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Biochemistry

Análisis de la función mitocondrial en un mutante PINK1B9-nulo de Drosophila melanogaster mediante respirometría de alta resolución

Published: November 10, 2023 doi: 10.3791/65664
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2
1Laboratory of Experimental Biochemistry and Toxicology, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Center of Natural and Exact Sciences, Federal University of Santa Maria, 2Graduate Program in Biological Sciences: Toxicological Biochemistry, Federal University of Santa Maria
* These authors contributed equally

Summary

En este trabajo presentamos un protocolo de respirometría de alta resolución para analizar la bioenergética en moscas de la fruta mutantes PINK1B9-nulas. El método utiliza el protocolo Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration (SUIT).

Abstract

Las enfermedades neurodegenerativas, incluida la enfermedad de Parkinson (EP), y las alteraciones celulares como el cáncer son algunos de los trastornos que alteran el metabolismo energético con deterioro de las funciones mitocondriales. Las mitocondrias son orgánulos que controlan tanto el metabolismo energético como los procesos celulares implicados en la supervivencia y muerte celular. Por esta razón, los enfoques para evaluar la función mitocondrial pueden ofrecer información importante sobre las condiciones celulares en los procesos patológicos y fisiológicos. En este sentido, los protocolos de respirometría de alta resolución (HRR) permiten evaluar toda la función de la cadena respiratoria mitocondrial o la actividad de complejos mitocondriales específicos. Además, el estudio de la fisiología mitocondrial y la bioenergética requiere modelos genética y experimentalmente manejables como Drosophila melanogaster.

Este modelo presenta varias ventajas, como su similitud con la fisiología humana, su rápido ciclo de vida, su fácil mantenimiento, su rentabilidad, su alto rendimiento y su minimización del número de preocupaciones éticas. Estos atributos lo establecen colectivamente como una herramienta invaluable para diseccionar procesos celulares complejos. El presente trabajo explica cómo analizar la función mitocondrial utilizando el mutante PINK1B9-null de Drosophila melanogaster. El gen pink1 es responsable de codificar la quinasa putativa 1 inducida por PTEN, a través de un proceso reconocido como mitofagia, que es crucial para la eliminación de mitocondrias disfuncionales de la red mitocondrial. Las mutaciones en este gen se han asociado con una forma familiar autosómica recesiva de inicio temprano de la EP. Este modelo se puede utilizar para estudiar la disfunción mitocondrial implicada en la fisiopatología de la EP.

Introduction

Las mitocondrias son orgánulos celulares que controlan funciones importantes, incluida la regulación apoptótica, la homeostasis del calcio y la participación en las vías biosintéticas. Al poseer material genético autónomo, son capaces de contribuir a los procesos de mantenimiento y reparación celular. Su estructura alberga la cadena de transporte de electrones y la fosforilación oxidativa, ambas cruciales para la energía celular 1,2,3. En particular, el control de la energía se logra a través de la producción de trifosfato de adenosina (ATP) a través de la fosforilación oxidativa (OXPHOS)2. La alteración del metabolismo energético con deterioro de las funciones mitocondriales ocurre tanto en la supervivencia como en la muerte celular 4,5, frecuentemente asociada a una amplia gama de patologías humanas, como el cáncer, y enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Parkinson (EP)3,6.

La EP es un trastorno crónico, progresivo y neurológico. La causa principal de esta enfermedad es la muerte de las células cerebrales, especialmente en la sustancia negra, que son responsables de la producción del neurotransmisor dopamina, que controla el movimiento 6,7,8. La primera observación que relacionó el parkinsonismo con la disfunción mitocondrial se realizó en 1988, en modelos experimentales utilizando toxinas que inhiben la cadena respiratoria Complejo I9.

Actualmente, existen varios métodos para evaluar la disfunción mitocondrial 10,11,12,1 3; sin embargo, en comparación con los abordajes convencionales, la respirometría de alta resolución (HRR) presenta una sensibilidad y ventajas superiores13,14. Por ejemplo, los protocolos de HRR permiten evaluar toda la función de la cadena respiratoria mitocondrial o la actividad de complejos mitocondriales específicos14,15. Las disfunciones mitocondriales pueden evaluarse en células intactas, mitocondrias aisladas o incluso ex vivo 10,11,13,14.

