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Biology

घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग करके मानव मल से बैक्टीरियल एक्स्ट्रासेल्युलर पुटिकाओं का अलगाव और शुद्धिकरण

Published: September 1, 2023 doi: 10.3791/65574
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Laboratory Medicine, Nanfang Hospital, Southern Medical University
* These authors contributed equally

Summary

यह अध्ययन घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन (डीजीसी) के माध्यम से मानव मल से समृद्ध बैक्टीरियल बाह्य पुटिकाओं (बीईवी) को अलग करने और शुद्ध करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है, आकृति विज्ञान, कण आकार और एकाग्रता से बीईवी की भौतिक विशेषताओं की पहचान करता है, और नैदानिक और वैज्ञानिक अनुसंधान में डीजीसी दृष्टिकोण के संभावित अनुप्रयोगों पर चर्चा करता है।

Abstract

बैक्टीरियल एक्स्ट्रासेल्युलर वेसिकल्स (बीईवी) बैक्टीरिया से प्राप्त नैनोवेसिकल्स हैं जो बैक्टीरिया-बैक्टीरिया और बैक्टीरिया-होस्ट संचार में सक्रिय भूमिका निभाते हैं, जो मूल बैक्टीरिया से विरासत में मिले प्रोटीन, लिपिड और न्यूक्लिक एसिड जैसे बायोएक्टिव अणुओं को स्थानांतरित करते हैं। आंत माइक्रोबायोटा से प्राप्त बीईवी का जठरांत्र संबंधी मार्ग के भीतर प्रभाव पड़ता है और दूर के अंगों तक पहुंच सकता है, जिसके परिणामस्वरूप शरीर विज्ञान और विकृति विज्ञान के लिए महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है। सैद्धांतिक जांच जो मानव मल से प्राप्त बीईवी के प्रकार, मात्रा और भूमिकाओं का पता लगाती है, आंत माइक्रोबायोटा से बीईवी के स्राव और कार्य को समझने के लिए महत्वपूर्ण हैं। इन जांचों में बीईवी को अलग करने और शुद्ध करने के लिए वर्तमान रणनीति में सुधार की भी आवश्यकता है।

इस अध्ययन ने दो घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन (डीजीसी) मोड स्थापित करके बीईवी के अलगाव और शुद्धिकरण प्रक्रिया को अनुकूलित किया: टॉप-डाउन और बॉटम-अप। बीईवी का समृद्ध वितरण अंश 6 से 8 (एफ 6-एफ 8) में निर्धारित किया गया था। दृष्टिकोण की प्रभावशीलता का मूल्यांकन कण आकृति विज्ञान, आकार, एकाग्रता और प्रोटीन सामग्री के आधार पर किया गया था। कण और प्रोटीन वसूली दर की गणना की गई थी, और दो डीजीसी मोड की वसूली और शुद्धता की तुलना करने के लिए विशिष्ट मार्करों की उपस्थिति का विश्लेषण किया गया था। परिणामों ने संकेत दिया कि टॉप-डाउन सेंट्रीफ्यूजेशन मोड में संदूषण का स्तर कम था और बॉटम-अप मोड के समान रिकवरी दर और शुद्धता हासिल की। 7 घंटे का एक सेंट्रीफ्यूजेशन समय 108 / मिलीग्राम की फेकल बीईवी एकाग्रता प्राप्त करने के लिए पर्याप्त था।

मल के अलावा, इस विधि को घटकों और चिपचिपाहट में अंतर के अनुसार उचित संशोधन के साथ शरीर के अन्य तरल पदार्थों पर लागू किया जा सकता है। अंत में, यह विस्तृत और विश्वसनीय प्रोटोकॉल बीईवी के मानकीकृत अलगाव और शुद्धिकरण की सुविधा प्रदान करेगा और इस प्रकार, बाद के बहु-ओमिक्स विश्लेषण और कार्यात्मक प्रयोगों के लिए एक नींव रखेगा।

Introduction

आंत को व्यापक रूप से मानव शरीर में सबसे प्रचुर मात्रा में माइक्रोबियल समुदायों को शरण देने वाले अंग के रूप में पहचाना जाता है, जिसमें 90% से अधिक बैक्टीरिया उपनिवेशण और गुणन 1,2 में शामिल होते हैं। व्यापक सबूत से पता चला है कि आंत माइक्रोबायोटा आंत microenvironment modulates और साथ ही दूर के अंगों में शिथिलता के साथ बातचीत, मुख्य रूप से एक बिगड़ा आंतों बाधा 3,4 के माध्यम से. बढ़ते सबूत आंत माइक्रोबायोटा के असंतुलन और सूजन आंत्र रोग (आईबीडी)5,6की प्रगति के साथ-साथ आंत-मस्तिष्क अक्ष 5,6,7,8के माध्यम से संज्ञानात्मक विकारों के बीच एक संबंध को इंगित करता है। बैक्टीरिया द्वारा उत्पादित बैक्टीरियल बाह्य पुटिकाओं (बीईवी) इन रोग प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं।

बीईवी नैनोस्केल कण हैं जो बैक्टीरियल डेरिवेटिव को एनकैप्सुलेट करते हैं, जिनका व्यास 20 से 400 एनएम तक होता है। वे बैक्टीरिया और उनके मेजबान जीवों 9,10 के बीच बातचीत की सुविधा के लिए प्रदर्शन किया गया है. उनकी अदृश्यता के बावजूद, इन कणों नैदानिक biomarkers के रूप में उनके संभावित व्यापक अनुप्रयोगों के कारण शोधकर्ताओं से बढ़ती ध्यान आकर्षित किया है, चिकित्सीय लक्ष्य, और दवा वितरण वाहनों11. मानव मल, अक्सर बीईवी का अध्ययन करने के लिए बायोस्पेसिमेन के रूप में उपयोग किया जाता है, मुख्य रूप से आंत बैक्टीरिया से प्राप्त होता है, जिसमें पानी, बैक्टीरिया, लिपिड, प्रोटीन, अपचित खाद्य अवशेष, और दूसरों के बीच एक्सफोलिएटेड एपिथेलियल कोशिकाओं का एक जटिल मिश्रण होता है। जटिल फेकल संरचना बीईवी के अलगाव और शुद्धता के लिए चुनौतियां पैदा करती है, जिससे बीईवी के व्यापक, उद्देश्यपूर्ण और यथार्थवादी विश्लेषण में बाधा उत्पन्न होती है। इसलिए, दूषित घटकों से हस्तक्षेप को कम करने और बीईवी की उपज बढ़ाने के लिए प्रभावी रणनीतियां महत्वपूर्ण मुद्दों के रूप में उभरी हैं जिन पर तत्काल ध्यान देने की आवश्यकता है।

मौजूदा अलगाव रणनीतियाँ काफी हद तक अल्ट्रा-हाई-स्पीड सेंट्रीफ्यूजेशन (यूसी), घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन (डीजीसी), और आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एसईसी)12,13,14,15,16,17जैसी तकनीकों पर निर्भर करती हैं। वर्तमान में, डीजीसी बीईवी पृथक्करण के क्षेत्र में सबसे व्यापक रूप से लागू तरीकों में से एक है, जिसमें दो अवसादन-फ्लोटिंग मोड, "टॉप-डाउन" और "बॉटम-अप" शामिल हैं, जो नमूने की प्रारंभिक लोडिंग स्थिति द्वारा निर्धारित किए जाते हैं। ये पद्धतियां आकार और घनत्व असमानताओं के आधार पर अन्य घटकों से बाह्य पुटिकाओं (ईवीएस) को अलग करती हैं, जिससे परिवर्तनीय शुद्धता और वसूली दर मिलती है। पूर्व शोध ने संकेत दिया है कि शरीर के तरल पदार्थ के नमूनों में घुलनशील प्रोटीन से ईवीएस को पर्याप्त रूप से अलग करने के लिए एकल-दृष्टिकोण रणनीतियां अपर्याप्त हैं, जैसे कि रक्त18 में लिपोप्रोटीन और मूत्र19 में टैम-हॉर्सफॉल प्रोटीन। इसके अतिरिक्त, यूकेरियोटिक बाह्य पुटिकाओं (ईईवी) का आकार वितरण अक्सर बीईवी के साथ ओवरलैप होता है, जिससे बीईवी उपज को अनुकूलित करने के लिए आगे पद्धतिगत संवर्द्धन की आवश्यकता होती है। नतीजतन, बीईवी के अध्ययन को आगे बढ़ाना प्रभावी पृथक्करण और शुद्धिकरण पद्धतियों के विकास पर टिका है। विशेष रूप से, टुल्केन्स एट अल 15 ने ईईवी से फेकल बीईवी को अलग करने के लिए एक ऑर्थोगोनल बायोफिजिकल रणनीति को नियोजित किया, जिसमें बॉटम-अप डीजीसी मोड का सेंट्रीफ्यूजेशन समय18 घंटे तक था। इसके विपरीत, इस अध्ययन ने इसे 7 घंटे तक कम कर दिया, ढाल-अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन समय को बहुत बचाया और प्रक्रिया को सरल बनाया।

वर्तमान अध्ययन में, हमने कम से अत्यधिक उच्च वेग तक, अंतर सेंट्रीफ्यूजेशन गति की एक श्रृंखला के साथ बीईवी को समृद्ध करने के बाद, अनुकूलित बफर स्थितियों के तहत दो डीजीसी मोड को नियोजित करने वाले फेकल बीईवी को अलग और शुद्ध किया। आकृति विज्ञान, कण आकार और एकाग्रता के आधार पर मूल्यांकन ने इस उन्नत विधि द्वारा एक सराहनीय प्रदर्शन का संकेत दिया। यह अध्ययन भविष्य के अनुसंधान की नींव के रूप में काम कर सकता है, इसके अनुप्रयोगों को एक व्यापक डोमेन तक बढ़ा सकता है, और मानव शरीर के भीतर बीईवी की विविधता में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है। यह बीईवी पृथक्करण और विश्लेषण तकनीकों के मानकीकरण में भी योगदान देता है।

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Protocol

दक्षिणी चिकित्सा विश्वविद्यालय के नानफांग अस्पताल की आचार समिति ने इस अध्ययन को मंजूरी दी, जो प्रतिभागियों की सूचित सहमति के साथ आयोजित किया गया था। यहां नियोजित सभी तरीकों ने अंतर्राष्ट्रीय मानव माइक्रोबायोम मानकों (IHMS: http://www.microbiome-standards.org/) द्वारा प्रस्तुत मानक संचालन दिशानिर्देशों का पालन किया। बाद की सभी तरल हैंडलिंग प्रक्रियाओं को जैव सुरक्षा कैबिनेट या अल्ट्रा-क्लीन बेंच के भीतर किया जाना अनिवार्य था।

