Summary
מחקר זה מתאר שיטה לבידוד וטיהור שלפוחיות חוץ-תאיות חיידקיות (BEVs) המועשרות מצואת אדם באמצעות צנטריפוגת שיפוע צפיפות (DGC), מזהה את המאפיינים הפיזיים של BEV ממורפולוגיה, גודל חלקיקים וריכוז, ודן ביישומים האפשריים של גישת DGC במחקר קליני ומדעי.
Abstract
שלפוחיות חוץ-תאיות חיידקיות (BEVs) הן ננו-שלפוחיות שמקורן בחיידקים הממלאים תפקיד פעיל בתקשורת חיידקים-חיידקים וחיידקים-מארחים, ומעבירים מולקולות ביו-אקטיביות כגון חלבונים, שומנים וחומצות גרעין העוברות בתורשה מחיידקי האם. ל-BEV שמקורו במיקרוביוטה של המעי יש השפעות בתוך מערכת העיכול והוא יכול להגיע לאיברים מרוחקים, וכתוצאה מכך יש לו השלכות משמעותיות על הפיזיולוגיה והפתולוגיה. מחקרים תיאורטיים שחוקרים את הסוגים, הכמויות והתפקידים של כ"ד שמקורם בצואה אנושית חיוניים להבנת ההפרשה והתפקוד של כ"ד מהמיקרוביוטה של המעי. חקירות אלה מחייבות גם שיפור באסטרטגיה הנוכחית לבידוד וטיהור כלי רכב חשמליים.
מחקר זה ייעל את תהליך הבידוד והטיהור של כלי רכב חשמליים על ידי הקמת שני מצבי צנטריפוגה הדרגתית בצפיפות (DGC): מלמעלה למטה ומלמטה למעלה. ההתפלגות המועשרת של כלי רכב חשמליים נקבעה בשברים 6 עד 8 (F6-F8). יעילות הגישה הוערכה בהתבסס על מורפולוגיה של חלקיקים, גודל, ריכוז ותכולת חלבונים. שיעורי התאוששות החלקיקים והחלבונים חושבו, ונוכחותם של סמנים ספציפיים נותחה כדי להשוות את ההתאוששות והטוהר של שני מצבי DGC. התוצאות הצביעו על כך שמצב הצנטריפוגה מלמעלה למטה היה בעל רמות זיהום נמוכות יותר והשיג שיעור התאוששות וטוהר דומים לזה של מצב מלמטה למעלה. זמן צנטריפוגה של 7 שעות הספיק כדי להשיג ריכוז BEV צואתי של 108/מ"ג.
מלבד צואה, שיטה זו יכולה להיות מיושמת על סוגים אחרים נוזלי גוף עם שינוי נכון על פי ההבדלים ברכיבים צמיגות. לסיכום, פרוטוקול מפורט ואמין זה יקל על בידוד וטיהור סטנדרטיים של כ"ד ובכך יניח בסיס לניתוח מולטי-אומיקס וניסויים פונקציונליים הבאים.
Introduction
המעי מוכר באופן נרחב כאיבר המאחסן את קהילות החיידקים הנפוצות ביותר בגוף האדם, כאשר מעל 90% מהחיידקים מעורבים בהתיישבות ובהכפלה 1,2. עדויות נרחבות הוכיחו כי מיקרוביוטת המעיים מווסתת את המיקרו-סביבה של המעי ובו זמנית מתקשרת עם תפקוד לקוי באיברים מרוחקים, בעיקר באמצעות מחסום מעיים לקוי 3,4. עדויות מצטברות מצביעות על מתאם בין חוסר איזון של מיקרוביוטת המעי לבין התקדמות מחלות מעי דלקתיות (IBD)5,6, כמו גם הפרעות קוגניטיביות דרך ציר מעי-מוח 5,6,7,8. שלפוחיות חוץ-תאיות חיידקיות (BEVs) המיוצרות על ידי חיידקים ממלאות תפקידים משמעותיים בתהליכים פתולוגיים אלה.
BEV הם חלקיקים ננומטריים העוטפים נגזרות חיידקיות, בקטרים הנעים בין 20 ל-400 ננומטר. הם הוכחו כמסייעים לאינטראקציות בין חיידקים לבין האורגניזמים המארחים שלהם 9,10. למרות היותם בלתי נראים, חלקיקים אלה זכו לתשומת לב הולכת וגוברת מצד חוקרים בשל היישומים הרחבים הפוטנציאליים שלהם כסמנים ביולוגיים אבחנתיים, מטרות טיפוליות וכלי משלוח תרופות11. צואת אדם, המשמשת לעתים קרובות כדגימות ביולוגיות לחקר BEVs, שמקורה בעיקר בחיידקי מעיים, מכילה תערובת מורכבת של מים, חיידקים, שומנים, חלבונים, שאריות מזון לא מעוכלות ותאי אפיתל מתקלפים, בין היתר. הרכב הצואה המורכב מציב אתגרים לבידוד ולטוהר של כלי רכב חשמליים, ובכך מעכב ניתוח מקיף, אובייקטיבי ומציאותי של כלי רכב חשמליים. לפיכך, אסטרטגיות יעילות למזעור הפרעות מרכיבים מזהמים ושיפור התפוקה של BEV התגלו כנושאים קריטיים המצדיקים תשומת לב מיידית.
אסטרטגיות בידוד קיימות מסתמכות במידה רבה על טכניקות כגון צנטריפוגה במהירות גבוהה במיוחד (UC), צנטריפוגה שיפוע צפיפות (DGC) וכרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (SEC)12,13,14,15,16,17. נכון לעכשיו, DGC היא אחת השיטות המיושמות ביותר בתחום הפרדת BEV, הכוללת שני מצבי שיקוע צפים, "מלמעלה למטה" ו "מלמטה למעלה", אשר נקבעים על ידי מיקום הטעינה הראשונית של המדגם. מתודולוגיות אלה מבדילות בועיות חוץ-תאיות (EVs) מרכיבים אחרים בהתבסס על פערי גודל וצפיפות, ומניבות שיעורי טוהר והתאוששות משתנים. מחקרים קודמים הצביעו על כך שאסטרטגיות של גישה אחת אינן מספיקות להפרדה מספקת של כלי רכב חשמליים מחלבונים מסיסים בדגימות נוזלי גוף, כגון ליפופרוטאין בדם18 וחלבון Tamm-Horsfall בשתן19. בנוסף, התפלגות הגודל של שלפוחיות חוץ-תאיות אאוקריוטיות (EEVs) חופפת לעתים קרובות לזו של BEVs, ולכן מחייבת שיפורים מתודולוגיים נוספים כדי לייעל את תפוקת ה-BEV. כתוצאה מכך, קידום המחקר של BEV תלוי בפיתוח מתודולוגיות הפרדה וטיהור יעילות. יש לציין כי Tulkens et al 15 השתמשו באסטרטגיה ביופיזיקלית אורתוגונלית כדי להפריד בין כלי רכב חשמליים צואתיים לבין EEVs, שבה זמן הצנטריפוגה של מצב DGC מלמטה למעלה היה עד18 שעות. לעומת זאת, מחקר זה צמצם אותו ל-7 שעות, ובכך חסך מאוד את זמן האולטרה-צנטריפוגה ההדרגתית ופישט את התהליך.
במחקר הנוכחי, בודדנו וטיהרנו כלי רכב חשמליים צואתיים באמצעות שני מצבי DGC בתנאי חיץ אופטימליים, לאחר שהעשרת כלי רכב חשמליים במגוון מהירויות צנטריפוגה דיפרנציאליות, ממהירות נמוכה למהירות גבוהה במיוחד. הערכות המבוססות על מורפולוגיה, גודל חלקיקים וריכוז הצביעו על ביצועים ראויים לשבח בשיטה משופרת זו. מחקר זה יכול לשמש בסיס למחקר עתידי, להרחיב את יישומו לתחום רחב יותר, ולהציע תובנות לגבי ההטרוגניות של כלי רכב חשמליים בגוף האדם. זה גם תורם לסטנדרטיזציה של הפרדת BEV וטכניקות ניתוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ועדת האתיקה של בית החולים נאן-פאנג, האוניברסיטה הרפואית הדרומית, אישרה מחקר זה, שנערך בהסכמה מדעת של המשתתפים. כל השיטות הננקטות במסמך זה עומדות בהנחיות ההפעלה הסטנדרטיות המסופקות על ידי תקני המיקרוביום האנושי הבינלאומיים (IHMS: http://www.microbiome-standards.org/). כל נהלי הטיפול בנוזלים הבאים חויבו להתבצע בתוך ארון בטיחות ביולוגית או ספסל נקי במיוחד.
1. איסוף ו aliquoting של דגימות צואה
- חילקו דוגם צואה, שקית אטומה וקופסת קרח, ותנו הנחיות מקיפות למשתתפים כיצד לרכוש ולשמר את הדגימות.
- יש להנחות כל משתתף לאסוף את דגימת הצואה שלו באמצעות הדוגם שסופק, ולשנע אותה למעבדה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחלון של 24 שעות.
- עם הקבלה במעבדה, השתמש בכפית סטרילית כדי aliquot פחות מ 3.5 גרם של צואה לתוך צינור צנטריפוגה 50 מ"ל שוקל מראש. ציין את משקל דגימת הצואה על הצינור להליכים הבאים לפני הטיפול.
נקודת השהיה: אם עיבוד מיידי של הדגימות אינו אפשרי, הקצה את הדגימה לאחסון לטווח ארוך ב -80 ° C לאחר סימון מתאים.
