجة. في الختام ، من شأن هذا البروتوكول المفصل والموثوق به أن يسهل عزل وتنقية BEVs الموحدة ، وبالتالي ، يضع أساسا لتحليل متعدد الأوميكس والتجارب الوظيفية اللاحقة.
Introduction
تعرف الأمعاء على نطاق واسع بأنها العضو الذي يؤوي المجتمعات الميكروبية الأكثر وفرة في جسم الإنسان ، حيث يشارك أكثر من 90٪ من البكتيريا في الاستعمار والتكاثر 1,2. أظهرت أدلة واسعة النطاق أن ميكروبيوتا الأمعاء تعدل البيئة الدقيقة للأمعاء وتتفاعل في نفس الوقت مع الخلل الوظيفي في الأعضاء البعيدة ، في المقام الأول من خلال ضعف الحاجز المعوي 3,4. تشير الأدلة المتزايدة إلى وجود علاقة بين اختلال توازن ميكروبيوتا الأمعاء وتطور مرض التهاب الأمعاء (IBD) 5,6 ، وكذلك الاضطرابات المعرفية من خلال محور الأمعاءوالدماغ 5،6،7،8. تلعب الحويصلات البكتيرية خارج الخلية (BEVs) التي تنتجها البكتيريا أدوارا مهمة في هذه العمليات المرضية.
BEVs هي جسيمات نانوية تغلف المشتقات البكتيرية ، بأقطار تتراوح من 20 إلى 400 نانومتر. لقد ثبت أنها تسهل التفاعلات بين البكتيريا والكائنات الحية المضيفةلها 9,10. على الرغم من عدم ظهورها ، فقد حظيت هذه الجسيمات باهتمام متزايد من الباحثين بسبب تطبيقاتها الواسعة المحتملة كمؤشرات حيوية تشخيصية وأهداف علاجية ومركبات توصيل الأدوية11. البراز البشري ، الذي يستخدم غالبا كعينات حيوية لدراسة BEVs ، والذي يتم الحصول عليه في الغالب من بكتيريا الأمعاء ، يحتوي على مزيج معقد من الماء والبكتيريا والدهون والبروتينات وبقايا الطعام غير المهضومة والخلايا الظهارية المقشرة وغيرها. يشكل تكوين البراز المعقد تحديات لعزل ونقاء BEVs ، مما يعيق إجراء تحليل شامل وموضوعي وواقعي ل BEVs. ومن ثم ، ظهرت استراتيجيات فعالة لتقليل التداخل من المكونات الملوثة وتعزيز إنتاجية BEVs كقضايا حاسمة تستحق الاهتمام الفوري.
تعتمد استراتيجيات العزل الحالية إلى حد كبير على تقنيات مثل الطرد المركزي فائق السرعة (UC) ، والطرد المركزي المتدرج الكثافة (DGC) ، وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) 12،13،14،15،16،17. حاليا ، تعد DGC واحدة من أكثر الطرق المطبقة على نطاق واسع في مجال فصل BEV ، وتشمل وضعين عائمين للترسيب ، "من أعلى إلى أسفل" و "من أسفل إلى أعلى" ، والتي يتم تحديدها من خلال موضع التحميل الأولي للعينة. تميز هذه المنهجيات الحويصلات خارج الخلية (EVs) عن المكونات الأخرى بناء على تفاوتات الحجم والكثافة ، مما ينتج عنه معدلات نقاء واسترداد متغيرة. أشارت الأبحاث السابقة إلى أن استراتيجيات النهج الواحد غير كافية لفصل EVs بشكل مناسب عن البروتينات القابلة للذوبان في عينات سوائل الجسم ، مثل البروتين الدهني في الدم18 وبروتين Tamm-Horsfall في البول19. بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما يتداخل توزيع حجم الحويصلات خارج الخلية حقيقية النواة (EEVs) مع توزيع BEVs ، مما يستلزم المزيد من التحسينات المنهجية لتحسين إنتاجية BEV. وبالتالي ، فإن النهوض بدراسة BEVs يتوقف على تطوير منهجيات فعالة للفصل والتنقية. والجدير بالذكر أن Tulkens etal 15 استخدم استراتيجية فيزيائية حيوية متعامدة لفصل BEVs البرازية عن EEVs ، حيث كان وقت الطرد المركزي لوضع DGC من أسفل إلى أعلى يصل إلى 18 ساعة. في المقابل ، خفضت هذه الدراسة إلى 7 ساعات ، مما أدى إلى توفير وقت الطرد المركزي الفائق التدرج بشكل كبير وتبسيط العملية.
في هذه الدراسة ، قمنا بعزل وتنقية BEVs البرازية باستخدام وضعين DGC في ظل ظروف عازلة محسنة ، بعد إثراء BEVs بمجموعة من سرعات الطرد المركزي التفاضلية ، من السرعة المنخفضة إلى السرعة العالية للغاية. أشارت التقييمات القائمة على التشكل وحجم الجسيمات والتركيز إلى أداء جدير بالثناء من خلال هذه الطريقة المعززة. يمكن أن تكون هذه الدراسة بمثابة أساس للبحث المستقبلي ، وتوسيع تطبيقاتها إلى مجال أوسع ، وتقديم رؤى حول عدم تجانس BEVs داخل جسم الإنسان. كما أنه يساهم في توحيد تقنيات فصل وتحليل BEV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أقرت لجنة الأخلاقيات في مستشفى نانفانغ ، الجامعة الطبية الجنوبية ، هذه الدراسة ، التي أجريت بموافقة مستنيرة من المشاركين. التزمت جميع الطرق المستخدمة هنا بإرشادات التشغيل القياسية التي توفرها المعايير الدولية للميكروبيوم البشري (IHMS: http://www.microbiome-standards.org/). تم تكليف جميع إجراءات مناولة السوائل اللاحقة بأن يتم تنفيذها داخل خزانة السلامة البيولوجية أو مقعد فائق النظافة.
1. جمع واقتباس عينات البراز
- قم بتوزيع عينات البراز ، وكيس مغلق ، وصندوق مثلج ، وقدم تعليمات شاملة للمشاركين حول كيفية شراء العينات وحفظها.
- اطلب من كل مشارك جمع عينة البراز الخاصة به باستخدام جهاز أخذ العينات المقدم ، ونقلها إلى المختبر عند درجة حرارة 4 درجات مئوية في غضون 24 ساعة.
- عند الاستلام في المختبر ، استخدم ملعقة معقمة لقسمة أقل من 3.5 غرام من البراز في أنبوب طرد مركزي 50 مل تم وزنه مسبقا. قم بتدوين وزن عينة البراز على الأنبوب لإجراءات ما قبل المعالجة اللاحقة.
نقطة التوقف: إذا لم تكن المعالجة الفورية للعينات ممكنة ، فقم بتخصيص العينة للتخزين طويل الأجل عند -80 درجة مئوية بعد التدوين المناسب.
2. إعداد عينة البراز
- برد 500 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) عند 4 درجات مئوية. قم بتصفية PBS المبرد مسبقا من خلال مرشح Polyethersulfone (PES) 0.22 ميكرومتر باستخدام حقنة 50 مل في عشرة أنابيب طرد مركزي سعة 50 مل.
- ضع أنبوبين سعة 50 مل على الجليد ، يحتوي كل منهما على 3.5 جم من عينات البراز. أضف 35 مل من برنامج تلفزيوني لكل أنبوب.
ملاحظة: احسب الكمية المطلوبة من PBS لإذابة البراز ، مع ضمان تركيز العينة الأقصى بنسبة 10٪ (وزن / حجم). في حالة معالجة عينات إضافية ، استخدم المزيد من الأنابيب حسب الحاجة. - رج العينات عند 300 دورة في الدقيقة لمدة 2 ساعة عند 4 درجات مئوية ، أو ضعها لمدة 8 ساعات على الأقل عند 4 درجات مئوية حتى يتم تعليق البراز تماما بشكل واضح.
3. الطرد المركزي السرعة التفاضلية
- قم بتبريد جهاز الطرد المركزي المبرد عالي السرعة إلى 4 درجات مئوية.
- اضبط وزن الأنبوبين اللذين يحتويان على العينات المحضرة في الخطوة 2.3 مع برنامج تلفزيوني للوصول إلى وزن إجمالي قدره 0.1 جم.
- أجهزة الطرد المركزي العينات في 3،000 × غرام لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
- ماصة بعناية طاف في اثنين من أنابيب الطرد المركزي نظيفة 50 مل ، وترك ما يقرب من 1 مل فوق بيليه. استخدم ماصة باستور بلاستيكية يمكن التخلص منها لهذه العملية.
- اضبط وزن الأنبوبين باستخدام PBS للوصول إلى الوزن الإجمالي في حدود ± 0.1 جم.
- أجهزة الطرد المركزي المادة الطافية المنقولة عند 12،000 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
- نضح المادة الطافية باستخدام حقنة سعة 20 مل ، وإزالة إبرة المحقنة ، وترشيحها من خلال مرشحات 0.22 ميكرومتر في أنابيب سعة 50 مل. عند هذه النقطة ، يجب أن يكون حجم الطافي حوالي 30 مل.
ملاحظة: إذا كانت كمية كبيرة من الشوائب لا تزال مرئية بعد الطرد المركزي 12000 × جرام ، فمن الضروري تكرار خطوة الطرد المركزي عند 12000 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. قد يؤدي عدم القيام بذلك إلى خسارة كبيرة في BEVs بسبب انسداد المسام أثناء الترشيح.