1. फेकल नमूनों का संग्रह और एलिकोट

  1. एक मल पारखी, एक सीलबंद बैग और एक आइस्ड बॉक्स वितरित करें, और प्रतिभागियों को नमूनों की खरीद और संरक्षण के बारे में व्यापक निर्देश प्रदान करें।
  2. प्रत्येक प्रतिभागी प्रदान किए गए पारखी का उपयोग कर अपने fecal नमूना इकट्ठा करने के लिए निर्देश, और एक 24 घंटे खिड़की के भीतर 4 डिग्री सेल्सियस के एक तापमान पर प्रयोगशाला के लिए परिवहन करने के लिए.
  3. प्रयोगशाला में प्राप्त होने पर, पूर्व-वजन वाले 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में 3.5 ग्राम से कम मल को विभाज्य करने के लिए एक बाँझ चम्मच का उपयोग करें। बाद के पूर्व-उपचार प्रक्रियाओं के लिए ट्यूब पर फेकल नमूने के वजन को नोट करें।
    ठहराव बिंदु: यदि नमूनों का तत्काल प्रसंस्करण संभव नहीं है, तो उचित संकेतन के बाद -80 डिग्री सेल्सियस पर दीर्घकालिक भंडारण के लिए नमूना आवंटित करें।

2. मल नमूना तैयार करना

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के 500 एमएल ठंडा करें। दस 50 एमएल सेंट्रीफ्यूजेशन ट्यूबों में 50 एमएल सिरिंज का उपयोग करके 0.22 माइक्रोन पॉलीएथरसल्फोन (पीईएस) फिल्टर के माध्यम से प्री-चिल्ड पीबीएस को फ़िल्टर करें।
  2. बर्फ पर दो 50 एमएल ट्यूबों की स्थिति बनाएं, जिनमें से प्रत्येक में 3.5 ग्राम फेकल नमूने हों। प्रत्येक ट्यूब के लिए पीबीएस के 35 एमएल जोड़ें.
    नोट: मल विघटन के लिए पीबीएस की आवश्यक मात्रा की गणना करें, 10% (डब्ल्यू / वी) की अधिकतम नमूना एकाग्रता सुनिश्चित करना। यदि अतिरिक्त नमूनों को संसाधित करते हैं, तो आवश्यकतानुसार अधिक ट्यूबों को नियोजित करें।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए 300 आरपीएम पर नमूनों को हिलाएं, या उन्हें 8 घंटे के लिए कम से कम 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें जब तक कि मल पूरी तरह से स्पष्ट रूप से निलंबित न हो जाए।

3. विभेदक गति सेंट्रीफ्यूजेशन

  1. उच्च गति प्रशीतित अपकेंद्रित्र को 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें।
  2. 0.1 ग्राम के कुल वजन तक पहुंचने के लिए पीबीएस के साथ चरण 2.3 में तैयार नमूनों वाले दो ट्यूबों के वजन को समायोजित करें।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 3, 000 × ग्राम पर नमूने अपकेंद्रित्र.
  4. ध्यान से दो साफ 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूबों में सतह पर तैरनेवाला विंदुक, गोली के ऊपर लगभग 1 एमएल छोड़ने. इस प्रक्रिया के लिए एक डिस्पोजेबल प्लास्टिक पाश्चर विंदुक का प्रयोग करें.
  5. पीबीएस के साथ दो ट्यूबों के वजन को समायोजित करने के लिए ± 0.1 ग्राम के भीतर कुल वजन तक पहुंचने के लिए।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 12, 000 × ग्राम पर स्थानांतरित सतह पर तैरनेवाला अपकेंद्रित्र.
  7. एक 20 एमएल सिरिंज का उपयोग सतह पर तैरनेवाला महाप्राण, सिरिंज सुई को हटा दें, और 50 एमएल ट्यूबों में 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से इसे फिल्टर. इस बिंदु पर, सतह पर तैरनेवाला मात्रा लगभग 30 एमएल होना चाहिए.
    नोट: यदि 12,000 × जी सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद भी अशुद्धता की एक महत्वपूर्ण मात्रा दिखाई दे रही है, तो 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिन के लिए 12,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन चरण को दोहराना आवश्यक है। ऐसा करने में विफलता के परिणामस्वरूप निस्पंदन के दौरान छिद्र रुकावट के कारण बीईवी का महत्वपूर्ण नुकसान हो सकता है।

4. अल्ट्रा-हाई-स्पीड सेंट्रीफ्यूजेशन

  1. किसी भी अवशिष्ट संदूषण को खत्म करने के लिए रोटर और बाल्टी को 75% (v/v) अल्कोहल से पोंछकर साफ करें।
  2. ट्यूब धारक में एक 38.5 एमएल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब रखें।
    नोट: नमूना मात्रा के आधार पर उपयुक्त अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब का चयन करें। उत्पाद मैनुअल में बताए अनुसार केन्द्रापसारक ट्यूबों को स्टरलाइज़ करने के लिए पराबैंगनी विकिरण और अनुपयुक्त रासायनिक अभिकर्मकों से बचें।
  3. अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब में चरण 3.7 से फ़िल्टर्ड फेकल सुपरनेटेंट के लगभग 30 एमएल स्थानांतरित करें।
  4. पीबीएस के लगभग 8 एमएल के साथ अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब भरें, ट्यूब के उद्घाटन से 3 मिमी का अंतर छोड़ दें।
  5. दो अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को नमूनों के साथ अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन बाल्टी का विरोध करने में रखें, उदाहरण के लिए, बाल्टी 1 4 (1-4), 2-5, 3-6 से मेल खाती है।
  6. पीबीएस के साथ दो बाल्टी के वजन को समायोजित करने के लिए ± 0.005 ग्राम के भीतर कुल वजन प्राप्त करें।
  7. रोटर पर सभी बाल्टी स्थापित करें, भले ही ट्यूब लोड किए गए हों।
  8. वैक्यूम आरंभ करें और नमूनों को 160,000 × ग्राम पर 70 डिग्री सेल्सियस पर 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र करें।
  9. चैम्बर वैक्यूम को छोड़ दें, और एक बार रेडी को इंस्ट्रूमेंट के होम पेज पर प्रदर्शित होने के बाद दरवाजा खोलें।
  10. अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज से रोटर निकालें।
  11. रोटर से रैक के लिए बाल्टी ले जाएँ, और एक निपर का उपयोग कर ट्यूबों पुनः प्राप्त.
  12. सतह पर तैरनेवाला त्यागें, जिसमें तल पर भूरे रंग के छर्रों को दिखाई देगा।
  13. पूरी तरह से निलंबित होने तक 1 एमएल प्रीचिल्ड (4 डिग्री सेल्सियस) पीबीएस के साथ 1,000 माइक्रोन पिपेट का उपयोग करके बार-बार उन्हें ऊपर और नीचे पाइप करके छर्रों को फिर से निलंबित करें। पीबीएस के लगभग 37 एमएल के साथ ट्यूब भरें, उद्घाटन से 3 मिमी का अंतर छोड़ दें।
  14. ट्यूब की दीवारों से आंशिक रूप से संलग्न दूषित घटकों को हटाने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 70 मिनट के लिए 160,000 × ग्राम पर चरण 4.5-4.11 के बाद एक और अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन करें।
  15. सतह पर तैरनेवाला त्यागें, 5 मिनट के लिए दो ultracentrifuge ट्यूबों पलटना, और वाइपर के साथ भीतरी दीवार पर किसी भी शेष समाधान स्पष्ट.
    नोट: आंतरिक दीवार की सफाई अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब की दीवार का पालन करने वाले अवशिष्ट संदूषण से हस्तक्षेप को कम करती है। ऐसे वाइपर चुनें जो बीईवी विश्लेषण को प्रभावित नहीं करेंगे, विशेष रूप से कण आकार के संबंध में।
  16. प्रत्येक ट्यूब में छर्रों को 1,000 माइक्रोन पिपेट का उपयोग करके पूर्व-ठंडा (4 डिग्री सेल्सियस) पीबीएस के 1.2 एमएल के साथ ऊपर और नीचे पाइप करके फिर से निलंबित करें।
  17. पीबीएस/बीईवी समाधान के 1.2 एमएल को एक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब से एक साफ 1.5 एमएल माइक्रोट्यूब में स्थानांतरित करें।
    ठहराव बिंदु: एक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब से एकत्र किया गया पीबीएस/बीईवी समाधान चरण 6 पर आगे बढ़ सकता है। -80 डिग्री सेल्सियस पर अन्य ट्यूब से समाधान की दुकान.

5. घनत्व ढाल centrifugation के लिए समाधान की तैयारी

  1. 0.02 एम HEPES बफर की तैयारी
    1. 0.477 ग्राम HEPES पाउडर और 0.8 ग्राम NaCl को 90 एमएल ऑटोक्लेव्ड विआयनीकृत पानी के साथ मिलाएं।
    2. 1 एम सोडियम हाइड्रॉक्साइड (NaOH) जोड़कर पीएच को 7.2 तक समायोजित करें। विआयनीकृत पानी के साथ मात्रा को 100 एमएल तक लाएं और 0.22 माइक्रोन पीईएस झिल्ली के माध्यम से समाधान को फ़िल्टर करें।
      चेतावनी: सोडियम हाइड्रॉक्साइड एक मजबूत कास्टिक क्षार है। ऑपरेटरों को इसे धूआं अलमारी में सावधानी से संभालना और तैयार करना चाहिए।
  2. घनत्व ढाल बफर की तैयारी
    1. घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन (चरण 6) के लिए अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूबों की संख्या के आधार पर प्रत्येक घनत्व ढाल बफर की आवश्यक मात्रा की गणना करें (इस प्रोटोकॉल में, 60%, 50%, 40%, 20% और 10% ढाल समाधान के लिए वॉल्यूम क्रमशः 2.5 एमएल, 3 एमएल, 6 एमएल, 6 एमएल, और 6 एमएल) थे)।
    2. 50% (w/v) iodixanol वर्किंग सॉल्यूशन तैयार करने के लिए, 0.02 M HEPES बफर और 60% (w/v) iodixanol स्टॉक सॉल्यूशन को 1:5 (0.5 mL:2.5 mL) के वॉल्यूम अनुपात में मिलाएं।
      नोट: आयोडिक्सानोल स्टॉक समाधान को वापस लेने और हवा शुरू करने से बचने के लिए एक डिस्पोजेबल 20 एमएल सिरिंज का उपयोग करें।
    3. विभिन्न सांद्रता के साथ iodixanol बफ़र्स तैयार करने के लिए, तालिका 1 में दिखाए गए अनुपात के अनुसार 1,000 माइक्रोन पिपेट का उपयोग करके चरण 5.1 में प्राप्त HEPES बफर के साथ चरण 5.2.2 से 50% iodixanol काम करने वाले समाधान को मिलाएं।
      नोट: लाइट बंद करके अल्ट्रा-क्लीन बेंच पर चरण 5 करें। बैक्टीरिया के विकास को रोकने के लिए रेफ्रिजरेटर में 4 डिग्री सेल्सियस पर खोला iodixanol स्टॉक समाधान स्टोर करें। आयोडिक्सानॉल समाधान और HEPES बफर को प्रकाश से सुरक्षित रखें।

6. घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन सिस्टम की स्थापना

  1. टॉप-डाउन डीजीसी मोड
    1. पीबीएस के 3 एमएल के साथ चरण 4 से अलग पीबीएस / बीईवी समाधान के 500 माइक्रोन को मिलाएं। धीरे पीबीएस / बीईवी समाधान के 3.5 एमएल प्राप्त करने के लिए एक 1,000 माइक्रोन विंदुक का उपयोग कर समाधान मिश्रण.
    2. छेद के साथ फोम प्लेट पर एक 31 एमएल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब रखें और इसे "↓" के रूप में लेबल करें।
    3. लंबवत एक 1,000 माइक्रोन विंदुक का उपयोग ट्यूब के नीचे करने के लिए 50% iodixanol समाधान के 3 एमएल जोड़ें.
    4. ट्यूब को 70 डिग्री के कोण पर झुकाएं और ट्यूब के उद्घाटन के नीचे, फोम प्लेट के स्तर से थोड़ा ऊपर एक ट्यूब धारक या अन्य समर्थन रखें।
    5. 1,000 माइक्रोन पिपेट का उपयोग करके 50% आयोडिक्सानोल समाधान के शीर्ष पर 40% आयोडिक्सानोल समाधान के 3 एमएल जोड़ें।
    6. एक 1,000 माइक्रोन विंदुक का उपयोग कर 40% iodixanol समाधान के शीर्ष पर 20% iodixanol समाधान के 3 एमएल जोड़ें.
    7. 1,000 माइक्रोन पिपेट का उपयोग करके 20% आयोडिक्सानोल समाधान के शीर्ष पर 10% आयोडिक्सानोल समाधान के 3 एमएल जोड़ें।
    8. 1,000 माइक्रोन पिपेट का उपयोग करके 10% आयोडिक्सानोल समाधान के शीर्ष पर चरण 6.1.1 से पीबीएस/बीईवी समाधान के 3.5 एमएल जोड़ें।
    9. धीरे एक ईमानदार स्थिति में ट्यूबों लौटें।
      नोट: पाइपिंग के बाद, स्तरीकरण दिखाई देना चाहिए।
  2. बॉटम-अप डीजीसी मोड
    1. छेद के साथ फोम प्लेट पर एक 31 एमएल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब रखें और इसे "↑" के रूप में लेबल करें।
    2. लंबवत ट्यूब के नीचे करने के लिए 60% iodixanol शेयर समाधान के 2.5 एमएल जोड़ें. 50% iodixanol/BEV समाधान के 3 एमएल प्राप्त करने के लिए 1,000 माइक्रोन पिपेट का उपयोग करके चरण 4 से अलग पीबीएस / बीईवी समाधान के 500 माइक्रोन के साथ इसे धीरे से मिलाएं।
    3. ट्यूब को 70 डिग्री के कोण पर झुकाएं और ट्यूब के उद्घाटन के नीचे, फोम प्लेट के स्तर से थोड़ा ऊपर एक ट्यूब धारक या अन्य समर्थन रखें।
    4. 1,000 माइक्रोन पिपेट का उपयोग करके 50% आयोडिक्सानोल / बीईवी समाधान के शीर्ष पर 40% आयोडिक्सानोल समाधान के 3 एमएल जोड़ें।
    5. 1000 माइक्रोन पिपेट का उपयोग करके 40% आयोडिक्सानोल समाधान के शीर्ष पर 20% आयोडिक्सानोल समाधान के 3 एमएल जोड़ें।
    6. 1000 माइक्रोन पिपेट का उपयोग करके 20% आयोडिक्सानोल समाधान के शीर्ष पर 10% आयोडिक्सानोल समाधान के 3 एमएल जोड़ें।
    7. 1,000 माइक्रोन पिपेट का उपयोग करके 10% आयोडिक्सानोल समाधान के शीर्ष पर पीबीएस के 3.5 एमएल जोड़ें।
    8. धीरे एक ईमानदार स्थिति में ट्यूबों लौटें।
    9. इस बिंदु पर, चरण 4.17 में प्राप्त निलंबन का 200 माइक्रोन बना रहा, जिसे बाद में "यूसी" नामक समूह के रूप में विश्लेषण किया जा सकता है।
      नोट: चरण 6 में समाधान स्थानांतरित करते समय, हमेशा ट्यूब की धुरी के लंबवत अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब दीवार के खिलाफ पिपेट टिप रखें।

7. घनत्व ढाल centrifugation और अंश संग्रह

  1. पीबीएस के साथ दो ट्यूबों के वजन को समायोजित करने के लिए ± 0.005 ग्राम के भीतर कुल वजन प्राप्त करें।
  2. चरण 4.5 के अनुसार बाल्टी में ट्यूबों रखें और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर 7 घंटे के लिए 160,000 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र के अधीन करें।
  3. निम्नलिखित क्रम में साइड की दीवार के खिलाफ ऊपर से नीचे तक एक पिपेटर (1000 माइक्रोन) का उपयोग करके अंशों को इकट्ठा करें: 3 एमएल, 2 एमएल, 1 एमएल, 1 एमएल, 1 एमएल, 1 एमएल, 1 एमएल, 1.5 एमएल, और 3 एमएल 38.5 एमएल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब में।
    नोट: तरल सतह के समान स्तर पर दृष्टि की रेखा बनाए रखें।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 70 मिनट के लिए 160,000 × ग्राम पर चरण 4 के अनुसार चरण 7.3 में प्राप्त प्रत्येक अंश के लिए अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन का संचालन करें।
  5. सतह पर तैरनेवाला निकालें और 5 मिनट के लिए ultracentrifuge ट्यूबों पलटना.
  6. 200 माइक्रोन पिपेट का उपयोग करके प्री-चिल्ड (4 डिग्री सेल्सियस) पीबीएस के 200 माइक्रोन में छर्रों को फिर से निलंबित करें।
  7. पीबीएस / बीईवी समाधान को एक साफ 1.5 एमएल माइक्रोट्यूब में स्थानांतरित करें।
  8. F1 से F10 तक के अंशों को लेबल करें और चरण 8 के आधार पर उनका विश्लेषण करें।
    ठहराव बिंदु: यदि चरण 7.8 में प्राप्त नमूनों को तुरंत संसाधित नहीं किया जा सकता है, तो उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