2. הכנת דגימת צואה
- יש לצנן 500 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS) ב 4 °C (75 °F). סנן את PBS המצונן מראש דרך מסנן פוליאתרסולפון (PES) 0.22 מיקרומטר באמצעות מזרק 50 מ"ל לעשרה צינורות צנטריפוגה של 50 מ"ל.
- מקם שני צינורות 50 מ"ל על קרח, כל אחד מכיל 3.5 גרם של דגימות צואה. הוסף 35 מ"ל של PBS לכל צינור.
הערה: חשב את הכמות הנדרשת של PBS להמסת צואה, תוך הבטחת ריכוז דגימה מרבי של 10% (w/v). אם אתם מעבדים דגימות נוספות, השתמשו בצינורות נוספים לפי הצורך. - נערו את הדגימות ב-300 סל"ד למשך שעתיים ב-4°C, או הניחו אותן למשך 8 שעות לפחות ב-4°C עד שהצואה תלויה לחלוטין באופן גלוי.
3. צנטריפוגה במהירות דיפרנציאלית
- מצננים את צנטריפוגת הקירור במהירות גבוהה ל-4°C.
- התאם את המשקל של שתי השפופרות המכילות את הדגימות שהוכנו בשלב 2.3 עם PBS כדי להגיע למשקל כולל של 0.1 גרם.
- צנטריפוגה הדגימות ב 3, 000 × גרם במשך 20 דקות ב 4 ° C.
- יש להכניס בזהירות את הסופרנאטנט לשני צינורות צנטריפוגות נקיים בנפח 50 מ"ל, ולהשאיר כ-1 מ"ל מעל הכדורית. השתמשו בפיפט פסטר חד פעמי מפלסטיק לתהליך זה.
- התאם את המשקל של שני הצינורות עם PBS כדי להגיע למשקל כולל בתוך ± 0.1 גרם.
- צנטריפוגה supernatant מועבר ב 12, 000 × גרם במשך 30 דקות ב 4 ° C.
- שאפו את הסופרנאטנט באמצעות מזרק 20 מ"ל, הסירו את מחט המזרק וסננו אותה דרך מסננים של 0.22 מיקרומטר לצינורות של 50 מ"ל. בשלב זה, נפח supernatant צריך להיות כ 30 מ"ל.
הערה: אם כמות משמעותית של טומאה עדיין נראית לעין לאחר צנטריפוגה של 12,000 × גרם, יש צורך לחזור על שלב הצנטריפוגה ב 12,000 × גרם במשך 30 דקות ב 4 ° C. כישלון לעשות זאת עלול לגרום לאובדן משמעותי של BEV עקב חסימת נקבוביות במהלך הסינון.
4. צנטריפוגה אולטרה מהירה
- נקו את הרוטור והדלי על ידי ניגוב שלהם עם 75% אלכוהול (v/v) כדי למנוע כל זיהום שיורי.
- מקם צינור אולטרה-צנטריפוגה 38.5 מ"ל במחזיק הצינור.
הערה: בחר את צינור האולטרה-צנטריפוגה המתאים בהתבסס על נפח הדגימה. הימנע מקרינה אולטרה סגולה וריאגנטים כימיים לא מתאימים לעיקור צינורות צנטריפוגליים כפי שמצוין במדריך המוצר. - מעבירים כ-30 מ"ל של סופרנאטנט צואתי מסונן משלב 3.7 לצינור האולטרצנטריפוגה.
- מלאו את צינור האולטרה-צנטריפוגה בכ-8 מ"ל PBS, תוך השארת רווח של 3 מ"מ מפתח הצינור.
- מקמו את שני צינורות האולטרה-צנטריפוגות עם הדגימות בדליים אולטרה-צנטריפוגות מנוגדות, לדוגמה, דלי 1 מתאים ל-4 (1-4), 2-5, 3-6.
- התאם את משקל שני הדליים עם PBS כדי להשיג משקל כולל בתוך ± 0.005 גרם.
- התקן את כל הדליים על הרוטור, ללא קשר אם הצינורות נטענים.
- התחל את הוואקום וצנטריפוגה את הדגימות ב 160,000 × גרם במשך 70 דקות ב 4 ° C.
- שחררו את שואב האבק הקאמרי ופתחו את הדלת ברגע שהאפשרות Ready מוצגת בדף הבית של המכשיר.
- הסר את הרוטור מן ultracentrifuge.
- העבר את הדליים מהרוטור למתלה, ואחזר את הצינורות באמצעות פטם.
- השליכו את הסופרנטנט, שיכיל כדורים חומים גלויים בתחתית.
- יש להשהות מחדש את הכדוריות על ידי השעייתן מעלה ומטה שוב ושוב באמצעות פיפטה של 1,000 μL עם 1 מ"ל של PBS מקורר מראש (4°C) עד להשעיה מוחלטת. ממלאים את הצינור בכ-37 מ"ל PBS, ומשאירים רווח של 3 מ"מ מהפתח.
- בצע אולטרה-צנטריפוגה נוספת בעקבות שלבים 4.5-4.11 ב-160,000 × גרם למשך 70 דקות ב-4°C כדי להסיר רכיבים מזהמים מחוברים חלקית מדפנות הצינור.
- השליכו את הסופרנטנט, הפכו את שני צינורות האולטרה-צנטריפוגות למשך 5 דקות, ונקו את כל התמיסה שנותרה בדופן הפנימית בעזרת מגבים.
הערה: ניקוי הקיר הפנימי ממזער הפרעות כתוצאה מזיהום שיורי הנדבק לדופן צינור האולטרה-צנטריפוגה. בחרו מגבים שלא ישפיעו על ניתוח ה-BEV, במיוחד בכל הנוגע לגודל החלקיקים. - השהה מחדש את הכדוריות בכל צינור על ידי צנרת אותן מעלה ומטה עם 1.2 מ"ל של PBS מקורר מראש (4 ° C) באמצעות פיפטה 1,000 μL.
- העבר 1.2 מ"ל של תמיסת PBS/BEV מצינור אולטרה-צנטריפוגה אחד למיקרו-צינור נקי של 1.5 מ"ל.
נקודת השהיה: פתרון PBS/BEV שנאסף מצינור אולטרה-צנטריפוגה אחד יכול להמשיך לשלב 6. אחסן את התמיסה מהצינור השני ב -80 ° C.
5. הכנת פתרון לצנטריפוגה שיפוע צפיפות
- הכנת חיץ HEPES 0.02 M
- ערבבו 0.477 גרם של אבקת HEPES ו-0.8 גרם של NaCl עם 90 מ"ל של מים נטולי יונים.
- כוונן את ה- pH ל- 7.2 על ידי הוספת 1 M נתרן הידרוקסידי (NaOH). הביאו את הנפח ל-100 מ"ל עם מים שעברו דה-יוניזציה וסננו את התמיסה דרך ממברנות PES של 0.22 מיקרומטר.
זהירות: נתרן הידרוקסידי הוא אלקלי קאוסטי חזק. המפעילים חייבים לטפל בו ולהכין אותו בזהירות בארון אדים.
- הכנת חיץ שיפוע צפיפות
- חשב את הנפח הנדרש של כל מאגר שיפוע צפיפות בהתבסס על מספר צינורות אולטרה-צנטריפוגות עבור צנטריפוגות שיפוע צפיפות (שלב 6) (בפרוטוקול זה, הנפחים עבור תמיסות שיפוע של 60%, 50%, 40%, 20% ו- 10% היו 2.5 מ"ל, 3 מ"ל, 6 מ"ל, 6 מ"ל ו- 6 מ"ל, בהתאמה).
- להכנת תמיסת עבודה של 50% (w/v) יודיקסנול, ערבב את מאגר HEPES 0.02 M ותמיסת מלאי יודיקסנול 60% (w/v) ביחס נפח של 1:5 (0.5 מ"ל: 2.5 מ"ל).
הערה: השתמש מזרק חד פעמי 20 מ"ל כדי למשוך את תמיסת מלאי יודיקסנול ולהימנע מהחדרת אוויר. - כדי להכין מאגרי יודיקסנול בריכוזים שונים, שלבו את תמיסת העבודה 50% יודיקסנול משלב 5.2.2 עם חיץ HEPES שהתקבל בשלב 5.1 באמצעות פיפטה של 1,000 מיקרוליטר בהתאם לפרופורציות המוצגות בטבלה 1.
הערה: בצעו את שלב 5 על ספסל נקי במיוחד כשהאורות כבויים. אחסנו את תמיסת היודיקסנול הפתוחה במקרר בטמפרטורה של 4°C כדי למנוע צמיחת חיידקים. שמור על תמיסת היודיקסנול ועל חיץ HEPES מוגנים מפני אור.
6. הקמת מערכת צנטריפוגות שיפוע צפיפות
- מצב DGC מלמעלה למטה
- שלב 500 μL של תמיסת PBS/BEV שבודדה משלב 4 עם 3 מ"ל PBS. ערבבו בעדינות את התמיסות באמצעות פיפטה של 1,000 מיקרוליטר לקבלת 3.5 מ"ל של תמיסת PBS/BEV.
- הניחו צינור אולטרה-צנטריפוגה בנפח 31 מ"ל על צלחת קצף עם חורים ותייגו אותו כ-"↓".
- הוסף אנכית 3 מ"ל של תמיסת 50% יודיקסנול לתחתית הצינור באמצעות פיפטה של 1,000 μL.
