Summary
نقدم هنا بروتوكول قياس التنفس عالي الدقة لتحليل الطاقة الحيوية في ذباب الفاكهة الطافر PINK1B9-null. تستخدم الطريقة بروتوكول الركيزة - فك التوصيل - المثبط - المعايرة (SUIT).
Abstract
الأمراض التنكسية العصبية ، بما في ذلك مرض باركنسون (PD) ، والاضطرابات الخلوية مثل السرطان هي بعض الاضطرابات التي تعطل استقلاب الطاقة مع ضعف وظائف الميتوكوندريا. الميتوكوندريا عضيات تتحكم في كل من استقلاب الطاقة والعمليات الخلوية المشاركة في بقاء الخلايا وموتها. لهذا السبب ، يمكن أن تقدم طرق تقييم وظيفة الميتوكوندريا رؤى مهمة حول الحالات الخلوية في العمليات المرضية والفسيولوجية. في هذا الصدد ، تسمح بروتوكولات قياس التنفس عالية الدقة (HRR) بتقييم وظيفة السلسلة التنفسية للميتوكوندريا بأكملها أو نشاط مجمعات الميتوكوندريا المحددة. علاوة على ذلك ، تتطلب دراسة فسيولوجيا الميتوكوندريا وعلم الطاقة الحيوية نماذج قابلة للتتبع وراثيا وتجريبيا مثل ذبابة الفاكهة الميلانوجاستر.
يقدم هذا النموذج العديد من المزايا ، مثل تشابهه مع علم وظائف الأعضاء البشرية ، ودورة حياته السريعة ، وسهولة الصيانة ، والفعالية من حيث التكلفة ، وقدرات الإنتاجية العالية ، وتقليل عدد المخاوف الأخلاقية. هذه السمات تؤسسها بشكل جماعي كأداة لا تقدر بثمن لتشريح العمليات الخلوية المعقدة. يشرح العمل الحالي كيفية تحليل وظيفة الميتوكوندريا باستخدام ذبابة الفاكهة الميلانوجاستر PINK1B9-null الطافرة. الجين pink1 مسؤول عن تشفير كيناز 1 المفترض الناجم عن PTEN ، من خلال عملية تعرف باسم mitophagy ، وهو أمر بالغ الأهمية لإزالة الميتوكوندريا المختلة وظيفيا من شبكة الميتوكوندريا. ارتبطت الطفرات في هذا الجين بشكل وراثي جسدي متنحي مبكر من مرض باركنسون. يمكن استخدام هذا النموذج لدراسة خلل الميتوكوندريا المتضمن في الفيزيولوجيا المرضية لمرض باركنسون.
Introduction
الميتوكوندريا عضيات خلوية تتحكم في وظائف مهمة، بما في ذلك التنظيم المبرمج، وتوازن الكالسيوم، والمشاركة في مسارات التخليق الحيوي. من خلال امتلاك مادة وراثية مستقلة ، فهي قادرة على المساهمة في عمليات الصيانة والإصلاح الخلوية. يحتوي هيكلها على سلسلة نقل الإلكترون والفسفرة التأكسدية ، وكلاهما ضروري للطاقة الخلوية1،2،3. على وجه الخصوص ، يتم تحقيق التحكم في الطاقة من خلال إنتاج أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) عن طريق الفسفرة التأكسدية (OXPHOS) 2. يحدث اضطراب استقلاب الطاقة مع ضعف وظائف الميتوكوندريا في كل من بقاء الخلية وموتها 4,5 ، وغالبا ما يرتبط بمجموعة واسعة من الأمراض البشرية ، مثل السرطان ، والأمراض التنكسية العصبية مثل مرض باركنسون (PD)3,6.
PD هو اضطراب مزمن وتقدمي وعصبي. السبب الرئيسي لهذا المرض هو موت خلايا المخ ، وخاصة في المادة السوداء ، المسؤولة عن إنتاج الناقل العصبي الدوبامين ، الذي يتحكم في الحركة6،7،8. تم إجراء أول ملاحظة تربط الشلل الرعاش بخلل الميتوكوندريا في عام 1988 ، في نماذج تجريبية باستخدام السموم التي تمنع السلسلة التنفسية ComplexI 9.
حاليا ، هناك عدة طرق لتقييم ضعف الميتوكوندريا10،11،12،13 ؛ ومع ذلك ، بالمقارنة مع الأساليب التقليدية ، فإن قياس التنفس عالي الدقة (HRR) يقدم حساسية ومزايا فائقة13,14. على سبيل المثال ، تسمح بروتوكولات HRR بتقييم وظيفة السلسلة التنفسية للميتوكوندريا بأكملها أو نشاط مجمعات الميتوكوندريا المحددة14,15. يمكن تقييم اختلالات الميتوكوندريا في الخلايا السليمة أو الميتوكوندريا المعزولة أو حتى خارج الجسم الحي10،11،13،14.