4. الطرد المركزي فائق السرعة
- نظف الدوار والدلو عن طريق مسحهما بالكحول بنسبة 75٪ (v / v) للتخلص من أي تلوث متبقي.
- ضع أنبوب طرد مركزي فائق سعة 38.5 مل في حامل الأنبوب.
ملاحظة: حدد أنبوب الطرد المركزي الفائق المناسب بناء على حجم العينة. تجنب الأشعة فوق البنفسجية والكواشف الكيميائية غير المناسبة لتعقيم أنابيب الطرد المركزي كما هو موضح في دليل المنتج. - انقل ما يقرب من 30 مل من طافي البراز المصفى من الخطوة 3.7 إلى أنبوب الطرد المركزي الفائق.
- املأ أنبوب الطرد المركزي الفائق بحوالي 8 مل من PBS ، تاركا فجوة 3 مم من فتحة الأنبوب.
- ضع أنبوبي الطرد المركزي الفائق مع العينات في دلاء الطرد المركزي الفائق المتعارضة ، على سبيل المثال ، يتوافق الجرافة 1 مع 4 (1-4) ، 2-5 ، 3-6.
- اضبط وزن الجرافتين باستخدام PBS لتحقيق وزن إجمالي في حدود ± 0.005 جم.
- قم بتثبيت جميع الجرافات على الدوار ، بغض النظر عما إذا كانت الأنابيب محملة أم لا.
- بدء الفراغ والطرد المركزي العينات عند 160000 × جم لمدة 70 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
- حرر مكنسة الحجرة ، وافتح الباب بمجرد عرض Ready على الصفحة الرئيسية للأداة.
- قم بإزالة الدوار من جهاز الطرد المركزي الفائق.
- انقل الدلاء من الدوار إلى الحامل ، واسترد الأنابيب باستخدام القراص.
- تخلص من المادة الطافية ، والتي ستحتوي على كريات بنية مرئية في الأسفل.
- أعد تعليق الكريات عن طريق سحبها بشكل متكرر لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة 1,000 ميكرولتر مع 1 مل من برنامج تلفزيوني مبرد مسبقا (4 درجات مئوية) حتى يتم تعليقه تماما. املأ الأنبوب بحوالي 37 مل من PBS ، تاركا فجوة 3 مم من الفتحة.
- قم بإجراء طرد مركزي فائق آخر باتباع الخطوات 4.5-4.11 عند 160000 × جم لمدة 70 دقيقة عند 4 درجات مئوية لإزالة المكونات الملوثة المرفقة جزئيا من جدران الأنبوب.
- تخلص من المادة الطافية ، واقلب أنبوبي الطرد المركزي الفائق لمدة 5 دقائق ، وقم بإزالة أي محلول متبقي على الجدار الداخلي باستخدام المساحات.
ملاحظة: تنظيف الجدار الداخلي يقلل من التداخل من التلوث المتبقي الملتصق بجدار أنبوب الطرد المركزي الفائق. اختر المساحات التي لن تؤثر على تحليل BEV ، خاصة فيما يتعلق بحجم الجسيمات. - أعد تعليق الكريات في كل أنبوب عن طريق سحبها لأعلى ولأسفل باستخدام 1.2 مل من PBS المبرد مسبقا (4 درجات مئوية) باستخدام ماصة 1,000 ميكرولتر.
- انقل 1.2 مل من محلول PBS / BEV من أنبوب طرد مركزي فائق إلى أنبوب دقيق نظيف سعة 1.5 مل.
نقطة التوقف: يمكن أن ينتقل حل PBS / BEV الذي تم جمعه من أنبوب طرد مركزي فائق إلى الخطوة 6. قم بتخزين المحلول من الأنبوب الآخر عند -80 درجة مئوية.
5. إعداد الحل للطرد المركزي تدرج الكثافة
- تحضير 0.02 م HEPES عازلة
- امزج 0.477 جم من مسحوق HEPES و 0.8 جم من كلوريد الصوديوم مع 90 مل من الماء منزوع الأيونات المعقم.
- اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.2 بإضافة 1 M هيدروكسيد الصوديوم (NaOH). ارفع الحجم إلى 100 مل بالماء منزوع الأيونات وقم بتصفية المحلول من خلال أغشية PES 0.22 ميكرومتر.
تنبيه: هيدروكسيد الصوديوم هو قلوي كاوي قوي. يجب على المشغلين التعامل معها وإعدادها بعناية في خزانة الدخان.
- إعداد المخزن المؤقت لتدرج الكثافة
- احسب الحجم المطلوب لكل مخزن مؤقت لتدرج الكثافة بناء على عدد أنابيب الطرد المركزي الفائقة للطرد المركزي المتدرج الكثافة (الخطوة 6) (في هذا البروتوكول ، كانت أحجام حلول التدرج 60٪ و 50٪ و 40٪ و 20٪ و 10٪ 2.5 مل و 3 مل و 6 مل و 6 مل و 6 مل على التوالي).
- لتحضير محلول عمل يوديكسانول بنسبة 50٪ (وزن / حجم) ، امزج محلول تخزين HEPES 0.02 M ومحلول مخزون يوديكسانول 60٪ (وزن / حجم) بنسبة حجم 1: 5 (0.5 مل: 2.5 مل).
ملاحظة: استخدم حقنة سعة 20 مل يمكن التخلص منها لسحب محلول مخزون اليوديكسانول وتجنب إدخال الهواء. - لتحضير مخازن اليوديكسانول بتركيزات مختلفة ، ادمج محلول عمل اليوديكسانول بنسبة 50٪ من الخطوة 5.2.2 مع المخزن المؤقت HEPES الذي تم الحصول عليه في الخطوة 5.1 باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر وفقا للنسب الموضحة في الجدول 1.
ملاحظة: قم بتنفيذ الخطوة 5 على مقعد فائق النظافة مع إطفاء الأنوار. قم بتخزين محلول مرق اليوديكسانول المفتوح في الثلاجة على حرارة 4 درجات مئوية لمنع نمو البكتيريا. حافظ على محلول اليوديكسانول والمخزن المؤقت HEPES محميين من الضوء.
6. إنشاء نظام طرد مركزي متدرج الكثافة
- وضع DGC من أعلى إلى أسفل
- اجمع بين 500 ميكرولتر من محلول PBS / BEV المعزول من الخطوة 4 مع 3 مل من PBS. امزج المحاليل برفق باستخدام ماصة سعة 1000 ميكرولتر للحصول على 3.5 مل من محلول PBS / BEV.
- ضع أنبوب طرد مركزي فائق سعة 31 مل على صفيحة رغوية بها ثقوب وقم بتسميتها ك "↓".
- أضف عموديا 3 مل من محلول اليوديكسانول بنسبة 50٪ إلى قاع الأنبوب باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر.
- قم بإمالة الأنبوب إلى زاوية 70 درجة وضع حامل أنبوب أو أي دعم آخر أعلى قليلا من مستوى لوحة الرغوة ، أسفل فتحة الأنبوب.
- أضف 3 مل من محلول يوديكسانول 40٪ فوق محلول يوديكسانول 50٪ باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر.
- أضف 3 مل من محلول يوديكسانول 20٪ فوق محلول يوديكسانول 40٪ باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر.
- أضف 3 مل من محلول يوديكسانول 10٪ فوق محلول يوديكسانول 20٪ باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر.
- أضف 3.5 مل من محلول PBS / BEV من الخطوة 6.1.1 فوق محلول اليوديكسانول 10٪ باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر.
- أعد الأنابيب برفق إلى الوضع الرأسي.
ملاحظة: بعد السحب ، يجب أن يكون التقسيم الطبقي مرئيا.
- وضع DGC من أسفل إلى أعلى
- ضع أنبوب طرد مركزي فائق سعة 31 مل على صفيحة رغوية بها ثقوب وقم بتسميتها ك "↑".
- أضف عموديا 2.5 مل من محلول مخزون اليوديكسانول بنسبة 60٪ إلى قاع الأنبوب. امزجه برفق مع 500 ميكرولتر من محلول PBS / BEV المعزول من الخطوة 4 باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر للحصول على 3 مل من محلول يوديكسانول / BEV بنسبة 50٪.
- قم بإمالة الأنبوب إلى زاوية 70 درجة وضع حامل أنبوب أو أي دعم آخر أعلى قليلا من مستوى لوحة الرغوة ، أسفل فتحة الأنبوب.
- أضف 3 مل من محلول اليوديكسانول 40٪ فوق محلول يوديكسانول / BEV بنسبة 50٪ باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر.
- أضف 3 مل من محلول اليوديكسانول 20٪ فوق محلول اليوديكسانول 40٪ باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر.
- أضف 3 مل من محلول اليوديكسانول 10٪ فوق محلول اليوديكسانول 20٪ باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر.
- أضف 3.5 مل من PBS فوق محلول اليوديكسانول 10٪ باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر.
- أعد الأنابيب برفق إلى الوضع الرأسي.
- في هذه المرحلة ، بقي 200 ميكرولتر من التعليق الذي تم الحصول عليه في الخطوة 4.17 ، والذي يمكن تحليله لاحقا كمجموعة تسمى "UC".