- הטה את הצינור לזווית של 70° ומקם מחזיק צינור או תמיכה אחרת מעט מעל גובה צלחת הקצף, מתחת לפתח הצינור.
- הוסף 3 מ"ל של תמיסת 40% יודיקסנול על גבי תמיסת 50% יודיקסנול באמצעות פיפטה של 1,000 מיקרוליטר.
- הוסף 3 מ"ל של תמיסת 20% יודיקסנול על גבי תמיסת 40% יודיקסנול באמצעות פיפטה של 1,000 μL.
- הוסף 3 מ"ל של תמיסת 10% יודיקסנול על גבי תמיסת 20% יודיקסנול באמצעות פיפטה של 1,000 מיקרוליטר.
- הוסף 3.5 מ"ל של תמיסת PBS/BEV משלב 6.1.1 על גבי תמיסת 10% יודיקסנול באמצעות פיפטה של 1,000 מיקרוליטר.
- החזירו בעדינות את הצינורות למצב זקוף.
הערה: לאחר צנרת, הריבוד צריך להיות גלוי.
- מצב DGC מלמטה למעלה
- הניחו צינור אולטרה-צנטריפוגה בנפח 31 מ"ל על צלחת קצף עם חורים ותייגו אותו כ-"↑".
- הוסף אנכית 2.5 מ"ל של תמיסת מלאי יודיקסנול 60% לתחתית הצינור. ערבבו אותו בעדינות עם 500 μL של תמיסת PBS/BEV שבודדה משלב 4 באמצעות פיפטה של 1,000 μL לקבלת 3 מ"ל של 50% תמיסת יודיקסנול/BEV.
- הטה את הצינור לזווית של 70° ומקם מחזיק צינור או תמיכה אחרת מעט מעל גובה צלחת הקצף, מתחת לפתח הצינור.
- הוסף 3 מ"ל של תמיסת 40% יודיקסנול על גבי תמיסת 50% יודיקסנול/BEV באמצעות פיפטה של 1,000 מיקרוליטר.
- הוסף 3 מ"ל של תמיסת 20% יודיקסנול על גבי תמיסת 40% יודיקסנול באמצעות פיפטה 1000 μL.
- הוסף 3 מ"ל של תמיסת 10% יודיקסנול על גבי תמיסת 20% יודיקסנול באמצעות פיפטה 1000 μL.
- הוסף 3.5 מ"ל PBS על גבי תמיסת 10% יודיקסנול באמצעות פיפטה של 1,000 מיקרוליטר.
- החזירו בעדינות את הצינורות למצב זקוף.
- בשלב זה, 200 μL של ההשעיה שהושגה בשלב 4.17 נשאר, אשר ניתן לנתח לאחר מכן כקבוצה בשם "UC".
הערה: בעת העברת פתרונות בשלב 6, שמור תמיד את קצה הפיפטה כנגד דופן צינור האולטרה-צנטריפוגה בניצב לציר הצינור.
7. צפיפות, צנטריפוגה הדרגתית ואיסוף שברים
- התאם את המשקל של שני הצינורות עם PBS כדי להשיג משקל כולל בתוך ± 0.005 גרם.
- הניחו את הצינורות בדליים לפי שלב 4.5 והעבירו אותם לצנטריפוגה בטמפרטורה של 160,000 × גרם למשך 7 שעות ב-4°C.
- אסוף את השברים באמצעות פיפטור (1000 μL) מלמעלה למטה כנגד הקיר הצדדי בסדר הבא: 3 מ"ל, 2 מ"ל, 1 מ"ל, 1 מ"ל, 1 מ"ל, 1 מ"ל, 1 מ"ל, 1 מ"ל, 1.5 מ"ל ו -3 מ"ל לתוך צינור אולטרה-צנטריפוגה 38.5 מ"ל.
הערה: שמור על קו הראייה באותה רמה כמו פני השטח הנוזליים. - בצע אולטרה-צנטריפוגה עבור כל שבר המתקבל בשלב 7.3 לפי שלב 4 ב 160,000 × גרם במשך 70 דקות ב 4 ° C.
- מוציאים את הסופרנאטנט והופכים את צינורות האולטרה-צנטריפוגות למשך 5 דקות.
- השהה מחדש את הכדוריות ב 200 μL של PBS מקורר מראש (4 ° C) באמצעות פיפטה 200 μL.
- העבר את תמיסת PBS/BEV למיקרו-צינור נקי בנפח 1.5 מ"ל.
- תייג את השברים מ- F1 ל- F10 ונתח אותם בהתבסס על שלב 8.
נקודת השהיה: אם לא ניתן לעבד את הדגימות שהתקבלו בשלב 7.8 באופן מיידי, אחסנו אותן בטמפרטורה של -80°C.
8. אפיון וניתוח כמותי של השברים שנאספו
- קבע את ערכי הספיגה (OD 340 ננומטר) של כל שבר באמצעות גלאי microplate עם פקד ריק כדי לחשב את צפיפותם המתאימה.
הערה: החלף את פתרון PBS/BEV (שלב 6.1.1 ושלב 6.2.2) ב- PBS כדי ליצור פקד ריק.- הכינו תמיסת יודיקסנול של 0%, 5%, 10%, 12.5% ו-20% יודיקסנול מדוללת ב-0.02 M HEPES המבוססת על תמיסת מלאי של 50% (שלב 5.2.2) כסטנדרטים, המתאימים לצפיפויות של 1.0058 גרם/מ"ל, 1.0318 גרם/מ"ל, 1.058 גרם/מ"ל, 1.0708 גרם/מ"ל ו-1.111 גרם/מ"ל, בהתאמה.
- הוסף 50 μL מכל שבר מהפקד הריק (שהוכן בשלב 7.3) ו- 50 μL מכל פתרון סטנדרטי (שהוכן בשלב 8.1.1) כדי לשכפל בארות של צלחת בת 96 בארות.
- הגדר את אורך הגל ל- 340 ננומטר, מדוד את הצפיפות האופטית של נקודת הקצה וחשב את הצפיפות של כל שבר.
- זהה את F4-F9 כטווח של שברי BEV בהתבסס על צפיפותם.
- קבע את ריכוז החלבון של שברי BEV באמצעות בדיקת חומצה ביכונית (BCA).
- לדלל את החומר פי עשרה ב- PBS שסופק על ידי היצרן כדי להכין תמיסת חלבון סטנדרטית של 0.5 מיקרוגרם/מיקרוליטר.
- הוסף את תמיסת החלבון הסטנדרטית (שהוכנה בשלב 8.2.1) בנפחים משתנים בהתאם להוראות המגיב, והשלם כל באר של צלחת 96 בארות עם PBS לנפח כולל של 20 μL.
- הוסף 20 μL של הדגימות שהוכנו בשלב 7.8 ואת הדגימות שנותרו לאחר UC שהוגדר בשלב 6.2.9 לכל באר.
- מערבבים ריאגנטים A ו-B ביחס של 50:1, ומעבירים 200 μL לכל באר.
- דוגרים על הצלחת באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- מדוד את ערך הספיגה באמצעות קורא מיקרו-לוחות, חשב את ריכוז החלבון (μg/μL) וקבע את תכולת החלבון (μg) של הדגימות בהתבסס על העקומה הסטנדרטית (x: צפיפות אופטית; y: ריכוז חלבון) המופקת מערכי התמיסות הסטנדרטיות המדוללות בשלב 8.2.2.
- אפיין את שברי BEV שהוגדרו בשלב 8.1.4 באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM) כדי לאמת את נוכחותם של BEVs. כל ההליכים להלן צריכים להתבצע על קרח.
- החל 10 μL מכל חלק F4-F9 מבודד משלב 7.8 ואת הדגימות שנותרו לאחר UC שהוגדר בשלב 6.2.9 על רשתות נחושת הנתמכות על ידי Formvar/Carbon למשך 20 דקות, וכתם עם נייר סינון.
- שטפו את הדגימות עם 100 מיקרוליטר של PBS שלוש פעמים למשך דקה אחת כל אחת, וכתם עם נייר סינון.
- תקן את הדגימות עם 100 μL של 1% (w/v) גלוטראלדהיד במשך 5 דקות וכתם עם נייר סינון.
- שטפו את הרשתות עם 100 מיקרוליטר של PBS עשר פעמים למשך 2 דקות כל אחת, וכתם עם נייר פילטר.
- צבעו את הרשתות ב-50 μL של 1.5% (w/v) אורניל אצטט למשך 10 דקות, וכתם עם נייר פילטר.
אזהרה: אורניל אצטט הוא רדיואקטיבי ורעיל ביותר כאשר הוא בא במגע עם העור או נשאף. טפל בתמיסות עם אורניל אצטט בארון אדים ופעל לפי אמצעי הבטיחות המתאימים. - העבירו את הרשתות לטפילת מתילצלולוז של 1% (w/v) למשך 5 דקות והוסיפו כתם עם נייר סינון.
- אחסנו את הרשתות המיובשות באוויר בסביבה חשוכה ונטולת אבק עד לתצפית.
- צלם תמונות ונתח אותן באמצעות TEM.
- אפיין את שברי BEV שהוגדרו בשלב 8.1.4 באמצעות ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים (NTA) כדי לספור את מספר החלקיקים.
- כיול המערכת באמצעות חלקיקי פוליסטירן 110 ננומטר.
- שטפו את הבריכה לדוגמה באמצעות PBS.
- לדלל את הדגימות משברים שונים שנרכשו בשלב 7.8 ואת הדגימות שנותרו לאחר UC שהוגדרו בשלב 6.2.9 לריכוז בטווח של 105-10 9 חלקיקים / מ"ל, עם ריכוז אופטימלי של 107 חלקיקים / מ"ל.
