Summary
Здесь мы представляем протокол респирометрии высокого разрешения для анализа биоэнергетики у мутантных плодовых мушек PINK1B9-null. В методе используется протокол SUIT (субстрат-разветвитель-ингибитор-титрование).
Abstract
Нейродегенеративные заболевания, включая болезнь Паркинсона (БП), и клеточные нарушения, такие как рак, являются одними из расстройств, которые нарушают энергетический метаболизм с нарушением функций митохондрий. Митохондрии — это органеллы, которые контролируют как энергетический обмен, так и клеточные процессы, участвующие в выживании и гибели клеток. По этой причине подходы к оценке функции митохондрий могут дать важную информацию о клеточных состояниях при патологических и физиологических процессах. В связи с этим протоколы респирометрии высокого разрешения (HRR) позволяют оценить всю функцию дыхательной цепи митохондрий или активность специфических митохондриальных комплексов. Кроме того, изучение физиологии митохондрий и биоэнергетики требует генетически и экспериментально управляемых моделей, таких как Drosophila melanogaster.
Эта модель имеет ряд преимуществ, таких как сходство с физиологией человека, быстрый жизненный цикл, простота обслуживания, экономичность, высокая пропускная способность и минимальное количество этических проблем. Эти свойства в совокупности делают его бесценным инструментом для анализа сложных клеточных процессов. В настоящей работе объясняется, как анализировать митохондриальную функцию с использованием мутанта Drosophila melanogaster PINK1B9-null. Ген pink1 отвечает за кодирование PTEN-индуцированной предполагаемой киназы 1 посредством процесса, известного как митофагия, который имеет решающее значение для удаления дисфункциональных митохондрий из митохондриальной сети. Мутации в этом гене были связаны с аутосомно-рецессивной ранней семейной формой болезни Паркинсона. Данная модель может быть использована для изучения митохондриальной дисфункции, участвующей в патофизиологии болезни Паркинсона.
Introduction
Митохондрии — это клеточные органеллы, которые контролируют важные функции, включая регуляцию апоптоза, гомеостаз кальция и участие в биосинтетических путях. Обладая автономным генетическим материалом, они способны вносить свой вклад в процессы поддержания и восстановления клеток. В их структуре находятся цепь переноса электронов и окислительное фосфорилирование, которые имеют решающее значение для клеточной энергии 1,2,3. В частности, энергетический контроль достигается за счет производства аденозинтрифосфата (АТФ) путем окислительного фосфорилирования (OXPHOS)2. Нарушение энергетического обмена с нарушением функций митохондрий происходит как при выживаемости, так и при гибели клеток 4,5, часто связанных с широким спектром патологий человека, таких как рак, и нейродегенеративными заболеваниями, такими как болезнь Паркинсона (БП)3,6.
Болезнь Паркинсона является хроническим, прогрессирующим и неврологическим расстройством. Основной причиной этого заболевания является гибель клеток головного мозга, особенно черной субстанции, которые отвечают за выработку нейромедиатора дофамина, контролирующего движения 6,7,8. Самое раннее наблюдение, которое связало паркинсонизм с митохондриальной дисфункцией, было сделано в 1988 году в экспериментальных моделях с использованием токсинов, которые ингибируют дыхательную цепь Complex I9.
В настоящее время существует несколько методов оценки митохондриальной дисфункции 10,11,12,1 3; однако, по сравнению с традиционными подходами, респирометрия высокого разрешения (HRR) обладает более высокой чувствительностью и преимуществами13,14. Например, протоколы HRR позволяют оценить всю функцию митохондриальной дыхательной цепи или активность специфических митохондриальных комплексов14,15. Митохондриальные дисфункции могут быть оценены в интактных клетках, изолированных митохондриях или даже ex vivo 10,11,13,14.
Митохондриальные дисфункции тесно связаны со многими патологическими и физиологическими процессами. Поэтому важно изучать митохондриальную физиологию и биоэнергетику с использованием генетически и экспериментально управляемых модельных систем. В этом отношении исследования дрозофилы меланогастер, плодовой мушки, имеют ряд преимуществ. Эта модель разделяет фундаментальные клеточные характеристики и процессы с людьми, включая использование ДНК в качестве генетического материала, общих органелл и консервативных молекулярных путей, участвующих в развитии, иммунитете и клеточной сигнализации. Кроме того, плодовые мушки обладают быстрым жизненным циклом, простотой в уходе, низкой стоимостью, высокой пропускной способностью и меньшим количеством этических проблем, что представляет собой бесценный инструмент для препарирования сложных клеточных процессов 16,17,18,19,20.