ملاحظة: عند نقل الحلول في الخطوة 6 ، احتفظ دائما بطرف الماصة مقابل جدار أنبوب الطرد المركزي الفائق عموديا على محور الأنبوب.
7. كثافة الطرد المركزي التدرج وجمع الكسور
- اضبط وزن الأنبوبين باستخدام PBS لتحقيق وزن إجمالي في حدود ± 0.005 جم.
- ضع الأنابيب في الدلاء وفقا للخطوة 4.5 وعرضها للطرد المركزي عند 160000 × جم لمدة 7 ساعات عند 4 درجات مئوية.
- اجمع الكسور باستخدام ماصة (1000 ميكرولتر) من أعلى إلى أسفل مقابل الجدار الجانبي بالترتيب التالي: 3 مل ، 2 مل ، 1 مل ، 1 مل ، 1 مل ، 1 مل ، 1 مل ، 1 مل ، 1 مل ، 1.5 مل ، و 3 مل في أنبوب طرد مركزي فائق 38.5 مل.
ملاحظة: حافظ على خط الرؤية عند نفس مستوى سطح السائل. - إجراء الطرد المركزي الفائق لكل جزء تم الحصول عليه في الخطوة 7.3 وفقا للخطوة 4 عند 160000 × جم لمدة 70 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
- قم بإزالة المادة الطافية واقلب أنابيب الطرد المركزي الفائقة لمدة 5 دقائق.
- أعد تعليق الكريات في 200 ميكرولتر من PBS المبرد مسبقا (4 درجات مئوية) باستخدام ماصة 200 ميكرولتر.
- انقل محلول PBS / BEV إلى أنبوب دقيق نظيف سعة 1.5 مل.
- قم بتسمية الكسور من F1 إلى F10 وتحليلها بناء على الخطوة 8.
نقطة التوقف: إذا تعذر معالجة العينات التي تم الحصول عليها في الخطوة 7.8 على الفور ، فقم بتخزينها في -80 درجة مئوية.
8. التوصيف والتحليل الكمي للكسور المجمعة
- حدد قيم الامتصاص (OD 340 نانومتر) لكل كسر باستخدام كاشف الصفائح الدقيقة مع عنصر تحكم فارغ لحساب الكثافة المقابلة لها.
ملاحظة: استبدل حل PBS/BEV (الخطوة 6.1.1 والخطوة 6.2.2) ب PBS لإنشاء عنصر تحكم فارغ.- تحضير 100 ميكرولتر لكل من 0٪ و 5٪ و 10٪ و 12.5٪ و 20٪ محلول يوديكسانول مخفف بمقدار 0.02 م HEPES بناء على محلول مخزون 50٪ (الخطوة 5.2.2) كمعايير ، المقابلة لكثافات 1.0058 جم / مل ، 1.0318 جم / مل ، 1.058 جم / مل ، 1.0708 جم / مل ، و 1.111 جم / مل ، على التوالي.
- أضف 50 ميكرولتر من كل كسر من عنصر التحكم الفارغ (المعد في الخطوة 7.3) و 50 ميكرولتر من كل محلول قياسي (تم إعداده في الخطوة 8.1.1) لتكرار آبار صفيحة 96 بئرا.
- اضبط الطول الموجي على 340 نانومتر ، وقم بقياس الكثافة البصرية لنقطة النهاية ، واحسب كثافة كل كسر.
- حدد F4-F9 كنطاق كسور BEV بناء على كثافتها.
- تحديد تركيز البروتين من كسور BEV باستخدام مقايسة حمض bicinchoninic (BCA).
- تمييع المادة عشرة أضعاف في PBS المقدمة من الشركة المصنعة لإعداد محلول بروتين قياسي 0.5 ميكروغرام / ميكرولتر.
- أضف محلول البروتين القياسي (المحضر في الخطوة 8.2.1) بأحجام مختلفة وفقا لتعليمات الكاشف ، واستكمل كل بئر من صفيحة 96 بئرا مع PBS إلى حجم إجمالي يبلغ 20 ميكرولتر.
- أضف 20 ميكرولتر من العينات المحضرة في الخطوة 7.8 والعينات المتبقية بعد UC المحددة في الخطوة 6.2.9 إلى كل بئر.
- امزج الكواشف A و B بنسبة 50: 1 ، وانقل 200 ميكرولتر إلى كل بئر.
- احتضن الطبق في حمام مائي على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- قم بقياس قيمة الامتصاص باستخدام قارئ الصفائح الدقيقة ، واحسب تركيز البروتين (ميكروغرام / ميكرولتر) ، وحدد محتوى البروتين (ميكروغرام) للعينات بناء على المنحنى القياسي (x: الكثافة البصرية ؛ y: تركيز البروتين) الناتج عن قيم المحاليل القياسية المخففة في الخطوة 8.2.2.
- توصيف كسور BEV المحددة في الخطوة 8.1.4 باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) للتحقق من وجود BEVs. يجب تنفيذ جميع الإجراءات أدناه على الجليد.
- ضع 10 ميكرولتر من كل جزء F4-F9 معزول من الخطوة 7.8 والعينات المتبقية بعد UC المحددة في الخطوة 6.2.9 على شبكات نحاسية مدعومة ب Formvar / Carbon لمدة 20 دقيقة ، وصمة عار بورق الترشيح.
- شطف العينات مع 100 ميكرولتر من PBS ثلاث مرات لمدة 1 دقيقة لكل منها ، وصمة عار مع ورقة الترشيح.
- ثبت العينات ب 100 ميكرولتر من 1٪ (وزن / حجم) جلوتارالدهيد لمدة 5 دقائق وصمة عار بورق الترشيح.
- اغسل الشبكات ب 100 ميكرولتر من PBS عشر مرات لمدة 2 دقيقة لكل منها ، وصمة عار بورق الترشيح.
- قم بتلطيخ الشبكات ب 50 ميكرولتر من 1.5٪ (وزن / حجم) أسيتات اليورانيل لمدة 10 دقائق ، وصمة عار بورق الترشيح.
تنبيه: أسيتات اليورانيل مشعة وشديدة السمية عند ملامستها للجلد أو استنشاقها. تعامل مع المحاليل التي تحتوي على أسيتات اليورانيل في خزانة الدخان واتبع تدابير السلامة المناسبة. - انقل الشبكات إلى قطرة ميثيل سلولوز بنسبة 1٪ (وزن / حجم) لمدة 5 دقائق وصمة عار بورق الترشيح.
- قم بتخزين الشبكات المجففة بالهواء في بيئة مظلمة وخالية من الغبار حتى المراقبة.
- التقط الصور وحللها باستخدام TEM.
- قم بتوصيف كسور BEV المحددة في الخطوة 8.1.4 باستخدام تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) لحساب عدد الجسيمات.
- معايرة النظام باستخدام جزيئات البوليسترين 110 نانومتر.
- اغسل مجموعة العينات باستخدام برنامج تلفزيوني.
- قم بتخفيف العينات من الكسور المختلفة المكتسبة في الخطوة 7.8 والعينات المتبقية بعد UC المحددة في الخطوة 6.2.9 إلى تركيز في حدود 105-10 9 جسيمات / مل ، بتركيز محسن قدره 107 جسيمات / مل.
- سجل وحلل في 11 موضعا مع ثلاث نسخ متماثلة ، مع الحفاظ على درجة الحرارة حوالي 23-30 درجة مئوية.
- تحليل محتويات البروتين في العينات عن طريق تلطيخ كوماسي الأزرق اللامع (CBBS) والنشاف الغربي (WB).
- قم بتخفيف عينات BEVs من الكسور المختلفة التي تم الحصول عليها في الخطوة 7.8 والعينات المتبقية بعد UC المحددة في الخطوة 6.2.9 باستخدام PBS ومخزن التحميل المؤقت 5 × إلى تركيز نهائي قدره 0.5 أو 1 ميكروغرام / ميكرولتر ، إذا كانت هناك حاجة إلى الكمية ، مما يضمن تحميل عينة كافية تبلغ 20 ميكرولتر (10 ميكروغرام أو 20 ميكروغرام) لكل بئر في الخطوة 8.5.2. تغلي العينات على حرارة 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- قم بتجميع جل بولي أكريلاميد الجاهز في خزان الرحلان الكهربائي ، ونقل العينات إلى الآبار.
- إجراء الكهربائي العمودي مع المعلمات التالية: 160 فولت لمدة 50 دقيقة.
- قم بتلطيخ الجل في محلول Coomassie الأزرق اللامع لمدة 1 ساعة ، واشطفه بالماء منزوع الأيونات حتى تضيء الخلفية الزرقاء ، والتقط الصور بالكاميرا.
- تنفيذ إجراءات نشاف البروتين للمواد الهلامية الأخرى مع المعلمات التالية: 400 مللي أمبير لمدة 20 دقيقة.
- قم بسد أغشية النشاف بمحلول BSA 5٪ (وزن / حجم) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- اغسل الأغشية في المخزن المؤقت TBST ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها.
- احتضان الأغشية بالأجسام المضادة الأولية (علامات BEV: LPS ، OmpA ، LTA ؛ علامات EEV: CD63 ، CD9 ، TSG-101 ، Syntenin ، Integrin β1 ؛ علامات التلوث الأخرى: فلاجلين ، كالنيكسين) لمدة 8-12 ساعة عند 4 درجات مئوية.
