Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

ניתוח תפקוד מיטוכונדריאלי במוטנט Drosophila melanogaster PINK1B9-Null באמצעות רספירומטריה ברזולוציה גבוהה

Published: November 10, 2023 doi: 10.3791/65664
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2
1Laboratory of Experimental Biochemistry and Toxicology, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Center of Natural and Exact Sciences, Federal University of Santa Maria, 2Graduate Program in Biological Sciences: Toxicological Biochemistry, Federal University of Santa Maria
* These authors contributed equally

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול רספירומטריה ברזולוציה גבוהה לניתוח ביו-אנרגטיקה בזבובי פירות מוטנטיים מסוג PINK1B9-null. השיטה משתמשת בפרוטוקול Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration (SUIT).

Abstract

מחלות נוירודגנרטיביות, כולל מחלת פרקינסון (PD), והפרעות תאיות כגון סרטן הן חלק מההפרעות המשבשות את חילוף החומרים האנרגטי עם פגיעה בתפקודי המיטוכונדריה. מיטוכונדריה הם אברונים השולטים הן בחילוף החומרים של האנרגיה והן בתהליכים תאיים המעורבים בהישרדות התאים ובמוות. מסיבה זו, גישות להערכת תפקוד המיטוכונדריה יכולות להציע תובנות חשובות על התנאים התאיים בתהליכים פתולוגיים ופיזיולוגיים. בהקשר זה, פרוטוקולי רספירומטריה ברזולוציה גבוהה (HRR) מאפשרים הערכה של כל תפקוד שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית או הפעילות של קומפלקסים מיטוכונדריאליים ספציפיים. יתר על כן, חקר הפיזיולוגיה והביו-אנרגטיקה של המיטוכונדריה דורש מודלים גנטיים וניסיוניים כגון Drosophila melanogaster.

מודל זה מציג מספר יתרונות, כגון הדמיון שלו לפיזיולוגיה האנושית, מחזור החיים המהיר שלו, תחזוקה קלה, עלות-תועלת, יכולות תפוקה גבוהות ומספר מינימלי של בעיות אתיות. תכונות אלה מבססות אותו באופן קולקטיבי ככלי רב ערך לניתוח תהליכים תאיים מורכבים. העבודה הנוכחית מסבירה כיצד לנתח את תפקוד המיטוכונדריה באמצעות מוטציה Drosophila melanogaster PINK1B9-null. הגן pink1 אחראי לקידוד קינאז משוער 1 המושרה על ידי PTEN, באמצעות תהליך המוכר כמיטופגיה, שהוא חיוני לסילוק מיטוכונדריה לא מתפקדת מהרשת המיטוכונדריאלית. מוטציות בגן זה נקשרו לצורה משפחתית אוטוזומלית רצסיבית מוקדמת של פרקינסון. מודל זה יכול לשמש לחקר תפקוד לקוי של המיטוכונדריה המעורב בפתופיזיולוגיה של פרקינסון.

Introduction

מיטוכונדריה הם אברונים תאיים השולטים בתפקודים חשובים, כולל ויסות אפופטוטי, הומאוסטזיס סידן והשתתפות במסלולים ביוסינתטיים. על ידי בעל חומר גנטי אוטונומי, הם מסוגלים לתרום לתהליכי תחזוקה ותיקון תאים. המבנה שלהם מכיל את שרשרת הובלת האלקטרונים ואת הזרחן החמצוני, שניהם חיוניים לאנרגיה תאית 1,2,3. בפרט, בקרת אנרגיה מושגת באמצעות ייצור אדנוזין טריפוספט (ATP) באמצעות זרחן חמצוני (OXPHOS)2. הפרעה בחילוף החומרים האנרגטי עם פגיעה בתפקודי המיטוכונדריה מתרחשת הן בהישרדות תאיםוהן במוות 4,5, הקשורים לעתים קרובות למגוון רחב של פתולוגיות אנושיות, כגון סרטן, ומחלות נוירודגנרטיביות כגון מחלת פרקינסון (PD)3,6.

מחלת פרקינסון היא הפרעה כרונית, פרוגרסיבית ונוירולוגית. הגורם העיקרי למחלה זו הוא מוות של תאי מוח, במיוחד בחומר ניגרה, אשר אחראים לייצור של נוירוטרנסמיטר דופמין, אשר שולט על תנועה 6,7,8. התצפית המוקדמת ביותר שקישרה בין פרקינסוניזם לתפקוד לקוי של המיטוכונדריה נעשתה בשנת 1988, במודלים ניסיוניים המשתמשים ברעלים המעכבים את שרשרת הנשימה קומפלקס I9.

נכון לעכשיו, ישנן מספר שיטות להערכת תפקוד לקוי של המיטוכונדריה 10,11,12,1 3; עם זאת, בהשוואה לגישות קונבנציונליות, רספירומטריה ברזולוציה גבוהה (HRR) מציגה רגישות ויתרונות מעולים13,14. לדוגמה, פרוטוקולי HRR מאפשרים להעריך את כל תפקוד שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית או את הפעילות של קומפלקסים מיטוכונדריאליים ספציפיים14,15. ניתן להעריך תפקוד לקוי של המיטוכונדריה בתאים שלמים, במיטוכונדריה מבודדים, או אפילו ב-ex vivo 10,11,13,14.

