Summary
Her præsenterer vi en respirometriprotokol med høj opløsning til analyse af bioenergetik i PINK1B9-null mutante frugtfluer. Metoden anvender SUIT-protokollen (Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration).
Abstract
Neurodegenerative sygdomme, herunder Parkinsons sygdom (PD), og cellulære forstyrrelser som kræft er nogle af de lidelser, der forstyrrer energimetabolisme med forringelse af mitokondriefunktioner. Mitokondrier er organeller, der styrer både energimetabolisme og cellulære processer involveret i celleoverlevelse og død. Af denne grund kan tilgange til evaluering af mitokondriefunktion give vigtig indsigt i cellulære tilstande i patologiske og fysiologiske processer. I denne henseende tillader højopløsningsrespirometri (HRR) protokoller evaluering af hele mitokondriel respiratorisk kædefunktion eller aktiviteten af specifikke mitokondriekomplekser. Desuden kræver undersøgelse af mitokondriel fysiologi og bioenergetik genetisk og eksperimentelt håndterbare modeller som Drosophila melanogaster.
Denne model præsenterer flere fordele, såsom dens lighed med menneskelig fysiologi, dens hurtige livscyklus, nem vedligeholdelse, omkostningseffektivitet, høj gennemstrømningskapacitet og et minimeret antal etiske bekymringer. Disse attributter etablerer det kollektivt som et uvurderligt værktøj til dissekering af komplekse cellulære processer. Dette arbejde forklarer, hvordan man analyserer mitokondriefunktionen ved hjælp af Drosophila melanogaster PINK1 B9-null-mutanten. Pink1-genet er ansvarlig for kodning af PTEN-induceret formodet kinase 1 gennem en proces, der anerkendes som mitofagi, hvilket er afgørende for fjernelse af dysfunktionelle mitokondrier fra mitokondrienetværket. Mutationer i dette gen har været forbundet med en autosomal recessiv tidlig debut familiær form for PD. Denne model kan bruges til at studere mitokondriel dysfunktion involveret i patofysiologien af PD.
Introduction
Mitokondrier er cellulære organeller, der styrer vigtige funktioner, herunder apoptotisk regulering, calciumhomeostase og deltagelse i biosyntetiske veje. Ved at besidde autonomt genetisk materiale er de i stand til at bidrage til cellulære vedligeholdelses- og reparationsprocesser. Deres struktur huser elektrontransportkæden og oxidativ fosforylering, begge afgørende for cellulær energi 1,2,3. Energikontrol opnås især gennem adenosintrifosfat (ATP) produktion via oxidativ phosphorylering (OXPHOS)2. Forstyrrelse af energimetabolisme med svækkelse af mitokondriefunktioner forekommer både i celleoverlevelse og død 4,5, ofte forbundet med en lang række humane patologier, såsom kræft og neurodegenerative sygdomme såsom Parkinsons sygdom (PD)3,6.
PD er en kronisk, progressiv og neurologisk lidelse. Den primære årsag til denne sygdom er hjernecellernes død, især i substantia nigra, som er ansvarlige for produktionen af neurotransmitterdopamin, som styrer bevægelse 6,7,8. Den tidligste observation, der forbandt Parkinsonisme med mitokondriel dysfunktion, blev foretaget i 1988 i eksperimentelle modeller ved hjælp af toksiner, der hæmmer respirationskæden Complex I9.
I øjeblikket er der flere metoder til evaluering af mitokondriel dysfunktion 10,11,12,1 3; sammenlignet med konventionelle tilgange giver respirometri med høj opløsning (HRR) imidlertid overlegen følsomhed og fordele13,14. For eksempel tillader HRR-protokoller evaluering af hele mitokondrie-respirationskædefunktionen eller aktiviteten af specifikke mitokondriekomplekser14,15. Mitokondrie dysfunktioner kan vurderes i intakte celler, isolerede mitokondrier eller endda ex vivo 10,11,13,14.
Mitokondrie dysfunktioner er tæt forbundet med mange patologiske og fysiologiske processer. Det er derfor vigtigt at studere mitokondriefysiologi og bioenergetik ved hjælp af genetisk og eksperimentelt håndterbare modelsystemer. I denne henseende har forskning på Drosophila melanogaster, frugtfluen, flere fordele. Denne model deler grundlæggende cellulære egenskaber og processer med mennesker, herunder brugen af DNA som genetisk materiale, fælles organeller og bevarede molekylære veje involveret i udvikling, immunitet og cellesignalering. Derudover har bananfluer en hurtig livscyklus, nem vedligeholdelse, lave omkostninger, høj gennemstrømning og færre etiske bekymringer, hvilket udgør et uvurderligt værktøj til at dissekere komplekse cellulære processer 16,17,18,19,20.
