Summary
Qui presentiamo un protocollo di respirometria ad alta risoluzione per analizzare la bioenergetica nei moscerini della frutta mutanti PINK1B9-null. Il metodo utilizza il protocollo SUIT (Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration).
Abstract
Le malattie neurodegenerative, tra cui il morbo di Parkinson (PD), e i disturbi cellulari come il cancro sono alcuni dei disturbi che interrompono il metabolismo energetico con compromissione delle funzioni mitocondriali. I mitocondri sono organelli che controllano sia il metabolismo energetico che i processi cellulari coinvolti nella sopravvivenza e nella morte cellulare. Per questo motivo, gli approcci per valutare la funzione mitocondriale possono offrire importanti informazioni sulle condizioni cellulari nei processi patologici e fisiologici. A questo proposito, i protocolli di respirometria ad alta risoluzione (HRR) consentono di valutare l'intera funzione della catena respiratoria mitocondriale o l'attività di specifici complessi mitocondriali. Inoltre, lo studio della fisiologia mitocondriale e della bioenergetica richiede modelli trattabili geneticamente e sperimentalmente come la Drosophila melanogaster.
Questo modello presenta diversi vantaggi, come la sua somiglianza con la fisiologia umana, il suo rapido ciclo di vita, la facilità di manutenzione, l'economicità, l'elevata capacità di produzione e un numero ridotto di preoccupazioni etiche. Questi attributi lo rendono uno strumento inestimabile per sezionare processi cellulari complessi. Il presente lavoro spiega come analizzare la funzione mitocondriale utilizzando il mutante Drosophila melanogaster PINK1B9-null. Il gene pink1 è responsabile della codifica della chinasi putativa 1 indotta da PTEN, attraverso un processo riconosciuto come mitofagia, che è cruciale per la rimozione dei mitocondri disfunzionali dalla rete mitocondriale. Le mutazioni di questo gene sono state associate a una forma familiare autosomica recessiva ad esordio precoce di Parkinson. Questo modello può essere utilizzato per studiare la disfunzione mitocondriale coinvolta nella fisiopatologia del Parkinson.
Introduction
I mitocondri sono organelli cellulari che controllano importanti funzioni, tra cui la regolazione apoptotica, l'omeostasi del calcio e la partecipazione a percorsi biosintetici. Possedendo materiale genetico autonomo, sono in grado di contribuire ai processi di mantenimento e riparazione cellulare. La loro struttura ospita la catena di trasporto degli elettroni e la fosforilazione ossidativa, entrambe cruciali per l'energia cellulare 1,2,3. In particolare, il controllo dell'energia è ottenuto attraverso la produzione di adenosina trifosfato (ATP) tramite fosforilazione ossidativa (OXPHOS)2. L'interruzione del metabolismo energetico con compromissione delle funzioni mitocondriali si verifica sia nella sopravvivenza che nella morte cellulare 4,5, frequentemente associata a un'ampia gamma di patologie umane, come il cancro, e malattie neurodegenerative come il morbo di Parkinson (PD)3,6.
La malattia di Parkinson è una malattia cronica, progressiva e neurologica. La causa principale di questa malattia è la morte delle cellule cerebrali, in particolare nella substantia nigra, che sono responsabili della produzione del neurotrasmettitore dopamina, che controlla il movimento 6,7,8. La prima osservazione che collegava il parkinsonismo alla disfunzione mitocondriale è stata fatta nel 1988, in modelli sperimentali che utilizzavano tossine che inibiscono la catena respiratoria Complesso I9.
Attualmente, esistono diversi metodi per valutare la disfunzione mitocondriale 10,11,12,1 3; tuttavia, rispetto agli approcci convenzionali, la respirometria ad alta risoluzione (HRR) presenta sensibilità e vantaggi superiori 13,14. Ad esempio, i protocolli HRR consentono di valutare la funzione dell'intera catena respiratoria mitocondriale o l'attività di specifici complessi mitocondriali14,15. Le disfunzioni mitocondriali possono essere valutate in cellule intatte, mitocondri isolati o anche ex vivo 10,11,13,14.