ترتبط اختلالات الميتوكوندريا ارتباطا وثيقا بالعديد من العمليات المرضية والفسيولوجية. لذلك من المهم دراسة فسيولوجيا الميتوكوندريا والطاقة الحيوية باستخدام أنظمة نموذجية قابلة للتتبع وراثيا وتجريبيا. في هذا الصدد ، فإن البحث عن ذبابة الفاكهة ، ذبابة الفاكهة ، له العديد من المزايا. يشترك هذا النموذج في الخصائص والعمليات الخلوية الأساسية مع البشر ، بما في ذلك استخدام الحمض النووي كمادة وراثية ، وعضيات مشتركة ، ومسارات جزيئية محفوظة تشارك في التطور والمناعة وإشارات الخلية. بالإضافة إلى ذلك ، تتمتع ذباب الفاكهة بدورة حياة سريعة ، وسهولة الصيانة ، وتكلفة منخفضة ، وإنتاجية عالية ، ومخاوف أخلاقية أقل ، مما يشكل أداة لا تقدر بثمن لتشريح العمليات الخلوية المعقدة16،17،18،19،20.
علاوة على ذلك ، يتم التعبير عن متماثل جين كيناز 1 (الوردي 1) الناجم عن PTEN في D. melanogaster. يلعب دورا حاسما في إزالة الميتوكوندريا التالفة من خلال عملية الميتوفاجي8. في البشر ، تهيئ الطفرات في هذا الجين الأفراد لشكل عائلي جسمي متنحي من مرض باركنسون المرتبط بخلل الميتوكوندريا8،21،22،23. وبالتالي ، فإن ذبابة الفاكهة هي نموذج حيواني قوي للدراسات حول الفيزيولوجيا المرضية لمرض باركنسون وفحص الأدوية المرشحة التي تركز على خلل الميتوكوندريا والطاقة الحيوية. لذلك ، يشرح العمل الحالي كيفية تحليل وظيفة الميتوكوندريا في نموذج PD من D. melanogaster باستخدام تقنية HRR في OROBOROS مع بروتوكول Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration (SUIT).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
استخدمنا السلالات w1118 (أبيض) و w [*] Pink1 [B9] / FM7i ، P {w [+ mC] = ActGFP}JMR3 (يشار إليها باسم Pink1B9) (معرف FlyBase: FBgn0029891) من مركز بلومنجتون ذبابة الفاكهة (رقم الهوية: 34749). في هذه الدراسة ، تمت مقارنة ذكور D. melanogaster PINK1B9-null مع ذكور D. melanogaster من سلالة w1118 ، والتي تستخدم كمجموعة تحكم (الخلفية الوراثية). يجب تحليل المعلمات الأخرى بالتزامن مع تجارب قياس التنفس للتأكد من أن الذباب لديه النمط الجيني الصحيح (Pink1B9 / Y) ، مثل تشوهات الصدر ومشاكل الحركة ، والتي تم وصفها جيدا للذباب الطافر الوردي 1B9 24،25،26.
1. والسكن
- احتفظ بالذباب في زجاجات زجاجية تحتوي على 10 مل من النظام الغذائي القياسي (الخميرة 1.73٪ ، دقيق الصويا 0.9٪ ، دقيق الذرة 7.3٪ ، أجار 0.5٪ ، شراب الذرة 7.6٪ ، وحمض البروبيونيك 0.48٪) في درجة حرارة ورطوبة ثابتة (25 درجة مئوية و 60٪ على التوالي) ، مع دورة ضوء / مظلمة 12 ساعة: 12 ساعة.
- لكل تجربة ، استخدم ذبابتين تتراوح أعمارهما بين 1-3 أيام بعد الإغلاق.
ملاحظة: تم تهجين إناث الذباب العذراء المتحولة PINK1B9-null مع ذكرw 1118 للحصول على ذكور F1 مع النمط الوراثي Pink1B9 / Y.
2. إعداد عينة
- قم بإعداد المخزن المؤقت MiR05 كما هو موضح في الجدول 1.
- تخدير الذباب على الجليد ونقله إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة (ذبابتان لكل أنبوب).
- في كل أنبوب ، أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت MiR05 المبرد وقم بتجانس الذباب. تجانس يدويا ، وتطبيق ضغط لطيف (حوالي 4-6 ضربات من المدقة) لمنع تفكك الميتوكوندريا.
3. معايرة قياس التنفس عالية الدقة لأجهزة استشعار الأكسجين البولاروغرافي
ملاحظة: يبلغ الحجم الإجمالي لغرف OROBOROS حوالي 2 مل. المعايرة مطلوبة للتأكد من أن تدفق الأكسجين قريب من 0 pmol لبدء الفحص.
- بدء المعايرة ، أضف 2 مل من MiR05 إلى الغرفة. قم بتغطية الغرفة بالسدادة دون ترك فقاعات هواء ؛ ثم اسحب السدادة بعناية لتشكيل فقاعة هواء واحدة.
- افتح برنامج OROBOROS Dat.Lab. أدخل درجة حرارة 25 درجة مئوية في حقل درجة حرارة الكتلة وانقر فوق الاتصال ب Oxygraph-2k (الشكل 1 أ).
