Summary
Denna studie beskriver en metod för att isolera och rena bakteriella extracellulära vesiklar (BEV) anrikade från mänsklig avföring via densitetsgradientcentrifugering (DGC), identifierar de fysiska egenskaperna hos BEV från morfologi, partikelstorlek och koncentration och diskuterar de potentiella tillämpningarna av DGC-metoden inom klinisk och vetenskaplig forskning.
Abstract
Bakteriella extracellulära vesiklar (BEV) är nanovesiklar som härrör från bakterier som spelar en aktiv roll i bakterie-bakterier och bakterie-värdkommunikation, och överför bioaktiva molekyler som proteiner, lipider och nukleinsyror som ärvs från moderbakterierna. BEV som härrör från tarmmikrobiotan har effekter i mag-tarmkanalen och kan nå avlägsna organ, vilket resulterar i betydande konsekvenser för fysiologi och patologi. Teoretiska undersökningar som utforskar typerna, kvantiteterna och rollerna för BEV som härrör från mänsklig avföring är avgörande för att förstå utsöndringen och funktionen av BEV från tarmmikrobiotan. Dessa undersökningar kräver också en förbättring av den nuvarande strategin för isolering och rening av batterielbilar.
Denna studie optimerade isolerings- och reningsprocessen för batterielbilar genom att etablera två lägen för gradientcentrifugering (DGC): Top-down och Bottom-up. Den anrikade fördelningen av batterielbilar bestämdes i fraktionerna 6 till 8 (F6-F8). Metodens effektivitet utvärderades baserat på partikelmorfologi, storlek, koncentration och proteininnehåll. Partikel- och proteinåtervinningshastigheterna beräknades, och förekomsten av specifika markörer analyserades för att jämföra återhämtningen och renheten hos de två DGC-lägena. Resultaten indikerade att Top-down-centrifugeringsläget hade lägre föroreningsnivåer och uppnådde en återvinningsgrad och renhet som liknade den för Bottom-up-läget. En centrifugeringstid på 7 timmar var tillräcklig för att uppnå en fekal BEV-koncentration på10,8/mg.
Förutom avföring kan denna metod tillämpas på andra typer av kroppsvätskor med korrekt modifiering beroende på skillnaderna i komponenter och viskositet. Sammanfattningsvis skulle detta detaljerade och tillförlitliga protokoll underlätta standardiserad isolering och rening av batterielbilar och därmed lägga en grund för efterföljande multi-omics-analys och funktionella experiment.
Introduction
Tarmen är allmänt erkänd som det organ som hyser de mest rikliga mikrobiella samhällena i människokroppen, med över 90 % av bakterierna involverade i kolonisering och förökning 1,2. Omfattande bevis har visat att tarmmikrobiotan modulerar tarmmikromiljön och samtidigt interagerar med dysfunktion i avlägsna organ, främst genom en försämrad tarmbarriär 3,4. Allt fler bevis tyder på ett samband mellan obalansen i tarmmikrobiotan och progressionen av inflammatorisk tarmsjukdom (IBD)5,6, samt kognitiva störningar genom tarm-hjärna-axeln 5,6,7,8. Bakteriella extracellulära vesiklar (BEV) som produceras av bakterier spelar en viktig roll i dessa patologiska processer.
BEV är partiklar i nanoskala som kapslar in bakteriederivat, med diametrar från 20 till 400 nm. De har visat sig underlätta interaktioner mellan bakterier och deras värdorganismer 9,10. Trots deras osynlighet har dessa partiklar fått allt större uppmärksamhet från forskare på grund av deras potentiella breda tillämpningar som diagnostiska biomarkörer, terapeutiska mål och bärare av läkemedel11. Mänsklig avföring, som ofta används som bioprover för att studera BEV, huvudsakligen från tarmbakterier, innehåller en komplex blandning av bland annat vatten, bakterier, lipider, proteiner, osmälta matrester och exfolierade epitelceller. Den intrikata fekala sammansättningen innebär utmaningar för isoleringen och renheten hos batterielbilar, vilket hindrar en heltäckande, objektiv och realistisk analys av batterielbilar. Därför har effektiva strategier för att minimera störningar från förorenande komponenter och öka utbytet av batterielbilar dykt upp som kritiska frågor som kräver omedelbar uppmärksamhet.
Befintliga isoleringsstrategier bygger till stor del på tekniker som ultrahöghastighetscentrifugering (UC), densitetsgradientcentrifugering (DGC) och storleksuteslutningskromatografi (SEC)12,13,14,15,16,17. För närvarande är DGC en av de mest använda metoderna inom BEV-separering, och omfattar två sedimentationsflytande lägen, "Top-down" och "Bottom-up", som bestäms av provets initiala lastningsposition. Dessa metoder skiljer extracellulära vesiklar (EV) från andra komponenter baserat på skillnader i storlek och densitet, vilket ger varierande renhet och återhämtningshastigheter. Tidigare forskning har indikerat att strategier med ett enda tillvägagångssätt är otillräckliga för att på ett adekvat sätt separera EV från lösliga proteiner i kroppsvätskeprover, såsom lipoprotein i blod18 och Tamm-Horsfall-protein i urin19. Dessutom överlappar storleksfördelningen för eukaryota extracellulära vesiklar (EEV) ofta med storleksfördelningen för BEV, vilket kräver ytterligare metodologiska förbättringar för att optimera BEV-utbytet. Följaktligen är utvecklingen av effektiva separations- och reningsmetoder beroende av att studier av batterielfordon förs framåt. Noterbart är att Tulkens et al 15 använde en ortogonal biofysisk strategi för att separera fekala BEV från EEV, där centrifugeringstiden för ett Bottom-up DGC-läge var upp till18 timmar. Däremot reducerade denna studie den till 7 timmar, vilket avsevärt sparade gradient-ultracentrifugeringstiden och förenklade processen.
I den aktuella studien isolerade och renade vi fekala BEV:er med hjälp av två DGC-lägen under optimerade buffertförhållanden, efter att ha berikat BEV:er med en rad differentiella centrifugeringshastigheter, från låg till extremt hög hastighet. Utvärderingar baserade på morfologi, partikelstorlek och koncentration indikerade en berömvärd prestanda med denna förbättrade metod. Denna studie kan fungera som grund för framtida forskning, utvidga dess tillämpningar till ett bredare område och ge insikter om heterogeniteten hos BEV i människokroppen. Det bidrar också till standardiseringen av BEV-separations- och analystekniker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etikkommittén vid Nanfang Hospital, Southern Medical University, sanktionerade denna studie, som genomfördes med deltagarnas informerade samtycke. Alla metoder som används häri följde de standardriktlinjer som tillhandahålls av International Human Microbiome Standards (IHMS: http://www.microbiome-standards.org/). Alla efterföljande vätskehanteringsprocedurer var obligatoriska att utföras i ett biosäkerhetsskåp eller en ultraren bänk.
1. Insamling och alikvotering av fekala prover
- Dela ut en avföringsprovtagare, en förseglad påse och en islåda och ge omfattande instruktioner till deltagarna om hur man skaffar och bevarar proverna.
- Instruera varje deltagare att samla in sitt avföringsprov med hjälp av den medföljande provtagaren och att transportera det till laboratoriet vid en temperatur på 4 °C inom ett 24-timmarsfönster.
- Vid mottagandet på laboratoriet, använd en steril sked för att alikvotera mindre än 3,5 g avföring i ett vägt 50 ml centrifugrör. Notera avföringsprovets vikt på röret för efterföljande förbehandlingsprocedurer.
PAUSPUNKT: Om omedelbar bearbetning av proverna inte är möjlig, fördela provet för långtidsförvaring vid -80 °C efter lämplig märkning.
2. Beredning av avföringsprover
- Kyl 500 ml fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) vid 4 °C. Filtrera den förkylda PBS:en genom ett 0,22 μm polyetersulfonfilter (PES) med en 50 ml spruta i tio 50 ml centrifugeringsrör.
- Placera två 50 ml rör på is, som var och en innehåller 3,5 g fekala prover. Tillsätt 35 ml PBS till varje rör.