Le disfunzioni mitocondriali sono strettamente associate a molti processi patologici e fisiologici. È quindi importante studiare la fisiologia mitocondriale e la bioenergetica utilizzando sistemi modello trattabili geneticamente e sperimentalmente. A questo proposito, la ricerca sulla Drosophila melanogaster, il moscerino della frutta, presenta diversi vantaggi. Questo modello condivide caratteristiche e processi cellulari fondamentali con gli esseri umani, tra cui l'uso del DNA come materiale genetico, organelli comuni e percorsi molecolari conservati coinvolti nello sviluppo, nell'immunità e nella segnalazione cellulare. Inoltre, i moscerini della frutta hanno un ciclo di vita rapido, una facile manutenzione, un basso costo, un'elevata produttività e meno problemi etici, costituendo così uno strumento prezioso per sezionare processi cellulari complessi 16,17,18,19,20.
Inoltre, un omologo del gene putativo chinasi 1 (pink1) indotto da PTEN è espresso in D. melanogaster. Svolge un ruolo cruciale nella rimozione dei mitocondri danneggiati attraverso il processo di mitofagia8. Nell'uomo, le mutazioni in questo gene predispongono gli individui a una forma familiare autosomica recessiva di PD associata a disfunzione mitocondriale 8,21,22,23. Di conseguenza, il moscerino della frutta è un potente modello animale per gli studi sulla fisiopatologia della malattia di Parkinson e lo screening di candidati farmaci incentrati sulla disfunzione mitocondriale e sulla bioenergetica. Pertanto, il presente lavoro spiega come analizzare la funzione mitocondriale in un modello di PD da D. melanogaster utilizzando la tecnica HRR in OROBOROS con il protocollo Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration (SUIT).
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Protocol
Abbiamo usato i ceppi w1118 (bianco) e w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 (indicato come Pink1B9) (ID FlyBase: FBgn0029891) dal centro di stoccaggio di Bloomington Drosophila (numero ID: 34749). In questo studio, i mutanti maschi di D. melanogaster PINK1B9-null sono stati confrontati con i maschi di D. melanogaster del ceppo w1118, che viene utilizzato come gruppo di controllo (background genetico). Altri parametri devono essere analizzati in concomitanza con gli esperimenti di respirometria per garantire che i moscerini abbiano il genotipo corretto (Pink1B9/Y), come le deformità del torace e i problemi di locomozione, che sono ben descritti per i moscerini mutanti pink1B9 24,25,26.
1. Animali e stabulazione
- Conservare le mosche in bottiglie di vetro contenenti 10 ml di dieta standard (lievito 1,73%, farina di soia 0,9%, farina di mais 7,3%, agar 0,5%, sciroppo di mais 7,6% e acido propionico 0,48%) a temperatura e umidità costanti (rispettivamente 25 °C e 60%), con un ciclo luce/buio di 12 ore:12 ore.
- Per ogni esperimento, utilizzare due mosche invecchiate 1-3 giorni dopo l'eclusione.
NOTA: Le femmine vergini mutanti PINK1B9-null sono state incrociate con maschi w1118 per ottenere i maschi F1 con genotipo Pink1B9/Y.
2. Preparazione del campione
- Preparare il buffer MiR05 come descritto nella Tabella 1.
- Anestetizzare le mosche su ghiaccio e trasferirle in provette per microcentrifuga (due mosche per provetta).
- In ogni provetta, aggiungere 200 μL di tampone MiR05 refrigerato e omogeneizzare le mosche. Omogeneizzare manualmente, applicando una leggera pressione (circa 4-6 colpi del pestello) per evitare la disintegrazione dei mitocondri.
3. Calibrazione respirometrica ad alta risoluzione di sensori di ossigeno polarografici
NOTA: Le camere OROBOROS hanno un volume totale di circa 2 ml. La calibrazione è necessaria per garantire che il flusso di ossigeno sia vicino a 0 pmol per avviare il test.
- Avviando la calibrazione, aggiungere 2 mL di MiR05 alla camera. Coprire la camera con il tappo senza lasciare bolle d'aria; Quindi, tirare con cautela il tappo per formare un'unica bolla d'aria.
- Aprire il software OROBOROS Dat.Lab. Immettere una temperatura di 25 °C nel campo Temperatura blocco e fare clic su Connetti a Oxygraph-2k (Figura 1A).