8. एकत्रित अंशों का लक्षण वर्णन और मात्रात्मक विश्लेषण

  1. उनके संबंधित घनत्व की गणना करने के लिए एक रिक्त नियंत्रण के साथ एक माइक्रोप्लेट डिटेक्टर का उपयोग करके प्रत्येक अंश के अवशोषण मूल्यों (ओडी 340 एनएम) का निर्धारण करें।
    नोट: रिक्त नियंत्रण स्थापित करने के लिए पीबीएस के साथ पीबीएस / बीईवी समाधान (चरण 6.1.1 और चरण 6.2.2) बदलें।
    1. 1.0058 ग्राम/एमएल, 1.058 ग्राम/एमएल, 1.0708 ग्राम/एमएल, और 1.111 ग्राम/एमएल, क्रमशः घनत्व के अनुरूप 50% स्टॉक समाधान (चरण 5.2.2) के आधार पर 0.02 एम एचईपीईएस द्वारा पतला 100 माइक्रोन प्रत्येक 0%, 5%, 10%, 10708 ग्राम/एमएल, और 1.111 ग्राम/एमएल तैयार करें।
    2. रिक्त नियंत्रण (चरण 7.3 में तैयार) से प्रत्येक अंश के 50 माइक्रोन और प्रत्येक मानक समाधान (चरण 8.1.1 में तैयार) के 50 माइक्रोन को 96-अच्छी प्लेट के कुओं की नकल करने के लिए जोड़ें।
    3. तरंग दैर्ध्य को 340 एनएम पर सेट करें, समापन बिंदु ऑप्टिकल घनत्व को मापें, और प्रत्येक अंश के घनत्व की गणना करें।
    4. F4-F9 को उनके घनत्व के आधार पर BEV अंशों की सीमा के रूप में पहचानें।
  2. बिसिनकोनिनिक एसिड परख (बीसीए) का उपयोग करके बीईवी अंशों की प्रोटीन एकाग्रता निर्धारित करें।
    1. 0.5 μg/μL मानक प्रोटीन समाधान तैयार करने के लिए निर्माता द्वारा प्रदान किए गए पीबीएस में पदार्थ को दस गुना पतला करें।
    2. अभिकर्मक निर्देशों के अनुसार अलग-अलग मात्रा के साथ मानक प्रोटीन समाधान (चरण 8.2.1 में तैयार) जोड़ें, और पीबीएस के साथ 96-अच्छी प्लेट के प्रत्येक कुएं को 20 माइक्रोन की कुल मात्रा में पूरक करें।
    3. चरण 7.8 में तैयार नमूनों के 20 माइक्रोन जोड़ें और प्रत्येक कुएं में चरण 6.2.9 में परिभाषित यूसी के बाद छोड़े गए नमूने।
    4. 50: 1 के अनुपात में अभिकर्मकों ए और बी मिलाएं, और प्रत्येक अच्छी तरह से 200 माइक्रोन स्थानांतरित करें।
    5. 30 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में थाली सेते हैं.
    6. माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके अवशोषण मूल्य को मापें, प्रोटीन एकाग्रता (μg/μL) की गणना करें, और मानक वक्र (x: ऑप्टिकल घनत्व; y: प्रोटीन एकाग्रता) के आधार पर नमूनों की प्रोटीन सामग्री (μg) निर्धारित करें।
  3. बीईवी की उपस्थिति को सत्यापित करने के लिए ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) का उपयोग करके चरण 8.1.4 में परिभाषित बीईवी अंशों की विशेषता बताएं। नीचे दी गई सभी प्रक्रियाओं को बर्फ पर किया जाना चाहिए।
    1. चरण 7.8 से प्रत्येक पृथक F4-F9 अंश के 10 माइक्रोन लागू करें और चरण 6.2.9 में परिभाषित यूसी के बाद छोड़े गए नमूने 20 मिनट के लिए फॉर्मवार/कार्बन समर्थित कॉपर ग्रिड पर लागू करें, और फिल्टर पेपर के साथ धब्बा।
    2. पीबीएस के 100 माइक्रोन के साथ नमूनों को 1 मिनट प्रत्येक के लिए तीन बार कुल्ला, और फिल्टर पेपर के साथ धब्बा।
    3. 5 मिन के लिए 1% (w/v) ग्लूटार्डाल्डिहाइड के 100 माइक्रोन के साथ नमूने ठीक करें और फिल्टर पेपर के साथ ब्लॉट करें।
    4. पीबीएस के 100 माइक्रोन के साथ ग्रिड को 2 मिनट प्रत्येक के लिए दस बार धोएं, और फिल्टर पेपर के साथ धब्बा।
    5. 10 मिनट के लिए 1.5% (डब्ल्यू / वी) यूरेनिल एसीटेट के 50 माइक्रोन के साथ ग्रिड को दागें, और फिल्टर पेपर के साथ धब्बा।
      चेतावनी: यूरेनिल एसीटेट रेडियोधर्मी और बेहद जहरीला होता है जब त्वचा के संपर्क में या साँस ली जाती है। एक धूआं अलमारी में यूरेनिल एसीटेट के साथ समाधान संभालें और उचित सुरक्षा उपायों का पालन करें।
    6. 5 मिनट के लिए एक 1% (डब्ल्यू / वी) मिथाइलसेलुलोज ड्रॉप पर ग्रिड को स्थानांतरित करें और फिल्टर पेपर के साथ धब्बा करें।
    7. अवलोकन तक हवा में सुखाए गए ग्रिड को अंधेरे, धूल रहित वातावरण में स्टोर करें।
    8. छवियों को कैप्चर करें और टीईएम का उपयोग करके उनका विश्लेषण करें।
  4. कणों की संख्या की गणना करने के लिए नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण (एनटीए) का उपयोग करके चरण 8.1.4 में परिभाषित बीईवी अंशों की विशेषता बताएं।
    1. 110 एनएम पॉलीस्टाइनिन कणों का उपयोग करके सिस्टम को कैलिब्रेट करें।
    2. पीबीएस का उपयोग कर नमूना पूल धो लें.
    3. चरण 7.8 में प्राप्त विभिन्न अंशों से नमूनों को पतला करें और चरण 6.2.9 में परिभाषित यूसी के बाद छोड़े गए नमूनों को 105-10 9 कणों/एमएल की सीमा में एकाग्रता के लिए, 107 कणों/एमएल की अनुकूलित एकाग्रता के साथ।
    4. तीन प्रतिकृति के साथ 11 पदों पर रिकॉर्ड और विश्लेषण करें, तापमान को 23-30 डिग्री सेल्सियस के आसपास बनाए रखें।
  5. coomassie शानदार नीले धुंधला (CBBS) और पश्चिमी सोख्ता (WB) द्वारा नमूनों की प्रोटीन सामग्री का विश्लेषण.
    1. चरण 7.8 में प्राप्त विभिन्न अंशों से बीईवी नमूनों को पतला करें और पीबीएस और 5 × लोडिंग बफर का उपयोग करके चरण 6.2.9 में परिभाषित यूसी के बाद छोड़े गए नमूनों को 0.5 या 1 माइक्रोग्राम / μL की अंतिम एकाग्रता के लिए, यदि मात्रा की आवश्यकता है, तो चरण 8.5.2 में प्रत्येक कुएं के 20 माइक्रोन (10 माइक्रोन या 20 माइक्रोग्राम) का पर्याप्त नमूना लोडिंग सुनिश्चित करना। 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर नमूने उबालें।
    2. वैद्युतकणसंचलन टैंक में पूर्वनिर्मित पॉलीक्रिलामाइड जेल को इकट्ठा करें, और नमूनों को कुओं में स्थानांतरित करें।
    3. निम्नलिखित मापदंडों के साथ ऊर्ध्वाधर वैद्युतकणसंचलन का संचालन करें: 50 मिनट के लिए 160 वी।
    4. 1 घंटे के लिए Coomassie शानदार नीले समाधान में जेल दाग, नीले रंग की पृष्ठभूमि हल्का होने तक विआयनीकृत पानी में कुल्ला, और एक कैमरे के साथ छवियों पर कब्जा.
    5. निम्नलिखित मापदंडों के साथ अन्य जैल के लिए प्रोटीन सोख्ता प्रक्रियाओं प्रदर्शन: 20 मिनट के लिए 400 एमए.
    6. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 5% (w/v) BSA समाधान के साथ सोख्ता झिल्ली ब्लॉक.
    7. टीबीएसटी बफर में झिल्ली को 5 मिनट प्रत्येक के लिए तीन बार धोएं।
    8. प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ झिल्ली को इनक्यूबेट करें (बीईवी मार्कर: एलपीएस, ओएमपीए, एलटीए; ईईवी मार्कर: सीडी 63, सीडी 9, टीएसजी -101, सिंटेनिन, इंटीग्रिन β1; अन्य संदूषण मार्कर: फ्लैगेलिन, कैलनेक्सिन) 4 डिग्री सेल्सियस पर 8-12 घंटे के लिए।
    9. टीबीएसटी बफर में झिल्ली को 10 मिनट प्रत्येक के लिए तीन बार धोएं।
    10. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ झिल्ली सेते हैं.
    11. चरण 8.5.9 करें।
    12. एक chemiluminescence तंत्र का उपयोग सोख्ता विकसित करना.
    13. पीबीएस/बीईवी समाधान (चरण 6.1.1 और चरण 6.2.2) को सकारात्मक नियंत्रण स्थापित करने के लिए एस्चेरिचिया कोलाई से बीईवी के साथ बदलें (कच्चे ई कोलाई-बीईवी को अलग करने की प्रक्रिया के लिए सामग्री की तालिका देखें), और बीईवी को चिह्नित करने के लिए उपरोक्त सभी प्रयोगों का संचालन करें।
      ठहराव बिंदु: फेकल बीईवी के लिए ऊपर वर्णित लक्षण वर्णन के परिणामों के आधार पर बीईवी-समृद्ध अंशों के वितरण के रूप में एफ 6-एफ 8 निर्धारित करें, और बाद के विश्लेषण के लिए इस संकुचित सीमा का उपयोग करें।
  6. दो डीजीसी मोड की दक्षता का आकलन करने के लिए कणों और प्रोटीन के संदर्भ में वसूली दर की गणना करें। नीचे दिए गए परिणाम प्रतिशत के रूप में प्रस्तुत किए गए हैं।
    1. टॉप-डाउन मोड में कणों की पुनर्प्राप्ति दर की गणना करें: चरण 6.2.9 में परिभाषित UC के बाद F6-F8/कणों में कुल कण।
    2. बॉटम-अप मोड में कणों की पुनर्प्राप्ति दरों की गणना करें: चरण 6.2.9 में परिभाषित UC के बाद F6-F8/कणों में कुल कण।
    3. टॉप-डाउन मोड में प्रोटीन की वसूली दर की गणना करें: चरण 6.2.9 (μg) में परिभाषित UC के बाद F6-F8 (μg)/प्रोटीन सामग्री में कुल प्रोटीन सामग्री।
    4. बॉटम-अप मोड में प्रोटीन की रिकवरी दरों की गणना करें: चरण 6.2.9 (μg) में परिभाषित UC के बाद F6-F8 (μg)/प्रोटीन सामग्री में कुल प्रोटीन सामग्री।
  7. यूसी और दो डीजीसी मोड के पारंपरिक रूप से परिभाषित शुद्धता का आकलन करने के लिए कण / प्रोटीन अनुपात की गणना करें, और नीचे दिए गए परिणाम सभी प्रतिशत के रूप में प्रस्तुत किए गए थे।
    1. चरण 6.2.9 में परिभाषित यूसी के बाद कण/प्रोटीन अनुपात: यूसी (μg) के बाद यूसी /
    2. टॉप-डाउन मोड में कण/प्रोटीन अनुपात: F6-F8 में कुल कण/F6-F8 (μg) में प्रोटीन सामग्री।
    3. बॉटम-अप मोड में कण/प्रोटीन अनुपात: F6-F8 में कुल कण/F6-F8 (μg) में प्रोटीन सामग्री।
  8. फेकल बीईवी शुद्धि और भविष्य के विश्लेषण के लिए सबसे उपयुक्त सेंट्रीफ्यूजेशन मोड (प्रोटोकॉल में टॉप-डाउन मोड का चयन किया गया था) का चयन करें।