- הקלט ונתח ב 11 עמדות עם שלושה שכפולים, שמירה על הטמפרטורה סביב 23-30 מעלות צלזיוס.
- נתח את תכולת החלבון של הדגימות על ידי צביעה כחולה מבריקה קומאסי (CBBS) וכתמים מערביים (WB).
- דלל את דגימות ה-BEV משברים שונים שהתקבלו בשלב 7.8 ואת הדגימות שנותרו לאחר UC שהוגדרו בשלב 6.2.9 באמצעות PBS ומאגר טעינה של 5 × לריכוז סופי של 0.5 או 1 מיקרוגרם/μL, אם יש צורך בכמות, כדי להבטיח העמסת דגימה מספקת של 20 מיקרוליטר (10 מיקרוגרם או 20 מיקרוגרם) מכל באר בשלב 8.5.2. מרתיחים את הדגימות ב 95 ° C במשך 10 דקות.
- להרכיב את ג'ל פוליאקרילאמיד טרומי לתוך מיכל אלקטרופורזה, ולהעביר את הדגימות לבארות.
- בצע אלקטרופורזה אנכית עם הפרמטרים הבאים: 160 V במשך 50 דקות.
- הכתימו את הג'ל בתמיסה הכחולה המבריקה של Coomassie למשך שעה אחת, שטפו במים נטולי יונים, עד שהרקע הכחול יתבהר, וצלמו תמונות עם מצלמה.
- בצע הליכי ניקוי חלבון עבור ג'לים אחרים עם הפרמטרים הבאים: 400 mA למשך 20 דקות.
- חסום את קרומי הכתמים עם תמיסת BSA של 5% (w/v) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
- שטפו את הממברנות במאגר TBST שלוש פעמים למשך 5 דקות כל אחת.
- לדגור על הממברנות עם נוגדנים ראשוניים (סמני BEV: LPS, OmpA, LTA; סמני EEV: CD63, CD9, TSG-101, Syntenin, Integrin β1; סמני זיהום אחרים: Flagellin, Calnexin) במשך 8-12 שעות ב 4 ° C.
- שטפו את הממברנות במאגר TBST שלוש פעמים למשך 10 דקות כל אחת.
- לדגור את הממברנות עם נוגדנים משניים במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר.
- בצע את שלב 8.5.9.
- לפתח את blotting באמצעות מנגנון chemiluminescence.
- החלף את תמיסת PBS/BEV (שלב 6.1.1 ושלב 6.2.2) בתמיסת BEV מ- Escherichia coli כדי לבסס בקרה חיובית (ראה טבלת חומרים להליך בידוד E. coli-BEV גולמי), ובצע את כל הניסויים לעיל לאפיון BEVs.
נקודת השהיה: קבע את F6-F8 כהתפלגות של שברים מועשרים ב-BEV בהתבסס על תוצאות האפיון שתואר לעיל עבור כ"ד צואתיים, והשתמש בטווח מצומצם זה לניתוח עוקב.
- חשב את שיעורי ההתאוששות במונחים של חלקיקים וחלבונים כדי להעריך את היעילות של שני מצבי DGC. התוצאות להלן מוצגות באחוזים.
- חשב את שיעורי השחזור של חלקיקים במצב מלמעלה למטה: סך כל החלקיקים ב- F6-F8/חלקיקים לאחר UC שהוגדר בשלב 6.2.9.
- חשב את שיעורי ההתאוששות של חלקיקים במצב מלמטה למעלה: סך כל החלקיקים ב- F6-F8/חלקיקים לאחר UC שהוגדר בשלב 6.2.9.
- חשב את שיעורי ההתאוששות של חלבונים במצב מלמעלה למטה: תכולת החלבון הכוללת בתכולת F6-F8 (מיקרוגרם)/חלבון לאחר UC שהוגדר בשלב 6.2.9 (מיקרוגרם).
- חשב את שיעורי ההתאוששות של חלבונים במצב מלמטה למעלה: תכולת החלבון הכוללת בתכולת F6-F8 (מיקרוגרם)/חלבון לאחר UC שהוגדר בשלב 6.2.9 (מיקרוגרם).
- חשב את יחס החלקיקים/חלבונים כדי להעריך את הטוהר המוגדר באופן מסורתי של UC ושני מצבי DGC, והתוצאות להלן הוצגו כולן באחוזים.
- יחס חלקיקים/חלבונים לאחר UC שהוגדר בשלב 6.2.9: חלקיקים לאחר UC/תכולת חלבון לאחר UC (מיקרוגרם).
- יחס חלקיקים/חלבונים במצב מלמעלה למטה: סך כל החלקיקים ב-F6-F8/תכולת חלבון ב-F6-F8 (מיקרוגרם).
- יחס חלקיקים/חלבונים במצב מלמטה למעלה: סך כל החלקיקים בתכולת F6-F8/חלבון ב-F6-F8 (מיקרוגרם).
- בחר את מצב הצנטריפוגה המתאים ביותר (מצב מלמעלה למטה נבחר בפרוטוקול) לטיהור BEV צואתי וניתוח עתידי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
קביעת ההתפלגות של שברים מועשרים ב-BEV
כדי לקבוע את התפלגות השברים המועשרים בשלפוחיות חוץ-תאיות חיידקיות (BEVs), הוקמה בקרה ריקה למדידת ערכי הספיגה ב-OD 340 ננומטר, והצפיפות של כל שבר חושבה על סמך המדידות והנחיות היודיקסנול (שלב 8.1). טבלה 2 מציגה את תוצאות הצפיפות, ומדגימה כי שברים F4 עד F9 הפגינו צפיפויות בטווח הקשור בדרך כלל לבועיות חוץ-תאיות. ממצא זה הצביע על כך שרוב כלי הרכב החשמליים היו מבודדים בשברים אלה, מה שהוביל להגדרת F4-F9 כטווח הגס של כלי רכב חשמליים. מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM) שימש כדי לאפיין את התכונות המורפולוגיות של כ"ד צואתי שבודדו כפי שמוצג באיור 1 בשברים F4-F9. תמונות TEM (איור 2) חשפו את נוכחותם של מבנים קלאסיים בצורת גביע, האופייניים לכלי רכב חשמליים. ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים (NTA) ובדיקת חומצה ביכומונית (BCA) נערכו כדי לקבוע את מספר החלקיקים ואת ריכוז החלבון, בהתאמה, מה שמאפשר הערכה נוספת של שיעורי ההתאוששות והטוהר. איור 3 מציג את ריכוזי החלבונים והחלקיקים עבור כל שבר, מה שמצביע על כך ש-F6 ו-F7 הציגו את הריכוזים הגבוהים ביותר, ואחריו F5 ו-F8. לאחר מכן, צביעה כחולה מבריקה של קומאסי (CBBS) וכתמים מערביים (WB) בוצעו כדי לספק ניתוח חלבון כולל. התוצאות של CBBS היו עקביות עם ממצאי ריכוז החלבון, כאשר F6 ו-F7 הציגו את הפסים האינטנסיביים ביותר (איור 4). כדי לאשר את התפלגות BEVs, שלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן ב - Escherichia coli שימשו כבקרה חיובית (מוגדרת בשלב 8.5.13). נהלי הבידוד והטיהור עקבו אחר השלבים המתוארים בטבלת החומרים ובסעיפי הפרוטוקול הנ"ל (שלבים 3, 4). ניתוח WB אישר עוד יותר את נוכחותו של חלבון הממברנה החיצונית A (OmpA), מרכיב עיקרי בקרום החיצוני של חיידקים וסמן ספציפי עבור BEVs, בשברים F6-F8. בהתבסס על תוצאות אלה, שברים F6-F8 הוגדרו כשברים מועשרים ב-BEV המתאימים לניסויים וניתוח הבאים.
אימות טווח ההצגה של רכיבי ההפרעה
שלפוחיות חוץ-תאיות אאוקריוטיות (EEVs), בעלות גודל וצפיפות דומים לאלה של BEVs, זוהו כהפרעה משמעותית בניתוח של BEVs. כדי לטפל בכך, שלושה חלבוני EEV נבדקו בשברים 5-8 הן ממצב מלמעלה למטה והן ממצב מלמטה למעלה, עם זמני צנטריפוגה של 7 שעות ו-15 שעות. CD63, חלבון טרנסממברנה הקשור ל-EEV, זוהה בעיקר ב-F5, בעוד שסמן ה-BEV LPS הועשר בשברים 6-7. דפוס זה נצפה בשני המצבים, אם כי מצב מלמטה למעלה הציג פסים קלים של CD63-EEV ב- F7. עם זאת, סמני EEV אחרים, CD9 ו- TSG-101, לא הראו אותות נראים לעין בשברים אלה ללא קשר למצבים או לזמני הצנטריפוגה. בניסוי עצמאי נעשה שימוש בנוגדנים המכוונים לסינטנין ולאינטגרין β1 כדי לוודא את העשרתם של סמנים חלבוניים מובהקים הטבועים ב-EEV בשברים 5-8. סינטנין זוהה באופן בולט בתוך F5, במיוחד במסגרת הגישה מלמעלה למטה, בעוד שנוכחותו של אינטגרין β1 הורגשה בתוך F6 (איור 5). כדי להעריך עוד יותר את נוכחותם של חלקיקים מפריעים, ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (Dil-LDL) הוכנס למערכת שיפוע הצפיפות, ועוצמת הפלואורסצנטיות נמדדה בכל השברים. במצב מלמעלה למטה, שברים 1-4 הציגו ערכים פלואורסצנטיים גבוהים יחסית, בעוד שבמצב מלמטה למעלה, היה זה F1-F6 שהציג עוצמות גבוהות יותר (איור 6).