- Fare clic e selezionare la cartella in cui salvare la calibrazione e fare clic su Salva.
- Quando si apre una nuova finestra, assegna un nome all'esperimento e ai campioni (se stai calibrando, inserisci semplicemente il nome calibrazione) e fai clic su Salva.
- Andare al menu Layout e scegliere la prima opzione: 01 Calibrazione Exp. Gr.3 - Temp come mostrato in Figura 1B.
- Attendere che il programma venga reindirizzato al layout di calibrazione, attendere che la linea rossa mostri una linea retta standard con punti intorno a 0 pmol. Quindi, selezionare due punti: uno per la camera A e l'altro per la camera B (Figura 1C) quando la linea rossa è esattamente a zero.
NOTA: I punti selezionati devono avere un flusso di ossigeno (linea rossa) intorno a 0.- Per contrassegnare i punti di entrambe le camere, selezionare la concentrazione di O2 a destra dello schermo, selezionare il punto contrassegnato e copiare sia i valori di temperatura che di pressione atmosferica relativi al punto. Incollare questi valori nelle caselle sottostanti e fare clic su Calibra e copia negli Appunti nell'angolo in basso a destra dello schermo, come mostrato nella Figura 2.
- Eseguire questa procedura per entrambe le camere (A e B), quindi accedere al menu File e selezionare Salva e disconnetti.
NOTA: Dopo il processo di calibrazione, il programma reindirizzerà l'utente alla schermata iniziale in modo che il software sia pronto per avviare il test HRR. Per questo test, utilizzeremo il protocollo SUIT.
4. Protocollo SUIT
- Al termine della calibrazione, rimuovere i tappi e aprire le camere.
- Lavare i tappi (tenendo la punta che non tocca il campione) e le camere con etanolo al 100%, etanolo al 70% e acqua distillata, in quest'ordine.
NOTA: Ripetere il processo per ogni cambio di campione. - Omogeneizzare le mosche in 200 μL di tampone, posizionare tutto il contenuto del campione nella camera utilizzando una micropipetta e riposizionare il tappo nella camera, facendo attenzione a non creare bolle d'aria.
NOTA: Se si formano bolle d'aria, rimuovere delicatamente il tappo e aggiungere 100 μL di tampone MIR05. - Fare clic sul menu Layout e selezionare l'opzione 05 Flusso per volume corretto, come mostrato nella Figura 1B.
- Attendi di essere reindirizzato a una nuova finestra. Fare clic su Salva per selezionare la cartella in cui salvare l'esperimento.
- Attendi l'apertura di un'altra nuova finestra. Assegna all'esperimento un nome nello spazio Codice sperimentale. Quindi, assegnare un nome a ciascun campione nelle rispettive camere A e B nel campo Campione e impostare il campo Unità su unità.
NOTA: È possibile scegliere anche altre unità, ad esempio Milioni di cellule o mg. - Considerando che questo protocollo utilizza due mosche (2 unità) e il volume della camera è di 2 mL, nel campo Concentrazione , definirne 1 per mL (Figura 1D).
NOTA: In questo caso, la quantità del campione è stata normalizzata in base al numero di mosche; tuttavia, questa normalizzazione può essere eseguita dal contenuto proteico del campione, dalla quantificazione del DNA mitocondriale o dall'attività della citrato sintasi. - Quando il segnale del flusso di ossigeno (linea rossa) è fisso sul valore positivo, avviare il protocollo HRR con la titolazione di substrati, inibitori e disaccoppiatori (Figura 3). Tutti i reagenti e le apparecchiature successive sono riportati nella Tabella 1.
- Aggiungere digitonina (5 μg/mL) per permeabilizzare la membrana mitocondriale.
- Aggiungere substrati di piruvato (5 mM), malato (2 mM) e prolina (10 mM) e attendere che il flusso di ossigeno aumenti e si stabilizzi. Per contrassegnare l'evento per ogni aggiunta di reagente, premere il tasto F4 sulla tastiera e immettere il nome di ciascun reagente.
- Aggiungere ADP (5mM) per accoppiare la catena respiratoria mitocondriale e attendere l'aumento e la stabilizzazione del flusso di ossigeno.