תפקוד לקוי של המיטוכונדריה קשור קשר הדוק עם תהליכים פתולוגיים ופיזיולוגיים רבים. לכן חשוב לחקור פיזיולוגיה מיטוכונדריאלית וביו-אנרגטיקה באמצעות מערכות מודל גנטיות וניסיוניות. בהקשר זה, מחקר על Drosophila melanogaster, זבוב הפירות, יש כמה יתרונות. מודל זה חולק מאפיינים ותהליכים תאיים בסיסיים עם בני אדם, כולל שימוש בדנ"א כחומר גנטי, אברונים משותפים ומסלולים מולקולריים שמורים המעורבים בהתפתחות, חסינות ואיתות תאי. בנוסף, לזבובי הפירות יש מחזור חיים מהיר, תחזוקה קלה, עלות נמוכה, תפוקה גבוהה ופחות דאגות אתיות, ובכך מהווים כלי רב ערך לניתוח תהליכים תאיים מורכבים 16,17,18,19,20.

יתר על כן, הומולוג של הגן קינאז משוער 1 (pink1) המושרה על ידי PTEN מבוטא ב- D. melanogaster. יש לו תפקיד מכריע בסילוק מיטוכונדריה פגומה בתהליך של מיטופגיה8. בבני אדם, מוטציות בגן זה נוטות אנשים לצורה משפחתית אוטוזומלית רצסיבית של PD הקשורה לתפקוד לקוי של המיטוכונדריה 8,21,22,23. כתוצאה מכך, זבוב הפירות הוא מודל חייתי רב עוצמה למחקרים על הפתופיזיולוגיה של מחלת פרקינסון ולסינון מועמדים לתרופות המתמקדים בתפקוד לקוי של המיטוכונדריה ובביו-אנרגטיקה. לכן, העבודה הנוכחית מסבירה כיצד לנתח תפקוד מיטוכונדריאלי במודל של PD מ D. melanogaster באמצעות טכניקת HRR ב OROBOROS עם Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration (SUIT) פרוטוקול.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

השתמשנו בזנים w1118 (לבן) ו-w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 (המכונה Pink1B9) (מזהה FlyBase: FBgn0029891) ממרכז המניות בלומינגטון דרוזופילה (מספר מזהה: 34749). במחקר זה, מוטנטים זכריים של D. melanogaster PINK1B9-null מושווים לזכר D. melanogaster מזן w1118, המשמש כקבוצת ביקורת (רקע גנטי). יש לנתח פרמטרים אחרים במקביל לניסויי הרספירומטריה כדי לוודא שלזבובים יש את הגנוטיפ הנכון (Pink1B9/Y), כגון עיוותים בבית החזה ובעיות תנועה, המתוארים היטב עבור זבובים מוטנטייםורודים1 B9 24,25,26.

1. בעלי חיים ודיור

  1. שמרו את הזבובים בבקבוקי זכוכית המכילים 10 מ"ל של תזונה סטנדרטית (שמרים 1.73%, קמח סויה 0.9%, קמח תירס 7.3%, אגר 0.5%, סירופ תירס 7.6% וחומצה פרופיונית 0.48%) בטמפרטורה ולחות קבועות (25 מעלות צלזיוס ו-60%, בהתאמה), עם מחזור אור/חושך של 12 שעות: 12 שעות.
  2. עבור כל ניסוי, השתמש בשני זבובים בגילאי 1-3 ימים לאחר האקלוסיה.
    הערה: נקבות הזבובים הבתוליות המוטנטיות PINK1B9-null הוצלבו עם w1118 זכרים כדי להשיג את זכרי F1 עם גנוטיפ Pink1B9/Y.

2. הכנת מדגם

  1. הכן את מאגר MiR05 כמתואר בטבלה 1.
  2. מרדימים את הזבובים על קרח ומעבירים אותם לצינורות מיקרוצנטריפוגות (שני זבובים בכל צינור).
  3. בכל צינור, הוסף 200 μL של חיץ MiR05 צונן והומוגניזציה של הזבובים. הומוגניזציה ידנית, הפעלת לחץ עדין (כ 4-6 פעימות של pestle) כדי למנוע את התפוררות המיטוכונדריה.

3. כיול רספירומטריה ברזולוציה גבוהה של חיישני חמצן פולרוגרפיים

הערה: לתאי OROBOROS יש נפח כולל של כ -2 מ"ל. כיול נדרש כדי להבטיח ששטף החמצן קרוב ל-0 PMOL כדי להתחיל את הבדיקה.