- اغسل الأغشية في المخزن المؤقت TBST ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منها.
- احتضان الأغشية مع الأجسام المضادة الثانوية لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- قم بتنفيذ الخطوة 8.5.9.
- تطوير النشاف باستخدام جهاز التلألؤ الكيميائي.
- استبدل محلول PBS / BEV (الخطوة 6.1.1 والخطوة 6.2.2) ب BEVs من الإشريكية القولونية لإنشاء تحكم إيجابي (انظر جدول المواد لإجراء عزل E. coli-BEVs الخام) ، وإجراء جميع التجارب المذكورة أعلاه لتوصيف BEVs.
نقطة التوقف: حدد F6-F8 كتوزيع للكسور المخصبة ب BEV بناء على نتائج التوصيف الموصوف أعلاه ل BEVs البرازية ، واستخدم هذا النطاق الضيق للتحليل اللاحق.
- حساب معدلات الاسترداد من حيث الجسيمات والبروتينات لتقييم كفاءة وضعي DGC. النتائج أدناه معروضة كنسب مئوية.
- احسب معدلات استرداد الجسيمات في الوضع من أعلى إلى أسفل: إجمالي الجسيمات في F6-F8 / الجسيمات بعد تعريف UC في الخطوة 6.2.9.
- احسب معدلات استرداد الجسيمات في الوضع من أسفل إلى أعلى: إجمالي الجسيمات في F6-F8 / الجسيمات بعد تعريف UC في الخطوة 6.2.9.
- احسب معدلات استرداد البروتينات في الوضع من أعلى إلى أسفل: إجمالي محتويات البروتين في F6-F8 (ميكروغرام) / محتوى البروتين بعد تعريف UC في الخطوة 6.2.9 (ميكروغرام).
- احسب معدلات استرداد البروتينات في الوضع من أسفل إلى أعلى: إجمالي محتويات البروتين في F6-F8 (ميكروغرام) / محتوى البروتين بعد تعريف UC في الخطوة 6.2.9 (ميكروغرام).
- احسب نسبة الجسيمات / البروتين لتقييم النقاء المحدد تقليديا ل UC ووضعي DGC ، وتم تقديم جميع النتائج أدناه كنسب مئوية.
- نسبة الجسيمات / البروتين بعد UC المحددة في الخطوة 6.2.9: الجسيمات بعد UC / محتوى البروتين بعد UC (ميكروغرام).
- نسبة الجسيمات / البروتين في الوضع من أعلى إلى أسفل: إجمالي الجسيمات في F6-F8 / محتوى البروتين في F6-F8 (ميكروغرام).
- نسبة الجسيمات / البروتين في الوضع من أسفل إلى أعلى: إجمالي الجسيمات في F6-F8 / محتوى البروتين في F6-F8 (ميكروغرام).
- حدد وضع الطرد المركزي الأنسب (تم تحديد الوضع من أعلى إلى أسفل في البروتوكول) لتنقية البراز BEV والتحليل المستقبلي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تحديد توزيع الكسور المخصبة بالطاقة الكهربائية الهجينة
لتحديد توزيع الحويصلات البكتيرية خارج الخلية (BEVs) - الكسور المخصبة ، تم إنشاء عنصر تحكم فارغ لقياس قيم الامتصاص عند OD 340 نانومتر ، وتم حساب كثافة كل جزء بناء على القياسات وإرشادات اليوديكسانول (الخطوة 8.1). يعرض الجدول 2 نتائج الكثافة ، مما يدل على أن الكسور F4 إلى F9 أظهرت كثافات ضمن النطاق المرتبط عادة بالحويصلات خارج الخلية. تشير هذه النتيجة إلى أن غالبية BEVs تم عزلها في هذه الكسور ، مما أدى إلى تعريف F4-F9 على أنه النطاق التقريبي ل BEVs. تم استخدام المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) لتوصيف السمات المورفولوجية ل BEVs البرازية المعزولة كما هو موضح في الشكل 1 في الكسور F4-F9. كشفت صور TEM (الشكل 2) عن وجود هياكل كلاسيكية على شكل كوب ، والتي تتميز بها BEVs. تم إجراء تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) ومقايسة حمض البيسينتشونينيك (BCA) لتحديد عدد الجسيمات وتركيز البروتين ، على التوالي ، مما يسمح بإجراء مزيد من التقييم لمعدلات الاسترداد والنقاء. يعرض الشكل 3 تركيزات البروتين والجسيمات لكل كسر ، مما يشير إلى أن F6 و F7 أظهرا أعلى تركيزات ، تليهما F5 و F8. بعد ذلك ، تم إجراء تلطيخ Coomassie الأزرق اللامع (CBBS) والنشاف الغربي (WB) لتوفير تحليل شامل للبروتين. كانت نتائج CBBS متسقة مع نتائج تركيز البروتين ، حيث أظهر F6 و F7 النطاقات الأكثر كثافة (الشكل 4). لتأكيد توزيع BEVs ، تم استخدام الحويصلات خارج الخلية المشتقة من الإشريكية القولونية كعنصر تحكم إيجابي (محدد في الخطوة 8.5.13). اتبعت إجراءات العزل والتنقية الخطوات الموضحة في جدول المواد وأقسام البروتوكول المذكورة أعلاه (الخطوتان 3 و 4). أكد تحليل WB كذلك وجود بروتين الغشاء الخارجي A (OmpA) ، وهو مكون رئيسي للغشاء الخارجي للبكتيريا وعلامة محددة ل BEVs ، في الكسور F6-F8. بناء على هذه النتائج ، تم تعريف الكسور F6-F8 على أنها كسور غنية ب BEV مناسبة للتجارب والتحليلات اللاحقة.
التحقق من نطاق عرض مكونات التداخل
تم تحديد الحويصلات خارج الخلية حقيقية النواة (EEVs) ، والتي تمتلك حجما وكثافة مماثلين ل BEVs ، على أنها تداخل رئيسي في تحليل BEVs. لمعالجة هذا ، تم فحص ثلاثة بروتينات EEV في الكسور 5-8 من كل من الوضعين من أعلى إلى أسفل ومن أسفل إلى أعلى ، مع أوقات طرد مركزي تبلغ 7 ساعات و 15 ساعة. تم اكتشاف CD63 ، وهو بروتين عبر الغشاء مرتبط ب EV ، في الغالب في F5 ، بينما تم إثراء علامة BEV LPS في الكسور 6-7. لوحظ هذا النمط في كلا الوضعين ، على الرغم من أن الوضع من أسفل إلى أعلى أظهر نطاقات طفيفة ل CD63-EEVs في F7. ومع ذلك ، فإن علامات EEV الأخرى ، CD9 و TSG-101 ، لم تظهر إشارات مرئية في هذه الكسور بغض النظر عن الأوضاع أو أوقات الطرد المركزي. في مشروع تجريبي مستقل ، تم استخدام الأجسام المضادة التي تستهدف Syntenin و Integrin β1 للتأكد من إثراء علامات البروتين المميزة المتأصلة في EEVs عبر الكسور 5-8. تم اكتشاف Syntenin بشكل بارز داخل F5 ، لا سيما في نطاق النهج من أعلى إلى أسفل ، في حين تم تمييز وجود Integrin β1 داخل F6 (الشكل 5). لمزيد من التقييم لوجود الجسيمات المتداخلة ، تم إدخال البروتين الدهني منخفض الكثافة المسمى Dil (Dil-LDL) في نظام تدرج الكثافة ، وتم قياس شدة التألق عبر جميع الكسور. في الوضع من أعلى إلى أسفل ، أظهرت الكسور 1-4 قيم مضان أعلى نسبيا ، بينما في الوضع من أسفل إلى أعلى ، كانت F1-F6 هي التي أظهرت كثافة أعلى (الشكل 6).
تقييم معدلات الاسترداد ونقاء وضعين DGC من التركيز وحجم الجسيمات وعلامات BEVs
بعد تحديد كسور F6-F8 كأجزاء غنية ب BEV ، تم تقييم معدلات الاسترداد ونقاء وضعي الطرد المركزي المتدرج الكثافة (DGC). تمت مقارنة أحجام الجسيمات للأجزاء المخصبة ب BEV التي تم الحصول عليها من الوضع من أعلى إلى أسفل ، والوضع من أسفل إلى أعلى ، والطرد المركزي الفائق (UC) وحده. تراوحت أحجام الجسيمات المرصودة في كلا وضعي الطرد المركزي من 90 إلى 300 نانومتر ، بما يتماشى مع القطر المحدد ل BEVs (الشكل 7). بعد ذلك ، تم حساب معدلات استرداد الجسيمات والبروتين للنمطين بناء على تركيزات الجسيمات والبروتين قبل وبعد DGC (الجدول 3 والشكل 8). والجدير بالذكر أن الوضع من أسفل إلى أعلى أظهر معدلات استرداد أعلى مقارنة بالوضع الآخر. في مجموعة تجريبية منفصلة ، تم تقييم استعادة البروتين في الوضعين في أوقات طرد مركزي مختلفة من 7 ساعات و 15 ساعة. الأهم من ذلك ، لم يكن هناك فرق ذو دلالة إحصائية في محتوى البروتين داخل كسور F6-F8 بعد DGC بين وقتي الطرد المركزي ، بغض النظر عن وضع التدرج المستخدم (الشكل 9). تم حساب نسبة الجسيمات / البروتين لتوفير تقييم تقريبي للنقاء في الوضعين. أشارت البيانات إلى عدم وجود فرق كبير في النقاء بين الأوضاع. بالإضافة إلى ذلك ، تم إجراء تلطيخ Coomassie الأزرق اللامع (CBBS) والنشاف الغربي (WB) لمزيد من مقارنة النقاء ، مع التركيز على ثلاث علامات BEV (LPS و OmpA و LTA) ، وعلامة EEV واحدة (CD63) ، وعلامتين ملوثتين (Calnexin ، Flagellin). أظهرت النتائج انخفاضا جزئيا في المواد المتداخلة بعد DGC ، حيث أظهر LPS و OmpA وجودا أكثر بروزا في كل من أوضاع DGC مقارنة ب UC وحده (الشكل 10).