- Aggiungere il succinato (10 mM) e attendere l'aumento e la stabilizzazione del flusso di ossigeno.
- Aggiungi l'oligomicina (2,5 μM) per inibire l'ATP sintasi e cerca una diminuzione del flusso di ossigeno.
- Attendere che la linea rossa si stabilizzi e disaccoppiare il trasferimento di elettroni mitocondriale utilizzando il cianuro di carbonil-4-(trifluorometossi) fenilidrazone (FCCP) con titoli di 0,25 μM fino a raggiungere il massimo consumo di ossigeno, dimostrato dall'aumento della linea rossa. Dopo aver stabilizzato il flusso di ossigeno, iniziare ad aggiungere gli inibitori di ciascun complesso, uno alla volta.
- Aggiungere Rotenone (0,5 μM), un inibitore del complesso I. Attendere la diminuzione e la stabilizzazione del flusso di ossigeno per aggiungere l'inibitore successivo.
- Aggiungere malonato (5 mM), un inibitore del complesso II. Attendere la diminuzione e la stabilizzazione del flusso di ossigeno per aggiungere l'inibitore successivo.
- Infine, aggiungere l'antimicina (2,5 μM), un inibitore del complesso III. Attendere la diminuzione seguita dall'aumento e dalla stabilizzazione del flusso di ossigeno.
NOTA: Il flusso di ossigeno dovrebbe stabilizzarsi a un valore positivo ma inferiore al valore dell'ultima inibizione dei complessi proteici mitocondriali.
- Al termine dell'analisi, rimuovere tutto il contenuto delle camere utilizzando una micropipetta. Conservare a -20 °C per analisi future, se necessario.
5. Analisi dei dati
- Utilizzare un pacchetto software statistico appropriato per l'analisi dei dati.
- Eseguire test t per valutare le differenze tra i due gruppi. Per le situazioni che coinvolgono più trattamenti, utilizzare l'analisi della varianza (ANOVA) come test statistico 27.
- Estrarre i valori di flusso di O2 dal grafico generato dal software. OXPHOS CI si riferisce al valore del flusso di O2 dopo l'aggiunta di ADP. OXPHOS CII si ottiene sottraendo OXPHOS CI&CII - OXPHOS CI. OXPHOS CI&CII è il valore del flusso di O2 estratto dopo l'aggiunta di succinato. ETS CI&CII è il valore di flusso di O2 dopo l'aggiunta di FCCP. ETS CI = FCCP - Rotenone e ETS CII = Rotenone - Malonato.
- Calcolare la sintesi di ATP come differenza tra OXPHOS (P) e LEAK (L) (P - L)28.
- Determinare il Respiratory Control Ratio (RCR) calcolando il rapporto OXPHOS/LEAK, dove RCR = P/L.11
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Representative Results
Qui, abbiamo che il flusso di O2 negli stati OXPHOS CI (P = 0,0341) e OXPHOS CI&II (P = 0,0392) è ridotto nei moscerini nulli PINK1B9 rispetto ai moscerini di controllo (Figura 4). Questo risultato è stato osservato anche nei risultati precedenti del nostro gruppo29,30.
CI e CII sono componenti chiave del sistema di trasporto degli elettroni (ETS), in cui CI è responsabile del trasferimento di elettroni dal NADH all'ubichinone, mentre il CII trasferisce elettroni dal succinato all'ubichinone 31,32,33. I moscerini nulli PINK1B9 hanno mostrato un flusso di O2 inferiore negli stati ETS CI (P = 0,0338), ETS CII (P = 0,0457) e ETS CI&II (P = 0,0247) (Figura 5). Questi risultati indicano che il sistema di trasferimento degli elettroni è compromesso nei moscerini privi del gene pink1 e che il flusso di O2 in entrambi gli stadi OXPHOS ed ETS dipende da CI e CI&CII, in linea con altri lavori che dimostrano una ridotta attività di CI nei modelli pink1-/- 33,34,35.