  1. החל מהכיול, הוסף 2 מ"ל של MiR05 לתא. מכסים את החדר בפקק ולא משאירים בועות אוויר; לאחר מכן, משוך בזהירות את הפקק ליצירת בועת אוויר אחת בודדת.
  2. פתח את תוכנת OROBOROS Dat.Lab. הזינו טמפרטורה של 25°C בשדה טמפרטורת הבלוק ולחצו על Connect to Oxygraph-2k (איור 1A).
  3. לחץ ובחר את התיקיה שבה יש לשמור את הכיול ולחץ על שמור.
  4. כאשר נפתח חלון חדש, תן שם לניסוי ולדוגמאות (אם אתה מכייל, פשוט הזן את כיול השם) ולחץ על שמור.
  5. עבור אל תפריט פריסה ובחר באפשרות הראשונה: 01 Calibration Exp. Gr.3 - Temp כפי שמוצג באיור 1B.
  6. המתן עד שהתוכנית תנתב מחדש לפריסת הכיול, המתן עד שהקו האדום יציג קו ישר סטנדרטי עם נקודות סביב 0 pmol. לאחר מכן, בחרו שתי נקודות: אחת עבור תא A והשנייה עבור תא B (איור 1C) כאשר הקו האדום נמצא בדיוק באפס.
    הערה: הנקודות שנבחרו חייבות להיות שטף חמצן (קו אדום) סביב 0.
    1. לסימון הנקודות בשני החדרים, בחרו ריכוז O2 בצד ימין של המסך, בחרו בנקודה המסומנת והעתיקו את ערכי הטמפרטורה והלחץ הברומטרי ביחס לנקודה. הדביקו את הערכים האלה בתיבות למטה ולחצו על כיול והעתקה ללוח בפינה הימנית התחתונה של המסך, כפי שמוצג באיור 2.
    2. בצע תהליך זה עבור שני החדרים (A ו - B), ולאחר מכן עבור לתפריט קובץ ובחר שמור והתנתק.
      הערה: לאחר תהליך הכיול, התוכנית תנתב מחדש את המשתמש למסך הבית כך שהתוכנה תהיה מוכנה להתחיל את בדיקת HRR. לצורך בדיקה זו, נשתמש בפרוטוקול SUIT.

4. פרוטוקול חליפה

  1. עם השלמת הכיול, הסר את הפקקים ופתח את החדרים.
  2. שטפו את הפקקים (המחזיקים את הקצה שאינו נוגע בדגימה) ואת התאים עם 100% אתנול, 70% אתנול ומים מזוקקים, בסדר הזה.
    הערה: חזור על התהליך עבור כל שינוי דגימה.
  3. הומוגניזציה של הזבובים ב 200 μL של חיץ, למקם את כל תוכן הדגימה בתא באמצעות micropipette, ולמקם מחדש את הפקק בתא, תוך הקפדה לא ליצור בועות אוויר.
    הערה: אם נוצרות בועות אוויר, הסר את הפקק בעדינות והוסף 100 μL של חיץ MIR05.
  4. לחץ על תפריט פריסה ובחר באפשרות 05 Flow by Corrected Volume כפי שמוצג באיור 1B.
  5. המתן לניתוב מחדש לחלון חדש. לחץ על שמור כדי לבחור את התיקיה שבה יש לשמור את הניסוי.
  6. המתן לפתיחת חלון חדש נוסף. תן שם לניסוי בחלל קוד ניסויי. לאחר מכן, תן שם לכל דגימה בתא המתאים לה A ו- B בשדה Sample, והגדר את יחידת השדה ליחידה.
    הערה: ניתן לבחור גם יחידות אחרות, לדוגמה, מיליוני תאים או מ"ג.
  7. בהתחשב בכך שפרוטוקול זה משתמש בשני זבובים (2 יחידות) ונפח התא הוא 2 מ"ל, בשדה הריכוז , הגדר 1 לכל מ"ל (איור 1D).
    הערה: כאן, כמות המדגם נורמלה על ידי מספר הזבובים; עם זאת, נורמליזציה זו עשויה להתבצע על ידי תכולת החלבון של הדגימה, כימות DNA מיטוכונדריאלי, או פעילות של ציטראט סינתאז.
  8. כאשר אות שטף החמצן (הקו האדום) יציב על הערך החיובי, התחילו את פרוטוקול HRR עם טיטרציה של מצעים, מעכבים ובלתי מצמדים (איור 3). כל הריאגנטים והציוד הבאים מוצגים בטבלה 1.
    1. הוסף דיגיטונין (5 מיקרוגרם/מ"ל) כדי לחדור לקרום המיטוכונדריה.
    2. מוסיפים מצעי פירובט (5 מ"מ), מלאט (2 מ"מ) ופרולין (10 מ"מ) וממתינים עד ששטף החמצן עולה ומתייצב. כדי לסמן את האירוע עבור כל תוספת מגיב, הקש על מקש F4 במקלדת והזן את השם של כל מגיב.
    3. הוסף ADP (5mM) כדי להתאים את שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית ולחכות לעלייה וייצוב של שטף החמצן.
    4. מוסיפים סוקצינאט (10 מ"מ) ומחכים לעלייה וייצוב של שטף החמצן.
    5. הוסף אוליגומיצין (2.5 מיקרומטר) כדי לעכב ATP סינתאז ולחפש ירידה בשטף החמצן.
    6. המתן עד שהקו האדום יתייצב ונפרק את העברת האלקטרונים המיטוכונדריאלית באמצעות קרבוניל-4-(trifluoromethoxy) פנילהידראזון ציאניד (FCCP) עם טיטרים של 0.25 מיקרומטר עד שתגיע לצריכת החמצן המרבית, כפי שמודגם על ידי עליית הקו האדום. לאחר ייצוב שטף החמצן, התחל להוסיף את המעכבים של כל קומפלקס, אחד בכל פעם.
    7. הוסף רוטנון (0.5 מיקרומטר), מעכב I מורכב. המתן לירידה וייצוב של שטף החמצן כדי להוסיף את המעכב הבא.
    8. הוסף Malonate (5 mM), מעכב II מורכב. המתן לירידה וייצוב של שטף החמצן כדי להוסיף את המעכב הבא.
    9. לבסוף, להוסיף Antimycin (2.5 μM), מעכב III מורכב. המתן לירידה ואחריה עלייה וייצוב של שטף החמצן.
      הערה: שטף החמצן אמור להתייצב בערך חיובי אך מתחת לערך עבור העיכוב האחרון של קומפלקסים של חלבון מיטוכונדריאלי.
  9. בסוף הניתוח, להסיר את כל התוכן של החדרים באמצעות micropipette. יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C לצורך ניתוח עתידי, בעת הצורך.