OBS: Beräkna den erforderliga mängden PBS för upplösning av avföring, säkerställ en maximal sample koncentration på 10 % (w/v). Om du bearbetar ytterligare prover, använd fler rör efter behov. - Skaka proverna vid 300 varv per minut i 2 timmar vid 4 °C, eller placera dem i minst 8 timmar vid 4 °C tills avföringen är helt upphängd.
3. Centrifugering med differenshastighet
- Kyl den kylda höghastighetscentrifugen till 4 °C.
- Justera vikten på de två rören som innehåller proverna som förberetts i steg 2.3 med PBS för att nå en totalvikt på 0.1 g.
- Centrifugera proverna vid 3 000 × g i 20 minuter vid 4 °C.
- Pipettera försiktigt supernatanten i två rena 50 ml centrifugrör, lämna cirka 1 ml ovanför pelleten. Använd en Pasteur-pipett av plast för engångsbruk för denna process.
- Justera vikten på de två rören med PBS för att nå en totalvikt inom ± 0.1 g.
- Centrifugera den överförda supernatanten vid 12 000 × g i 30 minuter vid 4 °C.
- Aspirera supernatanten med en 20 ml spruta, ta bort sprutnålen och filtrera den genom 0,22 μm filter till 50 ml rör. Vid denna tidpunkt bör supernatantvolymen vara cirka 30 ml.
OBS: Om en betydande mängd föroreningar fortfarande är synlig efter centrifugeringen på 12 000 × g, är det nödvändigt att upprepa centrifugeringssteget vid 12 000 × g i 30 minuter vid 4 °C. Underlåtenhet att göra det kan leda till en betydande förlust av batterielbilar på grund av porblockering under filtreringen.
4. Centrifugering med ultrahög hastighet
- Rengör rotorn och skopan genom att torka av dem med 75 % (v/v) alkohol för att eliminera eventuell kvarvarande förorening.
- Placera ett 38.5 ml ultracentrifugrör i rörhållaren.
OBS: Välj lämpligt ultracentrifugrör baserat på sample volym. Undvik ultraviolett strålning och olämpliga kemiska reagenser för sterilisering av centrifugalrör enligt anvisningarna i produktmanualen. - Överför cirka 30 ml av den filtrerade fekala supernatanten från steg 3.7 till ultracentrifugröret.
- Fyll ultracentrifugröret med cirka 8 ml PBS, lämna ett mellanrum på 3 mm från rörets öppning.
- Placera de två ultracentrifugrören med proverna i motsatta ultracentrifugeringshinkar, t.ex.ample, hink 1 motsvarar 4 (1-4), 2-5, 3-6.
- Justera vikten på de två skoporna med PBS för att uppnå en totalvikt inom ± 0,005 g.
- Montera alla skopor på rotorn, oavsett om rören är lastade eller inte.
- Initiera vakuumet och centrifugera proverna vid 160 000 × g i 70 minuter vid 4 °C.
- Släpp kammarvakuumet och öppna luckan när Ready visas på instrumentets hemsida.
- Ta bort rotorn från ultracentrifugen.
- Flytta skoporna från rotorn till ställningen och hämta rören med hjälp av en tång.
- Kassera supernatanten, som kommer att innehålla synliga bruna pellets i botten.
- Återsuspendera pelletsen genom att upprepade gånger pipettera dem upp och ner med en 1 000 μL pipett med 1 ml förkyld (4 °C) PBS tills den är helt avstängd. Fyll röret med cirka 37 ml PBS och lämna ett mellanrum på 3 mm från öppningen.
- Utför ytterligare en ultracentrifugering enligt steg 4.5-4.11 vid 160 000 × g i 70 minuter vid 4 °C för att avlägsna delvis fastsittande kontaminerande komponenter från rörväggarna.
- Kassera supernatanten, vänd upp och ner på de två ultracentrifugrören i 5 minuter och rensa bort eventuell kvarvarande lösning på innerväggen med vindrutetorkare.
OBS: Rengöring av innerväggen minimerar störningar från kvarvarande föroreningar som fastnar på ultracentrifugrörets vägg. Välj vindrutetorkare som inte påverkar BEV-analysen, särskilt när det gäller partikelstorlek. - Återsuspendera pelletsen i varje rör genom att pipettera dem upp och ner med 1,2 ml förkyld (4 °C) PBS med en 1 000 μL pipett.
- Överför 1,2 ml av PBS/BEV-lösningen från ett ultracentrifugrör till ett rent 1,5 ml mikrorör.
PAUSPUNKT: PBS/BEV-lösningen som samlas upp från ett ultracentrifugrör kan gå vidare till steg 6. Förvara lösningen från det andra röret vid -80 °C.
5. Beredning av lösning för densitetsgradientcentrifugering
- Beredning av 0,02 M HEPES-buffert
- Kombinera 0,477 g HEPES-pulver och 0,8 g NaCl med 90 ml autoklaverat avjoniserat vatten.
- Justera pH till 7,2 genom att tillsätta 1 M natriumhydroxid (NaOH). Höj volymen till 100 ml med avjoniserat vatten och filtrera lösningen genom 0,22 μm PES-membran.
VARNING: Natriumhydroxid är en stark frätande alkali. Operatörer måste hantera och förbereda den försiktigt i ett dragskåp.
- Beredning av densitetsgradientbuffert
- Beräkna erforderlig volym för varje densitetsgradientbuffert baserat på antalet ultracentrifugrör för densitetsgradientcentrifugering (steg 6) (I detta protokoll var volymerna för 60 %, 50 %, 40 %, 20 % och 10 % gradientlösningar 2,5 ml, 3 ml, 6 ml, 6 ml respektive 6 ml).
- För beredning av en 50 % (vikt/volym) jodixanolarbetslösning, blanda 0,02 M HEPES-bufferten och 60 % (vikt/volym) jodixanolstamlösning i ett volymförhållande på 1:5 (0,5 ml:2,5 ml).
OBS: Använd en engångsspruta på 20 ml för att dra upp jodixanollösningen och undvik att tillföra luft. - För att bereda jodixanolbuffertar med olika koncentrationer, kombinera 50 % jodixanolarbetslösningen från steg 5.2.2 med HEPES-bufferten som erhölls i steg 5.1 med hjälp av en 1 000 μL pipett enligt de proportioner som visas i tabell 1.
OBS: Utför steg 5 på en ultraren bänk med lamporna släckta. Förvara den öppnade jodixanollösningen i kylskåp vid 4 °C för att förhindra bakterietillväxt. Förvara jodixanollösningen och HEPES-bufferten skyddade från ljus.
6. Inrättande av ett system för densitetsgradientcentrifugering
- DGC-läge uppifrån och ned
- Blanda 500 μl PBS/BEV-lösning isolerad från steg 4 med 3 ml PBS. Blanda försiktigt lösningarna med en 1 000 μL pipett för att erhålla 3,5 ml PBS/BEV-lösning.
- Placera ett 31 ml ultracentrifugrör på en skumplatta med hål och märk det som "↓".
- Tillsätt 3 ml av 50 % jodixanollösning vertikalt till botten av röret med hjälp av en 1 000 μL pipett.
- Luta röret till en 70° vinkel och placera en rörhållare eller annat stöd något ovanför skumplattans nivå, under rörets öppning.
- Tillsätt 3 ml 40 % jodixanollösning ovanpå 50 % jodixanollösningen med en 1 000 μL pipett.
- Tillsätt 3 ml 20 % jodixanollösning ovanpå 40 % jodixanollösningen med en 1 000 μL pipett.
- Tillsätt 3 ml 10 % jodixanollösning ovanpå 20 % jodixanollösningen med hjälp av en 1 000 μl pipett.
- Tillsätt 3,5 ml PBS/BEV-lösning från steg 6.1.1 ovanpå 10 % jodixanollösningen med en 1 000 μL pipett.
- Sätt försiktigt tillbaka rören till upprätt läge.
OBS: Efter pipettering ska stratifieringen vara synlig.
- Nedifrån och upp DGC-läge
- Placera ett 31 ml ultracentrifugrör på en skumplatta med hål och märk det som "↑".
- Tillsätt vertikalt 2,5 ml av 60 % jodixanolstamlösning till botten av röret. Blanda den försiktigt med 500 μl PBS/BEV-lösning isolerad från steg 4 med en 1 000 μL pipett för att erhålla 3 ml 50 % jodixanol/BEV-lösning.