الشكل 1: سير العمل التخطيطي لعزل وتنقية BEVs. الاختصارات: BEVs = الحويصلات البكتيرية خارج الخلية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: صور TEM تمثيلية لكسور BEV. (أ) صور TEM للمركبات الكهربائية المعزولة بعد UC. (B) صور TEM للمركبات الكهربائية المعزولة بعد DGC باستخدام الوضع من أعلى إلى أسفل. (C) صور TEM للمركبات الكهربائية المعزولة بعد DGC باستخدام الوضع من أسفل إلى أعلى. تم تقديم جميع الصور بمقياس ثابت يبلغ 200 نانومتر. الاختصارات: TEM = المجهر الإلكتروني النافذ ؛ BEVs = الحويصلات البكتيرية خارج الخلية. UC = الطرد المركزي الفائق. DGC = الطرد المركزي المتدرج الكثافة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تركيز البروتين والجسيمات لكسور BEV بعد أوضاع DGC من أعلى إلى أسفل ومن أسفل إلى أعلى. تم تحديد تركيز البروتين لكسور BEV باستخدام BCA ويمثله الأشرطة الرمادية. تم قياس تركيز الجسيمات باستخدام NTA ويمثله الأشرطة الزرقاء. الاختصارات: BEV = حويصلة بكتيرية خارج الخلية. DGC = الطرد المركزي المتدرج الكثافة ؛ BCA = مقايسة حمض البيسينتشونينيك ؛ NTA = تحليل تتبع الجسيمات النانوية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تحديد الكسور المخصبة ب BEV. (أ) تم إجراء CBBS لتحديد الكسور المخصبة ب BEVs البرازية في كل من الوضعين من أعلى إلى أسفل ومن أسفل إلى أعلى. (ب) تم عزل المركبات الكهربائية المشتقة من الإشريكية القولونية وتنقيتها واستخدامها كعنصر تحكم إيجابي في WB لتأكيد وجود وتوزيع BEVs. OmpA: بروتين الغشاء الخارجي A ، علامة BEV. الاختصارات: BEV = حويصلة بكتيرية خارج الخلية. CBBS = تلطيخ أزرق لامع كوماسي ؛ EVs = حويصلات خارج الخلية ؛ WB = النشاف الغربي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تأكيد توزيع EEV. تحليل اللطخة الغربية للكسور 5-8 التي تم الحصول عليها من أوضاع DGC من أعلى إلى أسفل ومن أسفل إلى أعلى مع فترات طرد مركزي فائقة التدرج بكثافة مختلفة ، 7 ساعات (أ) و 15 ساعة (ب). وأجريت تجربة مستقلة ركزت على الطرد المركزي من F5 إلى F8 نتيجة لفترة طرد مركزي مدتها 7 ساعات، كما هو موضح في الفقرتين (جيم) و (دال). تضمنت العلامات المختارة تلك المرتبطة ب BEVs (LPS) و EEVs (CD63 و CD9 و TSG-101 و Syntenin و Integrin β1). الاختصارات: DGC = الطرد المركزي المتدرج الكثافة. BEV = حويصلة بكتيرية خارج الخلية ؛ EEV = حويصلة خارج الخلية حقيقية النواة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: توزيع البروتين الدهني منخفض الكثافة. تمت إضافة البروتين الدهني منخفض الكثافة المسمى Dil (Dil-LDL) ، والذي يعتبر علامة تلوث ، بتركيز 10 ميكروغرام إلى نظام التدرج في كل من الوضعين من أعلى إلى أسفل ومن أسفل إلى أعلى. استبدل Dil-LDL حل PBS / BEV (الخطوة 6.1.1 والخطوة 6.2.2) لإنشاء نموذج كشف. تم قياس شدة التألق لكل كسر باستخدام كاشف صفيحة مجهرية بطول موجة إثارة / انبعاث يبلغ 549/565 نانومتر. اختصار: BEV = حويصلة بكتيرية خارج الخلية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: أحجام الجسيمات للكسور المخصبة بالطاقة الكهربائية. (أ) توزيع حجم الجسيمات للمركبات الكهربائية الخام التي تم الحصول عليها بعد الاتصالات الموحدة. (ب) توزيع حجم الجسيمات للأجزاء المخصبة بالطاقة الكهربائية (F6-F8) التي تم الحصول عليها باستخدام أسلوب الطرد المركزي المتدرج الكثافة من أعلى إلى أسفل (DGC). (C) تم الحصول على توزيع حجم الجسيمات للأجزاء المخصبة ب BEV (F6-F8) باستخدام وضع DGC من أسفل إلى أعلى. تم إجراء NTA لتحديد أبعاد الجسيمات. كانت عوامل التخفيف المستخدمة للألواح (A-C) هي 10,000 و 2,000 و 5,000 ، في المقابل ، مع معايرة النتائج المترتبة على ذلك. الاختصارات: BEV = حويصلة بكتيرية خارج الخلية. UC = الطرد المركزي الفائق. DGC = الطرد المركزي المتدرج الكثافة ؛ NTA = تحليل تتبع الجسيمات النانوية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: معدلات استرداد البروتين والجسيمات لأوضاع DGC من أعلى إلى أسفل ومن أسفل إلى أعلى. (أ) معدلات استرداد البروتين للطريقتين محسوبة على أنها نسبة تركيز البروتين بعد وقبل DGC (UC). (ب) يتم حساب معدلات استعادة الجسيمات في الوضعين بنسبة تركيز الجسيمات بعد وقبل DGC (UC). (ج) نسب الجسيمات / البروتين في أوضاع UC ومن أعلى إلى أسفل ومن أسفل إلى أعلى. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± SEM. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام اختبار t ثنائي الطرف وغير مزاوج للألواح A و B ، وتحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) مع اختبار Tukey اللاحق للوحة C. لم يلاحظ أي اختلافات ذات دلالة إحصائية. الاختصارات: DGC = الطرد المركزي المتدرج الكثافة. UC = الطرد المركزي الفائق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 9: مقارنة استعادة البروتين بناء على أوضاع DGC من أعلى إلى أسفل ومن أسفل إلى أعلى باستخدام أوقات طرد مركزي فائقة مختلفة مرتبطة بالكثافة. تم تقييم معدلات استرداد البروتين في الكسور F6-F8 التي تم الحصول عليها من الطرد المركزي الفائق المتدرج لمدة 7 ساعات و 15 ساعة في تجارب مستقلة باستخدام كل من الوضعين من أعلى إلى أسفل ومن أسفل إلى أعلى. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± SEM. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام تحليل التباين ثنائي الاتجاه (ANOVA) مع اختبار فيشر للفرق الأقل أهمية. لم يلاحظ أي اختلافات ذات دلالة إحصائية. الاختصارات: DGC = الطرد المركزي المتدرج الكثافة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 10: تقييم نقاء أوضاع DGC من أعلى إلى أسفل ومن أسفل إلى أعلى. (أ) تم إجراء CBBS لمقارنة توزيع البروتين في أوضاع UC و من أعلى إلى أسفل ومن أسفل إلى أعلى. (ب) تم إجراء WB لتقييم نقاء أوضاع UC و من أعلى إلى أسفل ومن أسفل إلى أعلى. Calnexin: علامة البروتين المرتبطة بالشبكة الإندوبلازمية. فلاجلين ، علامة البروتين الملوثة من البكتيريا. CD63: علامة البروتين عبر الغشاء للحويصلات خارج الخلية حقيقية النواة. LTA: علامة BEVs من البكتيريا إيجابية الجرام ؛ LPS ، OmpA: علامات BEVs من البكتيريا سالبة الجرام. الاختصارات: DGC = الطرد المركزي المتدرج الكثافة. UC = الطرد المركزي الفائق. CBBS = تلطيخ أزرق كوماسي اللامع ؛ WB = النشاف الغربي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| تركيز محلول يوديكسانول (٪) | 0.02 م المخزن المؤقت HEPES | 50٪ يوديكسانول حل العمل |
| 40 | 1 | 4 |
| 20 | 3 | 2 |
| 10 | 4 | 1 |
الجدول 1: نسب تحضير مخازن تدرج كثافة اليوديكسانول. قدم الجدول نسبة 0.02 M HEPES buffer و 50٪ محلول عمل يوديكسانول للحصول على تركيز معين من محلول اليوديكسانول.