- انقر وحدد المجلد الذي سيتم حفظ المعايرة فيه وانقر فوق حفظ.
- عند فتح نافذة جديدة ، قم بتسمية التجربة والعينات (في حالة المعايرة ، ما عليك سوى إدخال معايرة الاسم) والنقر فوق حفظ.
- انتقل إلى قائمة التخطيط واختر الخيار الأول: 01 Calibration Exp. Gr.3 - Temp كما هو موضح في الشكل 1B.
- انتظر حتى يقوم البرنامج بإعادة التوجيه إلى تخطيط المعايرة ، وانتظر حتى يظهر الخط الأحمر خطا مستقيما قياسيا بنقاط حوالي 0 pmol. بعد ذلك ، حدد نقطتين: واحدة للغرفة A والأخرى للغرفة B (الشكل 1C) عندما يكون الخط الأحمر عند الصفر بالضبط.
ملاحظة: يجب أن تحتوي النقاط المحددة على تدفق الأكسجين (الخط الأحمر) حول 0.- لتحديد نقاط كلا المجلسين ، حدد تركيز O2 على يمين الشاشة ، وحدد النقطة المحددة ، وانسخ قيم درجة الحرارة والضغط الجوي بالنسبة للنقطة. الصق هذه القيم في المربعات أدناه وانقر فوق معايرة ونسخ إلى الحافظة في الركن الأيمن السفلي من الشاشة كما هو موضح في الشكل 2.
- نفذ هذه العملية لكلا المجلسين (A و B) ، ثم انتقل إلى قائمة "ملف " وحدد حفظ وقطع الاتصال.
ملاحظة: بعد عملية المعايرة ، سيقوم البرنامج بإعادة توجيه المستخدم إلى الشاشة الرئيسية بحيث يكون البرنامج جاهزا لبدء اختبار HRR. في هذا الاختبار ، سوف نستخدم بروتوكول SUIT.
4. بروتوكول الدعوى
- مع اكتمال المعايرة ، قم بإزالة السدادات وافتح الغرف.
- اغسل السدادات (أمسك الطرف الذي لا يلمس العينة) والغرف التي تحتوي على 100٪ إيثانول و 70٪ إيثانول وماء مقطر بهذا الترتيب.
ملاحظة: كرر العملية لكل تغيير عينة. - تجانس الذباب في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت ، ووضع كل محتوى العينة في الغرفة باستخدام ماصة صغيرة ، ونقل السدادة في الغرفة ، مع الحرص على عدم إنشاء فقاعات هواء.
ملاحظة: إذا تشكلت فقاعات هواء ، فقم بإزالة السدادة برفق وأضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت MIR05. - انقر فوق قائمة التخطيط وحدد الخيار 05 التدفق حسب الحجم المصحح كما هو موضح في الشكل 1 ب.
- انتظر حتى تتم إعادة توجيهك إلى نافذة جديدة. انقر فوق حفظ لتحديد المجلد الذي سيتم حفظ التجربة فيه.
- انتظر حتى تفتح نافذة جديدة أخرى. قم بتسمية التجربة في مساحة الكود التجريبي. بعد ذلك ، قم بتسمية كل عينة في الحجرة A و B الخاصة بها في حقل العينة ، وقم بتعيين وحدة الحقل إلى وحدة.
ملاحظة: يمكن أيضا اختيار وحدات أخرى ، على سبيل المثال ، ملايين الخلايا أو ملغ. - بالنظر إلى أن هذا البروتوكول يستخدم ذبابتين (وحدتان) وحجم الغرفة 2 مل ، في حقل التركيز ، حدد 1 لكل مل (الشكل 1 د).
ملاحظة: هنا ، تم تطبيع كمية العينة بعدد الذباب ؛ ومع ذلك ، يمكن إجراء هذا التطبيع من خلال محتوى البروتين في العينة ، أو تحديد كمية الحمض النووي للميتوكوندريا ، أو نشاط سينسيز السيترات. - عندما تكون إشارة تدفق الأكسجين (الخط الأحمر) ثابتة على القيمة الموجبة ، ابدأ بروتوكول HRR بمعايرة الركائز والمثبطات وأجهزة فك التوصيل (الشكل 3). جميع الكواشف والمعدات اللاحقة موضحة في الجدول 1.
- أضف الديجيتونين (5 ميكروغرام / مل) لنفاذية غشاء الميتوكوندريا.
- أضف ركائز البيروفات (5 mM) و malate (2 mM) والبرولين (10 mM) وانتظر حتى يزداد تدفق الأكسجين ويستقر. لوضع علامة على الحدث لكل إضافة كاشف ، اضغط على المفتاح F4 على لوحة المفاتيح وأدخل اسم كل كاشف.
- أضف ADP (5mM) لإقران سلسلة الجهاز التنفسي للميتوكوندريا وانتظر زيادة واستقرار تدفق الأكسجين.
- أضف السكسينات (10 مللي مول) وانتظر زيادة واستقرار تدفق الأكسجين.
- أضف Oligomycin (2.5 ميكرومتر) لتثبيط ATP synthase والبحث عن انخفاض في تدفق الأكسجين.