5. ניתוח נתונים

  1. השתמש בחבילת תוכנה סטטיסטית מתאימה לניתוח נתונים.
  2. בצע בדיקות t כדי להעריך את ההבדלים בין שתי הקבוצות. עבור מצבים הכוללים טיפולים מרובים, השתמש בניתוח שונות (ANOVA) כמבחן סטטיסטי 27.
  3. חלץ את ערכי שטף O2 מהגרף שנוצר על-ידי התוכנה. OXPHOS CI מתייחס לערך של שטף O2 לאחר הוספת ADP. OXPHOS CII מתקבל על ידי חיסור OXPHOS CI&CII - OXPHOS CI. OXPHOS CI&CII הוא הערך של שטף O2 המופק לאחר הוספת סוקצינאט. ETS CI&CII הוא ערך השטף O2 לאחר הוספת FCCP. ETS CI = FCCP - Rotenone ו- ETS CII = Rotenone - Malonate.
  4. חשב סינתזת ATP כהפרש בין OXPHOS (P) ו- LEAK (L) (P - L)28.
  5. קבע את יחס בקרת הנשימה (RCR) על ידי חישוב היחס OXPHOS/LEAK, כאשר RCR = P/L.11

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כאן, שטף O2 במצבי OXPHOS CI (P = 0.0341) ו-OXPHOS CI&II (P = 0.0392) מופחת בזבובי PINK1B9 null בהשוואה לזבובי ביקורת (איור 4). תוצאה זו נצפתה גם בממצאים קודמים של הקבוצה שלנו29,30.

CI ו-CII הם רכיבי מפתח של מערכת הובלת האלקטרונים (ETS), שבה CI אחראי על העברת אלקטרונים מ-NADH ליוביקינון, בעוד CII מעביר אלקטרונים מסוקסינט ליוביקינון 31,32,33. זבובי PINK1B9 null הראו שטף O2 נמוך יותר במצבי ETS CI (P = 0.0338), ETS CII (P = 0.0457) ו- ETS CI&II (P = 0.0247) (איור 5). תוצאות אלה מצביעות על כך שמערכת העברת האלקטרונים נפגעת בזבובים חסרי הגן pink1 ושטף O2 הן בשלב OXPHOS והן בשלב ETS תלוי ב-CI וב-CI&CII, דבר העולה בקנה אחד עם עבודות אחרות המדגימות פעילות CI מופחתת במודלים ורודים1-/- 33,34,35.

יתר על כן, שיפוע הפרוטון על פני הממברנה הפנימית של המיטוכונדריה חיוני לסינתזה של ATP28. הירידה בשטף O2 ב-ETS CI וב-ETS CII מצביעה על הפרעה בשטף האלקטרונים לאורך עשן טבק סביבתי. הפרעה זו בשטף האלקטרונים משפיעה על תהליך OXPHOS המוביל לירידה בסינתזת ATP. הייתה גם ירידה משמעותית בצריכת O2 הקשורה לסינתזה של ATP (P = 0.0280) בזבובי PINK1B9 null בהשוואה לזבובי ביקורת (איור 6B). לירידה בסינתזת ATP ב-D. melanogaster יכולות להיות השפעות משמעותיות על חילוף החומרים של אנרגיה, תהליכים תאיים ותפקודים פיזיולוגיים כלליים. בנוסף, ניתן לכמת את יעילות תהליך OXPHOS על ידי מדד המכונה RCR, המשקף את הידוק הצימוד בין נשימה לזרחון. לכן, הפחתת RCR (P = 0.0432) מצביעה על פירוק צימוד מיטוכונדריאלי, מה שעשוי להשפיע על תהליך OXPHOS, מה שמרמז על כך שהמיטוכונדריה פחות יעילים בניצול חמצן ובייצור ATP (איור 6C). תוצאות אלה עשויות להשפיע על גדילתו, התפתחותו, תנועתו, התרבותו ובריאותו הכללית של זבוב הפירות, ולתרום לפתוגנזה של מחלות נוירודגנרטיביות מסוימות, כולל PD 8,28,29,32.