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Representative Results

बीईवी-समृद्ध अंशों के वितरण का निर्धारण करें
बैक्टीरियल बाह्य पुटिकाओं (बीईवी) -समृद्ध अंशों के वितरण को निर्धारित करने के लिए, ओडी 340 एनएम पर अवशोषण मूल्यों को मापने के लिए एक रिक्त नियंत्रण स्थापित किया गया था, और प्रत्येक अंश के घनत्व की गणना माप और आयोडिक्सानोल दिशानिर्देशों (चरण 8.1) के आधार पर की गई थी। तालिका 2 घनत्व के परिणाम प्रस्तुत करता है, यह दर्शाता है कि एफ 4 से एफ 9 के अंश आमतौर पर बाह्य पुटिकाओं से जुड़े सीमा के भीतर घनत्व प्रदर्शित करते हैं। इस खोज ने सुझाव दिया कि अधिकांश बीईवी को इन अंशों में अलग कर दिया गया था, जिससे एफ 4-एफ 9 की परिभाषा बीईवी के लिए किसी न किसी सीमा के रूप में हुई। ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) को फेकल बीईवी की रूपात्मक विशेषताओं को चिह्नित करने के लिए नियोजित किया गया था जैसा कि अंश एफ 4-एफ 9 में चित्र 1 में दिखाया गया है। टीईएम छवियों (चित्रा 2) ने शास्त्रीय कप के आकार की संरचनाओं की उपस्थिति का खुलासा किया, जो बीईवी की विशेषता हैं। नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण (एनटीए) और बाइसिनकोनिनिक एसिड परख (बीसीए) क्रमशः कण संख्या और प्रोटीन एकाग्रता निर्धारित करने के लिए आयोजित किए गए थे, जिससे वसूली दर और शुद्धता के आगे मूल्यांकन की अनुमति मिलती है। चित्रा 3 प्रत्येक अंश के लिए प्रोटीन और कण सांद्रता प्रदर्शित करता है, यह दर्शाता है कि एफ 6 और एफ 7 ने उच्चतम सांद्रता का प्रदर्शन किया, इसके बाद एफ 5 और एफ 8। इसके बाद, कूमासी ब्रिलियंट ब्लू स्टेनिंग (सीबीबीएस) और वेस्टर्न ब्लॉटिंग (डब्ल्यूबी) को समग्र प्रोटीन विश्लेषण प्रदान करने के लिए प्रदर्शन किया गया। सीबीबीएस के परिणाम प्रोटीन एकाग्रता निष्कर्षों के अनुरूप थे, एफ 6 और एफ 7 सबसे तीव्र बैंड (चित्रा 4) प्रदर्शित करते थे। बीईवी के वितरण की पुष्टि करने के लिए, एस्चेरिचिया कोलाई से प्राप्त बाह्य पुटिकाओं को एक सकारात्मक नियंत्रण (चरण 8.5.13 में परिभाषित) के रूप में नियोजित किया गया था। अलगाव और शुद्धिकरण प्रक्रियाओं ने सामग्री की तालिका और उपरोक्त प्रोटोकॉल अनुभागों (चरण 3, 4) में वर्णित चरणों का पालन किया। डब्ल्यूबी विश्लेषण ने बाहरी झिल्ली प्रोटीन ए (ओएमपीए) की उपस्थिति की पुष्टि की, जो बैक्टीरिया की बाहरी झिल्ली का एक प्रमुख घटक और बीईवी के लिए एक विशिष्ट मार्कर है, जो एफ 6-एफ 8 अंशों में है। इन परिणामों के आधार पर, अंश F6-F8 बाद के प्रयोगों और विश्लेषण के लिए उपयुक्त BEV समृद्ध अंशों के रूप में परिभाषित किया गया.

हस्तक्षेप घटकों की प्रस्तुति की सीमा का सत्यापन
यूकेरियोटिक बाह्य पुटिकाओं (ईईवी), जिनके पास बीईवी के समान आकार और घनत्व होता है, को बीईवी के विश्लेषण में एक प्रमुख हस्तक्षेप के रूप में पहचाना गया था। इसे संबोधित करने के लिए, तीन ईईवी प्रोटीन को टॉप-डाउन और बॉटम-अप दोनों मोड से 5-8 अंशों में जांच की गई थी, जिसमें 7 घंटे और 15 घंटे के सेंट्रीफ्यूजेशन समय थे। सीडी 63, एक ईईवी से जुड़े ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन, मुख्य रूप से एफ 5 में पाया गया था, जबकि बीईवी मार्कर एलपीएस को 6-7 अंशों में समृद्ध किया गया था। यह पैटर्न दोनों मोड में देखा गया था, हालांकि बॉटम-अप मोड ने F7 में CD63-EEVs की मामूली बैंडिंग का प्रदर्शन किया। हालांकि, अन्य ईईवी मार्कर, सीडी 9 और टीएसजी -101, मोड या सेंट्रीफ्यूजेशन समय की परवाह किए बिना इन अंशों में दृश्य संकेत नहीं दिखाते थे। एक स्वतंत्र प्रयोगात्मक उपक्रम में, सिंटेनिन और इंटीग्रिन β1 को लक्षित करने वाले एंटीबॉडी को 5-8 अंशों में ईईवी में निहित अलग-अलग प्रोटीन मार्करों के संवर्धन का पता लगाने के लिए नियोजित किया गया था। F5 के भीतर Syntenin को प्रमुखता से पाया गया था, विशेष रूप से टॉप-डाउन दृष्टिकोण के दायरे में, जबकि Integrin β1 की उपस्थिति F6 (चित्र 5) के भीतर देखी गई थी। आगे हस्तक्षेप कणों की उपस्थिति का आकलन करने के लिए, दिल लेबल कम घनत्व लिपोप्रोटीन (दिल-एलडीएल) घनत्व ढाल प्रणाली में पेश किया गया था, और प्रतिदीप्ति तीव्रता सभी अंशों में मापा गया था. टॉप-डाउन मोड में, 1-4 अंशों ने अपेक्षाकृत उच्च प्रतिदीप्ति मूल्यों का प्रदर्शन किया, जबकि बॉटम-अप मोड में, यह F1-F6 था जो उच्च तीव्रता (चित्रा 6) प्रदर्शित करता था।

एकाग्रता, कण आकार और बीईवी के मार्करों से दो डीजीसी मोड की वसूली दर और शुद्धता का आकलन करें
एफ 6-एफ 8 अंशों को बीईवी-समृद्ध अंशों के रूप में पहचानने के बाद, दो घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन (डीजीसी) मोड की वसूली दर और शुद्धता का मूल्यांकन किया गया था। अकेले टॉप-डाउन मोड, बॉटम-अप मोड और अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन (यूसी) से प्राप्त बीईवी-समृद्ध अंशों के कण आकार की तुलना की गई थी। दोनों सेंट्रीफ्यूजेशन मोड में मनाया कण आकार 90 से 300 एनएम तक था, जो बीईवी(चित्रा 7)के परिभाषित व्यास के साथ संरेखित था। इसके बाद, दो मोड के कण और प्रोटीन वसूली दर की गणना डीजीसी(तालिका 3 और चित्रा 8)से पहले और बाद में कण और प्रोटीन सांद्रता के आधार पर की गई थी। विशेष रूप से, बॉटम-अप मोड ने अन्य मोड की तुलना में उच्च वसूली दर का प्रदर्शन किया। एक अलग प्रयोगात्मक समूह में, दो मोड में प्रोटीन वसूली 7 घंटे और 15 घंटे के विभिन्न centrifugation समय पर मूल्यांकन किया गया था. महत्वपूर्ण बात यह है कि दो सेंट्रीफ्यूजेशन समय के बीच डीजीसी के बाद एफ 6-एफ 8 अंशों के भीतर प्रोटीन सामग्री में कोई सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर नहीं था, भले ही इस्तेमाल किए गए ढाल मोड (चित्रा 9) की परवाह किए बिना। कण/प्रोटीन अनुपात की गणना दो मोड में शुद्धता का एक मोटा मूल्यांकन प्रदान करने के लिए की गई थी। डेटा ने मोड के बीच शुद्धता में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाया। इसके अतिरिक्त, कूमासी ब्रिलियंट ब्लू स्टेनिंग (सीबीबीएस) और वेस्टर्न ब्लॉटिंग (डब्ल्यूबी) को शुद्धता की तुलना करने के लिए किया गया था, जिसमें तीन बीईवी मार्कर (एलपीएस, ओएमपीए और एलटीए), एक ईईवी मार्कर (सीडी 63), और दो दूषित मार्कर (कैलनेक्सिन, फ्लैगेलिन) पर ध्यान केंद्रित किया गया था। परिणामों ने डीजीसी के बाद हस्तक्षेप करने वाले पदार्थों की आंशिक कमी का प्रदर्शन किया, एलपीएस और ओएमपीए अकेले यूसी (चित्रा 10) की तुलना में दोनों डीजीसी मोड में अधिक प्रमुख उपस्थिति दिखा रहे हैं।

Figure 1
चित्रा 1: बीईवी अलगाव और शुद्धिकरण का योजनाबद्ध कार्यप्रवाह। संक्षिप्ताक्षर: बीईवी = बैक्टीरियल बाह्य पुटिकाएं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: बीईवी अंशों की प्रतिनिधि टीईएम छवियां। (ए) यूसी के बाद अलग किए गए बीईवी की टीईएम छवियां। (बी) टॉप-डाउन मोड का उपयोग करके डीजीसी के बाद अलग बीईवी की टीईएम छवियां। (सी) बॉटम-अप मोड का उपयोग करके डीजीसी के बाद अलग किए गए बीईवी की टीईएम छवियां। सभी छवियों 200 एनएम के एक सुसंगत पैमाने पर प्रस्तुत किए गए थे. संक्षिप्ताक्षर: TEM = ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप; बीईवी = बैक्टीरियल बाह्य पुटिकाएं; यूसी = अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन; DGC = घनत्व ढाल केन्द्रिफ्तरीकरण। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: टॉप-डाउन और बॉटम-अप डीजीसी मोड के बाद बीईवी अंशों की प्रोटीन और कण एकाग्रता। बीईवी अंशों की प्रोटीन एकाग्रता बीसीए का उपयोग करके निर्धारित की गई थी और इसे ग्रे बार द्वारा दर्शाया गया है। कण एकाग्रता को एनटीए का उपयोग करके मापा गया था और इसे नीली पट्टियों द्वारा दर्शाया गया है। संक्षिप्ताक्षर: बीईवी = बैक्टीरियल बाह्य पुटिका; DGC = घनत्व ढाल केन्द्रापसारीकरण; बीसीए = बिसिनकोनिनिक एसिड परख; NTA = नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: बीईवी-समृद्ध अंशों का निर्धारण। (ए) सीबीएस को टॉप-डाउन और बॉटम-अप दोनों मोड में फेकल बीईवी के साथ समृद्ध अंशों को निर्धारित करने के लिए किया गया था। (बी) एस्चेरिचिया कोलाई से प्राप्त ईवीएस को बीईवी की उपस्थिति और वितरण की पुष्टि करने के लिए डब्ल्यूबी में सकारात्मक नियंत्रण के रूप में अलग, शुद्ध और उपयोग किया गया था। ओएमपीए: बाहरी झिल्ली प्रोटीन ए, एक बीईवी मार्कर। संक्षिप्ताक्षर: बीईवी = बैक्टीरियल बाह्य पुटिका; CBBS = coomassie शानदार नीला धुंधला; ईवीएस = बाह्य पुटिकाएं; WB = वेस्टर्न ब्लोटिंग। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: ईईवी वितरण की पुष्टि। विभिन्न घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन अवधि, 7 एच (ए) और 15 एच (बी) के साथ टॉप-डाउन और बॉटम-अप डीजीसी मोड से प्राप्त अंशों का पश्चिमी धब्बा विश्लेषण। 7-एच सेंट्रीफ्यूजेशन अवधि के परिणामस्वरूप एफ 5 से एफ 8 पर ध्यान केंद्रित करने वाला एक स्वतंत्र परीक्षण निष्पादित किया गया था, जैसा कि (सी) और (डी) में दिखाया गया है। चयनित मार्करों में बीईवी (एलपीएस) और ईईवी (सीडी 63, सीडी 9, टीएसजी -101, सिंटेनिन, इंटीग्रिन β1) से जुड़े लोग शामिल थे। संक्षिप्ताक्षर: DGC = घनत्व ढाल centrifugation; BEV = बैक्टीरियल बाह्य पुटिका; ईईवी = यूकेरियोटिक बाह्य पुटिका। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन का वितरण। दिल-लेबल वाले कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन (दिल-एलडीएल), जिसे संदूषण मार्कर माना जाता है, को टॉप-डाउन और बॉटम-अप दोनों मोड में ढाल प्रणाली में 10 माइक्रोग्राम की एकाग्रता में जोड़ा गया था। दिल-एलडीएल ने एक डिटेक्शन मॉडल स्थापित करने के लिए पीबीएस / बीईवी समाधान (चरण 6.1.1 और चरण 6.2.2) को बदल दिया। प्रत्येक अंश की प्रतिदीप्ति तीव्रता 549/565 एनएम की उत्तेजना / उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के साथ एक माइक्रोप्लेट डिटेक्टर का उपयोग करके मापा गया था। संक्षिप्त: बीईवी = बैक्टीरियल बाह्य पुटिका। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: बीईवी-समृद्ध अंशों के कण आकार। (ए) यूसी के बाद प्राप्त कच्चे बीईवी के कण आकार का वितरण। (बी) टॉप-डाउन घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन (डीजीसी) मोड का उपयोग करके प्राप्त बीईवी-समृद्ध अंशों (एफ 6-एफ 8) का कण आकार वितरण। (सी) बीईवी-समृद्ध अंशों (एफ 6-एफ 8) का कण आकार वितरण बॉटम-अप डीजीसी मोड का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। एनटीए कणों के आयामों को निर्धारित करने के लिए किया गया था। पैनलों (एसी) के लिए नियोजित कमजोर पड़ने वाले कारक 10,000, 2,000 और 5,000 थे, तदनुसार, आगामी परिणामों को कैलिब्रेट किया गया था। संक्षिप्ताक्षर: बीईवी = बैक्टीरियल बाह्य पुटिका; यूसी = अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन; DGC = घनत्व ढाल केन्द्रापसारीकरण; NTA = नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्रा 8: टॉप-डाउन और बॉटम-अप डीजीसी मोड की प्रोटीन और कण वसूली दर। (ए) डीजीसी (यूसी) के बाद और पहले प्रोटीन एकाग्रता के अनुपात के रूप में गणना की गई दो मोड की प्रोटीन रिकवरी दर। (बी) दो मोड के कण वसूली दरों की गणना डीजीसी (यूसी) के बाद और पहले कण एकाग्रता के अनुपात से की जाती है। (सी) यूसी, टॉप-डाउन और बॉटम-अप मोड के कण/प्रोटीन अनुपात। ±सांख्यिकीय विश्लेषण पैनल ए और बी के लिए दो-पूंछ, अयुग्मित टी-टेस्ट, और पैनल सी के लिए टुकी पोस्ट हॉक टेस्ट के साथ विचरण (एनोवा) के एक-तरफ़ा विश्लेषण का उपयोग करके किया गया था। कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया। संक्षिप्ताक्षर: DGC = घनत्व ढाल centrifugation; UC = अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 9
चित्रा 9: विभिन्न घनत्व से जुड़े अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन समय का उपयोग करके टॉप-डाउन और बॉटम-अप डीजीसी मोड के आधार पर प्रोटीन रिकवरी की तुलना। 7 घंटे और 15 घंटे के लिए ढाल ultracentrifugation से प्राप्त अंश F6-F8 में प्रोटीन वसूली दर दोनों ऊपर से नीचे और नीचे ऊपर मोड का उपयोग कर स्वतंत्र प्रयोगों में मूल्यांकन किया गया. डेटा को माध्य ± SEM के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। फिशर के कम से कम महत्वपूर्ण अंतर परीक्षण के साथ विचरण (एनोवा) के दो-तरफ़ा विश्लेषण का उपयोग करके सांख्यिकीय विश्लेषण किया गया था। कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया। संक्षिप्ताक्षर: DGC = घनत्व ढाल centrifugation। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 10
चित्रा 10: टॉप-डाउन और बॉटम-अप डीजीसी मोड की शुद्धता का मूल्यांकन। (ए) सीबीबीएस यूसी, टॉप-डाउन और बॉटम-अप मोड के प्रोटीन वितरण की तुलना करने के लिए आयोजित किया गया था। (B) WB UC, टॉप-डाउन और बॉटम-अप मोड की शुद्धता का आकलन करने के लिए आयोजित किया गया था। Calnexin: एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम-जुड़े प्रोटीन मार्कर; फ्लैगेलिन, बैक्टीरिया से प्रोटीन मार्कर को दूषित करता है। सीडी 63: यूकेरियोटिक बाह्य पुटिकाओं के लिए ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन मार्कर; एलटीए: ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया से बीईवी मार्कर; एलपीएस, ओएमपीए: ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया से बीईवी मार्कर। संक्षिप्ताक्षर: DGC = घनत्व ढाल centrifugation; यूसी = अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन; CBBS = Coomassie ब्रिलियंट ब्लू धुंधला; WB = वेस्टर्न ब्लोटिंग। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Iodixanol समाधान एकाग्रता (%) 0.02 एम HEPES बफर 50% Iodixanol काम कर रहे समाधान
40 1 4
20 3 2
10 4 1

तालिका 1: आयोडिक्सानॉल घनत्व ढाल बफ़र्स तैयार करने के लिए अनुपात। तालिका ने 0.02 एम HEPES बफर और 50% iodixanol काम करने वाले समाधान का अनुपात प्रदान किया ताकि iodixanol समाधान की एक निश्चित एकाग्रता प्राप्त की जा सके।

एफ1 एफ 2 एफ3 एफ4 एफ5 एफ6 एफ7 एफ8 एफ9 एफ10
घनत्व (जी / एमएल) 1.023 1.038 1.049 1.062 1.074 1.098 1.144 1.185 1.239 1.293

तालिका 2: आयोडिक्सानोल-आधारित घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन सिस्टम का घनत्व। तालिका ने एक आयोडिक्सानोल-आधारित घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन प्रणाली में प्रत्येक अंश के घनत्व को दिखाया। रिक्त नियंत्रण: पीबीएस-आधारित ढाल प्रणाली।

टॉप-डाउन मोड बॉटम-अप मोड
कण वसूली दर (%) 24.08 35.69
प्रोटीन रिकवरी दर (%) 24.5 32.45

तालिका 3: दो मोड के कण और प्रोटीन वसूली दर। तालिका ऊपर से नीचे और नीचे ऊपर मोड (चित्रा 8) के कण और प्रोटीन वसूली दर से पता चला.

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Discussion

बैक्टीरियल बाह्य पुटिकाओं (बीईवी) लिपिड-बाइलेयर नैनोकणों को बैक्टीरिया द्वारा स्रावित किया जाता है, प्रोटीन, लिपिड, न्यूक्लिक एसिड और अन्य बायोएक्टिव अणुओं का खजाना ले जाता है, जो बैक्टीरिया20 के कार्यात्मक प्रभावों की मध्यस्थता में योगदान देता है। आंत से प्राप्त बीईवी को सूजन आंत्र रोग, क्रोहन रोग और कोलोरेक्टल कैंसर जैसी बीमारियों के विकास में शामिल होने के लिए सत्यापित किया गया है, और सामान्य चयापचय को भी प्रभावित करते हैं और बिगड़ा हुआ संज्ञानात्मक कार्य 4,16,17,20,21,22,23,24,25,26 में मध्यस्थता करते हैं. वर्तमान में, मानव नमूनों-मल से आंत बैक्टीरिया की उत्पत्ति के बीईवी पर पूर्ण और उद्देश्यपूर्ण जैविक जानकारी प्राप्त करना अभी भी कारकों की एक श्रृंखला से विवश है, जिनमें से पहला और सबसे महत्वपूर्ण मुद्दा यह है कि जटिल मेजबान वातावरण से बीईवी को कैसे अलग किया जाए।

बीईवी को अलग करने के मुख्य तरीके, जैसे अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन (यूसी), घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन (डीजीसी), और आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एसईसी)13,14,15,16,17, दोनों के पास ऊपर और नीचे दोनों हैं। कुछ हस्तक्षेप करने वाले पदार्थों को हटाने में कठिनाई और लगातार संचालन प्रक्रियाओं की कमी, बीईवी के अधिक यथार्थवादी और व्यापक विश्लेषण को गंभीरता से प्रभावित करना, अलगाव की प्रक्रिया के लिए चुनौतियां बनी हुई हैं। हस्तक्षेप के अवांछनीय प्रभावों को कम करने के लिए, कई अध्ययनों 15,27,28 ने बीईवी के पृथक्करण को प्राप्त करने के लिए उपरोक्त दो या अधिक तरीकों को जोड़ा है, विशेष रूप से शरीर के तरल पदार्थ से, लेकिन जटिल प्रक्रियाएं परिणामों की स्थिरता को प्रभावित करती हैं। बीईवी के लिए, अन्य दूषित पदार्थों (जैसे, प्रोटीन समुच्चय, लिपिड घटक, यूकेरियोटिक बाह्य पुटिकाओं (ईईवी)15) के साथ घनत्व में अंतर आजकल अलगाव का एक विशिष्ट साधन बन सकता है।