- Luta röret till en 70° vinkel och placera en rörhållare eller annat stöd något ovanför skumplattans nivå, under rörets öppning.
- Tillsätt 3 ml av 40 % jodixanollösning ovanpå 50 % jodixanol/BEV-lösning med en 1 000 μL pipett.
- Tillsätt 3 ml av 20 % jodixanollösningen ovanpå 40 % jodixanollösningen med hjälp av en 1000 μL pipett.
- Tillsätt 3 ml av 10 % jodixanollösningen ovanpå 20 % jodixanollösningen med en 1000 μL pipett.
- Tillsätt 3,5 ml PBS ovanpå 10 % jodixanollösningen med en 1 000 μL pipett.
- Sätt försiktigt tillbaka rören till upprätt läge.
- Vid denna tidpunkt återstod 200 μL av suspensionen som erhölls i steg 4.17, som därefter kan analyseras som en grupp kallad "UC".
OBS: När du överför lösningar i steg 6, håll alltid pipettspetsen mot ultracentrifugrörets vägg vinkelrätt mot rörets axel.
7. Densitetsgradientcentrifugering och fraktionsuppsamling
- Justera vikten på de två rören med PBS för att uppnå en totalvikt inom ± 0,005 g.
- Placera rören i hinkarna enligt steg 4.5 och centrifugera dem vid 160 000 × g i 7 timmar vid 4 °C.
- Samla upp fraktionerna med en pipett (1000 μL) uppifrån och ner mot sidoväggen i följande ordning: 3 ml, 2 ml, 1 ml, 1 ml, 1 ml, 1 ml, 1 ml, 1 ml, 1 ml, 1 ml, 1,5 ml och 3 ml i ett 38,5 ml ultracentrifugrör.
OBS: Håll siktlinjen på samma nivå som vätskeytan. - Utför ultracentrifugering för varje fraktion som erhållits i steg 7.3 enligt steg 4 vid 160 000 × g i 70 minuter vid 4 °C.
- Ta bort supernatanten och vänd upp och ner på ultracentrifugrören i 5 minuter.
- Återsuspendera pelletsen i 200 μl förkyld (4 °C) PBS med en 200 μL pipett.
- Överför PBS/BEV-lösningen till ett rent 1.5 ml mikrorör.
- Märk fraktionerna från F1 till F10 och analysera dem baserat på steg 8.
PAUSPUNKT: Om proverna som erhållits i steg 7.8 inte kan bearbetas omedelbart, förvara dem vid -80 °C.
8. Karakterisering och kvantitativ analys av de insamlade fraktionerna
- Bestäm absorbansvärdena (OD 340 nm) för varje fraktion med hjälp av en mikroplattdetektor med blindkontroll för att beräkna deras motsvarande densitet.
OBS: Byt ut PBS/BEV-lösning (steg 6.1.1 och steg 6.2.2) med PBS för att upprätta en blankkontroll.- Bered 100 μl vardera av 0 %, 5 %, 10 %, 12,5 % och 20 % jodixanollösning utspädd med 0,02 M HEPES baserat på 50 % stamlösning (steg 5.2.2) som standard, motsvarande densiteter på 1,0058 g/ml, 1,0318 g/ml, 1,058 g/ml, 1,0708 g/ml respektive 1,111 g/ml.
- Tillsätt 50 μl av varje fraktion från blindprovet (bereds i steg 7.3) och 50 μl av varje standardlösning (bereds i steg 8.1.1) till dubbla brunnar i en 96-hålsplatta.
- Ställ in våglängden till 340 nm, mät slutpunktens optiska densitet och beräkna densiteten för varje fraktion.
- Identifiera F4-F9 som intervallet för BEV-fraktioner baserat på deras densitet.
- Bestäm proteinkoncentrationen i BEV-fraktionerna med hjälp av bicinkoninsyraanalysen (BCA).
- Späd ämnet tiofaldigt i PBS som tillhandahålls av tillverkaren för att bereda en 0,5 μg/μl standardproteinlösning.
- Tillsätt standardproteinlösningen (beredd enligt steg 8.2.1) med varierande volymer enligt reagensinstruktionerna, och komplettera varje brunn på en 96-hålsplatta med PBS till en total volym av 20 μL.
- Tillsätt 20 μl av de prover som beretts i steg 7.8 och de prover som lämnats efter UC enligt definitionen i steg 6.2.9 till varje brunn.
- Blanda reagenser A och B i förhållandet 50:1 och överför 200 μl till varje brunn.
- Inkubera plattan i ett 37 °C vattenbad i 30 min.
- Mät absorbansvärdet med hjälp av en mikroplattläsare, beräkna proteinkoncentrationen (μg/μL) och bestäm proteinhalten (μg) i proverna baserat på standardkurvan (x: optisk densitet; y: proteinkoncentration) som genereras från värdena för standardlösningarna utspädda i steg 8.2.2.
- Karakterisera BEV-fraktionerna som definieras i steg 8.1.4 med hjälp av transmissionselektronmikroskopi (TEM) för att verifiera närvaron av BEV. Alla procedurer nedan bör utföras på is.
- Applicera 10 μl av varje isolerad F4-F9-fraktion från steg 7.8 och proverna som finns kvar efter UC enligt definitionen i steg 6.2.9 på koppargaller som stöds av Formvar/Carbon i 20 minuter och torka av med filterpapper.
- Skölj proverna med 100 μL PBS tre gånger i 1 minut vardera och torka av med filterpapper.
- Fixera proverna med 100 μL 1 % (vikt/volym) glutaraldehyd i 5 minuter och torka av med filterpapper.
- Tvätta gallren med 100 μL PBS tio gånger i 2 minuter vardera och torka av med filterpapper.
- Färga gallren med 50 μL 1,5 % (w/v) uranylacetat i 10 minuter och torka av med filterpapper.
VARNING: Uranylacetat är radioaktivt och extremt giftigt vid kontakt med huden eller inandning. Hantera lösningar med uranylacetat i ett dragskåp och följ lämpliga säkerhetsåtgärder. - Överför gallren på en 1% (w/v) metylcellulosadroppe i 5 minuter och torka av med filterpapper.
- Förvara de lufttorkade gallren i en mörk, dammfri miljö tills observation.
- Ta bilder och analysera dem med hjälp av ett TEM.
- Karakterisera BEV-fraktionerna som definieras i steg 8.1.4 med hjälp av nanopartikelspårningsanalys (NTA) för att räkna antalet partiklar.
- Kalibrera systemet med 110 nm polystyrenpartiklar.
- Tvätta provpoolen med PBS.
- Späd proverna från olika fraktioner som förvärvats i steg 7.8 och proverna som lämnats efter UC enligt definitionen i steg 6.2.9 till en koncentration i intervallet 10 5-10 9 partiklar/ml, med en optimerad koncentration av 107 partiklar/ml.
- Spela in och analysera vid 11 positioner med tre replikationer, med en temperatur på cirka 23-30 °C.
- Analysera proteininnehållet i proverna genom coomassie brilliant blue färgning (CBBS) och western blotting (WB).
- Späd ut batterielbilsproverna från olika fraktioner som erhållits i steg 7.8 och de prover som lämnats efter UC enligt definitionen i steg 6.2.9 med hjälp av PBS och 5 × belastningsbuffert till en slutlig koncentration på 0,5 eller 1 μg/μl, om kvantifiering krävs, och säkerställ tillräcklig provbelastning på 20 μl (10 μg eller 20 μg) av varje brunn i steg 8.5.2. Koka proverna vid 95 °C i 10 min.
- Montera den prefabricerade polyakrylamidgelen i elektroforestanken och överför proverna till brunnarna.
- Utför vertikal elektrofores med följande parametrar: 160 V i 50 min.
- Färga gelen i Coomassie briljantblå lösning i 1 timme, skölj i avjoniserat vatten tills den blå bakgrunden ljusnar och ta bilder med en kamera.
- Utför proteinblottningsprocedurer för andra geler med följande parametrar: 400 mA i 20 min.
- Blockera blottingmembranen med en 5 % (w/v) BSA-lösning i 1 timme vid rumstemperatur.
- Tvätta hinnorna i TBST-buffert tre gånger i 5 minuter vardera.