Figure 1
איור 1: פריסות בתוכנת OROBOROS Dat.Lab. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: שלבי כיול החדרים בתוכנת OROBOROS Dat.Lab. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: פרוטוקול SUIT המדגים את עיקרי חיבור המצע והמעכב. ראשית, מוסיפים דיגיטונין (DIG) ואחריו מצע ספציפי קומפלקס I: מלאט, פירובט ופרולין (MPP), מצע ATP סינתאז (ADP), ולאחר מכן, מצע לקומפלקס II: סוקצינאט (S). לאחר מכן, מעכב ATP סינתאז: אוליגומיצין (OMY) מתווסף, ואחריו קרבוניל-4-(trifluoromethoxy) פנילהידראזון ציאניד (F), ומעכבי קומפלקס I, II ו- III: רוטנון (R), מלונט (MNA) ואנטימיצין (AMA)36. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: ספירומטריה ברזולוציה גבוהה המשווה בין זבובי W1118 ו-PINK1B9 . (A) OXPHOS CI, (B) OXPHOS CII ו-(C) OXPHOS CI&CII. הנתונים מוצגים כממוצע ±- S.E.M. ומנותחים באמצעות מבחן T. n = 5-9. עמ' < 0.05. קיצורים: OXPHOS = זרחן חמצוני; CI = קומפלקס I; CII = קומפלקס II. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: ספירומטריה ברזולוציה גבוהה המשווה בין זבובי W1118 ו-PINK1B9 . (A) ETS CI, (B) ETS CII ו-(C) ETS CI&CII. הנתונים מוצגים כממוצע ±- S.E.M. ומנותחים על ידי מבחן T. n = 5-9. עמ' < 0.05. קיצורים: ETS = מערכת הובלת אלקטרונים; CI = קומפלקס I; CII = קומפלקס II. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: ספירומטריה ברזולוציה גבוהה המשווה בין זבובי W1118 ו-PINK1B9 . (A) דליפה, (B) סינתזת ATP ו-(C) יחס שליטה נשימתית. הנתונים מוצגים כממוצע ±- S.E.M. ומנותחים על ידי מבחן T. n = 5-9. עמ' < 0.05. קיצור: RCR = יחס שליטה נשימתית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

HRR היא טכניקה רבת עוצמה לחקר נשימה מיטוכונדריאלית ומטבוליזם של אנרגיה ב-D. melanogaster ובאורגניזמים אחרים. הוא מספק הערכה מפורטת וכמותית של תפקוד המיטוכונדריה, ומאפשר לחוקרים לקבל תובנות לגבי הביו-אנרגטיקה של התאים. הפרוטוקול המוצג כאן מתאר את הערכת תפקוד שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית ואת הפעילות של קומפלקסים מיטוכונדריאליים ספציפיים באמצעות פרוטוקול SUIT ב- D. melanogaster. פרוטוקול SUIT כולל מניפולציה שיטתית של מצעים שונים, מפרקים ומעכבים כדי לבחון היבטים שונים של נשימה מיטוכונדריאלית.

הטכניקה המתוארת מאפשרת להעריך עיכוב נשימתי הנובע מהשפעות על OXPHOS או ETS, פעילות דהידרוגנאז (CI ו- CII) ושלמות הממברנה (צימוד של OXPHOS). כאן, ביצענו את הניסויים באמצעות זבובי PINK1B9-null כדי לחקור תפקוד לקוי של המיטוכונדריה, מאחר שהוא קשור למחלת פרקינסון34,35. עם זאת, פרוטוקול זה יכול להיות שימושי עבור מודלים שונים של מחלות, טיפולים תרופתיים ומחקרי טוקסיקולוגיה.

בנוסף, ניתן להתאים את הכנת הדגימה לדרישות הניסוי36. שלב קריטי בפרוטוקול הרספירומטריה הוא הכנת הדגימה. חשוב לקבוע את הפרוטוקול הנכון לסוג הדגימה (תא, מיטוכונדריה מבודדת, הומוגנאט), וחשוב לשקול את השיטה המתאימה לנורמליזציה של הדגימה (כמות חלבון, תכולת DNA, פעילות סינתאז ציטראט). חשוב גם להשתמש באותו חיץ להכנת הדגימה ולבדיקת הספירומטריה.

מכיוון שפרוטוקול הכנת הדגימה המתואר כאן הוא פשוט, הוא בדרך כלל אינו מהווה בעיות עבור הטכניקה. אם נבחר סוג אחר של מדגם או הכנתו השתנתה, יש צורך בסטנדרטיזציה זהירה. ערבוב ויציבות טמפרטורה משפיעים על האות של חיישן החמצן הפולרוגרפי, ויוצרים שגיאה במדידות נשימה באמצעות אוקסיגרף. לכן, כיול נכון של החדר מהווה צעד חשוב להפחתת טעויות במהלך מדידות הנשימה.