Кроме того, гомолог гена PTEN-индуцированной предполагаемой киназы 1 (pink1) экспрессируется у D. melanogaster. Он играет решающую роль в удалении поврежденных митохондрий в процессе митофагии8. У людей мутации в этом гене предрасполагают людей к аутосомно-рецессивной семейной форме болезни Паркинсона, связанной с митохондриальной дисфункцией 8,21,22,23. Следовательно, плодовая мушка является мощной животной моделью для исследований патофизиологии болезни Паркинсона и скрининга кандидатов в лекарственные препараты с акцентом на митохондриальную дисфункцию и биоэнергетику. Таким образом, в настоящей работе объясняется, как анализировать митохондриальную функцию в модели БП от D. melanogaster с использованием метода HRR в OROBOROS с протоколом Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration (SUIT).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Мы использовали штаммы w1118 (белый) и w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 (называемый Pink1B9) (идентификатор FlyBase: FBgn0029891) из Блумингтонского центра дрозофилы (идентификационный номер: 34749). В данном исследовании мужские мутанты D. melanogaster PINK1B9-null сравниваются с самцами D. melanogaster из штамма w1118, который используется в качестве контрольной группы (генетический фон). Другие параметры должны быть проанализированы одновременно с экспериментами по респирометрии, чтобы убедиться, что мухи имеют правильный генотип (Pink1B9/Y), такие как деформации грудной клетки и проблемы с локомоцией, которые хорошо описаны для мух-мутантов pink1B9 24,25,26.
1. Животные и жилье
- Содержать мух в стеклянных бутылках, содержащих 10 мл стандартного рациона (дрожжи 1,73%, соевая мука 0,9%, кукурузная мука 7,3%, агар 0,5%, кукурузный сироп 7,6% и пропионовая кислота 0,48%) при постоянной температуре и влажности (25 °C и 60% соответственно) с циклом свет/темнота 12 ч:12 ч.
- Для каждого эксперимента используют двух мух в возрасте 1-3 дней после эклозии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Самки девственных мух PINK1B9-null были скрещены с самцами w1118 для получения самцов F1 с генотипом Pink1B9/Y.
2. Пробоподготовка
- Подготовьте буфер MiR05, как описано в таблице 1.
- Обезболивайте мух на льду и перекладывайте их в микроцентрифужные пробирки (две мухи в пробирке).
- В каждую пробирку добавьте 200 мкл охлажденного буфера MiR05 и гомогенизируйте мух. Гомогенизируйте вручную, слегка надавливая (примерно 4-6 ударов пестика), чтобы предотвратить распад митохондрий.
3. Высокоразрешающая респирометрическая калибровка полярографических датчиков кислорода
ПРИМЕЧАНИЕ: Камеры OROBOROS имеют общий объем около 2 мл. Калибровка необходима для того, чтобы убедиться, что поток кислорода близок к 0 пмоль, чтобы начать анализ.
- Начав калибровку, добавьте в камеру 2 мл MiR05. Накройте камеру пробкой, не оставляя пузырьков воздуха; Затем осторожно потяните за пробку, чтобы образовался один пузырь воздуха.
- Откройте программу OROBOROS Dat.Lab. Введите температуру 25 °C в поле «Температура блока » и нажмите « Подключиться к Oxygraph-2k » (Рисунок 1A).
- Нажмите и выберите папку, в которой должна быть сохранена калибровка, и нажмите «Сохранить».
- Когда откроется новое окно, назовите эксперимент и образцы (если вы калибруете, просто введите название calibration) и нажмите « Сохранить».
- Перейдите в меню Layout и выберите первый вариант: 01 Calibration Exp. Gr.3 - Temp , как показано на рисунке 1B.