Desuden udtrykkes en homolog af det PTEN-inducerede formodede kinase 1 (pink1) gen i D. melanogaster. Det spiller en afgørende rolle i fjernelsen af beskadigede mitokondrier gennem processen med mitofagi:8. Hos mennesker prædisponerer mutationer i dette gen individer for en autosomal recessiv familiær form af PD forbundet med mitokondriel dysfunktion 8,21,22,23. Derfor er bananfluen en stærk dyremodel til studier af patofysiologien af PD og screening af lægemiddelkandidater med fokus på mitokondriel dysfunktion og bioenergetik. Derfor forklarer dette arbejde, hvordan man analyserer mitokondriefunktion i en model af PD fra D. melanogaster ved hjælp af HRR-teknikken i OROBOROS med SUIT-protokollen (Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vi brugte stammerne w1118 (hvid) og w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 (kaldet Pink1B9) (FlyBase-id: FBgn0029891) fra Bloomington Drosophila-lagercentret (ID-nummer: 34749). I denne undersøgelse sammenlignes mandlige D. melanogaster PINK1 B9-null-mutanter med mandlige D. melanogaster fra w1118-stammen, der bruges som kontrolgruppe (genetisk baggrund). Andre parametre skal analyseres samtidig med respirometriforsøgene for at sikre, at fluerne har den korrekte genotype (Pink1B9/Y), såsom thoraxdeformiteter og bevægelsesproblemer, som er velbeskrevet for pink1B9 mutantfluer 24,25,26.
1. Dyr og opstaldning
- Opbevar fluerne i glasflasker indeholdende 10 ml standarddiæt (gær 1,73%, sojamel 0,9%, majsmel 7,3%, agar 0,5%, majssirup 7,6% og propionsyre 0,48%) ved konstant temperatur og fugtighed (henholdsvis 25 ° C og 60%) med en 12 timer: 12 timers lys / mørk cyklus.
- For hvert eksperiment skal du bruge to fluer i alderen 1-3 dage efter eclosion.
BEMÆRK: PINK1B9-null mutante jomfruelige hunfluer blev krydset med w1118 hanner for at opnå F1 hannerne med genotype Pink1B9/Y.
2. Forberedelse af prøver
- Forbered MiR05-bufferen som beskrevet i tabel 1.
- Bedøv fluerne på is og overfør dem til mikrocentrifugerør (to fluer pr. Rør).
- I hvert rør tilsættes 200 μL kølet MiR05-buffer og homogeniseres fluerne. Homogeniser manuelt, påfør let tryk (ca. 4-6 slag af støderen) for at forhindre opløsning af mitokondrier.
3. Højopløselig respirometrikalibrering af polarografiske iltsensorer
BEMÆRK: OROBOROS kamrene har et samlet volumen på ca. 2 ml. Kalibrering er nødvendig for at sikre, at iltfluxen er tæt på 0 pmol for at starte analysen.
- Start kalibreringen, tilsæt 2 ml MiR05 til kammeret. Dæk kammeret med proppen, så der ikke efterlades luftbobler; Træk derefter forsigtigt i proppen for at danne en enkelt luftboble.
- Åbn OROBOROS Dat.Lab-softwaren. Indtast en temperatur på 25 °C i feltet Bloktemperatur , og klik på Opret forbindelse til Oxygraph-2k (figur 1A).
- Klik og vælg den mappe, hvor kalibreringen skal gemmes, og klik på Gem.
- Når et nyt vindue åbnes, skal du navngive eksperimentet og prøverne (hvis du kalibrerer, skal du blot indtaste navnekalibreringen) og klikke på Gem.
- Gå til menuen Layout , og vælg den første mulighed: 01 Kalibrering Exp. Gr.3 - Temp som vist i figur 1B.
- Vent på, at programmet omdirigerer til kalibreringslayoutet, vent indtil den røde linje viser en standard lige linje med punkter omkring 0 pmol. Vælg derefter to punkter: et for kammer A og et andet for kammer B (figur 1C), når den røde linje er nøjagtigt nul.