- انتظر حتى يستقر الخط الأحمر وقم بفصل نقل إلكترون الميتوكوندريا باستخدام Carbonyl-4- (ثلاثي فلورو روميثوكسي) فينيل هيدرازون سيانيد (FCCP) مع عيار 0.25 ميكرومتر حتى يتم الوصول إلى الحد الأقصى لاستهلاك الأكسجين ، كما يتضح من صعود الخط الأحمر. بعد تثبيت تدفق الأكسجين ، ابدأ في إضافة مثبطات كل مجمع ، واحدة تلو الأخرى.
- أضف روتينون (0.5 ميكرومتر) ، وهو مثبط معقد I. انتظر انخفاض واستقرار تدفق الأكسجين لإضافة المانع التالي.
- أضف Malonate (5 mM) ، وهو مثبط II معقد. انتظر انخفاض واستقرار تدفق الأكسجين لإضافة المانع التالي.
- أخيرا ، أضف Antimycin (2.5 μM) ، وهو مثبط III معقد. انتظر الانخفاض متبوعا بزيادة واستقرار تدفق الأكسجين.
ملاحظة: يجب أن يستقر تدفق الأكسجين عند قيمة موجبة ولكن أقل من قيمة التثبيط الأخير لمجمعات بروتين الميتوكوندريا.
- في نهاية التحليل ، قم بإزالة كل محتوى الغرف باستخدام ماصة صغيرة. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية للتحليل المستقبلي، عند الضرورة.
5. تحليل البيانات
- استخدام حزمة برامج إحصائية مناسبة لتحليل البيانات.
- إجراء اختبارات t لتقييم الاختلافات بين المجموعتين. بالنسبة للحالات التي تنطوي على علاجات متعددة ، استخدم تحليل التباين (ANOVA) كاختبار إحصائي 27.
- استخرج قيم تدفق O2 من الرسم البياني الذي تم إنشاؤه بواسطة البرنامج. يشير OXPHOS CI إلى قيمة تدفق O2 بعد إضافة ADP. يتم الحصول على OXPHOS CII عن طريق طرح OXPHOS CI&CII - OXPHOS CI. OXPHOS CI&CII هي قيمة تدفق O2 المستخرج بعد إضافة السكسينات. ETS CI&CII هي قيمة التدفق O2 بعد إضافة FCCP. ETS CI = FCCP - روتينون و ETS CII = روتينون - مالونات.
- احسب تخليق ATP باعتباره الفرق بين OXPHOS (P) و LEAK (L) (P - L) 28.
- أوجد نسبة التحكم في الجهاز التنفسي (RCR) عن طريق حساب النسبة OXPHOS / LEAK ، حيث RCR = P / L.11
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هنا ، نحن أن تدفق O2 في حالات OXPHOS CI (P = 0.0341) و OXPHOS CI&II (P = 0.0392) يتم تقليله في الذباب الفارغ PINK1B9 عند مقارنته بالذباب الضابط (الشكل 4). وقد لوحظت هذه النتيجة أيضا في النتائج السابقة من مجموعتنا29،30.
CI و CII هما مكونان رئيسيان لنظام نقل الإلكترونات (ETS) ، حيث يكون CI مسؤولا عن نقل الإلكترونات من NADH إلى يوبيكوينون ، بينما ينقل CII الإلكترونات من السكسينات إلى يوبيكوينون31،32،33. أظهر الذباب الفارغ PINK1B9 تدفق O2 أقل في حالات ETS CI (P = 0.0338) و ETS CII (P = 0.0457) و ETS CI&II (P = 0.0247) (الشكل 5). تشير هذه النتائج إلى أن نظام نقل الإلكترون ضعيف في الذباب الذي يفتقر إلى الجين pink1 وأن تدفق O2 في كل من مرحلتي OXPHOS و ETS يعتمد على CI و CI&CII ، بما يتفق مع الأعمال الأخرى التي تظهر انخفاض نشاط CI في نماذج pink1-/- 33،34،35.
علاوة على ذلك ، فإن تدرج البروتون عبر الغشاء الداخلي للميتوكوندريا ضروري لتخليق ATP28. يشير الانخفاض في تدفق O2 في ETS CI و ETS CII إلى حدوث اضطراب في تدفق الإلكترونات على طول ETS. يؤثر هذا الاضطراب في تدفق الإلكترونات على عملية OXPHOS مما يؤدي إلى انخفاض تخليق ATP. كان هناك أيضا انخفاض كبير في استهلاك O2 المتعلق بتوليف ATP (P = 0.0280) في الذباب الفارغ PINK1B9 عند مقارنته بالذباب الضابط (الشكل 6B). يمكن أن يكون لانخفاض تخليق ATP في D. melanogaster تأثيرات كبيرة على استقلاب الطاقة والعمليات الخلوية والوظائف الفسيولوجية الشاملة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن قياس كفاءة عملية OXPHOS من خلال مؤشر يعرف باسم RCR ، والذي يعكس ضيق الاقتران بين التنفس والفسفرة. لذلك ، يشير تقليل RCR (P = 0.0432) إلى فصل الميتوكوندريا ، مما قد يؤثر على عملية OXPHOS مما يشير إلى أن الميتوكوندريا أقل كفاءة في استخدام الأكسجين وإنتاج ATP (الشكل 6C). قد تؤثر هذه النتائج على نمو ذبابة الفاكهة وتطورها وحركتها وتكاثرها وصحتها العامة وتساهم في التسبب في بعض الأمراض التنكسية العصبية ، بما في ذلك PD8،28،29،32.