Las disfunciones mitocondriales están estrechamente asociadas con muchos procesos patológicos y fisiológicos. Por lo tanto, es importante estudiar la fisiología mitocondrial y la bioenergética utilizando sistemas modelo genética y experimentalmente tratables. En este sentido, la investigación sobre Drosophila melanogaster, la mosca de la fruta, tiene varias ventajas. Este modelo comparte características y procesos celulares fundamentales con los seres humanos, incluido el uso del ADN como material genético, orgánulos comunes y vías moleculares conservadas involucradas en el desarrollo, la inmunidad y la señalización celular. Además, las moscas de la fruta tienen un ciclo de vida rápido, fácil mantenimiento, bajo costo, alto rendimiento y menos preocupaciones éticas, lo que constituye una herramienta invaluable para diseccionar procesos celulares complejos 16,17,18,19,20.

Además, un homólogo del gen de la quinasa putativa 1 (pink1) inducido por PTEN se expresa en D. melanogaster. Desempeña un papel crucial en la eliminación de mitocondrias dañadas a través del proceso de mitofagia8. En humanos, las mutaciones en este gen predisponen a los individuos a una forma familiar autosómica recesiva de EP asociada a disfunción mitocondrial 8,21,22,23. En consecuencia, la mosca de la fruta es un poderoso modelo animal para estudios sobre la fisiopatología de la EP y el cribado de candidatos a fármacos centrados en la disfunción mitocondrial y la bioenergética. Por lo tanto, en el presente trabajo se explica cómo analizar la función mitocondrial en un modelo de EP de D. melanogaster utilizando la técnica HRR en el OROBOROS con el protocolo Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration (SUIT).

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Protocol

Utilizamos las cepas w1118 (blanca) y w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 (denominada Pink1B9) (FlyBase ID: FBgn0029891) del centro de stock Bloomington Drosophila (número de identificación: 34749). En este estudio, se comparan mutantes machos de D. melanogaster PINK1B9-null con machos de D. melanogaster de la cepa w1118, que se utiliza como grupo de control (antecedentes genéticos). Otros parámetros deben ser analizados concomitantemente con los experimentos de respirometría para asegurar que las moscas tengan el genotipo correcto (Pink1B9/Y), tales como deformidades del tórax y problemas de locomoción, que están bien descritos para las moscas mutantes pink1B9 24,25,26.

1. Animales y alojamiento

  1. Mantener las moscas en frascos de vidrio que contengan 10 mL de dieta estándar (levadura 1,73%, harina de soja 0,9%, harina de maíz 7,3%, agar 0,5%, jarabe de maíz 7,6% y ácido propiónico 0,48%) a temperatura y humedad constantes (25 °C y 60%, respectivamente), con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h:12 h.
  2. Para cada experimento, utilice dos moscas de 1 a 3 días después de la eclosión.
    NOTA: Las moscas hembras vírgenes mutantes PINK1B9-nulas se cruzaron con w1118 machos para obtener los machos F1 con genotipo Pink1B9/Y.

2. Preparación de la muestra

  1. Prepare el búfer MiR05 como se describe en la Tabla 1.
  2. Anestesiar las moscas en hielo y transferirlas a tubos de microcentrífuga (dos moscas por tubo).
  3. En cada tubo, añadir 200 μL de tampón MiR05 refrigerado y homogeneizar las moscas. Homogeneizar manualmente, aplicando una presión suave (aproximadamente 4-6 golpes de mortero) para evitar la desintegración de las mitocondrias.

3. Calibración de respirometría de alta resolución de sensores polarográficos de oxígeno

NOTA: Las cámaras OROBOROS tienen un volumen total de aproximadamente 2 mL. Se requiere calibración para garantizar que el flujo de oxígeno esté cerca de 0 pmol para iniciar el ensayo.