वर्तमान में, आयोडिक्सानॉल ईवीएस के घनत्व ढाल पृथक्करण के लिए पसंदीदा माध्यम के रूप में उभरा है, जो अपने आइसोटोनिक गुणों के कारण सुक्रोज की जगह ले रहा है। ये गुण ईवी आकृति विज्ञान को संरक्षित करने और प्रत्येक अंश29 के लिए घनत्व अनुमान की सुविधा प्रदान करने में योगदान करते हैं। Tulkens एट अल 15 के साथ संरेखण में, हमारे अध्ययन ने DGC प्रणाली के लिए एक समान एकाग्रता को अपनाया, 50% (w/v), 40% (w/v), 20% (w/v),10% (w/v), और 0% एकाग्रता ढाल परतों पर आयोडिक्सानोल का उपयोग किया। प्रारंभिक चरण में आयोडिक्सानोल समाधानों की विभिन्न सांद्रता तैयार करने के लिए HEPES बफर का उपयोग शामिल था। ट्रिस (-ईडीटीए) -सुक्रोज बफर की तुलना में, एचईपीईएस बफर की एक उपयुक्त एकाग्रता सेंट्रीफ्यूजेशन सिस्टम के भीतर दीर्घकालिक पीएच स्थिरता सुनिश्चित करती है, इसके आंतरिक गुणों के लिए धन्यवाद। समवर्ती रूप से, बाँझ पीबीएस बफर को सेंट्रीफ्यूजेशन सिस्टम की शीर्ष परत पर नियोजित किया गया था, न केवल समाधान तैयार करने के दौरान बैक्टीरिया और उनके चयापचयों द्वारा संभावित संदूषण के खिलाफ रक्षा करने के लिए बल्कि नमूना बफर स्थिरता पूर्व और बाद डीजीसी को बनाए रखने के लिए भी। इसमें यूसी के बाद पीबीएस बफर के साथ गोली को निलंबित करना और डीजीसी के बाद पीबीएस के साथ आयोडिक्सानोल को बदलना शामिल था, जिससे परिणामों के तुलनात्मक विश्लेषण की सुविधा मिलती है। इसके अलावा, डीजीसी प्रणाली के भीतर प्रत्येक ढाल परत की मात्रा क्रमशः 50%, 40%, 20%, 10%, और 0% (पीबीएस परत) आयोडिक्सानोल समाधान के लिए 3 एमएल, 3 एमएल, 3 एमएल, 3 एमएल, और 3.5 एमएल के लिए कैलिब्रेट की गई थी। यह रणनीति अपेक्षाकृत व्यापक घनत्व रेंज (1.02-1.30 g/mL) स्थापित करने में सहायता करती है, संभावित रूप से अन्य हस्तक्षेप करने वाले तत्वों से BEVs के पृथक्करण को बढ़ाती है, जिससे जटिल संदूषण वाले शरीर के अन्य तरल पदार्थों पर ग्रेडिएंट लागू होते हैं।

यह प्रोटोकॉल के कुछ चरणों महत्वपूर्ण हैं कि जोर देने के लिए महत्वपूर्ण है. विशेष रूप से, चरण 2.2 में उल्लिखित कमजोर पड़ने वाला कारक, जहां 1 ग्राम फेकल नमूनों को पीबीएस के न्यूनतम 10 एमएल के साथ मिलाया जाता है, ओवरसैचुरेशन को रोकने और प्रयोगात्मक संसाधनों के संरक्षण के लिए महत्वपूर्ण है। इन शर्तों के तहत, कण और प्रोटीन एकाग्रता आम तौर पर एक नमूने में फेकल द्रव्यमान के साथ आनुपातिक रूप से बढ़ती है, यह मानते हुए कि अन्य फेकल विशेषताएं स्थिर हैं। यदि आवश्यक हो, तो स्थिरता, लिपोप्रोटीन या रक्त सामग्री जैसे कारकों पर विचार करते हुए आगे का विश्लेषण किया जा सकता है। चरण 3.4 के दौरान, सावधानी सीधे समाधान डालने का कार्य से बचने के लिए प्रयोग किया जाना चाहिए, के रूप में यह गोली परेशान कर सकते हैं, संभावित रूप से 0.22 माइक्रोन फिल्टर की झिल्ली में बाधा डालने के लिए बड़े granules के कारण. यदि फिल्टर तेजी से संतृप्त हो जाता है (उदाहरण के लिए, यदि 10 एमएल से कम फिल्टर से गुजरता है), तो 12,000 × ग्राम पर एक अतिरिक्त सेंट्रीफ्यूजेशन कदम की सलाह दी जाती है। घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन के संदर्भ में, ढाल समाधान की सटीक तैयारी विश्वसनीय परिणामों के लिए एक शर्त है। इसके अतिरिक्त, स्तरीकरण के व्यवधान को रोकने के लिए ऊपरी कम घनत्व वाले समाधानों को बिछाते समय ट्यूब का सावधानीपूर्वक हेरफेर आवश्यक है, और किसी भी बुलबुले को चौकस पाइपिंग द्वारा समाप्त किया जाना चाहिए। अंत में, अंशों की आकांक्षा करते समय, उन्हें ट्यूब की दीवार के साथ सावधानीपूर्वक खींचना महत्वपूर्ण है, किसी भी अधिक या कम आकांक्षा से बचना जो गलत बीईवी वितरण का कारण बन सकता है। तरल स्तर का नियमित अवलोकन और लगातार अभ्यास इस मुद्दे को कम करने में मदद कर सकता है।

इस अध्ययन ने कई लक्षण वर्णन विधियों का उपयोग करके बीईवी-समृद्ध अंशों (एफ 6-एफ 8) को निर्धारित किया और दो अलग-अलग ढाल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन मोड का पता लगाया: टॉप-डाउन और बॉटम-अप। एफ 4-एफ 8 (चित्रा 3) में प्रोटीन और कण एकाग्रता के माप के माध्यम से और वसूली दर और शुद्धता (चित्रा 8 और चित्रा 10) की तुलना करते हुए, यह देखा गया कि बॉटम-अप सेंट्रीफ्यूजेशन मोड ने प्रोटीन और कण दोनों स्तरों पर उच्च ज्ञात मूल्यों का उत्पादन किया फेकल नमूनों से बीईवी को अलग करने और शुद्ध करने में वैकल्पिक विधि। यह अवलोकन विभिन्न गतिशील प्रक्रियाओं का तात्पर्य है। एक परिकल्पना प्रस्तावित की गई थी कि गैर-वेसिकुलर बाह्य नैनोकणों (एनवीईपी)29, जैसे लिपोप्रोटीन, बीईवी की तुलना में कम घनत्व के साथ, उनके उत्प्लावक घनत्व तक नहीं पहुंच सकते हैं यदि नमूने नीचे लोड किए जाते हैं (चित्र 6), संभावित रूप से डीजीसी(चित्रा 9)के 15 घंटे के बाद भी फुलाए हुए वसूली दर का कारण बनता है। इस अवलोकन पर विचार करने की आवश्यकता है कि क्या प्रोटीन के कणों के अनुपात के आधार पर पारंपरिक शुद्धता परिभाषा लागू होती है। इसके अलावा, यह ध्यान देने योग्य है कि ईईवी ने एफ 5 के भीतर प्रधानता का प्रदर्शन किया, जबकि बीईवी को एफ 6-एफ 7 (चित्र 4 और चित्र 5) में प्रमुखता से पाया गया। विशेष रूप से, टॉप-डाउन मोड को अपनाते समय यह भेदभाव स्पष्ट हो गया। इसलिए, यह मोड इस प्रोटोकॉल के लिए अधिक उपयुक्त हो सकता है। हालांकि, F6 के भीतर इंटीग्रिन β1 की उपस्थिति को उजागर करना आवश्यक है, संभावित रूप से ईईवी के बीच आंतरिक विविधता को दर्शाता है। इस पद्धति को शरीर के अन्य तरल पदार्थों जैसे रक्त और मूत्र पर लागू करते समय, शोधकर्ताओं को नमूनों की अनूठी विशेषताओं पर विचार करना चाहिए। इस प्रोटोकॉल में परिभाषित सेंट्रीफ्यूजेशन समय 7 एच है, जो अन्य अध्ययनों में उद्धृत अवधि से काफी कम है, जो 18 घंटे तक हो सकता है। जब इस अध्ययन (चित्रा 9) में एक ही पैटर्न में निष्पादित एक 15 घंटे की अवधि के साथ प्रोटीन वसूली की तुलना में, इस समय आवश्यक जुदाई शुद्धता को प्राप्त करने के लिए पर्याप्त प्रतीत होता है. इन परिचालन स्थितियों के तहत, टॉप-डाउन मोड में कण वसूली 10 8 (4.5 × 10 7-1.5 × 10 8) प्रति मिलीग्राम मल तक पहुंच गई, पिछली रिपोर्ट (10 11 बीईवी प्रति ग्राम गीले मल)15,29,30के साथ संरेखित हुई। अंत में, रिक्त नियंत्रण से प्रत्येक अंश के घनत्व माप ने पुष्टि की कि बीईवी का घनत्व 1.09-1.19 ग्राम / एमएल से था, जो पहले के शोध के अनुरूप है।

यह विधि, हालांकि प्रभावी है, आहार के प्रभाव, आंत समारोह और फेकल संरचना पर अन्य कारकों के कारण एक सीमा प्रस्तुत करती है। ये चर फेकल स्थिरता को बदल सकते हैं, संभावित रूप से बैक्टीरिया की बहुतायत और बीईवी वसूली को प्रभावित कर सकते हैं। इसलिए, बीईवी31,32 के अलगाव और शुद्धिकरण को मानकीकृत करना महत्वपूर्ण है, फेकल विशेषताओं के आकलन के आधार पर किए गए समायोजन के साथ। भविष्य के अनुसंधान को बीईवी उपज को सामान्य करने के लिए एक मानक की पहचान करने पर ध्यान केंद्रित करना चाहिए, मूत्र क्रिएटिनिन या मूत्र प्रवाह दर के समान। ऐसा बेंचमार्क पद्धतिगत मूल्यांकन को बढ़ा सकता है और फेकल बीईवी और शरीर की शारीरिक और रोग स्थिति के बीच की कड़ी को रोशन कर सकता है। इसके अलावा, फेकल बीईवी और विभिन्न बीमारियों के बीच मजबूत संबंध उनकी महत्वपूर्ण नैदानिक क्षमता को रेखांकित करता है। हालांकि, इस प्रोटोकॉल में निर्धारित सेंट्रीफ्यूजेशन समय चिकित्सकों द्वारा आवश्यक के रूप में अधिक सुविधाजनक और तेजी से परीक्षण की मांग को पूरा नहीं करता है। इसलिए, यह निर्धारित करने के लिए आगे की जांच की आवश्यकता है कि क्या कम सेंट्रीफ्यूजेशन समय, शायद 3 घंटे से कम, बराबर परिणाम प्राप्त कर सकते हैं। दोनों सेंट्रीफ्यूजेशन मोड में होने वाली घटनाओं को समझने के लिए आगे की खोज की भी आवश्यकता है। यद्यपि यह माना जाता है कि गैर-वेसिकुलर घटक बॉटम-अप मोड में F6-F8 में अधिक समृद्ध होते हैं, ढाल सांद्रता को परिष्कृत करना विशिष्ट कार्यों के साथ अतिरिक्त उपप्रकारों की पहचान करने में फायदेमंद साबित हो सकता है।