להעריך את שיעורי ההתאוששות והטוהר של שני מצבי DGC מריכוז, גודל חלקיקים וסמנים של BEV
לאחר זיהוי שברי F6-F8 כשברים מועשרים ב-BEV, הוערכו שיעורי ההתאוששות והטוהר של שני מצבי צנטריפוגת שיפוע צפיפות (DGC). גודל החלקיקים של שברים מועשרים ב-BEV שהתקבלו ממצב מלמעלה למטה, מצב מלמטה למעלה ואולטרה-צנטריפוגה (UC) בלבד הושוו. גדלי החלקיקים שנצפו בשני מצבי הצנטריפוגה נעו בין 90 ל-300 ננומטר, בהתאמה לקוטר המוגדר של כלי רכב חשמליים (איור 7). לאחר מכן, שיעורי התאוששות החלקיקים והחלבונים של שני המצבים חושבו בהתבסס על ריכוזי החלקיקים והחלבונים לפני ואחרי DGC (טבלה 3 ואיור 8). יש לציין כי מצב Bottom-up הציג שיעורי התאוששות גבוהים יותר בהשוואה למצב השני. בקבוצת ניסוי נפרדת, התאוששות החלבונים בשני המצבים הוערכה בזמני צנטריפוגה שונים של 7 שעות ו-15 שעות. חשוב לציין שלא היה הבדל מובהק סטטיסטית בתכולת החלבונים בתוך שברי F6-F8 לאחר DGC בין שני זמני הצנטריפוגה, ללא קשר למצב השיפוע שבו נעשה שימוש (איור 9). יחס חלקיקים/חלבונים חושב כדי לספק הערכה גסה של הטוהר בשני המצבים. הנתונים לא הצביעו על הבדל משמעותי בטוהר בין המצבים. בנוסף, צביעה כחולה מבריקה של קומאסי (CBBS) וכתמים מערביים (WB) בוצעו כדי להשוות עוד יותר את הטוהר, תוך התמקדות בשלושה סמני BEV (LPS, OmpA ו- LTA), סמן EEV אחד (CD63) ושני סמנים מזהמים (Calnexin, Flagellin). התוצאות הדגימו הפחתה חלקית של חומרים מפריעים לאחר DGC, כאשר LPS ו-OmpA הראו נוכחות בולטת יותר בשני מצבי DGC בהשוואה ל-UC בלבד (איור 10).
איור 1: זרימת עבודה סכמטית של בידוד וטיהור של כלי רכב חשמליים. קיצורים: BEVs = שלפוחיות חוץ-תאיות חיידקיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תמונות TEM מייצגות של שברי BEV. (A) תמונות TEM של כלי רכב חשמליים שבודדו לאחר UC. (B) תמונות TEM של כלי רכב חשמליים שבודדו לאחר DGC באמצעות מצב מלמעלה למטה. (C) תמונות TEM של כלי רכב חשמליים שבודדו לאחר DGC באמצעות מצב מלמטה למעלה. כל התמונות הוצגו בקנה מידה עקבי של 200 ננומטר. קיצורים: TEM = מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת; BEVs = שלפוחיות חוץ-תאיות חיידקיות; UC = אולטרה-צנטריפוגה; DGC = צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ריכוז חלבונים וחלקיקים של שברי BEV לאחר מצבי DGC מלמעלה למטה ומלמטה למעלה. ריכוז החלבון של שברי BEV נקבע באמצעות BCA והוא מיוצג על ידי הפסים האפורים. ריכוז החלקיקים נמדד באמצעות נת"ע והוא מיוצג על ידי הפסים הכחולים. קיצורים: BEV = שלפוחית חוץ-תאית חיידקית; DGC = צנטריפוגה שיפוע צפיפות; BCA = בדיקת חומצה ביכונית; נת"ע = ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: קביעת שברים מועשרים בכ"ד. (A) CBBS בוצע כדי לקבוע את השברים המועשרים ב-BEV צואתי הן במצב מלמעלה למטה והן במצב מלמטה למעלה. (B) כלי רכב חשמליים שמקורם ב-Escherichia coli בודדו, טוהרו ושימשו כבקרה חיובית ב-WB כדי לאשר את נוכחותם ותפוצתם של כלי רכב חשמליים. OmpA: חלבון קרום חיצוני A, סמן BEV. קיצורים: BEV = שלפוחית חוץ-תאית חיידקית; CBBS = קומאסי כתמים כחולים מבריקים; EVs = שלפוחיות חוץ-תאיות; WB = כתם מערבי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: אישור התפלגות EEV. ניתוח כתמים מערביים של שברים 5-8 המתקבל ממצבי DGC מלמעלה למטה ומלמטה למעלה עם משכי אולטרה-צנטריפוגה של שיפוע צפיפות שונה, 7 שעות (A) ו- 15 שעות (B). בוצע ניסוי עצמאי שהתמקד ב-F5 עד F8 כתוצאה מתקופת צנטריפוגה של 7 שעות, כפי שהודגם ב-(C) ו-(D). סמנים נבחרים כללו את אלה הקשורים ל- BEV (LPS) ו- EEV (CD63, CD9, TSG-101, Syntenin, Integrin β1). קיצורים: DGC = צנטריפוגה שיפוע צפיפות; BEV = שלפוחית חוץ-תאית חיידקית; EEV = שלפוחית חוץ-תאית אאוקריוטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: התפלגות ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה. ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (Dil-LDL), הנחשב לסמן זיהום, נוסף בריכוז של 10 מיקרוגרם למערכת השיפוע הן במצב מלמעלה למטה והן במצב מלמטה למעלה. Dil-LDL החליף את פתרון PBS/BEV (שלב 6.1.1 ושלב 6.2.2) כדי ליצור מודל זיהוי. עוצמת הפלואורסצנטיות של כל שבר נמדדה באמצעות גלאי מיקרו-פלטה באורך גל עירור/פליטה של 549/565 ננומטר. קיצור: BEV = שלפוחית חוץ-תאית חיידקית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: גדלי חלקיקים של שברים מועשרים ב-BEV. (A) התפלגות גודל חלקיקים של BEV גולמי המתקבלים לאחר UC. (B) התפלגות גודל חלקיקים של שברים מועשרים ב-BEV (F6-F8) המתקבלת באמצעות מצב צנטריפוגת שיפוע צפיפות מלמעלה למטה (DGC). (C) התפלגות גודל החלקיקים של שברים מועשרים ב-BEV (F6-F8) התקבלה באמצעות מצב DGC מלמטה למעלה. נת"ע נדרשה לכמת את ממדי החלקיקים. גורמי הדילול ששימשו לפאנלים (A-C) היו 10,000, 2,000 ו-5,000, בהתאמה, כאשר התוצאות הבאות כוילו בעקבותיהן. קיצורים: BEV = שלפוחית חוץ-תאית חיידקית; UC = אולטרה-צנטריפוגה; DGC = צנטריפוגה שיפוע צפיפות; נת"ע = ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: שיעורי התאוששות חלבונים וחלקיקים של מצבי DGC מלמעלה למטה ומלמטה למעלה. (A) שיעורי התאוששות החלבון של שני המצבים המחושבים כיחס בין ריכוז החלבון אחרי ולפני DGC (UC). (B) שיעורי התאוששות החלקיקים של שני המצבים מחושבים לפי היחס בין ריכוז החלקיקים אחרי ולפני DGC (UC). (C) יחסי חלקיקים/חלבונים של מצבי UC, מלמעלה למטה ומלמטה למעלה. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. הניתוח הסטטיסטי בוצע באמצעות מבחן t דו-זנבי ולא מזווג עבור לוחות A ו-B, וניתוח חד-כיווני של שונות (ANOVA) עם מבחן Tukey post hoc עבור לוח C. לא נצפו הבדלים משמעותיים. קיצורים: DGC = צנטריפוגה שיפוע צפיפות; UC = אולטרה-צנטריפוגה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 9: השוואה של התאוששות חלבונים בהתבסס על מצבי DGC מלמעלה למטה ומלמטה למעלה באמצעות זמני אולטרה-צנטריפוגה שונים הקשורים לצפיפות. שיעורי התאוששות החלבונים בשברים F6-F8 שהתקבלו מאולטרה-צנטריפוגה הדרגתית במשך 7 שעות ו-15 שעות הוערכו בניסויים עצמאיים באמצעות מצב מלמעלה למטה ומלמטה למעלה. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. הניתוח הסטטיסטי בוצע באמצעות ניתוח דו-כיווני של שונות (ANOVA) עם מבחן ההבדל הכי פחות משמעותי של פישר. לא נצפו הבדלים משמעותיים. קיצורים: DGC = צנטריפוגת שיפוע צפיפות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 10: הערכת טוהר של מצבי DGC מלמעלה למטה ומלמטה למעלה. (A) CBBS נערך כדי להשוות את התפלגות החלבונים של מצבי UC, מלמעלה למטה ומלמטה למעלה. (B) WB נערך כדי להעריך את הטוהר של מצבי UC, מלמעלה למטה ומלמטה למעלה. קלנקסין: סמן חלבון הקשור לרשתית אנדופלסמית; פלגלין, סמן חלבון מזהם מחיידקים. CD63: סמן חלבון transmembrane עבור שלפוחיות חוץ-תאיות אאוקריוטיות; LTA: סמן BEV מחיידקים גראם-חיוביים; LPS, OmpA: סמנים BEV מחיידקים גראם-שליליים. קיצורים: DGC = צנטריפוגה שיפוע צפיפות; UC = אולטרה-צנטריפוגה; CBBS = Coomassie צביעה כחולה מבריקה; WB = כתם מערבי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| ריכוז תמיסת יודיקסנול (%) | 0.02 מטר חיץ HEPES | פתרון עבודה 50% יודיקסנול |
| 40 | 1 | 4 |
| 20 | 3 | 2 |
| 10 | 4 | 1 |
טבלה 1: יחסים להכנת מאגרי שיפוע צפיפות יודיקסנול. הטבלה סיפקה את היחס בין חיץ HEPES 0.02 M ותמיסת עבודה 50% יודיקסנול להשגת ריכוז מסוים של תמיסת יודיקסנול.