  1. Al iniciar la calibración, agregue 2 ml de MiR05 a la cámara. Cubra la cámara con el tapón sin dejar burbujas de aire; Luego, tire con cuidado del tapón para formar una sola burbuja de aire.
  2. Abra el software OROBOROS Dat.Lab. Introduzca una temperatura de 25 °C en el campo Temperatura del bloque y haga clic en Conectar al Oxygraph-2k (Figura 1A).
  3. Haga clic y seleccione la carpeta donde se guardará la calibración y haga clic en Guardar.
  4. Cuando se abra una nueva ventana, asigne un nombre al experimento y a las muestras (si está calibrando, simplemente ingrese el nombre calibración) y haga clic en Guardar.
  5. Vaya al menú Diseño y elija la primera opción: 01 Calibración Exp. Gr.3 - Temp como se muestra en la Figura 1B.
  6. Espere a que el programa se redirija al diseño de calibración, espere hasta que la línea roja muestre una línea recta estándar con puntos alrededor de 0 pmol. A continuación, seleccione dos puntos: uno para la cámara A y otro para la cámara B (Figura 1C) cuando la línea roja esté exactamente en cero.
    NOTA: Los puntos seleccionados deben tener un flujo de oxígeno (línea roja) alrededor de 0.
    1. Para marcar los puntos de ambas cámaras, seleccione la concentración de O2 a la derecha de la pantalla, seleccione el punto marcado y copie los valores de temperatura y presión barométrica relativos al punto. Pegue estos valores en los cuadros a continuación y haga clic en Calibrar y copiar al portapapeles en la esquina inferior derecha de la pantalla, como se muestra en la Figura 2.
    2. Lleve a cabo este proceso para ambas cámaras (A y B), luego vaya al menú Archivo y seleccione Guardar y desconectar.
      NOTA: Después del proceso de calibración, el programa redirigirá al usuario a la pantalla de inicio para que el software esté listo para iniciar la prueba HRR. Para esta prueba, utilizaremos el protocolo SUIT.

4. Protocolo SUIT

  1. Una vez completada la calibración, retire los tapones y abra las cámaras.
  2. Lave los tapones (sosteniendo la punta que no toca la muestra) y las cámaras con etanol al 100%, etanol al 70% y agua destilada, en ese orden.
    NOTA: Repita el proceso para cada cambio de muestra.
  3. Homogeneizar las moscas en 200 μL de tampón, colocar todo el contenido de la muestra en la cámara con una micropipeta y reubicar el tapón en la cámara, teniendo cuidado de no crear burbujas de aire.
    NOTA: Si se forman burbujas de aire, retire el tapón suavemente y agregue 100 μL de tampón MIR05.
  4. Haga clic en el menú Diseño y seleccione la opción 05 Flujo por volumen corregido como se muestra en la Figura 1B.
  5. Espere a ser redirigido a una nueva ventana. Haga clic en Guardar para seleccionar la carpeta donde se va a guardar el experimento.
  6. Espere a que se abra otra ventana nueva. Asigne al experimento en el espacio el nombre Código experimental. A continuación, asigne a cada muestra el nombre A y B de sus respectivas cámaras en el campo Muestra y establezca el campo Unidad en unidad.
    NOTA: También se pueden elegir otras unidades, por ejemplo, Millones de células o mg.
  7. Teniendo en cuenta que este protocolo utiliza dos moscas (2 unidades) y el volumen de cámara es de 2 mL, en el campo de Concentración , defina 1 por mL (Figura 1D).
    NOTA: Aquí, la cantidad de muestra se normalizó por el número de moscas; sin embargo, esta normalización puede realizarse por el contenido proteico de la muestra, la cuantificación del ADN mitocondrial o la actividad de la citrato sintasa.
  8. Cuando la señal de flujo de oxígeno (línea roja) esté estable en el valor positivo, inicie el protocolo HRR con la valoración de sustratos, inhibidores y desacopladores (Figura 3). Todos los reactivos y equipos posteriores se muestran en la Tabla 1.
    1. Añadir digitonina (5 μg/mL) para permeabilizar la membrana mitocondrial.
    2. Agregue sustratos de piruvato (5 mM), malato (2 mM) y prolina (10 mM) y espere hasta que el flujo de oxígeno aumente y se estabilice. Para marcar el evento de cada adición de reactivo, pulse la tecla F4 del teclado e introduzca el nombre de cada reactivo.
    3. Añadir ADP (5mM) para acoplar la cadena respiratoria mitocondrial y esperar el aumento y estabilización del flujo de oxígeno.
    4. Añadir succinato (10 mM) y esperar a que aumente y se estabilice el flujo de oxígeno.
    5. Agregue oligomicina (2.5 μM) para inhibir la ATP sintasa y busque una disminución en el flujo de oxígeno.
    6. Espere hasta que la línea roja se estabilice y desacople la transferencia de electrones mitocondriales utilizando cianuro de fenilhidrazona (FCCP) de carbonil-4-(trifluorometoxi) con títulos de 0,25 μM hasta que se alcance el consumo máximo de oxígeno, demostrado por el aumento de la línea roja. Después de estabilizar el flujo de oxígeno, comience a agregar los inhibidores de cada complejo, uno a la vez.
    7. Añadir rotenona (0,5 μM), un inhibidor del complejo I. Espere a que disminuya y se estabilice el flujo de oxígeno para agregar el siguiente inhibidor.
    8. Agregue malonato (5 mM), un inhibidor del complejo II. Espere a que disminuya y se estabilice el flujo de oxígeno para agregar el siguiente inhibidor.
    9. Por último, añadir Antimicina (2,5 μM), un inhibidor del complejo III. Espere la disminución seguida del aumento y estabilización del flujo de oxígeno.
      NOTA: El flujo de oxígeno debe estabilizarse en un valor positivo pero por debajo del valor de la última inhibición de los complejos proteicos mitocondriales.
  9. Al final del análisis, elimine todo el contenido de las cámaras con una micropipeta. Almacenar a -20 °C para futuros análisis, cuando sea necesario.