الشكل 1: التخطيطات في برنامج OROBOROS Dat.Lab. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: خطوات معايرة الغرف في برنامج OROBOROS Dat.Lab. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: بروتوكول SUIT يوضح النقاط الرئيسية لإضافة الركيزة والمانع. أولا ، يضاف الديجيتونين (DIG) متبوعا بركائز معقدة من النوع الأول: مالات ، بيروفات ، وبرولين (MPP) ، ركيزة ATP سينسيز (ADP) ، ثم ركيزة للمركب الثاني: سكسينات (S). بعد ذلك ، يضاف مثبط سينسيز ATP: oligomycin (OMY) ، يليه غير المقرنة Carbonyl-4- (ثلاثي فلورو روميثوكسي) فينيل هيدرازون سيانيد (F) ، ومثبطات I و II و III المعقدة: روتينون (R) ، مالونات (MNA) ، ومضاد الميسين (AMA) 36. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: قياس التنفس عالي الدقة الذي يقارن بين الذباب w1118 و PINK1B9 . (أ) أوكسفوس CI، (ب) أوكسفوس CII، (ج) أوكسفوس CI&CII. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± S.E.M. وتحليلها باستخدام اختبار t. ن = 5-9. ص < 0.05. الاختصارات: OXPHOS = الفسفرة التأكسدية. CI = معقد I ؛ CII = مجمع II. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: قياس التنفس عالي الدقة الذي يقارن بين الذباب w1118 و PINK1B9 . (أ) ETS CI ، (ب) ETS CII ، و (ج) ETS CI&CII. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± S.E.M. وتحليلها بواسطة اختبار t. ن = 5-9. ص < 0.05. الاختصارات: ETS = نظام نقل الإلكترون ؛ CI = معقد I ؛ CII = مجمع II. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: قياس التنفس عالي الدقة يقارن بين الذباب w1118 و PINK1B9 . أ: التسرب، ب: تخليق الأدينوسين الثلاثي الفوسفات (ATP)، ج: نسبة التحكم في التنفس. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± S.E.M. وتحليلها بواسطة اختبار t. ن = 5-9. ص < 0.05. اختصار: RCR = نسبة التحكم في التنفس. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HRR هي تقنية قوية لدراسة تنفس الميتوكوندريا واستقلاب الطاقة في D. melanogaster والكائنات الحية الأخرى. يوفر تقييما مفصلا وكميا لوظيفة الميتوكوندريا ، مما يسمح للباحثين باكتساب نظرة ثاقبة على الطاقة الحيوية للخلايا. يصف البروتوكول المقدم هنا تقييم وظيفة السلسلة التنفسية للميتوكوندريا ونشاط معقدات الميتوكوندريا المحددة باستخدام بروتوكول SUIT في D. melanogaster. يتضمن بروتوكول SUIT معالجة الركائز المختلفة ومفككات ومثبطات بشكل منهجي لفحص الجوانب المختلفة لتنفس الميتوكوندريا.
تسمح التقنية الموصوفة بتقييم تثبيط الجهاز التنفسي الناتج عن التأثيرات على OXPHOS أو ETS ، ونشاط نازعة الهيدروجين (CI و CII) ، وسلامة الغشاء (اقتران OXPHOS). هنا ، أجرينا التجارب باستخدام ذباب PINK1B9-null لدراسة خلل الميتوكوندريا لأنه مرتبط ب PD34,35. ومع ذلك ، يمكن أن يكون هذا البروتوكول مفيدا لنماذج الأمراض المختلفة والعلاجات الدوائية ودراسات السموم.
بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تكييف إعداد العينة لتناسب المتطلبات التجريبية36. خطوة حاسمة في بروتوكول قياس التنفس هي تحضير العينة. من الأهمية بمكان إنشاء البروتوكول الصحيح لنوع العينة (الخلية ، الميتوكوندريا المعزولة ، التجانس) ، ومن المهم النظر في الطريقة المناسبة لتطبيع العينة (كمية البروتين ، محتوى الحمض النووي ، نشاط سينسيز السيترات). من المهم أيضا استخدام نفس المخزن المؤقت لإعداد العينة ومقايسة قياس التنفس.
نظرا لأن بروتوكول تحضير العينة الموصوف هنا بسيط ، فإنه لا يشكل عادة مشاكل للتقنية. إذا تم اختيار نوع آخر من العينات أو تغيير تحضيره ، فمن الضروري التوحيد الدقيق. يؤثر التحريك واستقرار درجة الحرارة على إشارة مستشعر الأكسجين البولاروغرافي ، مما يؤدي إلى حدوث خطأ في قياسات الجهاز التنفسي باستخدام جهاز أوكسيجراف. لذلك ، تشكل المعايرة الصحيحة للغرفة خطوة مهمة لتقليل الأخطاء أثناء قياسات الجهاز التنفسي.