- Inkubera membranen med primära antikroppar (BEV-markörer: LPS, OmpA, LTA; EEV-markörer: CD63, CD9, TSG-101, Syntenin, Integrin β1; Andra kontamineringsmarkörer: Flagellin, Calnexin) i 8-12 timmar vid 4 °C.
- Tvätta hinnorna i TBST-buffert tre gånger i 10 minuter vardera.
- Inkubera membranen med sekundära antikroppar i 1 timme vid rumstemperatur.
- Utför steg 8.5.9.
- Framkalla blotting med hjälp av en kemiluminiscensapparat.
- Ersätt PBS/BEV-lösning (steg 6.1.1 och steg 6.2.2) med batterielbilar från Escherichia coli för att fastställa en positiv kontroll (se materialtabell för proceduren för att isolera råa E. coli-BEV) och utför alla ovanstående experiment för karakterisering av batterielbilar.
PAUSPUNKT: Bestäm F6-F8 som fördelningen av BEV-berikade fraktioner baserat på resultaten av den karakterisering som beskrivs ovan för fekala BEV, och använd detta begränsade intervall för efterföljande analys.
- Beräkna återvinningsgraden i termer av partiklar och proteiner för att bedöma effektiviteten hos de två DGC-lägena. Resultaten nedan presenteras i procent.
- Beräkna återvinningsgraden för partiklar i uppifrån-och-ned-läge: totalt antal partiklar i F6–F8/partiklar efter UC enligt definitionen i steg 6.2.9.
- Beräkna återvinningsgraden för partiklar i bottom-up-läge: totalt antal partiklar i F6–F8/partiklar efter UC enligt definitionen i steg 6.2.9.
- Beräkna återvinningsgraden för proteiner i Top-down-läge: totalt proteininnehåll i F6-F8 (μg)/proteininnehåll efter UC definierat i steg 6.2.9 (μg).
- Beräkna återvinningsgraden för proteiner i bottom-up-läge: totalt proteininnehåll i F6-F8 (μg)/proteininnehåll efter UC definierat i steg 6.2.9 (μg).
- Beräkna partikel/protein-förhållandet för att bedöma den renhet som traditionellt definierats för UC och de två DGC-lägena, och resultaten nedan presenterades alla i procent.
- Partikel/protein-förhållande efter UC enligt definitionen i steg 6.2.9: partiklar efter UC/proteinhalt efter UC (μg).
- Partikel/protein-förhållande uppifrån och ned: totalt antal partiklar i F6-F8/proteinhalt i F6-F8 (μg).
- Partikel/protein-förhållande nedifrån och upp: totalt antal partiklar i F6-F8/proteinhalt i F6-F8 (μg).
- Välj det lämpligaste centrifugeringsläget (Top-down-läge valdes i protokollet) för fekal BEV-rening och framtida analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bestäm fördelningen av BEV-anrikade fraktioner
För att bestämma fördelningen av bakteriella extracellulära vesiklar (BEV)-berikade fraktioner upprättades en blankkontroll för att mäta absorbansvärdena vid OD 340 nm, och densiteten för varje fraktion beräknades baserat på mätningarna och jodixanolriktlinjerna (steg 8.1). Tabell 2 visar densitetsresultaten och visar att fraktionerna F4 till F9 uppvisade densiteter inom det intervall som vanligtvis förknippas med extracellulära vesiklar. Detta resultat tydde på att majoriteten av batterielfordonen var isolerade i dessa fraktioner, vilket ledde till att F4-F9 definierades som det grova intervallet för batterielbilar. Transmissionselektronmikroskopi (TEM) användes för att karakterisera de morfologiska egenskaperna hos fekala BEV isolerade som visas i figur 1 i fraktionerna F4-F9. TEM-bilderna (figur 2) avslöjade förekomsten av klassiska skålformade strukturer, som är karakteristiska för batterielbilar. Nanopartikelspårningsanalys (NTA) och bicinkoninsyraanalys (BCA) utfördes för att bestämma partikelantalet respektive proteinkoncentrationen, vilket möjliggjorde ytterligare utvärdering av återvinningshastigheter och renhet. Figur 3 visar protein- och partikelkoncentrationerna för varje fraktion, vilket indikerar att F6 och F7 uppvisade de högsta koncentrationerna, följt av F5 och F8. Därefter utfördes Coomassie brilliant blue staining (CBBS) och western blotting (WB) för att ge en övergripande proteinanalys. Resultaten av CBBS överensstämde med proteinkoncentrationsfynden, där F6 och F7 uppvisade de mest intensiva banden (figur 4). För att bekräfta fördelningen av BEV användes extracellulära vesiklar från Escherichia coli som en positiv kontroll (definieras i steg 8.5.13). Isolerings- och reningsprocedurerna följde de steg som beskrivs i materialförteckningen och de tidigare nämnda protokollavsnitten (steg 3, 4). WB-analys bekräftade vidare förekomsten av yttre membranprotein A (OmpA), en viktig komponent i bakteriers yttre membran och en specifik markör för BEV, i fraktionerna F6-F8. Baserat på dessa resultat definierades fraktionerna F6-F8 som BEV-anrikade fraktioner som är lämpliga för efterföljande experiment och analys.
Kontroll av störningskomponenternas presentationsområde
Eukaryota extracellulära vesiklar (EEV), som har en liknande storlek och densitet som BEV, identifierades som en viktig interferens vid analys av BEV. För att ta itu med detta undersöktes tre EEV-proteiner i fraktionerna 5-8 från både Top-down- och Bottom-up-läge, med centrifugeringstider på 7 timmar och 15 timmar. CD63, ett EEV-associerat transmembranprotein, detekterades främst i F5, medan BEV-markören LPS anrikades i fraktionerna 6-7. Detta mönster observerades i båda lägena, även om Bottom-up-läget uppvisade en liten bandning av CD63-EEV i F7. Andra EEV-markörer, CD9 och TSG-101, visade dock inga synliga signaler i dessa fraktioner oavsett moder eller centrifugeringstider. I ett oberoende experimentellt företag användes antikroppar riktade mot syntenin och integrin β1 för att fastställa anrikningen av distinkta proteinmarkörer som är inneboende i EEV över fraktionerna 5-8. Syntenin var framträdande inom F5, särskilt inom ramen för Top-down-metoden, medan närvaron av Integrin β1 kunde urskiljas inom F6 (figur 5). För att ytterligare bedöma förekomsten av störande partiklar infördes Dil-märkt lågdensitetslipoprotein (Dil-LDL) i densitetsgradientsystemet och fluorescensintensiteten mättes över alla fraktioner. I Top-down-läget uppvisade fraktionerna 1-4 relativt högre fluorescensvärden, medan det i Bottom-up-läget var F1-F6 som uppvisade högre intensiteter (Figur 6).
Bedöma återvinningsgraden och renheten för två DGC-steg utifrån koncentration, partikelstorlek och markörer för batterielfordon
Efter att ha identifierat F6-F8-fraktioner som BEV-anrikade fraktioner, utvärderades återvinningsgraden och renheten för de två densitetsgradientcentrifugeringslägena (DGC). Partikelstorlekarna för BEV-anrikade fraktioner erhållna från Top-down-läge, Bottom-up-läge och ultracentrifugering (UC) jämfördes. De observerade partikelstorlekarna i båda centrifugeringsstegen varierade mellan 90 och 300 nm, i linje med den definierade diametern på batterielfordon (figur 7). Därefter beräknades partikel- och proteinåtervinningsgraden för de två stegen baserat på partikel- och proteinkoncentrationerna före och efter DGC (tabell 3 och figur 8). Noterbart är att Bottom-up-läget uppvisade högre återhämtningsgrader jämfört med det andra läget. I en separat experimentgrupp utvärderades proteinåtervinningen i de två modusen vid olika centrifugeringstider på 7 timmar och 15 timmar. Det är viktigt att notera att det inte fanns någon statistiskt signifikant skillnad i proteininnehåll inom F6-F8-fraktionerna efter DGC mellan de två centrifugeringstiderna, oavsett vilket gradientläge som användes (figur 9). Partikel/protein-förhållandet beräknades för att ge en grov bedömning av renheten i de två lägena. Uppgifterna visade ingen signifikant skillnad i renhet mellan lägena. Dessutom utfördes Coomassie briljantblå färgning (CBBS) och western blotting (WB) för att ytterligare jämföra renheten, med fokus på tre BEV-markörer (LPS, OmpA och LTA), en EEV-markör (CD63) och två kontaminerande markörer (Calnexin, Flagellin). Resultaten visade en partiell minskning av störande ämnen efter DGC, där LPS och OmpA visade en mer framträdande närvaro i båda DGC-lägena jämfört med enbart UC (Figur 10).