BEMÆRK: De valgte punkter skal have iltflux (rød linje) omkring 0.- For at markere punkterne i begge kamre skal du vælge O2-koncentration til højre på skærmen, vælge det markerede punkt og kopiere både temperatur- og barometertrykværdierne i forhold til punktet. Indsæt disse værdier i felterne nedenfor, og klik på Kalibrer og kopier til udklipsholder i nederste højre hjørne af skærmen som vist i figur 2.
- Udfør denne proces for begge kamre (A og B), gå derefter til menuen Filer og vælg Gem og afbryd forbindelsen.
BEMÆRK: Efter kalibreringsprocessen omdirigerer programmet brugeren til startskærmen, så softwaren er klar til at starte HRR-testen. Til denne test bruger vi SUIT-protokollen.
4. SUIT-protokollen
- Når kalibreringen er afsluttet, fjernes propperne, og kamrene åbnes.
- Vask propperne (hold spidsen, der ikke rører prøven) og kamrene med 100% ethanol, 70% ethanol og destilleret vand i nævnte rækkefølge.
BEMÆRK: Gentag processen for hver prøveændring. - Homogeniser fluerne i 200 μL buffer, placer alt prøveindhold i kammeret ved hjælp af en mikropipette, og flyt proppen i kammeret, pas på ikke at skabe luftbobler.
BEMÆRK: Hvis der dannes luftbobler, fjernes proppen forsigtigt, og der tilsættes 100 μL MIR05-buffer. - Klik på menuen Layout , og vælg indstillingen 05 Flow efter korrigeret lydstyrke som vist i figur 1B.
- Vent på at blive omdirigeret til et nyt vindue. Klik på Gem for at vælge den mappe, hvor eksperimentet skal gemmes.
- Vent på, at et andet nyt vindue åbnes. Navngiv eksperimentet i rummet Eksperimentel kode. Navngiv derefter hver prøve i dens respektive kammer A og B i feltet Eksempel , og indstil feltet Enhed til enhed.
BEMÆRK: Andre enheder kan også vælges, for eksempel millioner af celler eller mg. - I betragtning af at denne protokol bruger to fluer (2 enheder), og kammervolumenet er 2 ml, skal du i feltet Koncentration definere 1 pr. ml (figur 1D).
BEMÆRK: Her blev prøvemængden normaliseret med antallet af fluer; denne normalisering kan imidlertid udføres af proteinindholdet i prøven, mitokondriel DNA-kvantificering eller aktivitet af citratsyntase. - Når iltfluxsignalet (rød linje) er konstant på den positive værdi, startes HRR-protokollen med titrering af substrater, inhibitorer og afkoblinger (figur 3). Alle efterfølgende reagenser og udstyr er vist i tabel 1.
- Tilsæt digitonin (5 μg / ml) for at permeabilisere mitokondriemembranen.
- Tilsæt pyruvat (5 mM), malat (2 mM) og prolin (10 mM) substrater og vent, indtil iltstrømmen øges og stabiliseres. For at markere hændelsen for hver reagenstilføjelse skal du trykke på F4-tasten på tastaturet og indtaste navnet på hvert reagens.
- Tilføj ADP (5mM) for at koble mitokondriel respirationskæde og vent på stigningen og stabiliseringen af iltfluxen.
- Tilsæt succinat (10 mM) og vent på stigningen og stabiliseringen af iltfluxen.
- Tilsæt oligomycin (2,5 μM) for at hæmme ATP-syntase og se efter et fald i iltflux.
- Vent, indtil den røde linje stabiliseres, og afkobl mitokondrieelektronoverførsel ved hjælp af carbonyl-4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazoncyanid (FCCP) med titere på 0,25 μM, indtil det maksimale iltforbrug er nået, demonstreret ved stigningen af den røde linje. Efter stabilisering af iltfluxen skal du begynde at tilføje hæmmerne af hvert kompleks, en ad gangen.
- Tilsæt rotenon (0,5 μM), en kompleks I-hæmmer. Vent på faldet og stabiliseringen af iltfluxen for at tilføje den næste hæmmer.
- Tilsæt malonat (5 mM), en kompleks II-hæmmer. Vent på faldet og stabiliseringen af iltfluxen for at tilføje den næste hæmmer.
- Til sidst tilsættes Antimycin (2,5 μM), en kompleks III-hæmmer. Vent på faldet efterfulgt af stigningen og stabiliseringen af iltfluxen.