توفر هذه الطريقة لتقييم وظيفة الميتوكوندريا في عينات الذباب العديد من المزايا مقارنة بالطرق البديلة. تتمثل إحدى نقاط القوة الرئيسية في HRR في قدرته على توفير قياسات مباشرة ودقيقة لاستهلاك الأكسجين ، مما يسمح بإجراء تحليل مفصل لوظيفة الميتوكوندريا والتمثيل الغذائي الخلوي. لذلك ، غالبا ما يستخدم HRR في الأبحاث التي تركز على فهم خلل الميتوكوندريا ، وإنتاج الطاقة ، والاستجابات الخلوية للركائز أو الظروف المختلفة. علاوة على ذلك ، فهي متعددة الاستخدامات - مما يسمح باستخدام مجموعة متنوعة من أنواع العينات ، بما في ذلك الميتوكوندريا المعزولة - وتتطلب كميات صغيرة من العينات البيولوجية ، وهو أمر مفيد عندما تكون كمية العينة محدودة1،2،3. الطرق التي تستخدم عزلات الميتوكوندريا ، على سبيل المثال ، عادة ما تنطوي على عدد كبير من الذباب ، يتراوح من 50 إلى 200 فرد ، مما يجعل الدراسة مع الطفرات صعبة ، لأن الحصول على عدد كبير من الطفرات لنماذج مرضية معينة قد لا يكون عمليا.
على غرار طريقة HRR ، يعد محلل التدفق خارج الخلية Seahorse Bioscience أداة علمية تستخدم لقياس استهلاك الأكسجين والتحمض خارج الخلية. ومع ذلك ، لديهم مناهج وتطبيقات مختلفة. يحدد محلل التدفق خارج الخلية Seahorse Bioscience التغيرات الفورية في معدل استهلاك الأكسجين (OCR) ومعدل التحمض خارج الخلية (ECAR) للخلايا. يشير التعرف الضوئي على الحروف إلى تنفس الميتوكوندريا وتوليد الطاقة ، بينما يقدم ECAR نظرة ثاقبة لنشاط تحلل السكر. تكمن وظيفتها الرئيسية في تقييم ديناميكيات التمثيل الغذائي الخلوي في ظل ظروف فسيولوجية متنوعة ، مما يجعلها مفيدة بشكل خاص في توضيح التشكيلات الأيضية المعقدة المرتبطة بالسياقات المرضية. بالإضافة إلى ذلك ، تم تصميم Seahorse لسهولة الاستخدام ، مما يسمح للباحثين بإجراء فحوصات التمثيل الغذائي السريع37،38،39. في المقابل ، يتطلب HRR تدريبا متخصصا وخبرة لتشغيل البيانات وتحليلها بشكل فعال. يتضمن استخدام قطب الأكسجين لقياس استهلاك الأكسجين مباشرة بواسطة الخلايا أو الميتوكوندريا13،14،40. ميزة HRR هي تنوعها في تصميم بروتوكولات قياس التنفس المختلفة ، وهو أمر غير عملي عند استخدام Seahorse. هذا التنوع في تصميم البروتوكولات المرتبطة بالتكلفة المنخفضة يجعل طريقة HRR خيارا قابلا للتطبيق للمختبرات ذات التمويل المحدود. عيب آخر لنظام قياس التنفس المستخدم في البروتوكول الحالي هو استحالة العمل مع عدة عينات في وقت واحد ، مما يعوق التحليل عالي الإنتاجية. وبالتالي ، يجب أن تكون المجموعات التجريبية مصممة جيدا للسماح بالمقارنة الصحيحة بينها. ومع ذلك ، تكمن مزايا هذا النظام في حقيقة أنه يمكن اختبار عينات من أي نوع ، من الخلايا المعزولة إلى الكائنات الحية الكاملة ، مثل C. elegans ، على سبيل المثال40.
باختصار ، HRR هي طريقة موثوقة لدراسة وظيفة الميتوكوندريا في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية41. كل نموذج تجريبي له خصائص وقيود مختلفة ، تتطلب منهجية وتعديلات إعداد العينة لضمان الحصول على بيانات موثوقة وذات مغزى في تقييم التنفس الميتوكوندريا. يقدم هذا البروتوكول للباحثين طريقة موثوقة لتقييم آثار العوامل البيئية أو التدخلات التجريبية أو الطفرات الجينية على وظيفة الميتوكوندريا في D. melanogaster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.