Figur 1: Schematiskt arbetsflöde för isolering och rening av batterielfordon. Förkortningar: BEV = bakteriella extracellulära vesiklar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Representativa TEM-bilder av BEV-fraktioner. A) Bilder av det tvärgående elektromagnetiska elnätet av batterielfordon som isolerats efter UC. B) Bilder av tvärgående elektromagnetiska körfält av batterielfordon som isolerats efter DGC med hjälp av uppifrån och ned-läge. C) Bilder av tvärgående elektromagnetiska fordon som isolerats efter DGC med hjälp av bottom-up-läge. Alla bilder presenterades i en konsekvent skala på 200 nm. Förkortningar: TEM = transmissionselektronmikroskop; BEV = bakteriella extracellulära vesiklar; UC = ultracentrifugering; DGC = densitetsgradientcentrifugering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Protein- och partikelkoncentration i BEV-fraktioner efter DGC-lägena uppifrån och ned och nedifrån och upp. Proteinkoncentrationen i BEV-fraktioner bestämdes med hjälp av BCA och representeras av de grå staplarna. Partikelkoncentrationen mättes med NTA och representeras av de blå staplarna. Förkortningar: BEV = bakteriell extracellulär vesikel; DGC = densitetsgradientcentrifugering, BCA = bikoninsyrahalt, NTA = analys av spårning av nanopartiklar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Bestämning av BEV-anrikade fraktioner. (A) CBBS utfördes för att bestämma fraktionerna som berikats med fekala BEV i både Top-down- och Bottom-up-lägen. (B) Elfordon som härrör från Escherichia coli isolerades, renades och användes som en positiv kontroll i WB för att bekräfta närvaron och distributionen av batterielbilar. OmpA: Yttre membranprotein A, en BEV-markör. Förkortningar: BEV = bakteriell extracellulär vesikel; CBBS = coomassie lysande blå färgning; EV = extracellulära vesiklar; WB = västra blotting. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Bekräftelse av EEV-distribution. Western blot-analys av fraktionerna 5-8 erhållen från DGC-lägena Top-down och Bottom-up med olika densitetsgradientultracentrifugeringsvaraktigheter, 7 h (A) och 15 h (B). Ett oberoende försök med fokus på F5 till F8 till följd av en 7-timmars centrifugeringsperiod utfördes, vilket visas i (C) och (D). Valda markörer inkluderade de som är associerade med BEV (LPS) och EEV (CD63, CD9, TSG-101, Syntenin, Integrin β1). Förkortningar: DGC = densitetsgradientcentrifugering; BEV = bakteriell extracellulär vesikel; EEV = eukaryot extracellulär vesikel. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Fördelning av lipoprotein med låg densitet. Dil-märkt lipoprotein med låg densitet (Dil-LDL), som anses vara en kontamineringsmarkör, tillsattes i en koncentration av 10 μg till gradientsystemet i både Top-down- och Bottom-up-läge. Dil-LDL ersatte PBS/BEV-lösningen (steg 6.1.1 och steg 6.2.2) för att upprätta en detektionsmodell. Fluorescensintensiteten för varje fraktion mättes med hjälp av en mikroplattdetektor med en excitations-/emissionsvåglängd på 549/565 nm. Förkortning: BEV = bakteriell extracellulär vesikel. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Partikelstorlekar för BEV-anrikade fraktioner. (A) Partikelstorleksfördelning för obearbetade BEV erhållna efter UC. B) Partikelstorleksfördelning för BEV-anrikade fraktioner (F6–F8) som erhålls med gradientcentrifugering uppifrån och ned (DGC). (C) Partikelstorleksfördelning av BEV-anrikade fraktioner (F6–F8) erhölls med hjälp av bottom-up-DGC-läget. NTA genomfördes för att kvantifiera partiklarnas dimensioner. Utspädningsfaktorerna som användes för paneler (A-C) var 10 000, 2 000 och 5 000, på motsvarande sätt kalibrerade de efterföljande resultaten. Förkortningar: BEV = bakteriell extracellulär vesikel; UC = ultracentrifugering; DGC = densitetsgradientcentrifugering, NTA = analys av spårning av nanopartiklar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 8: Protein- och partikelåtervinning i DGC-lägena uppifrån och ned och nedifrån och upp. A) Proteinåtervinningsgraden för de två stegen, beräknad som förhållandet mellan proteinkoncentrationen efter och före DGC (UC). B) Partikelåtervinningsgraden för de två stegen beräknas genom förhållandet mellan partikelkoncentrationen efter och före DGC (UC). (C) Partikel/protein-förhållanden för UC-, Top-down- och Bottom-up-lägen. Data presenteras som medelvärde ± SEM. Statistisk analys utfördes med hjälp av ett tvåsidigt, oparat t-test för panel A och B, och envägsanalys av varians (ANOVA) med Tukey post hoc-test för panel C. Inga signifikanta skillnader observerades. Förkortningar: DGC = densitetsgradientcentrifugering; UC = ultracentrifugering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 9: Jämförelse av proteinåtervinning baserat på Top-down och Bottom-up DGC-lägen med olika densitetsassocierade ultracentrifugeringstider. Proteinåtervinningshastigheter i fraktionerna F6-F8 erhållna från gradientultracentrifugering i 7 timmar och 15 timmar utvärderades i oberoende experiment med både Top-down- och Bottom-up-lägen. Data presenteras som medelvärde ± SEM. Statistisk analys utfördes med hjälp av tvåvägsanalys av varians (ANOVA) med Fishers test för minsta signifikanta skillnad. Inga signifikanta skillnader observerades. Förkortningar: DGC = densitetsgradientcentrifugering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 10: Renhetsbedömning av DGC-lägena Top-down och Bottom-up. (A) CBBS genomfördes för att jämföra proteinfördelningen för UC-, Top-down- och Bottom-up-lägen. (B) WB genomfördes för att bedöma renheten hos UC-, Top-down- och Bottom-up-lägena. Kalnexin: endoplasmatisk retikulumassocierad proteinmarkör; Flagellin, kontaminerande proteinmarkör från bakterier. CD63: transmembran proteinmarkör för eukaryota extracellulära vesiklar; LTA: BEV-markör från grampositiva bakterier; LPS, OmpA: BEV-markörer från gramnegativa bakterier. Förkortningar: DGC = densitetsgradientcentrifugering; UC = ultracentrifugering; CBBS = Coomassie Brilliant Blue färgning; WB = västra blotting. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Koncentration av jodixanollösning (%) | 0,02 M HEPES-buffert | 50% Iodixanol arbetslösning |
| 40 | 1 | 4 |
| 20 | 3 | 2 |
| 10 | 4 | 1 |
Tabell 1: Kvoter för beredning av jodixanoldensitetsgradientbuffertar. Tabellen gav förhållandet 0,02 M HEPES-buffert och 50 % jodixanolarbetslösning för att erhålla en viss koncentration av jodixanollösning.
| F1 (F1) | F2 | F3 | F4 | F5 | F6 | F7 | F8 | F9 | F10 | |
| Densitet (g/ml) | 1.023 | 1.038 | 1.049 | 1.062 | 1.074 | 1.098 | 1.144 | 1.185 | 1.239 | 1.293 |
Tabell 2: Densiteten hos det jodixanolbaserade gradientcentrifugeringssystemet. Tabellen visade densiteten för varje fraktion i ett jodixanolbaserat gradientcentrifugeringssystem. Tomt kontroll: PBS-baserat gradientsystem.
| Uppifrån och ned-läge | Nedifrån och upp-läge | |
| Partikelåtervinningsgrad (%) | 24.08 | 35.69 |
| Proteinåtervinningsgrad (%) | 24.5 | 32.45 |
Tabell 3: Partikel- och proteinåtervinningsgraden för två lägen. Tabellen visade partikel- och proteinåtervinningsgraden för top-down- och bottom-up-lägena (figur 8).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bakteriella extracellulära vesiklar (BEV) är lipid-dubbelskiktsnanopartiklar som utsöndras av bakterier, som bär på en mängd proteiner, lipider, nukleinsyror och andra bioaktiva molekyler, vilket bidrar till att förmedla bakteriernas funktionella effekter20. BEV som härrör från tarmen har verifierats vara involverade i utvecklingen av sjukdomar, såsom inflammatorisk tarmsjukdom, Crohns sjukdom och kolorektal cancer, och påverkar också den allmänna ämnesomsättningen och medierar nedsatt kognitiv funktion 4,16,17,20,21,22,23,24,25,26 . För närvarande är det fortfarande en rad faktorer som begränsar erhållandet av fullständig och objektiv biologisk information om batterielvanor från tarmbakterier från mänskliga prover-avföring, bland vilka den första och främsta nyckelfrågan är hur man ska isolera batterielbilar från den komplexa värdmiljön.