इस अध्ययन ने डीजीसी का उपयोग करके मानव मल से बीईवी के अलगाव और शुद्धिकरण का सफलतापूर्वक प्रदर्शन किया। रणनीति अन्य जैविक नमूनों, जैसे रक्त, मूत्र और लार के लिए आवेदन के लिए वादा करती है, जो शोधकर्ताओं को बीईवी की छिपी जानकारी को उजागर करने के लिए एक प्रभावी दृष्टिकोण प्रदान करती है, संभावित रूप से नैदानिक अनुप्रयोगों को आगे बढ़ाती है।

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Disclosures

लेखक कोई परस्पर विरोधी हितों की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

इस काम को प्रतिष्ठित युवा विद्वानों (82025024) के लिए राष्ट्रीय विज्ञान कोष द्वारा समर्थित किया गया था; चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (82230080) की प्रमुख परियोजना; चीन का राष्ट्रीय कुंजी अनुसंधान एवं विकास कार्यक्रम (2021YFA1300604); चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (81871735, 82272438, और 82002245); विशिष्ट युवा विद्वानों के लिए ग्वांगडोंग प्राकृतिक विज्ञान कोष (2023B1515020058); ग्वांगडोंग प्रांत का प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (2021A1515011639); चीन में शेडोंग प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन के प्रमुख राज्य बुनियादी अनुसंधान विकास कार्यक्रम (ZR2020ZD11); पोस्ट-डॉक्टरल साइंस फाउंडेशन (2022M720059); नानफांग अस्पताल, दक्षिणी चिकित्सा विश्वविद्यालय (2022J001) की उत्कृष्ट युवा विकास योजना।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 % (w/v) glutaraldehyde (prepared from 2.5 % stock solution in deionized water) ACMEC AP1126 Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.3
1 % (w/v) methylcellulose (prepared from original powder in deionized water) Sigma-Aldrich M7027 Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.6
1.5 % (w/v) uranyl acetate (prepared from original powder in deionized water) Polysciences 21447-25 Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.5
1000 μL, 200 μL, 10 μL Pipette KIRGEN KG1313, KG1212, KG1011 Transfer the solution
5 % (w/v) bovine serum albumin solution (prepared from the original powder in TBST buffer) Fdbio science FD0030 Used in western blotting for blocking at Step 8.5.6
5 × loading buffer Fdbio science FD006 Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5.1
75 % (v/v) alcohol LIRCON LIRCON-500 mL Surface disinfection
96-well plate Rar A8096 Measure the absorbance values 
Anti-Calnexin antibody Abcam ab92573 Western blotting (Primary Antibody)
Anti-CD63 antibody Abcam ab134045 Western blotting (Primary Antibody)
Anti-CD9 antibody Abcam ab236630 Western blotting (Primary Antibody)
Anti-Flagellin antibody Sino Biological 40067-MM06 Western blotting (Primary Antibody)
Anti-Integrin beta 1 antibody Abcam ab30394 Western blotting (Primary Antibody)
Anti-LPS antibody Thermo Fisher MA1-83152 Western blotting (Primary Antibody)
Anti-LTA antibody Thermo Fisher  MA1-7402 Western blotting (Primary Antibody)
Anti-OmpA antibody CUSABIO CSB-PA359226ZA01EOD, https://www.cusabio.com/ Western blotting (Primary Antibody)
Anti-Syntenin antibody Abcam ab133267 Western blotting (Primary Antibody)
Anti-TSG101 antibody Abcam ab125011 Western blotting (Primary Antibody)
Autoclave ZEALWAY GR110DP Sterilization for supplies and mediums used in the experiment
Balance Mettler Toledo AL104 Balance the tube sample-loaded with PBS
Bicinchoninic acid assay  Fdbio science FD2001 Measure protein content of BEVs at Step 8.2
BioRender BioRender https://app.biorender.com Make the schematic workflow of BEVs isolation and purification showed in Figure 1
Biosafety cabinet Haier HR1200- II B2 Peform the procedures about feces sample handling
Centrifuge 5810 R; Rotor F-34-6-38 Eppendorf 5805000092; 5804727002, adapter: 5804774000 Preprocess for BEVs (Step 3)
Chemiluminescence Apparatus BIO-OI OI600SE-MF Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12
Cytation 5 BioTek F01 Microplate detector for measuring the absorbance (Step 8.1) and fluorescence (Figure 6) values 
Dil-labled low density lipoprotein ACMEC AC12038 Definition of distribution of interfering components 
Electrophoresis equipment Bio-rad 1658033 Used in western blotting for protein separation and transfer at Step 8.5.2, 8.5.3, 8.5.5
Enhanced Chemiluminescence kit HRP  Fdbio science FD8020 Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12
Escherichia coli  American Type Culture Collection ATCC8739 Isolate BEVs as a positive control. Protocol: Dissolve 25 g of the LB powder in 1 L deionized water, and autoclave. Transfer the 800 μL of preserved Escherichia coli into the medium. Cultivate at 37 °C in the incubator shaker. Then centrifuge at 3, 000 × g for 20 min at 4 °C, 12, 000 × g for 30 min at 4 °C, filter the supernatant through 0.22 μm membrane, and perform ultra-speed centrifugation at 160, 000 × g for 70 min at 4 °C. Pellet defined as crude BEVs from Escherichia coli was suspended in 1.2 mL PBS (Step 3, 4).    
Falcon tubes 50 mL KIRGEN KG2811 Preprocess for BEVs (Step 3)
Feto Protein Staining Buffer Absci ab.001.50 Coomassie brilliant blue staining at Step 8.5.4
Filter paper Biosharp BS-TFP-070B Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 (Blotting the solution)
Formvar/Carbon supported copper grids  Sigma-Aldrich TEM-FCF200CU50 Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3
HEPES powder Meilunbio MB6078 Prepare iodixanol buffers with different concentrations for density gradient centrifugation
HRP AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Fdbio science FDM007 Western blotting (Secondary Antibody)
HRP AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Fdbio science FDR007 Western blotting (Secondary Antibody)
Incubator shaker Qiangwen DHZ-L Cultivate Escherichia coli 
Kimwipes™ Delicate Task Wipes Kimtech Science 34155 Wipe the inner wall of the ultracentrifuge tube at Step 4.15
LB broth Hopebio HB0128 Cultivate Escherichia coli 
Low temperature freezer (-80 °C) Haier DW-86L338J Store the samples
Methanol Alalddin M116118 Used in western blotting for activating PVDF membrane at Step 8.5.5
Micro tubes 1.5 mL KIRGEN KG2211 Recover fractions after density gradient centrifugation
Micro tubes 2 mL KIRGEN KG2911 Recover fractions after density gradient centrifugation
Micro tubes 5 mL BBI F610888-0001 Recover fractions after density gradient centrifugation
Microplate reader  Thermo Fisher  Multiskan MK3 Measure protein content of BEVs at Step 8.2
Millipore filter 0.22 μm Merck millipore SLGP033RB Filtration sterilization; Material: polyethersulfone, PES
NaCl GHTECH 1.01307.040 Density gradient centrifugation solution
NaOH GHTECH 1.01394.068 Density gradient centrifugation solution (pH adjustment)
Optima™ XPN-100 Beckman Coulter A94469 Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7
OptiPrep™ Serumwerk Bernburg AG 1893 Density gradient centrifugation stock solution
Orbital Shaker Youning CS-100 Dissolve feces at Step 2
Phosphate buffered saline Procell PB180327 Dissolve feces at Step 2
Pipettor Eppendorf 3120000267, 3120000259 Transfer the solution
Plastic pasteur pipette ABCbio ABC217003-4 Remove supernatant in preprocessing at Step 3.4
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes Millipore ISEQ00010, IPVH00010 Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5
Prefabricated polyacrylamide gel, 4–20% 15 Wells ACE F15420Gel Used in western blotting for protein separation at Step 8.5.2, 8.5.3
Primary antibody diluent Fdbio science FD0040 Used in western blotting at Step 8.5.8
Protein ladder Fdbio science FD0672 Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5
Rapid protein blotting solution UBIO UW0500 Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5
Rotor SW 32 Ti Swinging-Bucket Rotor Beckman Coulter 369650 Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7
Syringe 20 mL, 50 mL  Jetway ZSQ-20ML, YCXWJZSQ-50 mL Transfer buffers amd remove supernatant in preprocessing
TBS powder Fdbio science FD1021 Used in western blotting at Step 8.5
Transmission electron microscope (TEM) Hitachi  H-7650 Morphological observation for BEVs at Step 8.3
Tween-20 Fdbio science FD0020 Used in western blotting at Step 8.5
Ultracentrifuge tube Beckman 326823, 355642 Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7
Ultra-clean bench AIRTECH SW-CJ-2FD Peform the procedures about liquid handling
Water bath Bluepard CU600 Used for measuring protein content of BEVs at Step 8.2.5
ZetaView Particle Metrix S/N 21-734, Software ZetaView (version 8.05.14 SP7) Nanoparticle tracking analysis (NTA) for measuring the particle size and concentrarion of BEVs at Step 8.4

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References

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अलगाव और शुद्धिकरण बैक्टीरियल बाह्य पुटिकाएं मानव मल घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन आंत माइक्रोबायोटा बायोएक्टिव अणु प्रोटीन लिपिड न्यूक्लिक एसिड फिजियोलॉजी पैथोलॉजी स्राव फ़ंक्शन अनुकूलन टॉप-डाउन सेंट्रीफ्यूजेशन मोड बॉटम-अप सेंट्रीफ्यूजेशन मोड कण आकृति विज्ञान आकार एकाग्रता प्रोटीन सामग्री वसूली दर शुद्धता स्तर
घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग करके मानव मल से बैक्टीरियल एक्स्ट्रासेल्युलर पुटिकाओं का अलगाव और शुद्धिकरण
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Xue, Y., Huang, X., Ou, Z., Wu, Y.,… More

Xue, Y., Huang, X., Ou, Z., Wu, Y., Li, Q., Huang, X., Wen, M., Yang, Y., Situ, B., Zheng, L. Isolation and Purification of Bacterial Extracellular Vesicles from Human Feces Using Density Gradient Centrifugation. J. Vis. Exp. (199), e65574, doi:10.3791/65574 (2023).

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