| إف 1 | إف 2 | إف 3 | إف 4 | إف 5 | إف 6 | إف 7 | إف 8 | إف 9 | إف 10 | |
| الكثافة (جم / مل) | 1.023 | 1.038 | 1.049 | 1.062 | 1.074 | 1.098 | 1.144 | 1.185 | 1.239 | 1.293 |
الجدول 2: كثافة نظام الطرد المركزي المتدرج الكثافة القائم على اليوديكسانول. أظهر الجدول كثافة كل كسر في نظام الطرد المركزي المتدرج للكثافة القائم على اليوديكسانول. التحكم الفارغ: نظام التدرج القائم على PBS.
| الوضع من أعلى إلى أسفل | الوضع من أسفل إلى أعلى | |
| معدل استرداد الجسيمات (٪) | 24.08 | 35.69 |
| معدل استرداد البروتين (٪) | 24.5 | 32.45 |
الجدول 3: معدلات استعادة الجسيمات والبروتين لوضعين. أظهر الجدول معدلات استرداد الجسيمات والبروتين في الوضعين من أعلى إلى أسفل ومن أسفل إلى أعلى (الشكل 8).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الحويصلات البكتيرية خارج الخلية (BEVs) هي جسيمات نانوية ثنائية الطبقة تفرزها البكتيريا ، وتحمل ثروة من البروتينات والدهون والأحماض النووية وغيرها من الجزيئات النشطة بيولوجيا ، مما يساهم في التوسط في التأثيرات الوظيفية للبكتيريا20. تم التحقق من مشاركة BEVs المشتقة من الأمعاء في تطور الأمراض ، مثل مرض التهاب الأمعاء ومرض كرون وسرطان القولون والمستقيم ، وتؤثر أيضا على التمثيل الغذائي العام وتتوسط ضعف الوظيفة الإدراكية4،16،17،20،21،22،23،24،25،26. في الوقت الحالي ، لا يزال الحصول على معلومات بيولوجية كاملة وموضوعية عن BEVs من أصل بكتيريا الأمعاء من العينات البشرية - البراز مقيدا بسلسلة من العوامل ، من بينها القضية الرئيسية الأولى والأهم هي كيفية عزل BEVs عن البيئة المضيفة المعقدة.
الطرق الرئيسية لعزل BEVs ، مثل الطرد المركزي الفائق (UC) ، والطرد المركزي المتدرج الكثافة (DGC) ، وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) 13،14،15،16،17 ، تمتلك كلا من الجوانب الإيجابية والسلبية. ولا تزال صعوبة إزالة بعض المواد المتداخلة وعدم وجود إجراءات تشغيل متسقة، مما يؤثر تأثيرا خطيرا على إجراء تحليل أكثر واقعية وشمولا للمركبات الكهربائية الجاهزة، يشكلان تحديين أمام عملية الفصل. لتخفيف الآثار غير المرغوب فيها للتداخلات ، جمعت العديد من الدراسات15،27،28 طريقتين أو أكثر من الطرق المذكورة أعلاه لتحقيق فصل BEVs ، خاصة عن سوائل الجسم ، لكن الإجراءات المعقدة تميل إلى التأثير على استقرار النتائج. بالنسبة ل BEVs ، قد يصبح الاختلاف في الكثافة مع الملوثات الأخرى (على سبيل المثال ، مجاميع البروتين ، ومكونات الدهون ، والحويصلات خارج الخلية حقيقية النواة (EEVs) 15) وسيلة محددة للعزل في الوقت الحاضر.
في الوقت الحاضر ، برز اليوديكسانول كوسيط مفضل لفصل تدرج الكثافة للمركبات الكهربائية ، ليحل محل السكروز بسبب خصائصه متساوية التوتر. تساهم هذه الخصائص في الحفاظ على مورفولوجيا EV وتسهيل تقدير الكثافة لكل كسر29. تماشيا مع Tulkens etal 15 ، اعتمدت دراستنا تركيزا متطابقا لنظام DGC ، باستخدام اليوديكسانول عند 50٪ (وزن / حجم) ، 40٪ (وزن / حجم) ، 20٪ (وزن / حجم) ، 10٪ (وزن / حجم) ، و 0٪ طبقات تدرج التركيز. تضمنت الخطوة الأولى استخدام المخزن المؤقت HEPES لإعداد تركيزات مختلفة من محاليل اليوديكسانول. عند مقارنته بمحلول السكروز Tris (-EDTA) ، يضمن التركيز المناسب للمخزن المؤقت HEPES استقرار الأس الهيدروجيني على المدى الطويل داخل نظام الطرد المركزي ، وذلك بفضل خصائصه الجوهرية. في الوقت نفسه ، تم استخدام المخزن المؤقت PBS المعقم في الطبقة العليا من نظام الطرد المركزي ، ليس فقط للحماية من التلوث المحتمل بالبكتيريا ومستقلباتها أثناء تحضير المحلول ولكن أيضا للحفاظ على اتساق المخزن المؤقت للعينة قبل وبعد DGC. وشمل ذلك تعليق الحبيبات باستخدام المخزن المؤقت PBS بعد UC واستبدال اليوديكسانول ب PBS بعد DGC ، وبالتالي تسهيل التحليل المقارن للنتائج. علاوة على ذلك ، تمت معايرة حجم كل طبقة متدرجة داخل نظام DGC إلى 3 مل و 3 مل و 3 مل و 3 مل و 3.5 مل ل 50٪ و 40٪ و 20٪ و 10٪ و 0٪ (طبقة PBS) محاليل يوديكسانول على التوالي. تساعد هذه الاستراتيجية في إنشاء نطاق كثافة أوسع نسبيا (1.02-1.30 جم / مل) ، مما قد يعزز فصل BEVs عن العناصر المتداخلة الأخرى ، مما يجعل التدرجات قابلة للتطبيق على سوائل الجسم الأخرى ذات التلوث المعقد.
من المهم التأكيد على أن بعض مراحل البروتوكول حاسمة. والجدير بالذكر أن عامل التخفيف المبين في الخطوة 2.2 ، حيث يتم خلط 1 غرام من عينات البراز مع ما لا يقل عن 10 مل من PBS ، أمر محوري لمنع التشبع الزائد والحفاظ على الموارد التجريبية. في ظل هذه الظروف، يزداد تركيز الجسيمات والبروتين بشكل عام بشكل متناسب مع كتلة البراز في العينة، بافتراض أن خصائص البراز الأخرى ثابتة. إذا لزم الأمر ، يمكن إجراء مزيد من التحليل مع مراعاة عوامل مثل الاتساق أو البروتين الدهني أو محتوى الدم. خلال الخطوة 3.4 ، يجب توخي الحذر لتجنب صب المحلول مباشرة ، لأن هذا قد يزعج الحبيبات ، مما قد يتسبب في حبيبات أكبر لعرقلة غشاء مرشح 0.22 ميكرومتر. إذا أصبح المرشح مشبعا بسرعة (على سبيل المثال ، إذا مر أقل من 10 مل عبر مرشح) ، ينصح بخطوة طرد مركزي إضافية عند 12000 × جم . في سياق الطرد المركزي المتدرج الكثافة ، يعد التحضير الدقيق لحلول التدرج شرطا أساسيا للحصول على نتائج موثوقة. بالإضافة إلى ذلك ، يعد التلاعب الدقيق بالأنبوب عند وضع طبقات من المحاليل العلوية منخفضة الكثافة أمرا ضروريا لمنع تعطيل التقسيم الطبقي ، ويجب التخلص من أي فقاعات عن طريق السحب اليقظ. أخيرا ، عند استنشاق الكسور ، من المهم سحبها بدقة على طول جدار الأنبوب ، وتجنب أي طموح زائد أو ناقص قد يؤدي إلى توزيع BEV غير دقيق. يمكن أن تساعد المراقبة المنتظمة لمستوى السائل والممارسة المتسقة في التخفيف من هذه المشكلة.
حددت هذه الدراسة الكسور المخصبة ب BEVs (F6-F8) باستخدام طرق توصيف متعددة واستكشفت وضعين متميزين للطرد المركزي الفائق: من أعلى إلى أسفل ومن أسفل إلى أعلى. من خلال قياس تركيز البروتين والجسيمات في F4-F8 (الشكل 3) ومقارنة معدلات الاسترداد والنقاء (الشكل 8 والشكل 10) ، لوحظ أن وضع الطرد المركزي من أسفل إلى أعلى أسفر عن قيم مكتشفة أعلى عند كل من مستويات البروتين والجسيمات من الطريقة البديلة في عزل وتنقية BEVs من عينات البراز. هذه الملاحظة تنطوي على عمليات ديناميكية مختلفة. تم اقتراح فرضية مفادها أن الجسيمات النانوية خارج الخلية غير الحويصلية (NVEPs)29 ، مثل البروتينات الدهنية ، ذات الكثافة الأقل من BEVs ، قد لا تصل إلى كثافتها الطافية إذا تم تحميل العينات في القاع (الشكل 6) ، مما قد يتسبب في تضخم معدل الاسترداد ، حتى بعد 15 ساعة من DGC (الشكل 9). تستلزم هذه الملاحظة النظر فيما إذا كان تعريف النقاء التقليدي ، بناء على نسبة الجسيمات إلى البروتينات ، قابلا للتطبيق. علاوة على ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن EEVs أظهرت غلبة داخل F5 ، بينما تم اكتشاف BEVs بشكل بارز في F6-F7 (الشكل 4 والشكل 5). والجدير بالذكر أن هذا التمايز بدا واضحا عند اعتماد الوضع من أعلى إلى أسفل. وبالتالي ، قد يكون هذا الوضع أكثر ملاءمة لهذا البروتوكول. ومع ذلك ، من الضروري تسليط الضوء على وجود Integrin β1 داخل F6 ، مما قد يدل على عدم التجانس الجوهري بين EEVs. عند تطبيق هذه الطريقة على سوائل الجسم الأخرى مثل الدم والبول ، يجب على الباحثين النظر في الميزات الفريدة للعينات. وقت الطرد المركزي المحدد في هذا البروتوكول هو 7 ساعات ، أي أقل بكثير من المدة المذكورة في دراسات أخرى ، والتي يمكن أن تصل إلى 18 ساعة. عند مقارنتها باستعادة البروتين مع مدة 15 ساعة يتم تنفيذها بنفس النمط في هذه الدراسة (الشكل 9) ، يبدو هذا الوقت كافيا لتحقيق نقاء الفصل المطلوب. في ظل ظروف التشغيل هذه ، وصل استرداد الجسيمات في الوضع من أعلى إلى أسفل إلى 10 8 (4.5 × 10 7-1.5 × 108) لكل ملليغرام من البراز ، بما يتماشى مع التقارير السابقة (10 11 BEVs لكل جرام من البراز الرطب)15،29،30. أخيرا ، أكدت قياسات الكثافة لكل كسر من عنصر التحكم الفارغ أن كثافة BEVs تراوحت بين 1.09-1.19 جم / مل ، وهو ما يتوافق مع الأبحاث السابقة.