שיטה זו להערכת תפקוד המיטוכונדריה בדגימות זבובים מציעה מספר יתרונות על פני גישות חלופיות. אחת החוזקות העיקריות של HRR היא יכולתו לספק מדידות ישירות ומדויקות של צריכת חמצן, מה שמאפשר ניתוח מפורט של תפקוד המיטוכונדריה וחילוף החומרים בתאים. לכן, HRR משמש לעתים קרובות במחקר המתמקד בהבנת תפקוד לקוי של המיטוכונדריה, ייצור אנרגיה ותגובות תאיות למצעים או תנאים שונים. יתר על כן, הוא רב-תכליתי - המאפשר שימוש במגוון רחב של סוגי דגימות, כולל מיטוכונדריה מבודדים - ודורש כמויות קטנות של דגימות ביולוגיות, וזה שימושי כאשר כמות הדגימה מוגבלת 1,2,3. שיטות המשתמשות בבידוד מיטוכונדריאלי, למשל, כוללות בדרך כלל מספר משמעותי של זבובים, הנעים בין 50 ל -200 פרטים, מה שהופך את המחקר עם מוטנטים לקשה, מכיוון שהשגת מספר גדול של מוטנטים עבור מודלים מסוימים של מחלות עשויה להיות לא מעשית.

בדומה לשיטת HRR, מנתח השטף החוץ תאי של סוסון הים Bioscience הוא כלי מדעי המשמש למדידת צריכת חמצן והחמצה חוץ-תאית. עם זאת, יש להם גישות ויישומים שונים. מנתח השטף החוץ-תאי של סוסון ים Bioscience מכמת שינויים מיידיים בקצב צריכת החמצן (OCR) ובקצב ההחמצה החוץ-תאי (ECAR) של תאים. OCR מעיד על נשימה מיטוכונדריאלית וייצור אנרגיה, ואילו ECAR מציע תובנות לגבי פעילות גליקוליטית. תפקידו העיקרי טמון בהערכת הדינמיקה המטבולית התאית בתנאים פיזיולוגיים מגוונים, מה שהופך אותו לכלי חשוב במיוחד בהבהרת המודולציות המטבוליות המורכבות הקשורות להקשרים פתולוגיים. בנוסף, סוסון ים מיועד להקל על השימוש, ומאפשר לחוקרים לבצע בדיקות מטבוליות מהירות 37,38,39. לעומת זאת, HRR דורש הכשרה מיוחדת ומומחיות כדי להפעיל ולנתח נתונים ביעילות. זה כרוך בשימוש באלקטרודת חמצן כדי למדוד ישירות את צריכת החמצן על ידי תאים או מיטוכונדריה 13,14,40. יתרון של HRR הוא הרבגוניות שלו בתכנון פרוטוקולי ספירומטריה שונים, דבר שאינו מעשי בעת שימוש בסוסון ים. רב-תכליתיות זו לתכנון פרוטוקולים הקשורים בעלות נמוכה הופכת את שיטת HRR לבחירה בת קיימא עבור מעבדות עם מימון מוגבל. חסרון נוסף של מערכת הרספירומטריה המשמשת בפרוטוקול הנוכחי הוא חוסר האפשרות לעבוד עם מספר דגימות בו זמנית, מה שפוגע בניתוח התפוקה הגבוהה. לפיכך, קבוצות ניסוי חייבות להיות מתוכננות היטב כדי לאפשר השוואה נכונה ביניהן. עם זאת, היתרונות של מערכת זו טמונים בעובדה כי דגימות מכל סוג ניתן לבדוק, מתאים מבודדים אורגניזמים חיים שלמים, כגון C. elegans, למשל40.

לסיכום, HRR היא שיטה אמינה לחקר תפקוד המיטוכונדריה בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים41. לכל מודל ניסויי מאפיינים ומגבלות שונים, המחייבים מתודולוגיה והתאמות הכנת דגימות כדי להבטיח רכישת נתונים אמינה ומשמעותית בהערכת נשימה מיטוכונדריאלית. פרוטוקול זה מציע לחוקרים שיטה אמינה להעריך את ההשפעות של גורמים סביבתיים, התערבויות ניסיוניות או מוטציות גנטיות על תפקוד המיטוכונדריה ב-D. melanogaster.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.