BEMÆRK: Oxygenfluxen skal stabilisere sig ved en positiv værdi, men under værdien for den sidste hæmning af mitokondrieproteinkomplekser.
- Ved afslutningen af analysen fjernes alt indholdet af kamrene ved hjælp af en mikropipette. Opbevares om nødvendigt ved -20 °C til fremtidig analyse.
5. Analyse af data
- Brug en passende statistisk softwarepakke til dataanalyse.
- Udfør t-tests for at vurdere forskelle mellem de to grupper. I situationer, der involverer flere behandlinger, skal du bruge variansanalyse (ANOVA) som en statistisk test 27.
- UddragO2-fluxværdierne fra grafen genereret af softwaren. OXPHOS CI refererer til værdien afO2-flux efter tilsætning af ADP. OXPHOS CII opnås ved at trække OXPHOS CI&CII - OXPHOS CI. OXPHOS CI&CII er værdien afO2-flux ekstraheret efter tilsætning af succinat. ETS CI&CII erO2-fluxværdien efter tilføjelse af FCCP. ETS CI = FCCP - Rotenone og ETS CII = Rotenone - Malonate.
- Beregn ATP-syntese som forskellen mellem OXPHOS (P) og LÆKAGE (L) (P - L)28.
- Bestem respiratorisk kontrolforhold (RCR) ved at beregne forholdet OXPHOS/LEAK, hvor RCR = P/L.11
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her er vi, atO2-flux i OXPHOS CI (P = 0,0341) og OXPHOS CI&II (P = 0,0392) tilstande reduceres i PINK1B9 nullfluer sammenlignet med kontrolfluer (figur 4). Dette resultat blev også observeret i tidligere fund fra vores gruppe29,30.
CI og CII er nøglekomponenter i elektrontransportsystemet (ETS), hvor CI er ansvarlig for overførslen af elektroner fra NADH til ubiquinon, mens CII overfører elektroner fra succinat til ubiquinon 31,32,33. PINK1B9 nullfluer viste lavereO2-flux i ETS CI (P = 0,0338), ETS CII (P = 0,0457) og ETS CI&II (P = 0,0247) tilstande (figur 5). Disse resultater indikerer, at elektronoverførselssystemet er svækket i fluer, der mangler pink1-genet, ogO2-fluxen i både OXPHOS- og ETS-stadier er afhængige af CI og CI&CII, i overensstemmelse med andre værker, der viser reduceret CI-aktivitet i pink1-/- modeller 33,34,35.
Desuden er protongradienten over mitokondriets indre membran afgørende for syntesen af ATP28. Faldet iO2-flux i ETS CI og ETS CII indikerer en forstyrrelse i strømmen af elektroner langs ETS. Denne forstyrrelse i strømmen af elektroner påvirker OXPHOS-processen, hvilket fører til reduceret ATP-syntese. Der var også et signifikant fald iO2-forbruget relateret til ATP-syntese (P = 0,0280) i PINK1B9 nullfluer sammenlignet med kontrolfluer (figur 6B). Et fald i ATP syntese i D. melanogaster kan have betydelige virkninger på energi metabolisme, cellulære processer, og overordnede fysiologiske funktioner. Desuden kan effektiviteten af OXPHOS-processen kvantificeres ved hjælp af et indeks kendt som RCR, som afspejler tætheden af koblingen mellem respiration og phosphorylering. Derfor indikerer RCR-reduktion (P = 0,0432) mitokondriel afkobling, hvilket kan påvirke OXPHOS-processen, hvilket tyder på, at mitokondrierne er mindre effektive til at udnytte ilt og producere ATP (figur 6C). Disse resultater kan påvirke bananfluens vækst, udvikling, bevægelse, reproduktion og generelle sundhed og bidrage til patogenesen af visse neurodegenerative sygdomme, herunder PD 8,28,29,32.