- Дождитесь перенаправления программы на макет калибровки, подождите, пока красная линия покажет стандартную прямую с точками около 0 пмоль. Затем выберите две точки: одну для камеры А , а другую для камеры В (рис. 1С), когда красная линия будет точно равна нулю.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выбранные точки должны иметь поток кислорода (красная линия) около 0.- Чтобы отметить точки обеих камер, выберите концентрациюO2 в правой части экрана, выберите отмеченную точку и скопируйте значения температуры и барометрического давления относительно точки. Вставьте эти значения в поля ниже и нажмите Calibrate and Copy to Clipboard в правом нижнем углу экрана, как показано на рисунке 2.
- Проделайте этот процесс для обеих камер (A и B), затем перейдите в меню «Файл » и выберите «Сохранить и отключить».
ПРИМЕЧАНИЕ: После процесса калибровки программа перенаправит пользователя на главный экран, чтобы программное обеспечение было готово к запуску теста HRR. Для этого теста мы будем использовать протокол SUIT.
4. Протокол SUIT
- Завершив калибровку, снимите пробки и откройте камеры.
- Промойте пробки (держа наконечник, который не касается образца) и камеры 100% этанолом, 70% этанолом и дистиллированной водой в указанном порядке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Повторяйте процесс для каждой смены образца. - Гомогенизируйте мух в 200 мкл буфера, поместите все содержимое образца в камеру с помощью микропипетки и переместите пробку в камеру, следя за тем, чтобы не образовывались пузырьки воздуха.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если образуются пузырьки воздуха, осторожно снимите пробку и добавьте 100 мкл буфера MIR05. - Щелкните меню Layout и выберите опцию 05 Flow by Corrected Volume , как показано на рисунке 1B.
- Подождите, пока вас перенаправят в новое окно. Нажмите кнопку Сохранить , чтобы выбрать папку, в которую нужно сохранить эксперимент.
- Подождите, пока откроется еще одно новое окно. Назовите эксперимент в пространстве Экспериментальный код. Затем назовите каждый образец в соответствующей камере A и B в поле Sample и задайте для поля Unit значение unit.
ПРИМЕЧАНИЕ: Также можно выбрать другие единицы, например, Миллионы клеток или мг. - Учитывая, что в этом протоколе используются две мухи (2 единицы), а объем камеры составляет 2 мл, в поле «Концентрация » определите 1 на мл (рис. 1D).
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь количество выборки было нормировано по количеству мух; однако эта нормализация может быть выполнена по содержанию белка в образце, количественному определению митохондриальной ДНК или активности цитратсинтазы. - Когда сигнал потока кислорода (красная линия) стабилизируется на положительном значении, начинайте протокол HRR с титрования субстратов, ингибиторов и развязывателей (рис. 3). Все последующие реагенты и оборудование приведены в таблице 1.
- Добавьте дигитонин (5 мкг/мл) для пермеабилизации митохондриальной мембраны.
- Добавьте пируват (5 мМ), малат (2 мМ) и пролин (10 мМ) субстраты и подождите, пока поток кислорода не увеличится и не стабилизируется. Чтобы отметить событие для каждого добавления реагента, нажмите клавишу F4 на клавиатуре и введите название каждого реагента.
- Добавьте АДФ (5 мМ), чтобы связать митохондриальную дыхательную цепь, и дождитесь увеличения и стабилизации потока кислорода.
- Добавляем сукцинат (10 мМ) и ждем увеличения и стабилизации потока кислорода.
- Добавьте олигомицин (2,5 мкМ), чтобы ингибировать АТФ-синтазу и искать снижение потока кислорода.
- Подождите, пока красная линия стабилизируется, и разъедините митохондриальный перенос электронов с помощью карбонил-4-(трифторметокси)фенилгидразинцианида (FCCP) с титрами 0,25 мкМ, пока не будет достигнуто максимальное потребление кислорода, о чем свидетельствует подъем красной линии. После стабилизации потока кислорода начинайте добавлять ингибиторы каждого комплекса по одному.
- Добавьте ротенон (0,5 мкМ), комплексный ингибитор I. Дождитесь снижения и стабилизации потока кислорода, чтобы добавить следующий ингибитор.
- Добавьте малонат (5 мМ), комплексный ингибитор II. Дождитесь снижения и стабилизации потока кислорода, чтобы добавить следующий ингибитор.