Inoltre, il gradiente protonico attraverso la membrana interna mitocondriale è essenziale per la sintesi di ATP28. La diminuzione del flusso di O2 in ETS CI e ETS CII indica un'interruzione nel flusso di elettroni lungo l'ETS. Questa interruzione nel flusso di elettroni influisce sul processo OXPHOS portando a una ridotta sintesi di ATP. C'è stata anche una significativa diminuzione del consumo di O2 correlato alla sintesi di ATP (P = 0,0280) nei moscerini nulli PINK1B9 rispetto ai moscerini di controllo (Figura 6B). Una diminuzione della sintesi di ATP in D. melanogaster può avere effetti significativi sul metabolismo energetico, sui processi cellulari e sulle funzioni fisiologiche generali. Inoltre, l'efficienza del processo OXPHOS può essere quantificata da un indice noto come RCR, che riflette la tenuta dell'accoppiamento tra respirazione e fosforilazione. Pertanto, la riduzione dell'RCR (P = 0,0432) indica un disaccoppiamento mitocondriale, che può influenzare il processo OXPHOS, suggerendo che i mitocondri sono meno efficienti nell'utilizzare l'ossigeno e produrre ATP (Figura 6C). Questi risultati possono avere un impatto sulla crescita, lo sviluppo, la locomozione, la riproduzione e la salute generale del moscerino della frutta e contribuire alla patogenesi di alcune malattie neurodegenerative, tra cui la malattia di Parkinson 8,28,29,32.
Figura 1: Layout nel software OROBOROS Dat.Lab. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Fasi di calibrazione delle camere nel software OROBOROS Dat.Lab. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Protocollo SUIT che illustra i punti principali dell'aggiunta di substrato e inibitore. In primo luogo, viene aggiunta la digitonina (DIG) seguita da substrati specifici del complesso I: malato, piruvato e prolina (MPP), substrato dell'ATP sintasi (ADP) e quindi substrato per il complesso II: succinato (S). Successivamente, viene aggiunto l'inibitore dell'ATP sintasi: oligomicina (OMY), seguito dal disaccoppiatore Carbonil-4-(trifluorometossi) fenilidrazone cianuro (F) e dagli inibitori del complesso I, II e III: rotenone (R), malonato (MNA) e antimicina (AMA)36. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Repirometria ad alta risoluzione che confronta le mosche w1118 e PINK1B9 . (A) OXPHOS CI, (B) OXPHOS CII e (C) OXPHOS CI&CII. I dati sono presentati come media ± S.E.M. e analizzati utilizzando il t-test. n = 5-9. p < 0,05. Abbreviazioni: OXPHOS = fosforilazione ossidativa; CI = complesso I; CII = complesso II. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Respirometria ad alta risoluzione che confronta le mosche w1118 e PINK1B9 . (A) ETS CI, (B) ETS CII e (C) ETS CI&CII. I dati sono presentati come media ± S.E.M. e analizzati mediante t-test. n = 5-9. p < 0,05. Abbreviazioni: ETS = sistema di trasporto degli elettroni; CI = complesso I; CII = complesso II. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Respirometria ad alta risoluzione che confronta le mosche w1118 e PINK1B9 . (A) perdita, (b) sintesi di ATP e (C) rapporto di controllo respiratorio. I dati sono presentati come media ± S.E.M. e analizzati mediante t-test. n = 5-9. p < 0,05. Abbreviazione: RCR = rapporto di controllo respiratorio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L'HRR è una potente tecnica per studiare la respirazione mitocondriale e il metabolismo energetico in D. melanogaster e in altri organismi. Fornisce una valutazione dettagliata e quantitativa della funzione mitocondriale, consentendo ai ricercatori di ottenere informazioni sulla bioenergetica delle cellule. Il protocollo qui presentato descrive la valutazione della funzione della catena respiratoria mitocondriale e l'attività di specifici complessi mitocondriali utilizzando il protocollo SUIT in D. melanogaster. Il protocollo SUIT prevede la manipolazione sistematica di vari substrati, disaccoppiatori e inibitori per esaminare diversi aspetti della respirazione mitocondriale.
La tecnica descritta permette di valutare l'inibizione respiratoria derivante dagli effetti sull'OXPHOS o sull'ETS, sull'attività della deidrogenasi (CI e CII) e sull'integrità della membrana (accoppiamento di OXPHOS). Qui, abbiamo eseguito gli esperimenti utilizzando i moscerini PINK1B9-null per studiare la disfunzione mitocondriale poiché è associata a PD34,35. Tuttavia, questo protocollo può essere utile per diversi modelli di malattia, trattamenti farmacologici e studi tossicologici.
Inoltre, la preparazione del campione può essere adattata ai requisiti sperimentali36. Una fase fondamentale del protocollo respirometrico è la preparazione del campione. È fondamentale stabilire il protocollo corretto per il tipo di campione (cellula, mitocondri isolati, omogenato) ed è importante considerare il metodo appropriato per la normalizzazione del campione (quantità di proteine, contenuto di DNA, attività della citrato sintasi). È inoltre importante utilizzare lo stesso tampone per la preparazione del campione e il saggio di respirometria.
Poiché il protocollo di preparazione del campione qui descritto è semplice, di solito non pone problemi per la tecnica. Se si sceglie un altro tipo di campione o si modifica la sua preparazione, è necessaria un'attenta standardizzazione. L'agitazione e la stabilità della temperatura influenzano il segnale del sensore di ossigeno polarografico, generando errori nelle misurazioni respiratorie utilizzando un ossigrafo. Pertanto, la corretta taratura della camera costituisce un passo importante per ridurre gli errori durante le misurazioni respiratorie.
Questo metodo per valutare la funzione mitocondriale nei campioni di moscerini offre diversi vantaggi rispetto agli approcci alternativi. Uno dei principali punti di forza dell'HRR è la sua capacità di fornire misurazioni dirette e accurate del consumo di ossigeno, consentendo un'analisi dettagliata della funzione mitocondriale e del metabolismo cellulare. Pertanto, l'HRR è spesso utilizzato nella ricerca incentrata sulla comprensione della disfunzione mitocondriale, della produzione di energia e delle risposte cellulari a diversi substrati o condizioni. Inoltre, è versatile - consentendo l'uso di un'ampia varietà di tipi di campioni, compresi i mitocondri isolati - e richiede piccole quantità di campioni biologici, il che è utile quando la quantità di campione è limitata 1,2,3. I metodi che utilizzano isolati mitocondriali, ad esempio, coinvolgono in genere un numero considerevole di moscerini, che vanno da 50 a 200 individui, il che rende difficile lo studio con i mutanti, poiché ottenere un gran numero di mutanti per alcuni modelli di malattia potrebbe non essere pratico.
Simile al metodo HRR, l'analizzatore di flusso extracellulare Seahorse Bioscience è uno strumento scientifico utilizzato per misurare il consumo di ossigeno e l'acidificazione extracellulare. Tuttavia, hanno approcci e applicazioni diversi. L'analizzatore di flusso extracellulare Seahorse Bioscience quantifica le alterazioni istantanee del tasso di consumo di ossigeno (OCR) e del tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) delle cellule. L'OCR è indicativo della respirazione mitocondriale e della generazione di energia, mentre l'ECAR offre approfondimenti sull'attività glicolitica. La sua funzione principale risiede nella valutazione della dinamica metabolica cellulare in diverse condizioni fisiologiche, il che lo rende particolarmente utile nel chiarire le intricate modulazioni metaboliche associate a contesti patologici. Inoltre, Seahorse è progettato per la facilità d'uso, consentendo ai ricercatori di eseguire rapidi saggi metabolici 37,38,39. Al contrario, l'HRR richiede formazione e competenze specializzate per operare e analizzare i dati in modo efficace. Prevede l'uso di un elettrodo di ossigeno per misurare direttamente il consumo di ossigeno da parte delle cellule o dei mitocondri 13,14,40. Un vantaggio dell'HRR è la sua versatilità nella progettazione di diversi protocolli di respirometria, che è impraticabile quando si utilizza Seahorse. Questa versatilità nella progettazione di protocolli associati a basso costo rende il metodo HRR una scelta praticabile per i laboratori con finanziamenti limitati. Un altro svantaggio del sistema di respirometria utilizzato nel presente protocollo è l'impossibilità di lavorare con più campioni contemporaneamente, il che ostacola l'analisi ad alto rendimento. Pertanto, i gruppi sperimentali devono essere ben progettati per consentire il corretto confronto tra di loro. Tuttavia, i vantaggi di questo sistema risiedono nel fatto che possono essere analizzati campioni di qualsiasi tipo, da cellule isolate a interi organismi vivi, come C. elegans, ad esempio40.