Figur 1: Layout i OROBOROS Dat.Lab-software. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Trin til kalibrering af kamre i OROBOROS Dat.Lab-software. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: SUIT-protokol, der viser hovedpunkterne for substrat- og inhibitortilsætning. Først tilsættes digitonin (DIG) efterfulgt af komplekse I-specifikke substrater: malat, pyruvat og prolin (MPP), ATP-syntasesubstrat (ADP) og derefter substrat for kompleks II: succinat (S). Derefter tilsættes ATP-syntasehæmmeren: oligomycin (OMY) efterfulgt af afkobleren Carbonyl-4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazoncyanid (F) og komplekse I-, II- og III-hæmmere: rotenon (R), malonat (MNA) og antimycin (AMA)36. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Respirometri med høj opløsning, der sammenligner w1118 og PINK1B9 fluer. A) OXPHOS CI, B) OXPHOS CII og C) OXPHOS CII. Data præsenteres som middelværdi ± S.E.M. og analyseres ved hjælp af t-test. n = 5-9. p < 0,05. Forkortelser: OXPHOS = oxidativ phosphorylering; CI = kompleks I; CII = kompleks II. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Respirometri i høj opløsning, der sammenligner w1118 og PINK1B9 fluer. (A) ETS CI, (B) ETS CII og (C) ETS CI&CII. Data præsenteres som middelværdi ± S.E.M. og analyseres ved t-test. n = 5-9. p < 0,05. Forkortelser: ETS = elektrontransportsystem; CI = kompleks I; CII = kompleks II. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Respirometri med høj opløsning, der sammenligner w1118 og PINK1B9 fluer. (A) LÆKAGE, (B) ATP-syntese og (C) respirationskontrolforhold. Data præsenteres som gennemsnitlige ± S.E.M. og analyseres ved t-test. n = 5-9. p < 0,05. Forkortelse: RCR = respirationskontrolforhold. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HRR er en kraftfuld teknik til at studere mitokondriel respiration og energimetabolisme i D. melanogaster og andre organismer. Det giver en detaljeret og kvantitativ vurdering af mitokondriefunktionen, så forskerne kan få indsigt i cellernes bioenergetik. Protokollen, der præsenteres her, beskriver evalueringen af mitokondriel respiratorisk kædefunktion og aktiviteten af specifikke mitokondriekomplekser ved anvendelse af SUIT-protokollen i D. melanogaster. SUIT-protokollen involverer systematisk manipulation af forskellige substrater, afkoblinger og hæmmere for at undersøge forskellige aspekter af mitokondriel respiration.
Den beskrevne teknik gør det muligt at vurdere respirationshæmning som følge af virkninger på OXPHOS eller ETS, dehydrogenaseaktivitet (CI og CII) og membranintegritet (kobling af OXPHOS). Her udførte vi eksperimenterne med PINK1B9-null fluer til at studere mitokondriel dysfunktion, da det er forbundet med PD34,35. Denne protokol kan dog være nyttig til forskellige sygdomsmodeller, lægemiddelbehandlinger og toksikologiske undersøgelser.
Desuden kan prøveforberedelsen tilpasses, så den passer til forsøgskravene36. Et kritisk trin i respirometriprotokollen er prøveforberedelse. Det er afgørende, at den korrekte protokol etableres for typen af prøve (celle, isolerede mitokondrier, homogenat), og det er vigtigt at overveje den passende metode til normalisering af prøver (proteinmængde, DNA-indhold, citratsyntaseaktivitet). Det er også vigtigt at bruge den samme buffer til prøveforberedelse og respirometrianalysen.
Da prøveforberedelsesprotokollen beskrevet her er enkel, udgør den normalt ikke problemer for teknikken. Hvis der vælges en anden type prøve eller dens forberedelse ændres, er omhyggelig standardisering nødvendig. Omrøring og temperaturstabilitet påvirker signalet fra den polarografiske iltsensor og genererer fejl i åndedrætsmålinger ved hjælp af en oxygraf. Derfor udgør den korrekte kalibrering af kammeret et vigtigt skridt til at reducere fejl under åndedrætsmålingerne.
Denne metode til vurdering af mitokondriefunktion i flueprøver giver flere fordele i forhold til alternative tilgange. En af de vigtigste styrker ved HRR er dens evne til at levere direkte og nøjagtige målinger af iltforbruget, hvilket giver mulighed for en detaljeret analyse af mitokondriefunktion og cellulær metabolisme. Derfor bruges HRR ofte i forskning med fokus på forståelse af mitokondriel dysfunktion, energiproduktion og cellulære reaktioner på forskellige substrater eller tilstande. Desuden er den alsidig - hvilket giver mulighed for anvendelse af en lang række prøvetyper, herunder isolerede mitokondrier - og kræver små mængder biologiske prøver, hvilket er nyttigt, når prøvemængden er begrænsettil 1,2,3. Metoder, der bruger mitokondrieisolater, involverer for eksempel typisk et betydeligt antal fluer, der spænder fra 50 til 200 individer, hvilket gør undersøgelsen med mutanter vanskelig, da det måske ikke er praktisk muligt at opnå et stort antal mutanter til visse sygdomsmodeller.