5. Análisis de datos

  1. Utilice un paquete de software estadístico adecuado para el análisis de datos.
  2. Realizar pruebas t para evaluar las diferencias entre los dos grupos. Para situaciones que involucran múltiples tratamientos, utilice el Análisis de Varianza (ANOVA) como prueba estadística 27.
  3. Extraiga los valores de flujo de O2 del gráfico generado por el software. OXPHOS CI se refiere al valor del flujo deO2 después de agregar ADP. OXPHOS CII se obtiene restando OXPHOS CI&CII - OXPHOS CI. OXPHOS CI&CII es el valor del fundente deO2 extraído después de la adición de succinato. ETS CI&CII es el valor de flujo de O2 después de agregar FCCP. ETS CI = FCCP - Rotenona y ETS CII = Rotenona - Malonato.
  4. Calcular la síntesis de ATP como la diferencia entre el OXPHOS (P) y la FUGA (L) (P - L)28.
  5. Determinar el cociente de control respiratorio (RCR) calculando el cociente OXPHOS/LEAK, donde RCR = P/L.11

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Representative Results

Aquí, observamos que el flujo de O2 en los estados OXPHOS CI (P = 0.0341) y OXPHOS CI&II (P = 0.0392) se reduce en las moscas nulas PINK1B9 en comparación con las moscas de control (Figura 4). Este resultado también se observó en hallazgos previos de nuestro grupo29,30.

El CI y el CII son componentes clave del sistema de transporte de electrones (ETS), en el que el CI es responsable de la transferencia de electrones del NADH a la ubiquinona, mientras que el CII transfiere electrones del succinato a la ubiquinona 31,32,33. Las moscas nulas PINK1B9 mostraron un menor flujo deO2 en los estados ETS CI (P = 0.0338), ETS CII (P = 0.0457) y ETS CI&II (P = 0.0247) (Figura 5). Estos resultados indican que el sistema de transferencia de electrones está alterado en moscas que carecen del gen pink1 y que el flujo deO2 en las etapas OXPHOS y ETS depende de CI y CI&CII, lo que es consistente con otros trabajos que demuestran una actividad reducida de CI en modelos pink1-/- 33,34,35.

Además, el gradiente de protones a través de la membrana interna mitocondrial es esencial para la síntesis de ATP28. La disminución en el flujo de O2 en ETS CI y ETS CII indica una interrupción en el flujo de electrones a lo largo del ETS. Esta interrupción en el flujo de electrones afecta al proceso OXPHOS, lo que conduce a una reducción de la síntesis de ATP. También hubo una disminución significativa en el consumo deO2 relacionado con la síntesis de ATP (P = 0.0280) en las moscas nulas PINK1B9 en comparación con las moscas control (Figura 6B). Una disminución en la síntesis de ATP en D. melanogaster puede tener efectos significativos en el metabolismo energético, los procesos celulares y las funciones fisiológicas generales. Además, la eficiencia del proceso OXPHOS se puede cuantificar mediante un índice conocido como RCR, que refleja la estanqueidad del acoplamiento entre la respiración y la fosforilación. Por lo tanto, la reducción de RCR (P = 0.0432) indica un desacoplamiento mitocondrial, lo que puede afectar el proceso OXPHOS, lo que sugiere que las mitocondrias son menos eficientes en la utilización de oxígeno y la producción de ATP (Figura 6C). Estos resultados pueden afectar el crecimiento, el desarrollo, la locomoción, la reproducción y la salud general de la mosca de la fruta, y contribuir a la patogénesis de ciertas enfermedades neurodegenerativas, incluida la EP 8,28,29,32.

Figure 1
Figura 1: Diseños en el software OROBOROS Dat.Lab. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Pasos de calibración de cámaras en el software OROBOROS Dat.Lab. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Protocolo SUIT que muestra los puntos principales de la adición de sustratos e inhibidores. En primer lugar, se añade la digitonina (DIG), seguida de sustratos específicos del complejo I: malato, piruvato y prolina (MPP), sustrato de ATP sintasa (ADP) y, a continuación, sustrato para el complejo II: succinato (S). Posteriormente, se adiciona el inhibidor de la ATP sintasa: oligomicina (OMY), seguido del desacoplante Carbonil-4-(trifluorometoxi) cianuro de fenilhidrazona (F) e inhibidores de los complejos I, II y III: rotenona (R), malonato (MNA) y antimicina (AMA)36. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Respirometría de alta resolución comparando moscas w1118 y PINK1B9 . (A) OXPHOS CI, (B) OXPHOS CII y (C) OXPHOS CI&CII. Los datos se presentan como media ± S.E.M. y se analizan mediante la prueba t. n = 5-9. p < 0,05. Abreviaturas: OXPHOS = fosforilación oxidativa; IC = complejo I; CII = complejo II. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Respirometría de alta resolución comparando moscas w1118 y PINK1B9 . (A) ETS CI, (B) ETS CII y (C) ETS CI&CII. Los datos se presentan como media ± S.E.M. y se analizan mediante la prueba t. n = 5-9. p < 0,05. Abreviaturas: ETS = sistema de transporte de electrones; IC = complejo I; CII = complejo II. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Respirometría de alta resolución comparando moscas w1118 y PINK1B9 . (A) fuga, (B) síntesis de ATP y (C) relación de control respiratorio. Los datos se presentan como media ± S.E.M. y se analizan mediante la prueba t. n = 5-9. p < 0,05. Abreviatura: RCR = ratio de control respiratorio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

La HRR es una técnica poderosa para estudiar la respiración mitocondrial y el metabolismo energético en D. melanogaster y otros organismos. Proporciona una evaluación detallada y cuantitativa de la función mitocondrial, lo que permite a los investigadores obtener información sobre la bioenergética de las células. El protocolo presentado aquí describe la evaluación de la función de la cadena respiratoria mitocondrial y la actividad de complejos mitocondriales específicos utilizando el protocolo SUIT en D. melanogaster. El protocolo SUIT implica la manipulación sistemática de varios sustratos, desacopladores e inhibidores para examinar diferentes aspectos de la respiración mitocondrial.

La técnica descrita permite evaluar la inhibición respiratoria resultante de los efectos sobre el OXPHOS o el ETS, la actividad deshidrogenasa (CI y CII) y la integridad de la membrana (acoplamiento de OXPHOS). Aquí, realizamos los experimentos utilizando moscas PINK1B9-nulas para estudiar la disfunción mitocondrial, ya que se asocia con PD34,35. Sin embargo, este protocolo puede ser útil para diferentes modelos de enfermedad, tratamientos farmacológicos y estudios toxicológicos.

Además, la preparación de la muestra puede adaptarse a los requisitos experimentales36. Un paso crítico en el protocolo de respirometría es la preparación de la muestra. Es fundamental que se establezca el protocolo correcto para el tipo de muestra (célula, mitocondrias aisladas, homogeneizadas), y es importante considerar el método apropiado para la normalización de la muestra (cantidad de proteína, contenido de ADN, actividad de la citrato sintasa). También es importante utilizar el mismo tampón para la preparación de la muestra y el ensayo de respirometría.

Como el protocolo de preparación de muestras aquí descrito es sencillo, no suele plantear problemas para la técnica. Si se elige otro tipo de muestra o se cambia su preparación, es necesaria una estandarización cuidadosa. La agitación y la estabilidad de la temperatura afectan a la señal del sensor polarográfico de oxígeno, generando error en las mediciones respiratorias mediante oxígrafo. Por lo tanto, la correcta calibración de la cámara constituye un paso importante para reducir los errores durante las mediciones respiratorias.

Este método para evaluar la función mitocondrial en muestras de moscas ofrece varias ventajas sobre los enfoques alternativos. Una de las principales fortalezas de HRR es su capacidad para proporcionar mediciones directas y precisas del consumo de oxígeno, lo que permite un análisis detallado de la función mitocondrial y el metabolismo celular. Por lo tanto, la HRR se utiliza a menudo en investigaciones centradas en la comprensión de la disfunción mitocondrial, la producción de energía y las respuestas celulares a diferentes sustratos o condiciones. Además, es versátil, lo que permite el uso de una amplia variedad de tipos de muestras, incluidas las mitocondrias aisladas, y requiere pequeñas cantidades de muestras biológicas, lo que es útil cuando la cantidad de muestra es limitada 1,2,3. Los métodos que utilizan aislados mitocondriales, por ejemplo, suelen involucrar un número sustancial de moscas, que oscilan entre 50 y 200 individuos, lo que dificulta el estudio con mutantes, ya que la obtención de un gran número de mutantes para ciertos modelos de enfermedad puede no ser práctica.

Al igual que el método HRR, el analizador de flujo extracelular Seahorse Bioscience es una herramienta científica que se utiliza para medir el consumo de oxígeno y la acidificación extracelular. Sin embargo, tienen diferentes enfoques y aplicaciones. El analizador de flujo extracelular de Seahorse Bioscience cuantifica las alteraciones instantáneas en la tasa de consumo de oxígeno (OCR) y la tasa de acidificación extracelular (ECAR) de las células. El OCR es indicativo de la respiración mitocondrial y la generación de energía, mientras que el ECAR ofrece información sobre la actividad glucolítica. Su función principal radica en la evaluación de la dinámica metabólica celular bajo diversas condiciones fisiológicas, lo que la hace particularmente instrumental para dilucidar las intrincadas modulaciones metabólicas asociadas con contextos patológicos. Además, Seahorse está diseñado para facilitar su uso, lo que permite a los investigadores realizar ensayos metabólicos rápidos 37,38,39. Por el contrario, el HRR requiere capacitación y experiencia especializadas para operar y analizar datos de manera efectiva. Implica el uso de un electrodo de oxígeno para medir directamente el consumo de oxígeno por parte de las células o mitocondrias 13,14,40. Una ventaja de la HRR es su versatilidad en el diseño de diferentes protocolos de respirometría, lo cual es impracticable cuando se utiliza Seahorse. Esta versatilidad para diseñar protocolos asociados a un bajo coste hace que el método HRR sea una opción viable para los laboratorios con financiación limitada. Otra desventaja del sistema de respirometría utilizado en el presente protocolo es la imposibilidad de trabajar con varias muestras simultáneamente, lo que dificulta el análisis de alto rendimiento. Por lo tanto, los grupos experimentales deben estar bien diseñados para permitir la correcta comparación entre ellos. Sin embargo, las ventajas de este sistema radican en el hecho de que se pueden analizar muestras de cualquier tipo, desde células aisladas hasta organismos vivos completos, como C. elegans, por ejemplo40.

En resumen, la HRR es un método fiable para estudiar la función mitocondrial en condiciones fisiológicas y patológicas41. Cada modelo experimental tiene diferentes características y restricciones, lo que requiere ajustes en la metodología y en la preparación de la muestra para garantizar una adquisición de datos fiable y significativa en la evaluación de la respiración mitocondrial. Este protocolo ofrece a los investigadores un método fiable para evaluar los efectos de factores ambientales, intervenciones experimentales o mutaciones genéticas en la función mitocondrial de D. melanogaster.

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Disclosures

Los autores declaran no tener intereses contrapuestos.

Acknowledgments

Los autores reconocen a la agencia brasileña Coordenação de Aperfeiçoamento de Pesquisa Pessoal de Nível Superior (CAPES EPIDEMIAS 09 #88887.505377/2020). P.M. (#88887.512821/2020-00) y T.D. (#88887.512883/2020-00) son beneficiarios de becas de investigación.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ADP Sigma-Aldrich A5285 Adenosine 5′-diphosphate sodium sal (CAS number 72696-48-1); ≥95%; molecular weight = 501.31 g/mol.
Ágar Kasv K25-1800 For bacteriologal use
Antimycin-A Sigma-Aldrich A8674 Antimycin A from Streptomyces sp. (CAS number 1397-94-0); molecular weight  540 g/mol;
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A7030 Bovine Serum Albumin (CAS number 9048-46-8); pH 7,0 ≥ 98%
Datlab software Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria 20700 Software for data acquisition and analysis
Digitonin Sigma-Aldrich D 5628 CAS number 11024-24-1
Distilled water
Drosophila melanogaster strain w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 Obtained from Bloomington Drosophila stock center
Drosophila melanogaster strain w1118 Obtained  from the Federal University of Santa Maria
EGTA Sigma-Aldrich E8145 Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (CAS number 13638-13-3); ≥97%; molecular weight =468.28 g/mol
FCCP Sigma-Aldrich C2920 Carbonyl cyanide 4- (trifluoromethoxy)phenylhydrazone  (CAS number 370-86-5); ≥98% (TLC), powder 
GraphPad Prism version 8.0.1. Software for data acquisition and analysis
Hepes Sigma-Aldrich H4034 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (CAS number 7365-45-9); ≥99,5% (titration), cell cultured tested; molecular weight = 238.30 g/mol
High-resolution respirometer Oxygraph O2K Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria 10022-02 Startup O2K respirometer kit
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5379 Monopotassium phosphate (CAS number 7778-77-0); Reagente Plus, molecular weigt = 136.09 g/mol
KOH Sigma-Aldrich 211473 Potassium hydroxide (CAS number 1310-58-3); ACS reagent, ≥85%, pellets
Malate Sigma-Aldrich M1296 Malonic acid (CAS number 141-82-2); 99%, molecular weight = 104.06 g/mol). A solution is pH adjusted to approximately 7.0.
Malic acid Sigma-Aldrich M1000 (S)-(−)-2-Hydroxysuccinic acid (CAS number 97-67-6); ≥95% ; molecular weight = 134.09 g/mol
MES Sigma-Aldrich M3671 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (CAS number 4432-31-9); ≥99% (titration); molecular weight = 195.24 g/mol
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266 Magnesium chloride (CAS number 7786-30-3); anhydrous, ≥98%, molecular weight = 95.21 g/mol
Microcentrifuge tubes Eppendorf
O2K-Titration Set Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria 20820-03 Hamilton syringes with different volumes
Oligomycin Sigma-Aldrich O 4876 Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes (CAS number  1404-19-9); ≥90% total oligomycins basis (HPLC)
Pistil to homogenization
Proline Sigma-Aldrich P0380 L-Proline (CAS number 147-85-3); powder; 99%; molecular weight = 115.13 g/mol
Pyruvate Sigma-Aldrich P2256 Sodium pyruvate (CAS number 113-24-6), ≥99%; molecular weight = 110.04 g/mol
Rotenone Sigma-Aldrich R8875 Rotetone (CAS number 83-79-4); ≥95%, molecular weight 394.42 g/ mol
Succinate Sigma-Aldrich S 2378 Sodium succinate dibasic hexahydrate (CAS number 6106-21-4); ≥99%
Sucrose Merck 107,651,000 Sucrose for microbiology use (CAS number 57-50-1)
Taurine Sigma-Aldrich T0625 CAS number 107-35-7

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References

  1. Brand, M. D., Orr, A. L., Perevoshchikova, I. V., Quinlan, C. L. The role mitochondrial function and cellular bioenergetics in ageing and disease. Br J Dermatol. 169, 1-8 (2013).
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Bioquímica Número 201 función mitocondrial respirometría de alta resolución tasa de consumo de oxígeno Drosophila melanogaster
Análisis de la función mitocondrial en un mutante PINK1<sup>B9-nulo</sup> de <em>Drosophila melanogaster</em> mediante respirometría de alta resolución
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Michelotti, P., Duarte, T., Dalla… More

Michelotti, P., Duarte, T., Dalla Corte, C. L. Analyzing Mitochondrial Function in a Drosophila melanogaster PINK1B9-Null Mutant Using High-resolution Respirometry. J. Vis. Exp. (201), e65664, doi:10.3791/65664 (2023).

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