De viktigaste metoderna för att isolera batterielbilar, såsom ultracentrifugering (UC), densitetsgradientcentrifugering (DGC) och storleksuteslutningskromatografi (SEC)13,14,15,16,17, har både för- och nackdelar. Svårigheterna med att avlägsna vissa störande ämnen och bristen på konsekventa driftsrutiner, vilket allvarligt påverkar en mer realistisk och heltäckande analys av batterielfordon, är fortfarande utmaningar för separationsprocessen. För att lindra de oönskade effekterna av störningar har många studier 15,27,28 kombinerat två eller flera av ovanstående metoder för att uppnå separation av batterielbilar, särskilt från kroppsvätskor, men komplexa procedurer tenderar att påverka resultatens stabilitet. För batterielfordon kan skillnaden i densitet med andra föroreningar (t.ex. proteinaggregat, lipidkomponenter, eukaryota extracellulära vesiklar (EEV)15) bli en särskild isoleringsmetod nuförtiden.
För närvarande har jodixanol dykt upp som det föredragna mediet för densitetsgradientseparation av EV, och ersätter sackaros på grund av dess isotoniska egenskaper. Dessa egenskaper bidrar till att bevara EV-morfologin och underlätta densitetsuppskattning för varje fraktion29. I linje med Tulkens et al 15 antog vår studie en identisk koncentration för DGC-systemet, med användning av jodixanol vid 50 % (vikt/v), 40 % (vikt/v), 20 % (vikt/v),10 % (vikt/v) och 0 % koncentrationsgradientskikt. Det första steget innebar användning av HEPES-buffert för att bereda olika koncentrationer av jodixanollösningar. Jämfört med Tris (-EDTA)-sackarosbuffert säkerställer en lämplig koncentration av HEPES-buffert långsiktig pH-stabilitet i centrifugeringssystemet, tack vare dess inneboende egenskaper. Samtidigt användes steril PBS-buffert i det översta lagret av centrifugeringssystemet, inte bara för att skydda mot potentiell kontaminering av bakterier och deras metaboliter under beredning av lösningen utan också för att bibehålla provbuffertkonsistensen före och efter DGC. Detta innebar att pelleten återsuspenderades med PBS-buffert efter UC och ersattes med jodixanol med PBS efter DGC, vilket underlättade en jämförande analys av resultaten. Dessutom kalibrerades volymen för varje gradientskikt inom DGC-systemet till 3 ml, 3 ml, 3 ml, 3 ml och 3,5 ml för 50 %, 40 %, 20 %, 10 % respektive 0 % (PBS-skikt) jodixanollösningar. Denna strategi hjälper till att etablera ett relativt bredare densitetsintervall (1,02-1,30 g/ml), vilket potentiellt förbättrar separationen av BEV från andra störande element, vilket gör gradienterna tillämpliga på andra kroppsvätskor med komplex förorening.
Det är viktigt att betona att vissa steg i protokollet är avgörande. Utspädningsfaktorn som beskrivs i steg 2.2, där 1 g fekala prover blandas med minst 10 ml PBS, är avgörande för att förhindra övermättnad och bevara experimentella resurser. Under dessa förhållanden ökar partikel- och proteinkoncentrationen i allmänhet proportionellt med fekalmassan i ett prov, förutsatt att andra fekala egenskaper är konstanta. Vid behov kan ytterligare analys med hänsyn till faktorer som konsistens, lipoprotein eller blodhalt genomföras. Under steg 3.4 bör försiktighet iakttas för att undvika att hälla lösningen direkt, eftersom detta kan störa pelleten, vilket kan orsaka att större granulat blockerar membranet i 0.22 μm-filtret. Om filtret snabbt blir mättat (t.ex. om mindre än 10 ml passerar genom ett filter), rekommenderas ytterligare ett centrifugeringssteg vid 12 000 × g . I samband med densitetsgradientcentrifugering är exakt beredning av gradientlösningar en förutsättning för tillförlitliga resultat. Dessutom är noggrann manipulation av röret vid skiktning av de övre lösningarna med låg densitet avgörande för att förhindra störningar i skiktningen, och eventuella bubblor måste elimineras genom uppmärksam pipettering. Slutligen, när du aspirerar fraktionerna, är det viktigt att dra av dem noggrant längs rörväggen och undvika över- eller underaspiration som kan leda till felaktig BEV-fördelning. Regelbunden observation av vätskenivån och konsekvent praxis kan hjälpa till att mildra detta problem.
Denna studie bestämde de BEV-anrikade fraktionerna (F6-F8) med hjälp av flera karakteriseringsmetoder och utforskade två distinkta gradientultracentrifugeringslägen: Top-down och Bottom-up. Genom mätning av protein- och partikelkoncentration i F4-F8 (figur 3) och jämförelse av återvinningsgrader och renhet (figur 8 och figur 10) observerades att centrifugeringsmetoden nedifrån och upp gav högre detekterade värden på både protein- och partikelnivå än den alternativa metoden för att isolera och rena batterielbilar från fekala prover. Denna observation implicerar olika dynamiska processer. En hypotes föreslogs att icke-vesikulära extracellulära nanopartiklar (NVEP)29, såsom lipoproteiner, med lägre densitet än BEV, kanske inte når sin flytdensitet om proverna är bottenladdade (figur 6), vilket kan orsaka en uppblåst återvinningsgrad, även efter 15 timmar av DGC (figur 9). Denna observation gör det nödvändigt att överväga om den traditionella renhetsdefinitionen, baserad på förhållandet mellan partiklar och proteiner, är tillämplig. Dessutom är det värt att notera att EEV uppvisade övervikt inom F5, medan BEV hade en framträdande plats i F6–F7 (figur 4 och figur 5). Det är värt att notera att denna differentiering tycktes accentueras när man antog Top-down-läget. Därför kan det här läget vara mer lämpligt för det här protokollet. Det är dock viktigt att betona förekomsten av integrin β1 inom F6, vilket kan beteckna den inneboende heterogeniteten bland EEV. När man tillämpar denna metod på andra kroppsvätskor som blod och urin bör forskare ta hänsyn till provernas unika egenskaper. Centrifugeringstiden som definieras i detta protokoll är 7 timmar, betydligt kortare än den varaktighet som anges i andra studier, som kan vara så lång som 18 timmar. Jämfört med proteinåtervinning med en varaktighet på 15 timmar utförd i samma mönster i denna studie (figur 9), verkar denna tid vara tillräcklig för att uppnå den erforderliga separationsrenheten. Under dessa driftsförhållanden nådde partikelåtervinningen i Top-down-läget upp till 10 8 (4,5 × 10 7-1,5 × 108) per milligram avföring, i linje med tidigare rapporter (1011 BEV per gram våt avföring)15,29,30. Slutligen bekräftade densitetsmätningar av varje fraktion från blindkontrollen att densiteten hos batterielbilar varierade mellan 1,09 och 1,19 g/ml, vilket överensstämmer med tidigare forskning.
Denna metod, även om den är effektiv, utgör en begränsning på grund av inverkan av kost, tarmfunktion och andra faktorer på avföringssammansättningen. Dessa variabler kan förändra fekal konsistens, vilket kan påverka bakteriemängden och BEV-återhämtningen. Därför är det viktigt att standardisera isoleringen och reningen av BEV31,32, med justeringar baserade på bedömningen av fekala egenskaper. Framtida forskning bör fokusera på att identifiera en standard för att normalisera BEV-utbytet, besläktad med urinkreatinin eller urinflödeshastighet. Ett sådant riktmärke skulle kunna förbättra den metodologiska bedömningen och belysa kopplingen mellan fekala batterielbilar och kroppens fysiologiska och patologiska tillstånd. Dessutom understryker det starka sambandet mellan fekala BEV och olika sjukdomar deras betydande kliniska potential. Centrifugeringstiden som anges i detta protokoll uppfyller dock inte kravet på bekvämare och snabbare testning som krävs av kliniker. Därför behövs ytterligare undersökningar för att avgöra om kortare centrifugeringstider, kanske mindre än 3 timmar, kan ge likvärdiga resultat. Ytterligare utforskning behövs också för att förstå de händelser som inträffar i båda centrifugeringslägena. Även om det antas att icke-vesikulära komponenter är mer anrikade i F6-F8 i bottom-up-läge, kan raffinering av gradientkoncentrationer visa sig vara fördelaktigt för att identifiera ytterligare subtyper med specifika funktioner.
Denna studie visade framgångsrikt isolering och rening av batterielbilar från mänsklig avföring med hjälp av DGC. Strategin är lovande för tillämpning på andra biologiska prover, såsom blod, urin och saliv, vilket ger forskare ett effektivt tillvägagångssätt för att avslöja BEV:s dolda information, vilket potentiellt kan främja kliniska tillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna redovisar inga motstridiga intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Science Fund for Distinguished Young Scholars (82025024); Nyckelprojektet för Kinas nationella naturvetenskapliga stiftelse (82230080). Kinas nationella viktiga FoU-program (2021YFA1300604); Kinas nationella naturvetenskapliga stiftelse (81871735, 82272438 och 82002245); Guangdongs naturvetenskapliga fond för framstående unga forskare (2023B1515020058); Naturvetenskapliga stiftelsen i provinsen Guangdong (2021A1515011639). det stora statliga programmet för utveckling av grundforskning vid Natural Science Foundation i Shandongprovinsen i Kina (ZR2020ZD11); Stiftelsen för postdoktoral vetenskap (2022M720059). Outstanding Youths Development Scheme of Nanfang Hospital, Southern Medical University (2022J001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 % (w/v) glutaraldehyde (prepared from 2.5 % stock solution in deionized water) | ACMEC | AP1126 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.3 |
| 1 % (w/v) methylcellulose (prepared from original powder in deionized water) | Sigma-Aldrich | M7027 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.6 |
| 1.5 % (w/v) uranyl acetate (prepared from original powder in deionized water) | Polysciences | 21447-25 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.5 |
| 1000 μL, 200 μL, 10 μL Pipette | KIRGEN | KG1313, KG1212, KG1011 | Transfer the solution |
| 5 % (w/v) bovine serum albumin solution (prepared from the original powder in TBST buffer) | Fdbio science | FD0030 | Used in western blotting for blocking at Step 8.5.6 |
| 5 × loading buffer | Fdbio science | FD006 | Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5.1 |
| 75 % (v/v) alcohol | LIRCON | LIRCON-500 mL | Surface disinfection |
| 96-well plate | Rar | A8096 | Measure the absorbance values |
| Anti-Calnexin antibody | Abcam | ab92573 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-CD63 antibody | Abcam | ab134045 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-CD9 antibody | Abcam | ab236630 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-Flagellin antibody | Sino Biological | 40067-MM06 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-Integrin beta 1 antibody | Abcam | ab30394 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-LPS antibody | Thermo Fisher | MA1-83152 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-LTA antibody | Thermo Fisher | MA1-7402 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-OmpA antibody | CUSABIO | CSB-PA359226ZA01EOD, https://www.cusabio.com/ | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-Syntenin antibody | Abcam | ab133267 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-TSG101 antibody | Abcam | ab125011 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Autoclave | ZEALWAY | GR110DP | Sterilization for supplies and mediums used in the experiment |
| Balance | Mettler Toledo | AL104 | Balance the tube sample-loaded with PBS |
| Bicinchoninic acid assay | Fdbio science | FD2001 | Measure protein content of BEVs at Step 8.2 |
| BioRender | BioRender | https://app.biorender.com | Make the schematic workflow of BEVs isolation and purification showed in Figure 1 |
| Biosafety cabinet | Haier | HR1200- II B2 | Peform the procedures about feces sample handling |
| Centrifuge 5810 R; Rotor F-34-6-38 | Eppendorf | 5805000092; 5804727002, adapter: 5804774000 | Preprocess for BEVs (Step 3) |
| Chemiluminescence Apparatus | BIO-OI | OI600SE-MF | Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12 |
| Cytation 5 | BioTek | F01 | Microplate detector for measuring the absorbance (Step 8.1) and fluorescence (Figure 6) values |
| Dil-labled low density lipoprotein | ACMEC | AC12038 | Definition of distribution of interfering components |
| Electrophoresis equipment | Bio-rad | 1658033 | Used in western blotting for protein separation and transfer at Step 8.5.2, 8.5.3, 8.5.5 |
| Enhanced Chemiluminescence kit HRP | Fdbio science | FD8020 | Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12 |
| Escherichia coli | American Type Culture Collection | ATCC8739 | Isolate BEVs as a positive control. Protocol: Dissolve 25 g of the LB powder in 1 L deionized water, and autoclave. Transfer the 800 μL of preserved Escherichia coli into the medium. Cultivate at 37 °C in the incubator shaker. Then centrifuge at 3, 000 × g for 20 min at 4 °C, 12, 000 × g for 30 min at 4 °C, filter the supernatant through 0.22 μm membrane, and perform ultra-speed centrifugation at 160, 000 × g for 70 min at 4 °C. Pellet defined as crude BEVs from Escherichia coli was suspended in 1.2 mL PBS (Step 3, 4). |
| Falcon tubes 50 mL | KIRGEN | KG2811 | Preprocess for BEVs (Step 3) |
| Feto Protein Staining Buffer | Absci | ab.001.50 | Coomassie brilliant blue staining at Step 8.5.4 |
| Filter paper | Biosharp | BS-TFP-070B | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 (Blotting the solution) |
| Formvar/Carbon supported copper grids | Sigma-Aldrich | TEM-FCF200CU50 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 |
| HEPES powder | Meilunbio | MB6078 | Prepare iodixanol buffers with different concentrations for density gradient centrifugation |
| HRP AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Fdbio science | FDM007 | Western blotting (Secondary Antibody) |
| HRP AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Fdbio science | FDR007 | Western blotting (Secondary Antibody) |
| Incubator shaker | Qiangwen | DHZ-L | Cultivate Escherichia coli |
| Kimwipes™ Delicate Task Wipes | Kimtech Science | 34155 | Wipe the inner wall of the ultracentrifuge tube at Step 4.15 |
| LB broth | Hopebio | HB0128 | Cultivate Escherichia coli |
| Low temperature freezer (-80 °C) | Haier | DW-86L338J | Store the samples |
| Methanol | Alalddin | M116118 | Used in western blotting for activating PVDF membrane at Step 8.5.5 |
| Micro tubes 1.5 mL | KIRGEN | KG2211 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
| Micro tubes 2 mL | KIRGEN | KG2911 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
| Micro tubes 5 mL | BBI | F610888-0001 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
| Microplate reader | Thermo Fisher | Multiskan MK3 | Measure protein content of BEVs at Step 8.2 |
| Millipore filter 0.22 μm | Merck millipore | SLGP033RB | Filtration sterilization; Material: polyethersulfone, PES |
| NaCl | GHTECH | 1.01307.040 | Density gradient centrifugation solution |
| NaOH | GHTECH | 1.01394.068 | Density gradient centrifugation solution (pH adjustment) |
| Optima™ XPN-100 | Beckman Coulter | A94469 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
| OptiPrep™ | Serumwerk Bernburg AG | 1893 | Density gradient centrifugation stock solution |
| Orbital Shaker | Youning | CS-100 | Dissolve feces at Step 2 |
| Phosphate buffered saline | Procell | PB180327 | Dissolve feces at Step 2 |
| Pipettor | Eppendorf | 3120000267, 3120000259 | Transfer the solution |
| Plastic pasteur pipette | ABCbio | ABC217003-4 | Remove supernatant in preprocessing at Step 3.4 |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes | Millipore | ISEQ00010, IPVH00010 | Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5 |
| Prefabricated polyacrylamide gel, 4–20% 15 Wells | ACE | F15420Gel | Used in western blotting for protein separation at Step 8.5.2, 8.5.3 |
| Primary antibody diluent | Fdbio science | FD0040 | Used in western blotting at Step 8.5.8 |
| Protein ladder | Fdbio science | FD0672 | Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5 |
| Rapid protein blotting solution | UBIO | UW0500 | Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5 |
| Rotor SW 32 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 369650 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
| Syringe 20 mL, 50 mL | Jetway | ZSQ-20ML, YCXWJZSQ-50 mL | Transfer buffers amd remove supernatant in preprocessing |
| TBS powder | Fdbio science | FD1021 | Used in western blotting at Step 8.5 |
| Transmission electron microscope (TEM) | Hitachi | H-7650 | Morphological observation for BEVs at Step 8.3 |
| Tween-20 | Fdbio science | FD0020 | Used in western blotting at Step 8.5 |
| Ultracentrifuge tube | Beckman | 326823, 355642 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
| Ultra-clean bench | AIRTECH | SW-CJ-2FD | Peform the procedures about liquid handling |
| Water bath | Bluepard | CU600 | Used for measuring protein content of BEVs at Step 8.2.5 |
| ZetaView | Particle Metrix | S/N 21-734, Software ZetaView (version 8.05.14 SP7) | Nanoparticle tracking analysis (NTA) for measuring the particle size and concentrarion of BEVs at Step 8.4 |
References
- Costello, E. K., et al. Bacterial community variation in human body habitats across space and time. Science. 326 (5960), 1694-1697 (2009).