Acknowledgments
يعترف المؤلفون بالوكالة البرازيلية Coordenação de Aperfeiçoamento de Pesquisa Pessoal de Nível Superior (CAPES EPIDEMIAS 09 # 88887.505377/2020). P.M. (# 88887.512821 / 2020-00) و T.D. (# 88887.512883 / 2020-00) هم من المستفيدين من الزمالة البحثية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | Adenosine 5′-diphosphate sodium sal (CAS number 72696-48-1); ≥95%; molecular weight = 501.31 g/mol. |
| Ágar | Kasv | K25-1800 | For bacteriologal use |
| Antimycin-A | Sigma-Aldrich | A8674 | Antimycin A from Streptomyces sp. (CAS number 1397-94-0); molecular weight 540 g/mol; |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | Bovine Serum Albumin (CAS number 9048-46-8); pH 7,0 ≥ 98% |
| Datlab software | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20700 | Software for data acquisition and analysis |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D 5628 | CAS number 11024-24-1 |
| Distilled water | |||
| Drosophila melanogaster strain w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 | Obtained from Bloomington Drosophila stock center | ||
| Drosophila melanogaster strain w1118 | Obtained from the Federal University of Santa Maria | ||
| EGTA | Sigma-Aldrich | E8145 | Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (CAS number 13638-13-3); ≥97%; molecular weight =468.28 g/mol |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920 | Carbonyl cyanide 4- (trifluoromethoxy)phenylhydrazone (CAS number 370-86-5); ≥98% (TLC), powder |
| GraphPad Prism version 8.0.1. | Software for data acquisition and analysis | ||
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034 | 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (CAS number 7365-45-9); ≥99,5% (titration), cell cultured tested; molecular weight = 238.30 g/mol |
| High-resolution respirometer Oxygraph O2K | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 10022-02 | Startup O2K respirometer kit |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | Monopotassium phosphate (CAS number 7778-77-0); Reagente Plus, molecular weigt = 136.09 g/mol |
| KOH | Sigma-Aldrich | 211473 | Potassium hydroxide (CAS number 1310-58-3); ACS reagent, ≥85%, pellets |
| Malate | Sigma-Aldrich | M1296 | Malonic acid (CAS number 141-82-2); 99%, molecular weight = 104.06 g/mol). A solution is pH adjusted to approximately 7.0. |
| Malic acid | Sigma-Aldrich | M1000 | (S)-(−)-2-Hydroxysuccinic acid (CAS number 97-67-6); ≥95% ; molecular weight = 134.09 g/mol |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (CAS number 4432-31-9); ≥99% (titration); molecular weight = 195.24 g/mol |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Magnesium chloride (CAS number 7786-30-3); anhydrous, ≥98%, molecular weight = 95.21 g/mol |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | ||
| O2K-Titration Set | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20820-03 | Hamilton syringes with different volumes |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O 4876 | Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes (CAS number 1404-19-9); ≥90% total oligomycins basis (HPLC) |
| Pistil to homogenization | |||
| Proline | Sigma-Aldrich | P0380 | L-Proline (CAS number 147-85-3); powder; 99%; molecular weight = 115.13 g/mol |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Sodium pyruvate (CAS number 113-24-6), ≥99%; molecular weight = 110.04 g/mol |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | Rotetone (CAS number 83-79-4); ≥95%, molecular weight 394.42 g/ mol |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S 2378 | Sodium succinate dibasic hexahydrate (CAS number 6106-21-4); ≥99% |
| Sucrose | Merck | 107,651,000 | Sucrose for microbiology use (CAS number 57-50-1) |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | CAS number 107-35-7 |
References
- Brand, M. D., Orr, A. L., Perevoshchikova, I. V., Quinlan, C. L. The role mitochondrial function and cellular bioenergetics in ageing and disease. Br J Dermatol. 169, 1-8 (2013).
- Ramaccini, D., et al. Mitochondrial function and dysfunction in dilated cardiomyopathy. Front Cell Dev Biol. 8, 624216 (2021).
- Zhunina, O. A., et al. The role of mitochondrial dysfunction in vascular disease, tumorigenesis, and diabetes. Front Mol Biosci. 8, 671908 (2021).
- Prasun, P.
- Bhatti, J. S., Bhatti, G. K., Reddy, P. H. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in metabolic disorders - A Step towards mitochondria based therapeutic strategies. Biochim Biophys Acta. 1863 (5), 1066-1077 (2017).
- Perier, C., Vila, M. Mitochondrial biology and Parkinson's disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (2), 009332 (2012).
- DeMaagd, G., Philip, A. Parkinson's disease and its management. Pharmacy and Therapeutics. 40 (8), 504-532 (2015).
- Miyazaki, N., et al. PINK1-dependent and Parkin-independent mitophagy is involved in reprogramming of glycometabolism in pancreatic cancer cells. Biochem Biophys Res Commun. 625, 167-173 (2022).
- Kopin, I. J., Markey, S. P. MPTP toxicity: implications for research in Parkinson's disease. Annual Review of Neuroscience. 11, 81-96 (1988).
- Connolly, N. M. C., et al. Guidelines on experimental methods to assess mitochondrial dysfunction in cellular models of neurodegenerative diseases. Cell Death Differ. 25 (3), 542-572 (2018).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G.
- Haynes, C. M., Fiorese, C. J., Lin, Y. -F. Evaluating and responding to mitochondrial dysfunction: The UPRmt and beyond. Trends Cell Mol Biol. 23 (7), 311-318 (2013).
- Long, Q., Huang, L., Huang, K., Yang, Q. Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from mouse heart tissues using oroboros 2k-oxygraph. Methods Mol Biol. 1966, Clifton, N.J. 237-246 (2019).
- Scheiber, D., et al. High-resolution respirometry in human endomyocardial biopsies shows reduced ventricular oxidative capacity related to heart failure. Exp Mol Med. 51 (2), 1-10 (2019).
- Krumschnabel, G., Eigentler, A., Fasching, M., Gnaiger, E. Chapter nine - use of safranin for the assessment of mitochondrial membrane potential by high-resolution respirometry and fluorometry. Methods Enzymol. 542, 163-181 (2014).
- Demir, E. The potential use of Drosophila as an in vivo model organism for COVID-19-related research: a review. Turk J Biol. 45 (4), 559-569 (2021).
- Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: a primer on the Drosophila model system. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
- McBride, S. M. J., Holloway, S. L., Jongens, T. A. Using Drosophila as a tool to identify pharmacological therapies for fragile X syndrome. Drug Discov Today Technol Technologies. 10 (1), e129-e136 (2013).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods (San Diego, Calif). 68 (1), 105-115 (2014).
- Bar, S., Prasad, M., Datta, R. Neuromuscular degeneration and locomotor deficit in a Drosophila model of mucopolysaccharidosis VII is attenuated by treatment with resveratrol). Dis Model Mech. 11 (11), (2018).
- Imai, Y. PINK1-Parkin signaling in Parkinson's disease: Lessons from Drosophila. Neurosci Res. 159, 40-46 (2020).
- Julienne, H., Buhl, E., Leslie, D. S., Hodge, J. J. L. Drosophila PINK1 and parkin loss-of-function mutants display a range of non-motor Parkinson's disease phenotypes. Neurobiol Dis. 104, 15-23 (2017).
- Biswas, S., Bagchi, A. Analysis of the structural dynamics of the mutations in the kinase domain of PINK1 protein associated with Parkinson's disease. Gene. 857, 147183 (2023).
- Koh, H., Chung, J. PINK1 and Parkin to control mitochondria remodeling. Anat Cell Biol. 43 (3), 179-184 (2010).
- Zhu, M., Li, X., Tian, X., Wu, C. Mask loss-of-function rescues mitochondrial impairment and muscle degeneration of Drosophila pink1 and parkin mutants. Hum Mol Genet. 24 (11), 3272-3285 (2015).
- Park, J., et al. Mitochondrial dysfunction in Drosophila PINK1 mutants is complemented by parkin. Nature. 441 (7097), 1157-1161 (2006).
- Dytham, C. Choosing and using statistics: a biologist's guide. , Wiley-Blackwell. Hoboken, NJ. (2011).
- Bonora, M., et al.
- Gonçalves, D. F., et al. Caffeine improves mitochondrial function in PINK1B9-null mutant Drosophila melanogaster. J Bioenerg Biomembr. 55 (1), 1-13 (2023).
- Gonçalves, D. F., et al. Mitochondrial function and cellular energy maintenance during aging in a Drosophila melanogaster model of Parkinson disease. Mitochondrion. 65, 166-175 (2022).
- Janowska, J. I., et al. Mitochondrial respiratory chain complex I dysfunction induced by N-methyl carbamate ex vivo can be alleviated with a cell-permeable succinate prodrug. Toxicol In Vitro. 65, 104794 (2020).
- Ngo, D. T. M., et al. Oxidative modifications of mitochondrial complex II are associated with insulin resistance of visceral fat in obesity. Physiol Endocrinol Metab. 316 (2), E168-E177 (2019).
- Stroud, D. A., et al. Accessory subunits are integral for assembly and function of human mitochondrial complex I. Nature. 538 (7623), 123-126 (2016).
- Senyilmaz, D., et al. Regulation of mitochondrial morphology and function by stearoylation of TFR1. Nature. 525 (7567), 124-128 (2015).
- Poddighe, S., et al. Mucuna pruriens (Velvet bean) rescues motor, olfactory, mitochondrial and synaptic impairment in PINK1B9 Drosophila melanogaster genetic model of Parkinson's disease. PloS One. 9 (10), e110802 (2014).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 810, 25-58 (2012).
- Winer, L. S. P., Wu, M. Rapid analysis of glycolytic and oxidative substrate flux of cancer cells in a microplate. PloS One. 9 (10), e109916 (2014).
- Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio Protoc. 8 (10), e2850 (2018).
- Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. Am J Physiol. Cell Physiol. 292 (1), C125-C136 (2007).
- Divakaruni, A. S., Jastroch, M. A practical guide for the analysis, standardization and interpretation of oxygen consumption measurements. Nat Metab. 4 (8), 978-994 (2022).
- Bingol, B., Sheng, M. Mechanisms of mitophagy: PINK1, Parkin, USP30 and beyond. Free Radic Biol Med. 100, 210-222 (2016).