In sintesi, l'HRR è un metodo affidabile per studiare la funzione mitocondriale in condizioni fisiologiche e patologiche41. Ogni modello sperimentale ha caratteristiche e restrizioni diverse, che richiedono aggiustamenti della metodologia e della preparazione del campione per garantire un'acquisizione affidabile e significativa dei dati nella valutazione della respirazione mitocondriale. Questo protocollo offre ai ricercatori un metodo affidabile per valutare gli effetti di fattori ambientali, interventi sperimentali o mutazioni genetiche sulla funzione mitocondriale in D. melanogaster.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi contrastanti.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano l'agenzia brasiliana Coordenação de Aperfeiçoamento de Pesquisa Pessoal de Nível Superior (CAPES EPIDEMIAS 09 #88887.505377/2020). P.M. (#88887.512821/2020-00) e T.D. (#88887.512883/2020-00) sono beneficiari di assegni di ricerca.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | Adenosine 5′-diphosphate sodium sal (CAS number 72696-48-1); ≥95%; molecular weight = 501.31 g/mol. |
| Ágar | Kasv | K25-1800 | For bacteriologal use |
| Antimycin-A | Sigma-Aldrich | A8674 | Antimycin A from Streptomyces sp. (CAS number 1397-94-0); molecular weight 540 g/mol; |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | Bovine Serum Albumin (CAS number 9048-46-8); pH 7,0 ≥ 98% |
| Datlab software | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20700 | Software for data acquisition and analysis |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D 5628 | CAS number 11024-24-1 |
| Distilled water | |||
| Drosophila melanogaster strain w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 | Obtained from Bloomington Drosophila stock center | ||
| Drosophila melanogaster strain w1118 | Obtained from the Federal University of Santa Maria | ||
| EGTA | Sigma-Aldrich | E8145 | Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (CAS number 13638-13-3); ≥97%; molecular weight =468.28 g/mol |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920 | Carbonyl cyanide 4- (trifluoromethoxy)phenylhydrazone (CAS number 370-86-5); ≥98% (TLC), powder |
| GraphPad Prism version 8.0.1. | Software for data acquisition and analysis | ||
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034 | 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (CAS number 7365-45-9); ≥99,5% (titration), cell cultured tested; molecular weight = 238.30 g/mol |
| High-resolution respirometer Oxygraph O2K | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 10022-02 | Startup O2K respirometer kit |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | Monopotassium phosphate (CAS number 7778-77-0); Reagente Plus, molecular weigt = 136.09 g/mol |
| KOH | Sigma-Aldrich | 211473 | Potassium hydroxide (CAS number 1310-58-3); ACS reagent, ≥85%, pellets |
| Malate | Sigma-Aldrich | M1296 | Malonic acid (CAS number 141-82-2); 99%, molecular weight = 104.06 g/mol). A solution is pH adjusted to approximately 7.0. |
| Malic acid | Sigma-Aldrich | M1000 | (S)-(−)-2-Hydroxysuccinic acid (CAS number 97-67-6); ≥95% ; molecular weight = 134.09 g/mol |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (CAS number 4432-31-9); ≥99% (titration); molecular weight = 195.24 g/mol |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Magnesium chloride (CAS number 7786-30-3); anhydrous, ≥98%, molecular weight = 95.21 g/mol |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | ||
| O2K-Titration Set | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20820-03 | Hamilton syringes with different volumes |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O 4876 | Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes (CAS number 1404-19-9); ≥90% total oligomycins basis (HPLC) |
| Pistil to homogenization | |||
| Proline | Sigma-Aldrich | P0380 | L-Proline (CAS number 147-85-3); powder; 99%; molecular weight = 115.13 g/mol |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Sodium pyruvate (CAS number 113-24-6), ≥99%; molecular weight = 110.04 g/mol |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | Rotetone (CAS number 83-79-4); ≥95%, molecular weight 394.42 g/ mol |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S 2378 | Sodium succinate dibasic hexahydrate (CAS number 6106-21-4); ≥99% |
| Sucrose | Merck | 107,651,000 | Sucrose for microbiology use (CAS number 57-50-1) |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | CAS number 107-35-7 |
References
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