| פורמולה 1 | ו2 | ו3 | F4 | F5 | F6 | F7 | F8 | F9 | F10 | |
| צפיפות (גר'/מ"ל) | 1.023 | 1.038 | 1.049 | 1.062 | 1.074 | 1.098 | 1.144 | 1.185 | 1.239 | 1.293 |
טבלה 2: צפיפות מערכת הצנטריפוגות ההדרגתיות המבוססת על יודיקסנול. הטבלה הראתה את הצפיפות של כל שבר במערכת צנטריפוגה הדרגתית מבוססת יודיקסנול. בקרה ריקה: מערכת שיפוע מבוססת PBS.
| מצב מלמעלה למטה | מצב מלמטה למעלה | |
| קצב שחזור חלקיקים (%) | 24.08 | 35.69 |
| שיעור התאוששות חלבון (%) | 24.5 | 32.45 |
טבלה 3: שיעורי התאוששות החלקיקים והחלבונים של שני מצבים. הטבלה הראתה את שיעורי התאוששות החלקיקים והחלבונים של המצב מלמעלה למטה ומלמטה למעלה (איור 8).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שלפוחיות חוץ-תאיות חיידקיות (BEVs) הן ננו-חלקיקים דו-שכבתיים ליפידים המופרשים על-ידי חיידקים, נושאים שפע של חלבונים, שומנים, חומצות גרעין ומולקולות ביו-אקטיביות אחרות, התורמות לתיווך ההשפעות התפקודיות של חיידקים20. BEV שמקורו במעיים אומת כמעורב בהתפתחות מחלות, כגון מחלות מעי דלקתיות, מחלת קרוהן וסרטן המעי הגס, וכן משפיע על חילוף החומרים הכללי ומתווך תפקוד קוגניטיבי לקוי 4,16,17,20,21,22,23,24,25,26 . נכון לעכשיו, השגת מידע ביולוגי מלא ואובייקטיבי על BEV של חיידקי מעיים שמקורם בדגימות אנושיות - צואה עדיין מוגבלת על ידי שורה של גורמים, ביניהם הנושא המרכזי בראש ובראשונה הוא כיצד לבודד BEV מהסביבה המארחת המורכבת.
השיטות העיקריות לבידוד BEVs, כגון אולטרה-צנטריפוגה (UC), צנטריפוגת שיפוע צפיפות (DGC) וכרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (SEC)13,14,15,16,17, הן בעלות יתרונות וחסרונות. הקושי בסילוק חלק מהחומרים המפריעים והיעדר נהלי הפעלה עקביים, המשפיעים באופן חמור על ניתוח מציאותי ומקיף יותר של כלי רכב חשמליים, נותרו אתגרים לתהליך ההפרדה. כדי להקל על ההשפעות הבלתי רצויות של הפרעות, מחקרים רבים 15,27,28 שילבו שתיים או יותר מהשיטות הנ"ל כדי להשיג הפרדה של BEVs, במיוחד מנוזלי גוף, אך הליכים מורכבים נוטים להשפיע על יציבות התוצאות. עבור BEVs, ההבדל בצפיפות עם מזהמים אחרים (למשל, אגרגטים חלבוניים, רכיבי שומנים, שלפוחיות חוץ-תאיות אאוקריוטיות (EEVs)15) עשוי להפוך לאמצעי בידוד ספציפי בימינו.
כיום, יודיקסנול התגלה כמדיום המועדף להפרדת שיפוע צפיפות של כלי רכב חשמליים, ומחליף את הסוכרוז בשל תכונותיו האיזוטוניות. תכונות אלה תורמות לשימור המורפולוגיה של הרכב החשמלי ומקלות על הערכת הצפיפות עבור כל שבר29. בהתאמה עם Tulkens et al 15, המחקר שלנו אימץ ריכוז זהה עבור מערכת DGC, תוך שימוש ביודיקסנול ב-50% (w/v), 40% (w/v), 20% (w/v),10% (w/v) ו-0% בשכבות שיפוע ריכוז. השלב הראשוני כלל שימוש בחיץ HEPES להכנת ריכוזים שונים של תמיסות יודיקסנול. בהשוואה לחיץ סוכרוז Tris (-EDTA), ריכוז מתאים של חיץ HEPES מבטיח יציבות pH ארוכת טווח במערכת הצנטריפוגות, הודות לתכונות המהותיות שלו. במקביל, נעשה שימוש בחיץ PBS סטרילי בשכבה העליונה של מערכת הצנטריפוגות, לא רק כדי להגן מפני זיהום פוטנציאלי על ידי חיידקים והמטבוליטים שלהם במהלך הכנת התמיסה, אלא גם כדי לשמור על עקביות חיץ הדגימה לפני ואחרי DGC. זה כלל השעיה מחדש של הגלולה עם חיץ PBS לאחר UC והחלפת יודיקסנול עם PBS לאחר DGC, ובכך להקל על ניתוח השוואתי של התוצאות. יתר על כן, הנפח של כל שכבת שיפוע במערכת DGC כויל ל -3 מ"ל, 3 מ"ל, 3 מ"ל, 3 מ"ל ו -3.5 מ"ל עבור תמיסות יודיקסנול 50%, 40%, 20%, 10% ו- 0% (שכבת PBS) בהתאמה. אסטרטגיה זו מסייעת לבסס טווח צפיפות רחב יחסית (1.02-1.30 גרם/מ"ל), מה שעשוי לשפר את ההפרדה של BEV מאלמנטים מפריעים אחרים, ובכך להפוך את שיפועים ישימים לנוזלי גוף אחרים עם זיהום מורכב.
חשוב להדגיש כי שלבים מסוימים של הפרוטוקול הם קריטיים. יש לציין כי גורם הדילול המתואר בשלב 2.2, שבו 1 גרם של דגימות צואה מעורבב עם מינימום של 10 מ"ל של PBS, הוא חיוני למניעת רוויית יתר ושימור משאבי הניסוי. בתנאים אלה, ריכוז החלקיקים והחלבונים בדרך כלל עולה באופן יחסי עם מסת הצואה בדגימה, בהנחה שמאפיינים צואתיים אחרים קבועים. במידת הצורך, ניתן לבצע ניתוח נוסף בהתחשב בגורמים כגון עקביות, ליפופרוטאין או תכולת דם. במהלך שלב 3.4, יש לנקוט משנה זהירות כדי להימנע ממזיגה ישירה של התמיסה, מכיוון שהדבר עלול להפריע לכדורית, מה שעלול לגרום לגרגירים גדולים יותר לחסום את הממברנה של מסנן 0.22 מיקרומטר. אם המסנן הופך במהירות לרווי (לדוגמה, אם פחות מ-10 מ"ל עובר דרך מסנן), מומלץ לבצע שלב צנטריפוגה נוסף ב-12,000 × גרם . בהקשר של צנטריפוגת שיפוע צפיפות, הכנה מדויקת של פתרונות שיפוע היא תנאי מוקדם לתוצאות אמינות. בנוסף, מניפולציה זהירה של הצינור בעת שכבות התמיסות העליונות בצפיפות נמוכה חיונית למניעת הפרעה בריבוד, ויש לסלק כל בועות על ידי צנרת קשובה. לבסוף, כאשר שואפים את השברים, חשוב למשוך אותם בקפידה לאורך דופן הצינור, ולהימנע מכל שאיפת יתר או תת-שאיפת שעלולה להוביל לפיזור BEV לא מדויק. תצפית קבועה על רמת הנוזלים ותרגול עקבי יכולים לעזור להקל על בעיה זו.