هذه الطريقة ، على الرغم من فعاليتها ، تمثل قيدا بسبب تأثير الوجبات الغذائية ووظيفة الأمعاء وعوامل أخرى على تكوين البراز. يمكن لهذه المتغيرات تغيير اتساق البراز ، مما قد يؤثر على وفرة البكتيريا واستعادة BEV. لذلك ، من الأهمية بمكان توحيد عزل وتنقية BEVs31,32 ، مع إجراء تعديلات بناء على تقييم خصائص البراز. يجب أن تركز الأبحاث المستقبلية على تحديد معيار لتطبيع محصول BEV ، على غرار الكرياتينين في البول أو معدل تدفق البول. مثل هذا المعيار يمكن أن يعزز التقييم المنهجي ويسلط الضوء على العلاقة بين BEVs البرازية والحالة الفسيولوجية والمرضية للجسم. علاوة على ذلك ، فإن الارتباط القوي بين BEVs البرازية والأمراض المختلفة يؤكد إمكاناتها السريرية الكبيرة. ومع ذلك ، فإن وقت الطرد المركزي المنصوص عليه في هذا البروتوكول لا يلبي الطلب على اختبار أكثر ملاءمة وأسرع كما هو مطلوب من قبل الأطباء. لذلك ، هناك حاجة إلى مزيد من التحقيق لتحديد ما إذا كانت أوقات الطرد المركزي الأقصر ، ربما أقل من 3 ساعات ، يمكن أن تسفر عن نتائج مكافئة. هناك حاجة أيضا إلى مزيد من الاستكشاف لفهم الأحداث التي تحدث في كلا وضعي الطرد المركزي. على الرغم من أنه يفترض أن المكونات غير الحويصلية تكون أكثر إثراء في F6-F8 في الوضع من أسفل إلى أعلى ، إلا أن تكرير تركيزات التدرج قد يكون مفيدا في تحديد أنواع فرعية إضافية ذات وظائف محددة.
أظهرت هذه الدراسة بنجاح عزل وتنقية BEVs من البراز البشري باستخدام DGC. تبشر الاستراتيجية بالتطبيق على عينات بيولوجية أخرى ، مثل الدم والبول واللعاب ، مما يوفر للباحثين نهجا فعالا للكشف عن المعلومات المخفية ل BEVs ، مما قد يؤدي إلى تقدم التطبيقات السريرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متضاربة.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل الصندوق الوطني للعلوم للعلماء الشباب المتميزين (82025024) ؛ المشروع الرئيسي للمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82230080) ؛ البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2021YFA1300604)؛ المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81871735 و 82272438 و 82002245) ؛ صندوق قوانغدونغ للعلوم الطبيعية للعلماء الشباب المتميزين (2023B1515020058) ؛ مؤسسة العلوم الطبيعية بمقاطعة قوانغدونغ (2021A1515011639) ؛ برنامج تطوير البحوث الأساسية الرئيسي للدولة التابع لمؤسسة العلوم الطبيعية بمقاطعة شاندونغ في الصين (ZR2020ZD11) ؛ مؤسسة علوم ما بعد الدكتوراه (2022M720059) ؛ مخطط تنمية الشباب المتميز لمستشفى نانفانغ ، الجامعة الطبية الجنوبية (2022J001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 % (w/v) glutaraldehyde (prepared from 2.5 % stock solution in deionized water) | ACMEC | AP1126 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.3 |
| 1 % (w/v) methylcellulose (prepared from original powder in deionized water) | Sigma-Aldrich | M7027 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.6 |
| 1.5 % (w/v) uranyl acetate (prepared from original powder in deionized water) | Polysciences | 21447-25 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.5 |
| 1000 μL, 200 μL, 10 μL Pipette | KIRGEN | KG1313, KG1212, KG1011 | Transfer the solution |
| 5 % (w/v) bovine serum albumin solution (prepared from the original powder in TBST buffer) | Fdbio science | FD0030 | Used in western blotting for blocking at Step 8.5.6 |
| 5 × loading buffer | Fdbio science | FD006 | Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5.1 |
| 75 % (v/v) alcohol | LIRCON | LIRCON-500 mL | Surface disinfection |
| 96-well plate | Rar | A8096 | Measure the absorbance values |
| Anti-Calnexin antibody | Abcam | ab92573 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-CD63 antibody | Abcam | ab134045 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-CD9 antibody | Abcam | ab236630 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-Flagellin antibody | Sino Biological | 40067-MM06 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-Integrin beta 1 antibody | Abcam | ab30394 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-LPS antibody | Thermo Fisher | MA1-83152 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-LTA antibody | Thermo Fisher | MA1-7402 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-OmpA antibody | CUSABIO | CSB-PA359226ZA01EOD, https://www.cusabio.com/ | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-Syntenin antibody | Abcam | ab133267 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-TSG101 antibody | Abcam | ab125011 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Autoclave | ZEALWAY | GR110DP | Sterilization for supplies and mediums used in the experiment |
| Balance | Mettler Toledo | AL104 | Balance the tube sample-loaded with PBS |
| Bicinchoninic acid assay | Fdbio science | FD2001 | Measure protein content of BEVs at Step 8.2 |
| BioRender | BioRender | https://app.biorender.com | Make the schematic workflow of BEVs isolation and purification showed in Figure 1 |
| Biosafety cabinet | Haier | HR1200- II B2 | Peform the procedures about feces sample handling |
| Centrifuge 5810 R; Rotor F-34-6-38 | Eppendorf | 5805000092; 5804727002, adapter: 5804774000 | Preprocess for BEVs (Step 3) |
| Chemiluminescence Apparatus | BIO-OI | OI600SE-MF | Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12 |
| Cytation 5 | BioTek | F01 | Microplate detector for measuring the absorbance (Step 8.1) and fluorescence (Figure 6) values |
| Dil-labled low density lipoprotein | ACMEC | AC12038 | Definition of distribution of interfering components |
| Electrophoresis equipment | Bio-rad | 1658033 | Used in western blotting for protein separation and transfer at Step 8.5.2, 8.5.3, 8.5.5 |
| Enhanced Chemiluminescence kit HRP | Fdbio science | FD8020 | Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12 |
| Escherichia coli | American Type Culture Collection | ATCC8739 | Isolate BEVs as a positive control. Protocol: Dissolve 25 g of the LB powder in 1 L deionized water, and autoclave. Transfer the 800 μL of preserved Escherichia coli into the medium. Cultivate at 37 °C in the incubator shaker. Then centrifuge at 3, 000 × g for 20 min at 4 °C, 12, 000 × g for 30 min at 4 °C, filter the supernatant through 0.22 μm membrane, and perform ultra-speed centrifugation at 160, 000 × g for 70 min at 4 °C. Pellet defined as crude BEVs from Escherichia coli was suspended in 1.2 mL PBS (Step 3, 4). |
| Falcon tubes 50 mL | KIRGEN | KG2811 | Preprocess for BEVs (Step 3) |
| Feto Protein Staining Buffer | Absci | ab.001.50 | Coomassie brilliant blue staining at Step 8.5.4 |
| Filter paper | Biosharp | BS-TFP-070B | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 (Blotting the solution) |
| Formvar/Carbon supported copper grids | Sigma-Aldrich | TEM-FCF200CU50 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 |
| HEPES powder | Meilunbio | MB6078 | Prepare iodixanol buffers with different concentrations for density gradient centrifugation |
| HRP AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Fdbio science | FDM007 | Western blotting (Secondary Antibody) |
| HRP AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Fdbio science | FDR007 | Western blotting (Secondary Antibody) |
| Incubator shaker | Qiangwen | DHZ-L | Cultivate Escherichia coli |
| Kimwipes™ Delicate Task Wipes | Kimtech Science | 34155 | Wipe the inner wall of the ultracentrifuge tube at Step 4.15 |
| LB broth | Hopebio | HB0128 | Cultivate Escherichia coli |
| Low temperature freezer (-80 °C) | Haier | DW-86L338J | Store the samples |
| Methanol | Alalddin | M116118 | Used in western blotting for activating PVDF membrane at Step 8.5.5 |
| Micro tubes 1.5 mL | KIRGEN | KG2211 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
| Micro tubes 2 mL | KIRGEN | KG2911 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
| Micro tubes 5 mL | BBI | F610888-0001 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
| Microplate reader | Thermo Fisher | Multiskan MK3 | Measure protein content of BEVs at Step 8.2 |
| Millipore filter 0.22 μm | Merck millipore | SLGP033RB | Filtration sterilization; Material: polyethersulfone, PES |
| NaCl | GHTECH | 1.01307.040 | Density gradient centrifugation solution |
| NaOH | GHTECH | 1.01394.068 | Density gradient centrifugation solution (pH adjustment) |
| Optima™ XPN-100 | Beckman Coulter | A94469 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