I lighed med HRR-metoden er Seahorse Bioscience Extracellular Flux Analyzer et videnskabeligt værktøj, der bruges til at måle iltforbrug og ekstracellulær forsuring. De har dog forskellige tilgange og applikationer. Seahorse Bioscience Extracellular Flux Analyzer kvantificerer øjeblikkelige ændringer i cellernes iltforbrugshastighed (OCR) og ekstracellulære forsuringshastighed (ECAR). OCR er tegn på mitokondriel respiration og energiproduktion, mens ECAR giver indsigt i glykolytisk aktivitet. Dets vigtigste funktion ligger i vurderingen af cellulær metabolisk dynamik under forskellige fysiologiske forhold, hvilket gør det særligt medvirkende til at belyse de indviklede metaboliske modulationer forbundet med patologiske sammenhænge. Derudover er Seahorse designet til brugervenlighed, så forskere kan udføre hurtige metaboliske assays 37,38,39. I modsætning hertil kræver HRR specialiseret uddannelse og ekspertise til at betjene og analysere data effektivt. Det indebærer brugen af en iltelektrode til direkte måling af iltforbrug af celler eller mitokondrier 13,14,40. En fordel ved HRR er dens alsidighed i design af forskellige respirometriprotokoller, hvilket er praktisk umuligt, når du bruger Seahorse. Denne alsidighed til at designe protokoller forbundet med lave omkostninger gør HRR-metoden til et levedygtigt valg for laboratorier med begrænset finansiering. En anden ulempe ved det respirometriske system, der anvendes i denne protokol, er umuligheden af at arbejde med flere prøver samtidigt, hvilket hæmmer analysen med høj kapacitet. Således skal eksperimentelle grupper være veldesignede for at muliggøre den korrekte sammenligning mellem dem. Fordelene ved dette system ligger imidlertid i, at prøver af enhver art kan testes, fra isolerede celler til hele levende organismer, såsom C. elegans, for eksempel40.
Sammenfattende er HRR en pålidelig metode til at studere mitokondriefunktion under fysiologiske og patologiske tilstande41. Hver eksperimentel model har forskellige egenskaber og begrænsninger, hvilket kræver metodologi og prøveforberedelsesjusteringer for at sikre pålidelig og meningsfuld dataindsamling i mitokondriel respirationsevaluering. Denne protokol giver forskere en pålidelig metode til at vurdere virkningerne af miljøfaktorer, eksperimentelle interventioner eller genetiske mutationer på mitokondriefunktionen i D. melanogaster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender det brasilianske agentur Coordenação de Aperfeiçoamento de Pesquisa Pessoal de Nível Superior (CAPES EPIDEMIAS 09 #88887.505377/2020). P.M. (#88887.512821/2020-00) og T.D. (#88887.512883/2020-00) er modtagere af forskningsstipendier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | Adenosine 5′-diphosphate sodium sal (CAS number 72696-48-1); ≥95%; molecular weight = 501.31 g/mol. |
| Ágar | Kasv | K25-1800 | For bacteriologal use |
| Antimycin-A | Sigma-Aldrich | A8674 | Antimycin A from Streptomyces sp. (CAS number 1397-94-0); molecular weight 540 g/mol; |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | Bovine Serum Albumin (CAS number 9048-46-8); pH 7,0 ≥ 98% |
| Datlab software | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20700 | Software for data acquisition and analysis |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D 5628 | CAS number 11024-24-1 |
| Distilled water | |||
| Drosophila melanogaster strain w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 | Obtained from Bloomington Drosophila stock center | ||
| Drosophila melanogaster strain w1118 | Obtained from the Federal University of Santa Maria | ||
| EGTA | Sigma-Aldrich | E8145 | Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (CAS number 13638-13-3); ≥97%; molecular weight =468.28 g/mol |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920 | Carbonyl cyanide 4- (trifluoromethoxy)phenylhydrazone (CAS number 370-86-5); ≥98% (TLC), powder |
| GraphPad Prism version 8.0.1. | Software for data acquisition and analysis | ||
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034 | 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (CAS number 7365-45-9); ≥99,5% (titration), cell cultured tested; molecular weight = 238.30 g/mol |
| High-resolution respirometer Oxygraph O2K | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 10022-02 | Startup O2K respirometer kit |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | Monopotassium phosphate (CAS number 7778-77-0); Reagente Plus, molecular weigt = 136.09 g/mol |
| KOH | Sigma-Aldrich | 211473 | Potassium hydroxide (CAS number 1310-58-3); ACS reagent, ≥85%, pellets |
| Malate | Sigma-Aldrich | M1296 | Malonic acid (CAS number 141-82-2); 99%, molecular weight = 104.06 g/mol). A solution is pH adjusted to approximately 7.0. |
| Malic acid | Sigma-Aldrich | M1000 | (S)-(−)-2-Hydroxysuccinic acid (CAS number 97-67-6); ≥95% ; molecular weight = 134.09 g/mol |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (CAS number 4432-31-9); ≥99% (titration); molecular weight = 195.24 g/mol |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Magnesium chloride (CAS number 7786-30-3); anhydrous, ≥98%, molecular weight = 95.21 g/mol |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | ||
| O2K-Titration Set | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20820-03 | Hamilton syringes with different volumes |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O 4876 | Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes (CAS number 1404-19-9); ≥90% total oligomycins basis (HPLC) |
| Pistil to homogenization | |||
| Proline | Sigma-Aldrich | P0380 | L-Proline (CAS number 147-85-3); powder; 99%; molecular weight = 115.13 g/mol |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Sodium pyruvate (CAS number 113-24-6), ≥99%; molecular weight = 110.04 g/mol |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | Rotetone (CAS number 83-79-4); ≥95%, molecular weight 394.42 g/ mol |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S 2378 | Sodium succinate dibasic hexahydrate (CAS number 6106-21-4); ≥99% |
| Sucrose | Merck | 107,651,000 | Sucrose for microbiology use (CAS number 57-50-1) |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | CAS number 107-35-7 |
References
- Brand, M. D., Orr, A. L., Perevoshchikova, I. V., Quinlan, C. L. The role mitochondrial function and cellular bioenergetics in ageing and disease. Br J Dermatol. 169, 1-8 (2013).
- Ramaccini, D., et al. Mitochondrial function and dysfunction in dilated cardiomyopathy. Front Cell Dev Biol. 8, 624216 (2021).
- Zhunina, O. A., et al. The role of mitochondrial dysfunction in vascular disease, tumorigenesis, and diabetes. Front Mol Biosci. 8, 671908 (2021).
- Prasun, P.
- Bhatti, J. S., Bhatti, G. K., Reddy, P. H. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in metabolic disorders - A Step towards mitochondria based therapeutic strategies. Biochim Biophys Acta. 1863 (5), 1066-1077 (2017).
- Perier, C., Vila, M. Mitochondrial biology and Parkinson's disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (2), 009332 (2012).
- DeMaagd, G., Philip, A. Parkinson's disease and its management. Pharmacy and Therapeutics. 40 (8), 504-532 (2015).
- Miyazaki, N., et al. PINK1-dependent and Parkin-independent mitophagy is involved in reprogramming of glycometabolism in pancreatic cancer cells. Biochem Biophys Res Commun. 625, 167-173 (2022).
- Kopin, I. J., Markey, S. P. MPTP toxicity: implications for research in Parkinson's disease. Annual Review of Neuroscience. 11, 81-96 (1988).
- Connolly, N. M. C., et al. Guidelines on experimental methods to assess mitochondrial dysfunction in cellular models of neurodegenerative diseases. Cell Death Differ. 25 (3), 542-572 (2018).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G.
- Haynes, C. M., Fiorese, C. J., Lin, Y. -F. Evaluating and responding to mitochondrial dysfunction: The UPRmt and beyond. Trends Cell Mol Biol. 23 (7), 311-318 (2013).
- Long, Q., Huang, L., Huang, K., Yang, Q. Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from mouse heart tissues using oroboros 2k-oxygraph. Methods Mol Biol. 1966, Clifton, N.J. 237-246 (2019).
- Scheiber, D., et al. High-resolution respirometry in human endomyocardial biopsies shows reduced ventricular oxidative capacity related to heart failure. Exp Mol Med. 51 (2), 1-10 (2019).
- Krumschnabel, G., Eigentler, A., Fasching, M., Gnaiger, E. Chapter nine - use of safranin for the assessment of mitochondrial membrane potential by high-resolution respirometry and fluorometry. Methods Enzymol. 542, 163-181 (2014).
- Demir, E. The potential use of Drosophila as an in vivo model organism for COVID-19-related research: a review. Turk J Biol. 45 (4), 559-569 (2021).
- Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: a primer on the Drosophila model system. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
- McBride, S. M. J., Holloway, S. L., Jongens, T. A. Using Drosophila as a tool to identify pharmacological therapies for fragile X syndrome. Drug Discov Today Technol Technologies. 10 (1), e129-e136 (2013).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods (San Diego, Calif). 68 (1), 105-115 (2014).
- Bar, S., Prasad, M., Datta, R. Neuromuscular degeneration and locomotor deficit in a Drosophila model of mucopolysaccharidosis VII is attenuated by treatment with resveratrol). Dis Model Mech. 11 (11), (2018).
- Imai, Y. PINK1-Parkin signaling in Parkinson's disease: Lessons from Drosophila. Neurosci Res. 159, 40-46 (2020).
- Julienne, H., Buhl, E., Leslie, D. S., Hodge, J. J. L. Drosophila PINK1 and parkin loss-of-function mutants display a range of non-motor Parkinson's disease phenotypes. Neurobiol Dis. 104, 15-23 (2017).
- Biswas, S., Bagchi, A. Analysis of the structural dynamics of the mutations in the kinase domain of PINK1 protein associated with Parkinson's disease. Gene. 857, 147183 (2023).
- Koh, H., Chung, J. PINK1 and Parkin to control mitochondria remodeling. Anat Cell Biol. 43 (3), 179-184 (2010).
- Zhu, M., Li, X., Tian, X., Wu, C. Mask loss-of-function rescues mitochondrial impairment and muscle degeneration of Drosophila pink1 and parkin mutants. Hum Mol Genet. 24 (11), 3272-3285 (2015).
- Park, J., et al. Mitochondrial dysfunction in Drosophila PINK1 mutants is complemented by parkin. Nature. 441 (7097), 1157-1161 (2006).
- Dytham, C. Choosing and using statistics: a biologist's guide. , Wiley-Blackwell. Hoboken, NJ. (2011).
- Bonora, M., et al.
- Gonçalves, D. F., et al. Caffeine improves mitochondrial function in PINK1B9-null mutant Drosophila melanogaster. J Bioenerg Biomembr. 55 (1), 1-13 (2023).
- Gonçalves, D. F., et al. Mitochondrial function and cellular energy maintenance during aging in a Drosophila melanogaster model of Parkinson disease. Mitochondrion. 65, 166-175 (2022).
- Janowska, J. I., et al. Mitochondrial respiratory chain complex I dysfunction induced by N-methyl carbamate ex vivo can be alleviated with a cell-permeable succinate prodrug. Toxicol In Vitro. 65, 104794 (2020).
- Ngo, D. T. M., et al. Oxidative modifications of mitochondrial complex II are associated with insulin resistance of visceral fat in obesity. Physiol Endocrinol Metab. 316 (2), E168-E177 (2019).
- Stroud, D. A., et al. Accessory subunits are integral for assembly and function of human mitochondrial complex I. Nature. 538 (7623), 123-126 (2016).
- Senyilmaz, D., et al. Regulation of mitochondrial morphology and function by stearoylation of TFR1. Nature. 525 (7567), 124-128 (2015).
- Poddighe, S., et al. Mucuna pruriens (Velvet bean) rescues motor, olfactory, mitochondrial and synaptic impairment in PINK1B9 Drosophila melanogaster genetic model of Parkinson's disease. PloS One. 9 (10), e110802 (2014).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 810, 25-58 (2012).
- Winer, L. S. P., Wu, M. Rapid analysis of glycolytic and oxidative substrate flux of cancer cells in a microplate. PloS One. 9 (10), e109916 (2014).
- Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio Protoc. 8 (10), e2850 (2018).
- Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. Am J Physiol. Cell Physiol. 292 (1), C125-C136 (2007).
- Divakaruni, A. S., Jastroch, M. A practical guide for the analysis, standardization and interpretation of oxygen consumption measurements. Nat Metab. 4 (8), 978-994 (2022).
- Bingol, B., Sheng, M. Mechanisms of mitophagy: PINK1, Parkin, USP30 and beyond. Free Radic Biol Med. 100, 210-222 (2016).