- Наконец, добавьте антимицин (2,5 мкМ), комплексный ингибитор III. Дождитесь снижения с последующим увеличением и стабилизацией потока кислорода.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поток кислорода должен стабилизироваться на положительном значении, но ниже значения последнего ингибирования митохондриальных белковых комплексов.
- По окончании анализа удалите все содержимое камер с помощью микропипетки. Хранить при температуре -20 °C для последующего анализа, когда это необходимо.
5. Анализ данных
- Используйте соответствующий пакет статистического программного обеспечения для анализа данных.
- Выполните t-критерий для оценки различий между двумя группами. В ситуациях, включающих несколько методов лечения, используйте дисперсионный анализ (ANOVA) в качестве статистического критерия 27.
- Извлеките значения потокаO2 из графика, сгенерированного программным обеспечением. OXPHOS CI относится к значению потокаO2 после добавления АДФ. OXPHOS CII получается путем вычитания OXPHOS CI&CII - OXPHOS CI. OXPHOS CI&CII – это значение флюсаO2 , экстрагированного после добавления сукцината. ETS CI&CII — это величина потокаO2 после добавления FCCP. ETS CI = FCCP - Ротенон и ETS CII = Ротенон - Малонат.
- Рассчитайте синтез АТФ как разность между OXPHOS (P) и LEAK (L) (P - L)28.
- Определите коэффициент контроля дыхания (RCR), рассчитав соотношение OXPHOS/LEAK, где RCR = P/L.11
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Здесь мы видим, что потокO2 в состояниях OXPHOS CI (P = 0,0341) и OXPHOS CI&II (P = 0,0392) уменьшается у нулевых мух PINK1B9 по сравнению с контрольными мухами (рис. 4). Этот результат также наблюдался в предыдущих результатах нашей группы29,30.
CI и CII являются ключевыми компонентами системы переноса электронов (ETS), в которой CI отвечает за перенос электронов от NADH к убихинону, в то время как CII передает электроны от сукцината к убихинону 31,32,33. Нуль-мухи PINK1B9 показали более низкий потокO2 в состояниях ETS CI (P = 0,0338), ETS CII (P = 0,0457) и ETS CI&II (P = 0,0247) (рис. 5). Эти результаты указывают на то, что система переноса электронов нарушена у мух, лишенных гена pink1, а потокO2 как на стадиях OXPHOS, так и на ETS зависит от CI и CI&CII, что согласуется с другими работами, демонстрирующими снижение активности КИ в pink1-/- моделях 33,34,35.
Кроме того, градиент протонов через внутреннюю мембрану митохондрий необходим для синтезаАТФ-28. Уменьшение потокаO2 в ETS CI и ETS CII указывает на нарушение потока электронов вдоль ETS. Это нарушение потока электронов влияет на процесс OXPHOS, что приводит к снижению синтеза АТФ. Также наблюдалось значительное снижение потребленияO2, связанного с синтезом АТФ (P = 0,0280) у нуль-мух PINK1B9 по сравнению с контрольными мухами (рис. 6B). Снижение синтеза АТФ у D. melanogaster может оказывать значительное влияние на энергетический обмен, клеточные процессы и общие физиологические функции. Кроме того, эффективность процесса OXPHOS может быть количественно оценена с помощью индекса, известного как RCR, который отражает тесную связь между дыханием и фосфорилированием. Таким образом, снижение RCR (P = 0,0432) указывает на разъединение митохондрий, что может повлиять на процесс OXPHOS, предполагая, что митохондрии менее эффективно используют кислород и производят АТФ (рис. 6C). Эти результаты могут влиять на рост, развитие, передвижение, размножение и общее состояние здоровья плодовой мушки, а также способствовать патогенезу некоторых нейродегенеративных заболеваний, включая PD 8,28,29,32.