| OptiPrep™ | Serumwerk Bernburg AG | 1893 | Density gradient centrifugation stock solution |
| Orbital Shaker | Youning | CS-100 | Dissolve feces at Step 2 |
| Phosphate buffered saline | Procell | PB180327 | Dissolve feces at Step 2 |
| Pipettor | Eppendorf | 3120000267, 3120000259 | Transfer the solution |
| Plastic pasteur pipette | ABCbio | ABC217003-4 | Remove supernatant in preprocessing at Step 3.4 |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes | Millipore | ISEQ00010, IPVH00010 | Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5 |
| Prefabricated polyacrylamide gel, 4–20% 15 Wells | ACE | F15420Gel | Used in western blotting for protein separation at Step 8.5.2, 8.5.3 |
| Primary antibody diluent | Fdbio science | FD0040 | Used in western blotting at Step 8.5.8 |
| Protein ladder | Fdbio science | FD0672 | Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5 |
| Rapid protein blotting solution | UBIO | UW0500 | Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5 |
| Rotor SW 32 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 369650 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
| Syringe 20 mL, 50 mL | Jetway | ZSQ-20ML, YCXWJZSQ-50 mL | Transfer buffers amd remove supernatant in preprocessing |
| TBS powder | Fdbio science | FD1021 | Used in western blotting at Step 8.5 |
| Transmission electron microscope (TEM) | Hitachi | H-7650 | Morphological observation for BEVs at Step 8.3 |
| Tween-20 | Fdbio science | FD0020 | Used in western blotting at Step 8.5 |
| Ultracentrifuge tube | Beckman | 326823, 355642 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
| Ultra-clean bench | AIRTECH | SW-CJ-2FD | Peform the procedures about liquid handling |
| Water bath | Bluepard | CU600 | Used for measuring protein content of BEVs at Step 8.2.5 |
| ZetaView | Particle Metrix | S/N 21-734, Software ZetaView (version 8.05.14 SP7) | Nanoparticle tracking analysis (NTA) for measuring the particle size and concentrarion of BEVs at Step 8.4 |
References
- Costello, E. K., et al. Bacterial community variation in human body habitats across space and time. Science. 326 (5960), 1694-1697 (2009).
- Greenhalgh, K., Meyer, K. M., Aagaard, K. M., Wilmes, P. The human gut microbiome in health: establishment and resilience of microbiota over a lifetime. Environmental Microbiology. 18 (7), 2103-2116 (2016).
- de Vos, W. M., Tilg, H., Van Hul, M., Cani, P. D. Gut microbiome and health: mechanistic insights. Gut. 71 (5), 1020-1032 (2022).
- Zhou, P., Yang, D., Sun, D., Zhou, Y. Gut microbiome: New biomarkers in early screening of colorectal cancer. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 36 (5), 24359 (2022).
- Paik, D., et al. Human gut bacteria produce Τ(Η)17-modulating bile acid metabolites. Nature. 603 (7903), 907-912 (2022).
- Parada Venegas, D., et al. Short chain fatty acids (SCFAs)-mediated gut epithelial and immune regulation and its relevance for inflammatory bowel diseases. Frontiers in Immunology. 10, 277 (2019).
- Jiang, C., Li, G., Huang, P., Liu, Z., Zhao, B. The Gut microbiota and Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 58 (1), 1-15 (2017).
- Morais, L. H., Schreiber, H. L. t, Mazmanian, S. K. The gut microbiota-brain axis in behaviour and brain disorders. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 241-255 (2021).
- Kim, J. H., Lee, J., Park, J., Gho, Y. S. Gram-negative and Gram-positive bacterial extracellular vesicles. Seminars in Cell and Developmental Biology. 40, 97-104 (2015).
- Toyofuku, M., Nomura, N., Eberl, L. Types and origins of bacterial membrane vesicles. Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 13-24 (2019).
- Xie, J., Li, Q., Haesebrouck, F., Van Hoecke, L., Vandenbroucke, R. E. The tremendous biomedical potential of bacterial extracellular vesicles. Trends in Biotechnology. 40 (10), 1173-1194 (2022).
- Coumans, F. A. W., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).
- Northrop-Albrecht, E. J., Taylor, W. R., Huang, B. Q., Kisiel, J. B., Lucien, F. Assessment of extracellular vesicle isolation methods from human stool supernatant. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (4), 12208 (2022).
- Park, Y. E., et al. Microbial changes in stool, saliva, serum, and urine before and after anti-TNF-α therapy in patients with inflammatory bowel diseases. Scientific Reports. 12 (1), 6359 (2022).
- Tulkens, J., De Wever, O., Hendrix, A. Analyzing bacterial extracellular vesicles in human body fluids by orthogonal biophysical separation and biochemical characterization. Nature Protocols. 15 (1), 40-67 (2020).
- Tulkens, J., et al. Increased levels of systemic LPS-positive bacterial extracellular vesicles in patients with intestinal barrier dysfunction. Gut. 69 (1), 191-193 (2020).
- Kang, C. S., et al. Extracellular vesicles derived from gut microbiota, especially Akkermansia muciniphila, protect the progression of dextran sulfate sodium-induced colitis. PloS one. 8 (10), 76520 (2013).
- Simonsen, J. B. What are we looking at? Extracellular vesicles, lipoproteins, or both. Circulation Research. 121 (8), 920-922 (2017).
- Correll, V. L., et al. Optimization of small extracellular vesicle isolation from expressed prostatic secretions in urine for in-depth proteomic analysis. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12184 (2022).
- Liang, X., et al. Gut bacterial extracellular vesicles: important players in regulating intestinal microenvironment. Gut Microbes. 14 (1), 2134689 (2022).
- Alberti, G., et al. Extracellular vesicles derived from gut microbiota in inflammatory bowel disease and colorectal cancer. Biomedical papers of the Medical Faculty of the University Palacky, Olomouc, Czech Republic. 165 (3), 233-240 (2021).
- Díez-Sainz, E., Milagro, F. I., Riezu-Boj, J. I., Lorente-Cebrián, S. Effects of gut microbiota-derived extracellular vesicles on obesity and diabetes and their potential modulation through diet. Journal of Physiology and Biochemistry. 78 (2), 485-499 (2022).
- Lajqi, T., et al. Gut microbiota-derived small extracellular vesicles endorse memory-like inflammatory responses in murine neutrophils. Biomedicines. 10 (2), 442 (2022).
- Lee, K. E., et al. The extracellular vesicle of gut microbial Paenalcaligenes hominis is a risk factor for vagus nerve-mediated cognitive impairment. Microbiome. 8 (1), 107 (2020).
- Villard, A., Boursier, J., Andriantsitohaina, R. Bacterial and eukaryotic extracellular vesicles and nonalcoholic fatty liver disease: new players in the gut-liver axis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 320 (4), G485-G495 (2021).
- Wei, S., et al. Outer membrane vesicles enhance tau phosphorylation and contribute to cognitive impairment. Journal of Cellular Physiology. 235 (5), 4843-4855 (2020).
- Bitto, N. J., Kaparakis-Liaskos, M. Methods of bacterial membrane vesicle production, purification, quantification, and examination of their immunogenic functions. Methods in Molecular Biology. 2523, 43-61 (2022).
- Stentz, R., Miquel-Clopés, A., Carding, S. R. Production, isolation, and characterization of bioengineered bacterial extracellular membrane vesicles derived from Bacteroides thetaiotaomicron and their use in vaccine development. Methods in Molecular Biology. 2414, 171-190 (2022).
- Zhang, Q., Jeppesen, D. K., Higginbotham, J. N., Franklin, J. L., Coffey, R. J. Comprehensive isolation of extracellular vesicles and nanoparticles. Nature Protocols. 18 (5), 1462-1487 (2023).
- Iwai, K., Minamisawa, T., Suga, K., Yajima, Y., Shiba, K. Isolation of human salivary extracellular vesicles by iodixanol density gradient ultracentrifugation and their characterizations. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 30829 (2016).
- Vandeputte, D., et al. Stool consistency is strongly associated with gut microbiota richness and composition, enterotypes and bacterial growth rates. Gut. 65 (1), 57-62 (2016).
- Wen, M., et al. Bacterial extracellular vesicles: A position paper by the Microbial Vesicles Task Force of the Chinese Society of Extracellular Vesicles. Interdisciplinary Medicine. 1, 12046 (2023).