- Greenhalgh, K., Meyer, K. M., Aagaard, K. M., Wilmes, P. The human gut microbiome in health: establishment and resilience of microbiota over a lifetime. Environmental Microbiology. 18 (7), 2103-2116 (2016).
- de Vos, W. M., Tilg, H., Van Hul, M., Cani, P. D. Gut microbiome and health: mechanistic insights. Gut. 71 (5), 1020-1032 (2022).
- Zhou, P., Yang, D., Sun, D., Zhou, Y. Gut microbiome: New biomarkers in early screening of colorectal cancer. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 36 (5), 24359 (2022).
- Paik, D., et al. Human gut bacteria produce Τ(Η)17-modulating bile acid metabolites. Nature. 603 (7903), 907-912 (2022).
- Parada Venegas, D., et al. Short chain fatty acids (SCFAs)-mediated gut epithelial and immune regulation and its relevance for inflammatory bowel diseases. Frontiers in Immunology. 10, 277 (2019).
- Jiang, C., Li, G., Huang, P., Liu, Z., Zhao, B. The Gut microbiota and Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 58 (1), 1-15 (2017).
- Morais, L. H., Schreiber, H. L. t, Mazmanian, S. K. The gut microbiota-brain axis in behaviour and brain disorders. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 241-255 (2021).
- Kim, J. H., Lee, J., Park, J., Gho, Y. S. Gram-negative and Gram-positive bacterial extracellular vesicles. Seminars in Cell and Developmental Biology. 40, 97-104 (2015).
- Toyofuku, M., Nomura, N., Eberl, L. Types and origins of bacterial membrane vesicles. Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 13-24 (2019).
- Xie, J., Li, Q., Haesebrouck, F., Van Hoecke, L., Vandenbroucke, R. E. The tremendous biomedical potential of bacterial extracellular vesicles. Trends in Biotechnology. 40 (10), 1173-1194 (2022).
- Coumans, F. A. W., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).
- Northrop-Albrecht, E. J., Taylor, W. R., Huang, B. Q., Kisiel, J. B., Lucien, F. Assessment of extracellular vesicle isolation methods from human stool supernatant. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (4), 12208 (2022).
- Park, Y. E., et al. Microbial changes in stool, saliva, serum, and urine before and after anti-TNF-α therapy in patients with inflammatory bowel diseases. Scientific Reports. 12 (1), 6359 (2022).
- Tulkens, J., De Wever, O., Hendrix, A. Analyzing bacterial extracellular vesicles in human body fluids by orthogonal biophysical separation and biochemical characterization. Nature Protocols. 15 (1), 40-67 (2020).
- Tulkens, J., et al. Increased levels of systemic LPS-positive bacterial extracellular vesicles in patients with intestinal barrier dysfunction. Gut. 69 (1), 191-193 (2020).
- Kang, C. S., et al. Extracellular vesicles derived from gut microbiota, especially Akkermansia muciniphila, protect the progression of dextran sulfate sodium-induced colitis. PloS one. 8 (10), 76520 (2013).
- Simonsen, J. B. What are we looking at? Extracellular vesicles, lipoproteins, or both. Circulation Research. 121 (8), 920-922 (2017).
- Correll, V. L., et al. Optimization of small extracellular vesicle isolation from expressed prostatic secretions in urine for in-depth proteomic analysis. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12184 (2022).
- Liang, X., et al. Gut bacterial extracellular vesicles: important players in regulating intestinal microenvironment. Gut Microbes. 14 (1), 2134689 (2022).
- Alberti, G., et al. Extracellular vesicles derived from gut microbiota in inflammatory bowel disease and colorectal cancer. Biomedical papers of the Medical Faculty of the University Palacky, Olomouc, Czech Republic. 165 (3), 233-240 (2021).
- Díez-Sainz, E., Milagro, F. I., Riezu-Boj, J. I., Lorente-Cebrián, S. Effects of gut microbiota-derived extracellular vesicles on obesity and diabetes and their potential modulation through diet. Journal of Physiology and Biochemistry. 78 (2), 485-499 (2022).
- Lajqi, T., et al. Gut microbiota-derived small extracellular vesicles endorse memory-like inflammatory responses in murine neutrophils. Biomedicines. 10 (2), 442 (2022).
- Lee, K. E., et al. The extracellular vesicle of gut microbial Paenalcaligenes hominis is a risk factor for vagus nerve-mediated cognitive impairment. Microbiome. 8 (1), 107 (2020).
- Villard, A., Boursier, J., Andriantsitohaina, R. Bacterial and eukaryotic extracellular vesicles and nonalcoholic fatty liver disease: new players in the gut-liver axis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 320 (4), G485-G495 (2021).
- Wei, S., et al. Outer membrane vesicles enhance tau phosphorylation and contribute to cognitive impairment. Journal of Cellular Physiology. 235 (5), 4843-4855 (2020).
- Bitto, N. J., Kaparakis-Liaskos, M. Methods of bacterial membrane vesicle production, purification, quantification, and examination of their immunogenic functions. Methods in Molecular Biology. 2523, 43-61 (2022).
- Stentz, R., Miquel-Clopés, A., Carding, S. R. Production, isolation, and characterization of bioengineered bacterial extracellular membrane vesicles derived from Bacteroides thetaiotaomicron and their use in vaccine development. Methods in Molecular Biology. 2414, 171-190 (2022).
- Zhang, Q., Jeppesen, D. K., Higginbotham, J. N., Franklin, J. L., Coffey, R. J. Comprehensive isolation of extracellular vesicles and nanoparticles. Nature Protocols. 18 (5), 1462-1487 (2023).
- Iwai, K., Minamisawa, T., Suga, K., Yajima, Y., Shiba, K. Isolation of human salivary extracellular vesicles by iodixanol density gradient ultracentrifugation and their characterizations. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 30829 (2016).
- Vandeputte, D., et al. Stool consistency is strongly associated with gut microbiota richness and composition, enterotypes and bacterial growth rates. Gut. 65 (1), 57-62 (2016).
- Wen, M., et al. Bacterial extracellular vesicles: A position paper by the Microbial Vesicles Task Force of the Chinese Society of Extracellular Vesicles. Interdisciplinary Medicine. 1, 12046 (2023).