מחקר זה קבע את השברים המועשרים ב-BEV (F6-F8) באמצעות שיטות אפיון מרובות ובחן שני מצבי אולטרה-צנטריפוגה הדרגתיים נפרדים: מלמעלה למטה ומלמטה למעלה. באמצעות מדידת ריכוז החלבונים והחלקיקים ב-F4-F8 (איור 3) והשוואת שיעורי ההתאוששות והטוהר (איור 8 ואיור 10), נצפה כי מצב הצנטריפוגה מלמטה למעלה הניב ערכים גבוהים יותר שזוהו הן ברמת החלבון והן ברמת החלקיקים מאשר השיטה החלופית לבידוד וטיהור כלי רכב חשמליים מדגימות צואה. תצפית זו מרמזת על תהליכים דינמיים שונים. הוצעה השערה שננו-חלקיקים חוץ-תאיים לא-שלפוחיתיים (NVEPs)29, כגון ליפופרוטאינים, בעלי צפיפות נמוכה יותר מאשר BEVs, עשויים שלא להגיע לצפיפויות הציפה שלהם אם הדגימות טעונות בעומס נמוך יותר (איור 6), מה שעלול לגרום לקצב התאוששות מנופח, אפילו לאחר 15 שעות של DGC (איור 9). תצפית זו מחייבת בחינה האם הגדרת הטוהר המסורתית, המבוססת על היחס בין חלקיקים לחלבונים, ישימה. יתר על כן, ראוי לציין כי EEV הפגינו דומיננטיות בתוך F5, בעוד BEV זוהו באופן בולט ב-F6-F7 (איור 4 ואיור 5). יש לציין כי בידול זה הודגש כאשר אימצו את המצב מלמעלה למטה. לפיכך, מצב זה עשוי להתאים יותר לפרוטוקול זה. עם זאת, חיוני להדגיש את נוכחותו של אינטגרין β1 בתוך F6, מה שעשוי לסמל את ההטרוגניות הפנימית בקרב EEVs. בעת יישום שיטה זו על נוזלי גוף אחרים כגון דם ושתן, החוקרים צריכים לשקול את התכונות הייחודיות של הדגימות. זמן הצנטריפוגה המוגדר בפרוטוקול זה הוא 7 שעות, קצר משמעותית ממשך הזמן שצוטט במחקרים אחרים, שיכול להגיע עד 18 שעות. בהשוואה לשחזור חלבון עם משך זמן של 15 שעות שבוצע באותה תבנית במחקר זה (איור 9), נראה שזמן זה מספיק כדי להשיג את טוהר ההפרדה הנדרש. בתנאי הפעלה אלה, התאוששות החלקיקים במצב מלמעלה למטה הגיעה עד 10 8 (4.5 × 10 7-1.5 × 10 8) למיליגרם צואה, בהתאם לדיווחים קודמים (10 11 BEV לגרם צואה רטובה) 15,29,30. לבסוף, מדידות צפיפות של כל שבר מהבקרה הריקה אישרו כי צפיפות כלי הרכב החשמליים נעה בין 1.09-1.19 גרם למ"ל, דבר העולה בקנה אחד עם מחקרים קודמים.
שיטה זו, למרות יעילותה, מהווה מגבלה בשל ההשפעה של דיאטות, תפקוד המעיים, וגורמים אחרים על הרכב הצואה. משתנים אלה יכולים לשנות את עקביות הצואה, מה שעלול להשפיע על שפע חיידקים והתאוששות BEV. לכן, חיוני לתקנן את הבידוד והטיהור של BEV31,32, עם התאמות שנעשו על בסיס הערכת מאפייני צואה. מחקר עתידי צריך להתמקד בזיהוי תקן לנרמול תפוקת BEV, בדומה לקריאטינין בשתן או קצב זרימת השתן. אמת מידה כזו יכולה לשפר את ההערכה המתודולוגית ולהאיר את הקשר בין כ"ד צואתי לבין המצב הפיזיולוגי והפתולוגי של הגוף. יתר על כן, הקשר החזק בין BEV צואתי ומחלות שונות מדגיש את הפוטנציאל הקליני המשמעותי שלהם. עם זאת, זמן הצנטריפוגה הקבוע בפרוטוקול זה אינו עונה על הדרישה לבדיקות נוחות ומהירות יותר כפי שנדרש על ידי רופאים. לכן, יש צורך בחקירה נוספת כדי לקבוע אם זמני צנטריפוגה קצרים יותר, אולי פחות מ -3 שעות, יכולים להניב תוצאות שוות-ערך. חקירה נוספת נדרשת גם כדי להבין את האירועים המתרחשים בשני מצבי הצנטריפוגה. למרות ההנחה כי רכיבים שאינם שלפוחית מועשרים יותר ב- F6-F8 במצב מלמטה למעלה, זיקוק ריכוזי שיפוע עשוי להיות מועיל בזיהוי תת-סוגים נוספים עם פונקציות ספציפיות.
מחקר זה הדגים בהצלחה את הבידוד והטיהור של כלי רכב חשמליים מצואת בני אדם באמצעות DGC. האסטרטגיה טומנת בחובה הבטחה ליישום על דגימות ביולוגיות אחרות, כגון דם, שתן ורוק, ומספקת לחוקרים גישה יעילה לחשיפת המידע החבוי של כלי רכב חשמליים, מה שעשוי לקדם יישומים קליניים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין ניגודי אינטרסים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע לחוקרים צעירים מצטיינים (82025024); פרויקט המפתח של הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82230080); תוכנית המו"פ הלאומית של סין (2021YFA1300604); הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81871735, 82272438 ו-82002245); קרן גואנגדונג למדעי הטבע לחוקרים צעירים מצטיינים (2023B1515020058); הקרן למדעי הטבע של מחוז גואנגדונג (2021A1515011639); תוכנית פיתוח המחקר הבסיסית של הקרן למדעי הטבע של פרובינציית שאנדונג בסין (ZR2020ZD11); הקרן לפוסט-דוקטורט במדע (2022M720059); תוכנית פיתוח הצעירים המצטיינים של בית החולים נאן-פאנג, האוניברסיטה הרפואית הדרומית (2022J001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 % (w/v) glutaraldehyde (prepared from 2.5 % stock solution in deionized water) | ACMEC | AP1126 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.3 |
| 1 % (w/v) methylcellulose (prepared from original powder in deionized water) | Sigma-Aldrich | M7027 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.6 |
| 1.5 % (w/v) uranyl acetate (prepared from original powder in deionized water) | Polysciences | 21447-25 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.5 |
| 1000 μL, 200 μL, 10 μL Pipette | KIRGEN | KG1313, KG1212, KG1011 | Transfer the solution |
| 5 % (w/v) bovine serum albumin solution (prepared from the original powder in TBST buffer) | Fdbio science | FD0030 | Used in western blotting for blocking at Step 8.5.6 |
| 5 × loading buffer | Fdbio science | FD006 | Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5.1 |
| 75 % (v/v) alcohol | LIRCON | LIRCON-500 mL | Surface disinfection |
| 96-well plate | Rar | A8096 | Measure the absorbance values |
| Anti-Calnexin antibody | Abcam | ab92573 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-CD63 antibody | Abcam | ab134045 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-CD9 antibody | Abcam | ab236630 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-Flagellin antibody | Sino Biological | 40067-MM06 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-Integrin beta 1 antibody | Abcam | ab30394 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-LPS antibody | Thermo Fisher | MA1-83152 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-LTA antibody | Thermo Fisher | MA1-7402 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-OmpA antibody | CUSABIO | CSB-PA359226ZA01EOD, https://www.cusabio.com/ | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-Syntenin antibody | Abcam | ab133267 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-TSG101 antibody | Abcam | ab125011 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Autoclave | ZEALWAY | GR110DP | Sterilization for supplies and mediums used in the experiment |
| Balance | Mettler Toledo | AL104 | Balance the tube sample-loaded with PBS |
| Bicinchoninic acid assay | Fdbio science | FD2001 | Measure protein content of BEVs at Step 8.2 |
| BioRender | BioRender | https://app.biorender.com | Make the schematic workflow of BEVs isolation and purification showed in Figure 1 |
| Biosafety cabinet | Haier | HR1200- II B2 | Peform the procedures about feces sample handling |
| Centrifuge 5810 R; Rotor F-34-6-38 | Eppendorf | 5805000092; 5804727002, adapter: 5804774000 | Preprocess for BEVs (Step 3) |
| Chemiluminescence Apparatus | BIO-OI | OI600SE-MF | Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12 |
| Cytation 5 | BioTek | F01 | Microplate detector for measuring the absorbance (Step 8.1) and fluorescence (Figure 6) values |
| Dil-labled low density lipoprotein | ACMEC | AC12038 | Definition of distribution of interfering components |
| Electrophoresis equipment | Bio-rad | 1658033 | Used in western blotting for protein separation and transfer at Step 8.5.2, 8.5.3, 8.5.5 |
| Enhanced Chemiluminescence kit HRP | Fdbio science | FD8020 | Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12 |
| Escherichia coli | American Type Culture Collection | ATCC8739 | Isolate BEVs as a positive control. Protocol: Dissolve 25 g of the LB powder in 1 L deionized water, and autoclave. Transfer the 800 μL of preserved Escherichia coli into the medium. Cultivate at 37 °C in the incubator shaker. Then centrifuge at 3, 000 × g for 20 min at 4 °C, 12, 000 × g for 30 min at 4 °C, filter the supernatant through 0.22 μm membrane, and perform ultra-speed centrifugation at 160, 000 × g for 70 min at 4 °C. Pellet defined as crude BEVs from Escherichia coli was suspended in 1.2 mL PBS (Step 3, 4). |
| Falcon tubes 50 mL | KIRGEN | KG2811 | Preprocess for BEVs (Step 3) |
| Feto Protein Staining Buffer | Absci | ab.001.50 | Coomassie brilliant blue staining at Step 8.5.4 |
| Filter paper | Biosharp | BS-TFP-070B | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 (Blotting the solution) |
| Formvar/Carbon supported copper grids | Sigma-Aldrich | TEM-FCF200CU50 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 |
| HEPES powder | Meilunbio | MB6078 | Prepare iodixanol buffers with different concentrations for density gradient centrifugation |
| HRP AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Fdbio science | FDM007 | Western blotting (Secondary Antibody) |
| HRP AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Fdbio science | FDR007 | Western blotting (Secondary Antibody) |
| Incubator shaker | Qiangwen | DHZ-L | Cultivate Escherichia coli |
| Kimwipes™ Delicate Task Wipes | Kimtech Science | 34155 | Wipe the inner wall of the ultracentrifuge tube at Step 4.15 |
| LB broth | Hopebio | HB0128 | Cultivate Escherichia coli |
| Low temperature freezer (-80 °C) | Haier | DW-86L338J | Store the samples |
| Methanol | Alalddin | M116118 | Used in western blotting for activating PVDF membrane at Step 8.5.5 |
| Micro tubes 1.5 mL | KIRGEN | KG2211 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
| Micro tubes 2 mL | KIRGEN | KG2911 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
| Micro tubes 5 mL | BBI | F610888-0001 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
| Microplate reader | Thermo Fisher | Multiskan MK3 | Measure protein content of BEVs at Step 8.2 |
| Millipore filter 0.22 μm | Merck millipore | SLGP033RB | Filtration sterilization; Material: polyethersulfone, PES |
| NaCl | GHTECH | 1.01307.040 | Density gradient centrifugation solution |
| NaOH | GHTECH | 1.01394.068 | Density gradient centrifugation solution (pH adjustment) |
| Optima™ XPN-100 | Beckman Coulter | A94469 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
| OptiPrep™ | Serumwerk Bernburg AG | 1893 | Density gradient centrifugation stock solution |
| Orbital Shaker | Youning | CS-100 | Dissolve feces at Step 2 |
| Phosphate buffered saline | Procell | PB180327 | Dissolve feces at Step 2 |
| Pipettor | Eppendorf | 3120000267, 3120000259 | Transfer the solution |
| Plastic pasteur pipette | ABCbio | ABC217003-4 | Remove supernatant in preprocessing at Step 3.4 |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes | Millipore | ISEQ00010, IPVH00010 | Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5 |
| Prefabricated polyacrylamide gel, 4–20% 15 Wells | ACE | F15420Gel | Used in western blotting for protein separation at Step 8.5.2, 8.5.3 |
| Primary antibody diluent | Fdbio science | FD0040 | Used in western blotting at Step 8.5.8 |
| Protein ladder | Fdbio science | FD0672 | Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5 |
| Rapid protein blotting solution | UBIO | UW0500 | Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5 |
| Rotor SW 32 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 369650 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
| Syringe 20 mL, 50 mL | Jetway | ZSQ-20ML, YCXWJZSQ-50 mL | Transfer buffers amd remove supernatant in preprocessing |
| TBS powder | Fdbio science | FD1021 | Used in western blotting at Step 8.5 |
| Transmission electron microscope (TEM) | Hitachi | H-7650 | Morphological observation for BEVs at Step 8.3 |
| Tween-20 | Fdbio science | FD0020 | Used in western blotting at Step 8.5 |
| Ultracentrifuge tube | Beckman | 326823, 355642 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
| Ultra-clean bench | AIRTECH | SW-CJ-2FD | Peform the procedures about liquid handling |
| Water bath | Bluepard | CU600 | Used for measuring protein content of BEVs at Step 8.2.5 |
| ZetaView | Particle Metrix | S/N 21-734, Software ZetaView (version 8.05.14 SP7) | Nanoparticle tracking analysis (NTA) for measuring the particle size and concentrarion of BEVs at Step 8.4 |
References
- Costello, E. K., et al. Bacterial community variation in human body habitats across space and time. Science. 326 (5960), 1694-1697 (2009).
- Greenhalgh, K., Meyer, K. M., Aagaard, K. M., Wilmes, P. The human gut microbiome in health: establishment and resilience of microbiota over a lifetime. Environmental Microbiology. 18 (7), 2103-2116 (2016).
- de Vos, W. M., Tilg, H., Van Hul, M., Cani, P. D. Gut microbiome and health: mechanistic insights. Gut. 71 (5), 1020-1032 (2022).
- Zhou, P., Yang, D., Sun, D., Zhou, Y. Gut microbiome: New biomarkers in early screening of colorectal cancer. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 36 (5), 24359 (2022).
- Paik, D., et al. Human gut bacteria produce Τ(Η)17-modulating bile acid metabolites. Nature. 603 (7903), 907-912 (2022).
- Parada Venegas, D., et al. Short chain fatty acids (SCFAs)-mediated gut epithelial and immune regulation and its relevance for inflammatory bowel diseases. Frontiers in Immunology. 10, 277 (2019).
- Jiang, C., Li, G., Huang, P., Liu, Z., Zhao, B. The Gut microbiota and Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 58 (1), 1-15 (2017).
- Morais, L. H., Schreiber, H. L. t, Mazmanian, S. K. The gut microbiota-brain axis in behaviour and brain disorders. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 241-255 (2021).
- Kim, J. H., Lee, J., Park, J., Gho, Y. S. Gram-negative and Gram-positive bacterial extracellular vesicles. Seminars in Cell and Developmental Biology. 40, 97-104 (2015).
- Toyofuku, M., Nomura, N., Eberl, L. Types and origins of bacterial membrane vesicles. Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 13-24 (2019).
- Xie, J., Li, Q., Haesebrouck, F., Van Hoecke, L., Vandenbroucke, R. E. The tremendous biomedical potential of bacterial extracellular vesicles. Trends in Biotechnology. 40 (10), 1173-1194 (2022).
- Coumans, F. A. W., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).
- Northrop-Albrecht, E. J., Taylor, W. R., Huang, B. Q., Kisiel, J. B., Lucien, F. Assessment of extracellular vesicle isolation methods from human stool supernatant. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (4), 12208 (2022).
- Park, Y. E., et al. Microbial changes in stool, saliva, serum, and urine before and after anti-TNF-α therapy in patients with inflammatory bowel diseases. Scientific Reports. 12 (1), 6359 (2022).
- Tulkens, J., De Wever, O., Hendrix, A. Analyzing bacterial extracellular vesicles in human body fluids by orthogonal biophysical separation and biochemical characterization. Nature Protocols. 15 (1), 40-67 (2020).
- Tulkens, J., et al. Increased levels of systemic LPS-positive bacterial extracellular vesicles in patients with intestinal barrier dysfunction. Gut. 69 (1), 191-193 (2020).
- Kang, C. S., et al. Extracellular vesicles derived from gut microbiota, especially Akkermansia muciniphila, protect the progression of dextran sulfate sodium-induced colitis. PloS one. 8 (10), 76520 (2013).
- Simonsen, J. B. What are we looking at? Extracellular vesicles, lipoproteins, or both. Circulation Research. 121 (8), 920-922 (2017).
- Correll, V. L., et al. Optimization of small extracellular vesicle isolation from expressed prostatic secretions in urine for in-depth proteomic analysis. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12184 (2022).
- Liang, X., et al. Gut bacterial extracellular vesicles: important players in regulating intestinal microenvironment. Gut Microbes. 14 (1), 2134689 (2022).
- Alberti, G., et al. Extracellular vesicles derived from gut microbiota in inflammatory bowel disease and colorectal cancer. Biomedical papers of the Medical Faculty of the University Palacky, Olomouc, Czech Republic. 165 (3), 233-240 (2021).
- Díez-Sainz, E., Milagro, F. I., Riezu-Boj, J. I., Lorente-Cebrián, S. Effects of gut microbiota-derived extracellular vesicles on obesity and diabetes and their potential modulation through diet. Journal of Physiology and Biochemistry. 78 (2), 485-499 (2022).
- Lajqi, T., et al. Gut microbiota-derived small extracellular vesicles endorse memory-like inflammatory responses in murine neutrophils. Biomedicines. 10 (2), 442 (2022).
- Lee, K. E., et al. The extracellular vesicle of gut microbial Paenalcaligenes hominis is a risk factor for vagus nerve-mediated cognitive impairment. Microbiome. 8 (1), 107 (2020).
- Villard, A., Boursier, J., Andriantsitohaina, R. Bacterial and eukaryotic extracellular vesicles and nonalcoholic fatty liver disease: new players in the gut-liver axis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 320 (4), G485-G495 (2021).
- Wei, S., et al. Outer membrane vesicles enhance tau phosphorylation and contribute to cognitive impairment. Journal of Cellular Physiology. 235 (5), 4843-4855 (2020).
- Bitto, N. J., Kaparakis-Liaskos, M. Methods of bacterial membrane vesicle production, purification, quantification, and examination of their immunogenic functions. Methods in Molecular Biology. 2523, 43-61 (2022).
- Stentz, R., Miquel-Clopés, A., Carding, S. R. Production, isolation, and characterization of bioengineered bacterial extracellular membrane vesicles derived from Bacteroides thetaiotaomicron and their use in vaccine development. Methods in Molecular Biology. 2414, 171-190 (2022).
- Zhang, Q., Jeppesen, D. K., Higginbotham, J. N., Franklin, J. L., Coffey, R. J. Comprehensive isolation of extracellular vesicles and nanoparticles. Nature Protocols. 18 (5), 1462-1487 (2023).
- Iwai, K., Minamisawa, T., Suga, K., Yajima, Y., Shiba, K. Isolation of human salivary extracellular vesicles by iodixanol density gradient ultracentrifugation and their characterizations. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 30829 (2016).
- Vandeputte, D., et al. Stool consistency is strongly associated with gut microbiota richness and composition, enterotypes and bacterial growth rates. Gut. 65 (1), 57-62 (2016).
- Wen, M., et al. Bacterial extracellular vesicles: A position paper by the Microbial Vesicles Task Force of the Chinese Society of Extracellular Vesicles. Interdisciplinary Medicine. 1, 12046 (2023).