Acknowledgments

המחברים מודים לסוכנות הברזילאית Coordenação de Aperfeiçoamento de Pesquisa Pessoal de Nível Superior (CAPES EPIDEMIAS 09 #88887.505377/2020). P.M. (#88887.512821/2020-00) ו- T.D. (#88887.512883/2020-00) הם מקבלי מלגות מחקר.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ADP Sigma-Aldrich A5285 Adenosine 5′-diphosphate sodium sal (CAS number 72696-48-1); ≥95%; molecular weight = 501.31 g/mol.
Ágar Kasv K25-1800 For bacteriologal use
Antimycin-A Sigma-Aldrich A8674 Antimycin A from Streptomyces sp. (CAS number 1397-94-0); molecular weight  540 g/mol;
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A7030 Bovine Serum Albumin (CAS number 9048-46-8); pH 7,0 ≥ 98%
Datlab software Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria 20700 Software for data acquisition and analysis
Digitonin Sigma-Aldrich D 5628 CAS number 11024-24-1
Distilled water
Drosophila melanogaster strain w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 Obtained from Bloomington Drosophila stock center
Drosophila melanogaster strain w1118 Obtained  from the Federal University of Santa Maria
EGTA Sigma-Aldrich E8145 Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (CAS number 13638-13-3); ≥97%; molecular weight =468.28 g/mol
FCCP Sigma-Aldrich C2920 Carbonyl cyanide 4- (trifluoromethoxy)phenylhydrazone  (CAS number 370-86-5); ≥98% (TLC), powder 
GraphPad Prism version 8.0.1. Software for data acquisition and analysis
Hepes Sigma-Aldrich H4034 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (CAS number 7365-45-9); ≥99,5% (titration), cell cultured tested; molecular weight = 238.30 g/mol
High-resolution respirometer Oxygraph O2K Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria 10022-02 Startup O2K respirometer kit
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5379 Monopotassium phosphate (CAS number 7778-77-0); Reagente Plus, molecular weigt = 136.09 g/mol
KOH Sigma-Aldrich 211473 Potassium hydroxide (CAS number 1310-58-3); ACS reagent, ≥85%, pellets
Malate Sigma-Aldrich M1296 Malonic acid (CAS number 141-82-2); 99%, molecular weight = 104.06 g/mol). A solution is pH adjusted to approximately 7.0.
Malic acid Sigma-Aldrich M1000 (S)-(−)-2-Hydroxysuccinic acid (CAS number 97-67-6); ≥95% ; molecular weight = 134.09 g/mol
MES Sigma-Aldrich M3671 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (CAS number 4432-31-9); ≥99% (titration); molecular weight = 195.24 g/mol
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266 Magnesium chloride (CAS number 7786-30-3); anhydrous, ≥98%, molecular weight = 95.21 g/mol
Microcentrifuge tubes Eppendorf
O2K-Titration Set Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria 20820-03 Hamilton syringes with different volumes
Oligomycin Sigma-Aldrich O 4876 Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes (CAS number  1404-19-9); ≥90% total oligomycins basis (HPLC)
Pistil to homogenization
Proline Sigma-Aldrich P0380 L-Proline (CAS number 147-85-3); powder; 99%; molecular weight = 115.13 g/mol
Pyruvate Sigma-Aldrich P2256 Sodium pyruvate (CAS number 113-24-6), ≥99%; molecular weight = 110.04 g/mol
Rotenone Sigma-Aldrich R8875 Rotetone (CAS number 83-79-4); ≥95%, molecular weight 394.42 g/ mol
Succinate Sigma-Aldrich S 2378 Sodium succinate dibasic hexahydrate (CAS number 6106-21-4); ≥99%
Sucrose Merck 107,651,000 Sucrose for microbiology use (CAS number 57-50-1)
Taurine Sigma-Aldrich T0625 CAS number 107-35-7