Рисунок 1: Макеты в программном обеспечении OROBOROS Dat.Lab. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Этапы калибровки камер в программном обеспечении OROBOROS Dat.Lab. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Протокол SUIT, демонстрирующий основные моменты добавления субстрата и ингибитора. Сначала добавляется дигитонин (DIG), затем специфические субстраты комплекса I: малат, пируват и пролин (MPP), субстрат АТФ-синтазы (ADP), а затем субстрат для комплекса II: сукцинат (S). Затем добавляют ингибитор АТФ-синтазы: олигомицин (OMY), за которым следует разъединитель карбонил-4-(трифторметокси) фенилгидразона цианид (F) и комплексные ингибиторы I, II и III: ротенон (R), малонат (MNA) и антимицин (AMA)36. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Респирометрия высокого разрешения, сравнивающая мушки w1118 и PINK1B9. (A) OXPHOS CI, (B) OXPHOS CII и (C) OXPHOS CI&CII. Данные представлены в виде среднего ± S.E.M. и проанализированы с помощью t-критерия. n = 5-9. стр < 0,05. Сокращения: OXPHOS = окислительное фосфорилирование; CI = комплекс I; CII = комплекс II. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Респирометрия высокого разрешения, сравнивающая мушки w1118 и PINK1B9 . (A) ETS CI, (B) ETS CII и (C) ETS CI&CII. Данные представлены в виде среднего ± S.E.M. и проанализированы с помощью t-критерия. n = 5-9. стр < 0,05. Сокращения: ETS = электронная транспортная система; CI = комплекс I; CII = комплекс II. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Респирометрия высокого разрешения, сравнивающая мухи w1118 и PINK1B9. (А) утечка, (Б) синтез АТФ и (В) коэффициент контроля дыхания. Данные представлены в виде среднего ± S.E.M. и проанализированы с помощью t-критерия. n = 5-9. стр < 0,05. Аббревиатура: RCR = коэффициент контроля дыхания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HRR является мощным методом изучения митохондриального дыхания и энергетического обмена у D. melanogaster и других организмов. Он обеспечивает детальную и количественную оценку митохондриальной функции, позволяя исследователям получить представление о биоэнергетике клеток. Представленный здесь протокол описывает оценку функции дыхательной цепи митохондрий и активности специфических митохондриальных комплексов с использованием протокола SUIT у D. melanogaster. Протокол SUIT включает в себя систематическое манипулирование различными субстратами, развязывателями и ингибиторами для изучения различных аспектов митохондриального дыхания.
Описанная методика позволяет оценить торможение дыхания, возникающее в результате воздействия на OXPHOS или ETS, активность дегидрогеназы (CI и CII) и целостность мембраны (сопряжение OXPHOS). Здесь мы проводили эксперименты с использованием мух PINK1B9-null для изучения митохондриальной дисфункции, поскольку она ассоциирована с PD34,35. Тем не менее, этот протокол может быть полезен для различных моделей заболеваний, медикаментозного лечения и токсикологических исследований.
Кроме того, пробоподготовка может быть адаптирована в соответствии с экспериментальными требованиями36. Важнейшим этапом в протоколе респирометрии является пробоподготовка. Крайне важно, чтобы был установлен правильный протокол для типа образца (клетка, изолированные митохондрии, гомогенат), и важно рассмотреть соответствующий метод нормализации образца (количество белка, содержание ДНК, активность цитратсинтазы). Также важно использовать один и тот же буфер для пробоподготовки и респирометрического анализа.
Поскольку описанный здесь протокол пробоподготовки прост, он обычно не создает проблем для методики. Если выбран другой тип образца или изменена его подготовка, то необходима тщательная стандартизация. Перемешивание и температурная стабильность влияют на сигнал полярографического датчика кислорода, генерируя погрешность при измерении дыхания с помощью оксиграфа. Таким образом, правильная калибровка камеры является важным шагом для уменьшения ошибок при измерениях дыхания.
Этот метод оценки митохондриальной функции в образцах мух имеет ряд преимуществ по сравнению с альтернативными подходами. Одним из основных преимуществ HRR является его способность обеспечивать прямые и точные измерения потребления кислорода, что позволяет проводить детальный анализ функции митохондрий и клеточного метаболизма. Поэтому HRR часто используется в исследованиях, направленных на понимание митохондриальной дисфункции, выработки энергии и клеточных реакций на различные субстраты или условия. Кроме того, он универсален, позволяя использовать широкий спектр типов образцов, включая изолированные митохондрии, и требует небольшого количества биологических образцов, что полезно, когда количество образцов ограничено 1,2,3. Методы, использующие митохондриальные изоляты, например, обычно включают значительное количество мух, от 50 до 200 особей, что затрудняет исследование с мутантами, поскольку получение большого количества мутантов для определенных моделей заболеваний может быть непрактичным.
Подобно методу HRR, анализатор внеклеточного потока Seahorse Bioscience является научным инструментом, используемым для измерения потребления кислорода и внеклеточного подкисления. Однако у них разные подходы и приложения. Анализатор внеклеточного потока Seahorse Bioscience количественно определяет мгновенные изменения скорости потребления кислорода (OCR) и скорости внеклеточного закисления (ECAR) клеток. OCR указывает на митохондриальное дыхание и выработку энергии, в то время как ECAR дает представление о гликолитической активности. Его основная функция заключается в оценке клеточной метаболической динамики в различных физиологических условиях, что делает его особенно полезным для выяснения сложных метаболических модуляций, связанных с патологическими контекстами. Кроме того, Seahorse разработан для простоты использования, что позволяет исследователям проводить быстрые метаболические анализы 37,38,39. В отличие от этого, HRR требует специальной подготовки и опыта для эффективной работы с данными и их анализа. Он включает в себя использование кислородного электрода для непосредственного измерения потребления кислорода клетками или митохондриями 13,14,40. Преимуществом HRR является его универсальность в разработке различных протоколов респирометрии, что неосуществимо при использовании Seahorse. Эта универсальность в разработке протоколов, связанная с низкой стоимостью, делает метод HRR жизнеспособным выбором для лабораторий с ограниченным финансированием. Еще одним недостатком респирометрической системы, используемой в настоящем протоколе, является невозможность одновременной работы с несколькими образцами, что затрудняет проведение высокопроизводительного анализа. Таким образом, экспериментальные группы должны быть хорошо спроектированы, чтобы обеспечить корректное сравнение между ними. Однако преимущества этой системы заключаются в том, что можно тестировать образцы любого типа, от изолированных клеток до целых живых организмов, таких как C. elegans, например,40.
Таким образом, HRR является надежным методом изучения функции митохондрий в физиологических и патологических состояниях41. Каждая экспериментальная модель имеет различные характеристики и ограничения, требующие корректировки методологии и пробоподготовки для обеспечения надежного и значимого сбора данных при оценке митохондриального дыхания. Этот протокол предлагает исследователям надежный метод оценки влияния факторов окружающей среды, экспериментальных вмешательств или генетических мутаций на функцию митохондрий у D. melanogaster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.
Acknowledgments
Авторы выражают благодарность бразильскому агентству Coordenação de Aperfeiçoamento de Pesquisa Pessoal de Nível Superior (CAPES EPIDEMIAS 09 #88887.505377/2020). P.M. (#88887.512821/2020-00) и T.D. (#88887.512883/2020-00) являются получателями исследовательских стипендий.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | Adenosine 5′-diphosphate sodium sal (CAS number 72696-48-1); ≥95%; molecular weight = 501.31 g/mol. |
| Ágar | Kasv | K25-1800 | For bacteriologal use |
| Antimycin-A | Sigma-Aldrich | A8674 | Antimycin A from Streptomyces sp. (CAS number 1397-94-0); molecular weight 540 g/mol; |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | Bovine Serum Albumin (CAS number 9048-46-8); pH 7,0 ≥ 98% |
| Datlab software | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20700 | Software for data acquisition and analysis |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D 5628 | CAS number 11024-24-1 |
| Distilled water | |||
| Drosophila melanogaster strain w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 | Obtained from Bloomington Drosophila stock center | ||
| Drosophila melanogaster strain w1118 | Obtained from the Federal University of Santa Maria | ||
| EGTA | Sigma-Aldrich | E8145 | Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (CAS number 13638-13-3); ≥97%; molecular weight =468.28 g/mol |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920 | Carbonyl cyanide 4- (trifluoromethoxy)phenylhydrazone (CAS number 370-86-5); ≥98% (TLC), powder |
| GraphPad Prism version 8.0.1. | Software for data acquisition and analysis | ||
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034 | 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (CAS number 7365-45-9); ≥99,5% (titration), cell cultured tested; molecular weight = 238.30 g/mol |
| High-resolution respirometer Oxygraph O2K | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 10022-02 | Startup O2K respirometer kit |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | Monopotassium phosphate (CAS number 7778-77-0); Reagente Plus, molecular weigt = 136.09 g/mol |
| KOH | Sigma-Aldrich | 211473 | Potassium hydroxide (CAS number 1310-58-3); ACS reagent, ≥85%, pellets |
| Malate | Sigma-Aldrich | M1296 | Malonic acid (CAS number 141-82-2); 99%, molecular weight = 104.06 g/mol). A solution is pH adjusted to approximately 7.0. |
| Malic acid | Sigma-Aldrich | M1000 | (S)-(−)-2-Hydroxysuccinic acid (CAS number 97-67-6); ≥95% ; molecular weight = 134.09 g/mol |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (CAS number 4432-31-9); ≥99% (titration); molecular weight = 195.24 g/mol |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Magnesium chloride (CAS number 7786-30-3); anhydrous, ≥98%, molecular weight = 95.21 g/mol |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | ||
| O2K-Titration Set | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20820-03 | Hamilton syringes with different volumes |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O 4876 | Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes (CAS number 1404-19-9); ≥90% total oligomycins basis (HPLC) |
| Pistil to homogenization | |||
| Proline | Sigma-Aldrich | P0380 | L-Proline (CAS number 147-85-3); powder; 99%; molecular weight = 115.13 g/mol |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Sodium pyruvate (CAS number 113-24-6), ≥99%; molecular weight = 110.04 g/mol |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | Rotetone (CAS number 83-79-4); ≥95%, molecular weight 394.42 g/ mol |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S 2378 | Sodium succinate dibasic hexahydrate (CAS number 6106-21-4); ≥99% |
| Sucrose | Merck | 107,651,000 | Sucrose for microbiology use (CAS number 57-50-1) |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | CAS number 107-35-7 |
References
- Brand, M. D., Orr, A. L., Perevoshchikova, I. V., Quinlan, C. L. The role mitochondrial function and cellular bioenergetics in ageing and disease. Br J Dermatol. 169, 1-8 (2013).
- Ramaccini, D., et al. Mitochondrial function and dysfunction in dilated cardiomyopathy. Front Cell Dev Biol. 8, 624216 (2021).
- Zhunina, O. A., et al. The role of mitochondrial dysfunction in vascular disease, tumorigenesis, and diabetes. Front Mol Biosci. 8, 671908 (2021).
- Prasun, P.
- Bhatti, J. S., Bhatti, G. K., Reddy, P. H. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in metabolic disorders - A Step towards mitochondria based therapeutic strategies. Biochim Biophys Acta. 1863 (5), 1066-1077 (2017).
- Perier, C., Vila, M. Mitochondrial biology and Parkinson's disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (2), 009332 (2012).
- DeMaagd, G., Philip, A. Parkinson's disease and its management. Pharmacy and Therapeutics. 40 (8), 504-532 (2015).
- Miyazaki, N., et al. PINK1-dependent and Parkin-independent mitophagy is involved in reprogramming of glycometabolism in pancreatic cancer cells. Biochem Biophys Res Commun. 625, 167-173 (2022).
- Kopin, I. J., Markey, S. P. MPTP toxicity: implications for research in Parkinson's disease. Annual Review of Neuroscience. 11, 81-96 (1988).
- Connolly, N. M. C., et al. Guidelines on experimental methods to assess mitochondrial dysfunction in cellular models of neurodegenerative diseases. Cell Death Differ. 25 (3), 542-572 (2018).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G.
- Haynes, C. M., Fiorese, C. J., Lin, Y. -F. Evaluating and responding to mitochondrial dysfunction: The UPRmt and beyond. Trends Cell Mol Biol. 23 (7), 311-318 (2013).
- Long, Q., Huang, L., Huang, K., Yang, Q. Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from mouse heart tissues using oroboros 2k-oxygraph. Methods Mol Biol. 1966, Clifton, N.J. 237-246 (2019).
- Scheiber, D., et al. High-resolution respirometry in human endomyocardial biopsies shows reduced ventricular oxidative capacity related to heart failure. Exp Mol Med. 51 (2), 1-10 (2019).
- Krumschnabel, G., Eigentler, A., Fasching, M., Gnaiger, E. Chapter nine - use of safranin for the assessment of mitochondrial membrane potential by high-resolution respirometry and fluorometry. Methods Enzymol. 542, 163-181 (2014).
- Demir, E. The potential use of Drosophila as an in vivo model organism for COVID-19-related research: a review. Turk J Biol. 45 (4), 559-569 (2021).
- Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: a primer on the Drosophila model system. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
- McBride, S. M. J., Holloway, S. L., Jongens, T. A. Using Drosophila as a tool to identify pharmacological therapies for fragile X syndrome. Drug Discov Today Technol Technologies. 10 (1), e129-e136 (2013).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods (San Diego, Calif). 68 (1), 105-115 (2014).
- Bar, S., Prasad, M., Datta, R. Neuromuscular degeneration and locomotor deficit in a Drosophila model of mucopolysaccharidosis VII is attenuated by treatment with resveratrol). Dis Model Mech. 11 (11), (2018).
- Imai, Y. PINK1-Parkin signaling in Parkinson's disease: Lessons from Drosophila. Neurosci Res. 159, 40-46 (2020).
- Julienne, H., Buhl, E., Leslie, D. S., Hodge, J. J. L. Drosophila PINK1 and parkin loss-of-function mutants display a range of non-motor Parkinson's disease phenotypes. Neurobiol Dis. 104, 15-23 (2017).
- Biswas, S., Bagchi, A. Analysis of the structural dynamics of the mutations in the kinase domain of PINK1 protein associated with Parkinson's disease. Gene. 857, 147183 (2023).
- Koh, H., Chung, J. PINK1 and Parkin to control mitochondria remodeling. Anat Cell Biol. 43 (3), 179-184 (2010).
- Zhu, M., Li, X., Tian, X., Wu, C. Mask loss-of-function rescues mitochondrial impairment and muscle degeneration of Drosophila pink1 and parkin mutants. Hum Mol Genet. 24 (11), 3272-3285 (2015).
- Park, J., et al. Mitochondrial dysfunction in Drosophila PINK1 mutants is complemented by parkin. Nature. 441 (7097), 1157-1161 (2006).
- Dytham, C. Choosing and using statistics: a biologist's guide. , Wiley-Blackwell. Hoboken, NJ. (2011).
- Bonora, M., et al.
- Gonçalves, D. F., et al. Caffeine improves mitochondrial function in PINK1B9-null mutant Drosophila melanogaster. J Bioenerg Biomembr. 55 (1), 1-13 (2023).
- Gonçalves, D. F., et al. Mitochondrial function and cellular energy maintenance during aging in a Drosophila melanogaster model of Parkinson disease. Mitochondrion. 65, 166-175 (2022).
- Janowska, J. I., et al. Mitochondrial respiratory chain complex I dysfunction induced by N-methyl carbamate ex vivo can be alleviated with a cell-permeable succinate prodrug. Toxicol In Vitro. 65, 104794 (2020).
- Ngo, D. T. M., et al. Oxidative modifications of mitochondrial complex II are associated with insulin resistance of visceral fat in obesity. Physiol Endocrinol Metab. 316 (2), E168-E177 (2019).
- Stroud, D. A., et al. Accessory subunits are integral for assembly and function of human mitochondrial complex I. Nature. 538 (7623), 123-126 (2016).
- Senyilmaz, D., et al. Regulation of mitochondrial morphology and function by stearoylation of TFR1. Nature. 525 (7567), 124-128 (2015).
- Poddighe, S., et al. Mucuna pruriens (Velvet bean) rescues motor, olfactory, mitochondrial and synaptic impairment in PINK1B9 Drosophila melanogaster genetic model of Parkinson's disease. PloS One. 9 (10), e110802 (2014).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 810, 25-58 (2012).
- Winer, L. S. P., Wu, M. Rapid analysis of glycolytic and oxidative substrate flux of cancer cells in a microplate. PloS One. 9 (10), e109916 (2014).
- Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio Protoc. 8 (10), e2850 (2018).
- Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. Am J Physiol. Cell Physiol. 292 (1), C125-C136 (2007).
- Divakaruni, A. S., Jastroch, M. A practical guide for the analysis, standardization and interpretation of oxygen consumption measurements. Nat Metab. 4 (8), 978-994 (2022).
- Bingol, B., Sheng, M. Mechanisms of mitophagy: PINK1, Parkin, USP30 and beyond. Free Radic Biol Med. 100, 210-222 (2016).