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brand, M. D., Orr, A. L., Perevoshchikova, I. V., Quinlan, C. L. The role mitochondrial function and cellular bioenergetics in ageing and disease. Br J Dermatol. 169, 1-8 (2013).
  2. Ramaccini, D., et al. Mitochondrial function and dysfunction in dilated cardiomyopathy. Front Cell Dev Biol. 8, 624216 (2021).
  3. Zhunina, O. A., et al. The role of mitochondrial dysfunction in vascular disease, tumorigenesis, and diabetes. Front Mol Biosci. 8, 671908 (2021).
  4. Prasun, P. Mitochondrial dysfunction in metabolic syndrome. Biochim Biophys Acta. 1866 (10), 165838 (2020).
  5. Bhatti, J. S., Bhatti, G. K., Reddy, P. H. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in metabolic disorders - A Step towards mitochondria based therapeutic strategies. Biochim Biophys Acta. 1863 (5), 1066-1077 (2017).
  6. Perier, C., Vila, M. Mitochondrial biology and Parkinson's disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (2), 009332 (2012).
  7. DeMaagd, G., Philip, A. Parkinson's disease and its management. Pharmacy and Therapeutics. 40 (8), 504-532 (2015).
  8. Miyazaki, N., et al. PINK1-dependent and Parkin-independent mitophagy is involved in reprogramming of glycometabolism in pancreatic cancer cells. Biochem Biophys Res Commun. 625, 167-173 (2022).
  9. Kopin, I. J., Markey, S. P. MPTP toxicity: implications for research in Parkinson's disease. Annual Review of Neuroscience. 11, 81-96 (1988).
  10. Connolly, N. M. C., et al. Guidelines on experimental methods to assess mitochondrial dysfunction in cellular models of neurodegenerative diseases. Cell Death Differ. 25 (3), 542-572 (2018).
  11. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem J. 435, 297-312 (2011).
  12. Haynes, C. M., Fiorese, C. J., Lin, Y. -F. Evaluating and responding to mitochondrial dysfunction: The UPRmt and beyond. Trends Cell Mol Biol. 23 (7), 311-318 (2013).
  13. Long, Q., Huang, L., Huang, K., Yang, Q. Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from mouse heart tissues using oroboros 2k-oxygraph. Methods Mol Biol. 1966, Clifton, N.J. 237-246 (2019).
  14. Scheiber, D., et al. High-resolution respirometry in human endomyocardial biopsies shows reduced ventricular oxidative capacity related to heart failure. Exp Mol Med. 51 (2), 1-10 (2019).
  15. Krumschnabel, G., Eigentler, A., Fasching, M., Gnaiger, E. Chapter nine - use of safranin for the assessment of mitochondrial membrane potential by high-resolution respirometry and fluorometry. Methods Enzymol. 542, 163-181 (2014).
  16. Demir, E. The potential use of Drosophila as an in vivo model organism for COVID-19-related research: a review. Turk J Biol. 45 (4), 559-569 (2021).
  17. Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: a primer on the Drosophila model system. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
  18. McBride, S. M. J., Holloway, S. L., Jongens, T. A. Using Drosophila as a tool to identify pharmacological therapies for fragile X syndrome. Drug Discov Today Technol Technologies. 10 (1), e129-e136 (2013).
  19. Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods (San Diego, Calif). 68 (1), 105-115 (2014).
  20. Bar, S., Prasad, M., Datta, R. Neuromuscular degeneration and locomotor deficit in a Drosophila model of mucopolysaccharidosis VII is attenuated by treatment with resveratrol). Dis Model Mech. 11 (11), (2018).
  21. Imai, Y. PINK1-Parkin signaling in Parkinson's disease: Lessons from Drosophila. Neurosci Res. 159, 40-46 (2020).
  22. Julienne, H., Buhl, E., Leslie, D. S., Hodge, J. J. L. Drosophila PINK1 and parkin loss-of-function mutants display a range of non-motor Parkinson's disease phenotypes. Neurobiol Dis. 104, 15-23 (2017).
  23. Biswas, S., Bagchi, A. Analysis of the structural dynamics of the mutations in the kinase domain of PINK1 protein associated with Parkinson's disease. Gene. 857, 147183 (2023).
  24. Koh, H., Chung, J. PINK1 and Parkin to control mitochondria remodeling. Anat Cell Biol. 43 (3), 179-184 (2010).
  25. Zhu, M., Li, X., Tian, X., Wu, C. Mask loss-of-function rescues mitochondrial impairment and muscle degeneration of Drosophila pink1 and parkin mutants. Hum Mol Genet. 24 (11), 3272-3285 (2015).
  26. Park, J., et al. Mitochondrial dysfunction in Drosophila PINK1 mutants is complemented by parkin. Nature. 441 (7097), 1157-1161 (2006).
  27. Dytham, C. Choosing and using statistics: a biologist's guide. , Wiley-Blackwell. Hoboken, NJ. (2011).
  28. Bonora, M., et al. ATP synthesis and storage. Purinergic Signal. 8 (3), 343-357 (2012).
  29. Gonçalves, D. F., et al. Caffeine improves mitochondrial function in PINK1B9-null mutant Drosophila melanogaster. J Bioenerg Biomembr. 55 (1), 1-13 (2023).
  30. Gonçalves, D. F., et al. Mitochondrial function and cellular energy maintenance during aging in a Drosophila melanogaster model of Parkinson disease. Mitochondrion. 65, 166-175 (2022).
  31. Janowska, J. I., et al. Mitochondrial respiratory chain complex I dysfunction induced by N-methyl carbamate ex vivo can be alleviated with a cell-permeable succinate prodrug. Toxicol In Vitro. 65, 104794 (2020).
  32. Ngo, D. T. M., et al. Oxidative modifications of mitochondrial complex II are associated with insulin resistance of visceral fat in obesity. Physiol Endocrinol Metab. 316 (2), E168-E177 (2019).
  33. Stroud, D. A., et al. Accessory subunits are integral for assembly and function of human mitochondrial complex I. Nature. 538 (7623), 123-126 (2016).
  34. Senyilmaz, D., et al. Regulation of mitochondrial morphology and function by stearoylation of TFR1. Nature. 525 (7567), 124-128 (2015).
  35. Poddighe, S., et al. Mucuna pruriens (Velvet bean) rescues motor, olfactory, mitochondrial and synaptic impairment in PINK1B9 Drosophila melanogaster genetic model of Parkinson's disease. PloS One. 9 (10), e110802 (2014).
  36. Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 810, 25-58 (2012).
  37. Winer, L. S. P., Wu, M. Rapid analysis of glycolytic and oxidative substrate flux of cancer cells in a microplate. PloS One. 9 (10), e109916 (2014).
  38. Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio Protoc. 8 (10), e2850 (2018).
  39. Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. Am J Physiol. Cell Physiol. 292 (1), C125-C136 (2007).
  40. Divakaruni, A. S., Jastroch, M. A practical guide for the analysis, standardization and interpretation of oxygen consumption measurements. Nat Metab. 4 (8), 978-994 (2022).
  41. Bingol, B., Sheng, M. Mechanisms of mitophagy: PINK1, Parkin, USP30 and beyond. Free Radic Biol Med. 100, 210-222 (2016).

Tags

ביוכימיה גיליון 201 תפקוד מיטוכונדריאלי ספירומטריה ברזולוציה גבוהה קצב צריכת חמצן דרוזופילה מלנוגסטר
ניתוח תפקוד מיטוכונדריאלי במוטנט <em>Drosophila melanogaster</em> PINK1<sup>B9-Null</sup> באמצעות רספירומטריה ברזולוציה גבוהה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Michelotti, P., Duarte, T., Dalla… More

Michelotti, P., Duarte, T., Dalla Corte, C. L. Analyzing Mitochondrial Function in a Drosophila melanogaster PINK1B9-Null Mutant Using High-resolution Respirometry. J. Vis. Exp. (201), e65664, doi:10.3791/65664 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter