Summary
Här presenterar vi ett högupplöst respirometriprotokoll för att analysera bioenergetik i PINK1 B9-null-muterade bananflugor. Metoden använder protokollet Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration (SUIT).
Abstract
Neurodegenerativa sjukdomar, inklusive Parkinsons sjukdom (PD), och cellulära störningar som cancer är några av de sjukdomar som stör energimetabolismen med försämring av mitokondriella funktioner. Mitokondrier är organeller som styr både energimetabolism och cellulära processer som är involverade i cellöverlevnad och celldöd. Av denna anledning kan metoder för att utvärdera mitokondriell funktion ge viktiga insikter om cellulära förhållanden i patologiska och fysiologiska processer. I detta avseende möjliggör högupplösta respirometriprotokoll (HRR) utvärdering av hela den mitokondriella andningskedjans funktion eller aktiviteten hos specifika mitokondriella komplex. För att studera mitokondriell fysiologi och bioenergetik krävs dessutom genetiskt och experimentellt lätthanterliga modeller som Drosophila melanogaster.
Denna modell har flera fördelar, såsom dess likhet med mänsklig fysiologi, dess snabba livscykel, enkla underhåll, kostnadseffektivitet, höga genomströmningskapacitet och ett minimerat antal etiska problem. Dessa egenskaper gör det till ett ovärderligt verktyg för att dissekera komplexa cellulära processer. Det aktuella arbetet förklarar hur man analyserar mitokondriell funktion med hjälp av Drosophila melanogaster PINK1 B9-null-mutanten. Pink1-genen är ansvarig för att koda för PTEN-inducerat förmodat kinas 1, genom en process som kallas mitofagi, vilket är avgörande för avlägsnandet av dysfunktionella mitokondrier från mitokondrienätverket. Mutationer i denna gen har associerats med en autosomalt recessiv tidigt debuterande familjär form av Parkinsons sjukdom. Denna modell kan användas för att studera mitokondriell dysfunktion som är involverad i patofysiologin vid Parkinsons sjukdom.
Introduction
Mitokondrier är cellulära organeller som styr viktiga funktioner, inklusive apoptotisk reglering, kalciumhomeostas och deltagande i biosyntetiska vägar. Genom att ha autonomt genetiskt material kan de bidra till cellulära underhålls- och reparationsprocesser. Deras struktur rymmer elektrontransportkedjan och oxidativ fosforylering, båda avgörande för cellulär energi 1,2,3. I synnerhet uppnås energikontroll genom produktion av adenosintrifosfat (ATP) via oxidativ fosforylering (OXPHOS)2. Störningar i energimetabolismen med försämring av mitokondriella funktioner förekommer både vid cellöverlevnad och celldöd 4,5, ofta förknippade med ett brett spektrum av mänskliga patologier, såsom cancer, och neurodegenerativa sjukdomar som Parkinsons sjukdom (PD)3,6.
PD är en kronisk, progressiv och neurologisk sjukdom. Den främsta orsaken till denna sjukdom är döden av hjärnceller, särskilt i substantia nigra, som är ansvariga för produktionen av signalsubstansen dopamin, som styr rörelse 6,7,8. Den tidigaste observationen som kopplade Parkinsonism till mitokondriell dysfunktion gjordes 1988, i experimentella modeller med toxiner som hämmar andningskedjan Komplex I9.
För närvarande finns det flera metoder för att utvärdera mitokondriell dysfunktion 10,11,12,1 3; Jämfört med konventionella metoder ger dock högupplöst respirometri (HRR) överlägsen känslighet och fördelar13,14. Till exempel tillåter HRR-protokoll utvärdering av hela den mitokondriella andningskedjans funktion eller aktiviteten hos specifika mitokondriella komplex14,15. Mitokondriella dysfunktioner kan bedömas i intakta celler, isolerade mitokondrier eller till och med ex vivo 10,11,13,14.
Mitokondriella dysfunktioner är nära förknippade med många patologiska och fysiologiska processer. Det är därför viktigt att studera mitokondriell fysiologi och bioenergetik med hjälp av genetiskt och experimentellt lätthanterliga modellsystem. I detta avseende har forskning på bananflugan Drosophila melanogaster flera fördelar. Denna modell delar grundläggande cellulära egenskaper och processer med människor, inklusive användningen av DNA som genetiskt material, vanliga organeller och bevarade molekylära vägar som är involverade i utveckling, immunitet och cellsignalering. Dessutom har bananflugor en snabb livscykel, enkelt underhåll, låg kostnad, hög genomströmning och färre etiska problem, vilket utgör ett ovärderligt verktyg för att dissekera komplexa cellulära processer 16,17,18,19,20.
Dessutom uttrycks en homolog av den PTEN-inducerade förmodade kinas 1 (pink1)-genen i D. melanogaster. Det spelar en avgörande roll i avlägsnandet av skadade mitokondrier genom processen med mitofagi8. Hos människor predisponerar mutationer i denna gen individer för en autosomalt recessiv familjär form av PD associerad med mitokondriell dysfunktion 8,21,22,23. Bananflugan är därför en kraftfull djurmodell för studier av patofysiologin vid Parkinsons sjukdom och screening av läkemedelskandidater med fokus på mitokondriell dysfunktion och bioenergetik. Därför förklarar detta arbete hur man analyserar mitokondriell funktion i en modell av PD från D. melanogaster med hjälp av HRR-tekniken i OROBOROS med SUIT-protokollet (Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vi använde stammarna w1118 (vit) och w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 (kallad Pink1B9) (FlyBase ID: FBgn0029891) från Bloomington Drosophila Stock Center (ID-nummer: 34749). I denna studie jämförs manliga D. melanogaster PINK1 B9-null-mutanter med hanar av D. melanogaster från w1118-stammen, som används som kontrollgrupp (genetisk bakgrund). Andra parametrar måste analyseras samtidigt med respirometriexperimenten för att säkerställa att flugorna har rätt genotyp (Pink1B9/Y), såsom bröstkorgsdeformiteter och rörelseproblem, som är väl beskrivna för rosa1B9-muterade flugor 24,25,26.
1. Djur och bostäder
- Förvara flugorna i glasflaskor som innehåller 10 ml standardfoder (jäst 1,73 %, sojamjöl 0,9 %, majsmjöl 7,3 %, agar 0,5 %, majssirap 7,6 % och propionsyra 0,48 %) vid konstant temperatur och luftfuktighet (25 °C respektive 60 %), med en 12 tim:12 timmars ljus/mörk cykel.
- För varje experiment, använd två flugor som är äldre 1-3 dagar efter stängning.
OBS: PINK1B9-null mutant virgin honor korsades med w1118 hanar för att erhålla F1 hanar med genotyp Pink1B9/Y.
2. Beredning av prover
- Bered MiR05-bufferten enligt beskrivningen i tabell 1.
- Bedöva flugorna på is och överför dem till mikrocentrifugrör (två flugor per rör).
- Tillsätt 200 μl kyld MiR05-buffert i varje rör och homogenisera flugorna. Homogenisera manuellt, applicera ett lätt tryck (cirka 4-6 slag av mortelstöten) för att förhindra sönderfall av mitokondrier.
3. Högupplöst respirometrikalibrering av polarografiska syresensorer
OBS: OROBOROS-kamrarna har en total volym på cirka 2 ml. Kalibrering krävs för att säkerställa att syreflödet är nära 0 pmol för att starta analysen.
- Starta kalibreringen och tillsätt 2 ml MiR05 till kammaren. Täck kammaren med proppen och lämna inga luftbubblor; Dra sedan försiktigt i proppen för att bilda en enda luftbubbla.
- Öppna programvaran OROBOROS Dat.Lab. Ange en temperatur på 25 °C i fältet Blocktemperatur och klicka på Anslut till Oxygraph-2k (Figur 1A).
- Klicka och välj den mapp där kalibreringen ska sparas och klicka på Spara.
- När ett nytt fönster öppnas namnger du experimentet och proverna (om du kalibrerar anger du bara namnet kalibrering) och klickar på Spara.
- Gå till menyn Layout och välj det första alternativet: 01 Kalibrering Exp. Gr.3 - Temp som visas i figur 1B.
- Vänta tills programmet omdirigerar till kalibreringslayouten, vänta tills den röda linjen visar en vanlig rak linje med punkter runt 0 pmol. Välj sedan två punkter: en för kammare A och den andra för kammare B (Figur 1C) när den röda linjen är exakt noll.
OBS: De valda punkterna måste ha syreflödet (röd linje) runt 0.- För att markera punkterna för båda kamrarna, välj O2-koncentration till höger på skärmen, välj den markerade punkten och kopiera både temperatur - och barometertrycksvärdena i förhållande till punkten. Klistra in dessa värden i rutorna nedan och klicka på Kalibrera och kopiera till Urklipp i det nedre högra hörnet av skärmen som visas i figur 2.
- Utför denna process för båda kamrarna (A och B), gå sedan till Arkiv-menyn och välj Spara och koppla från.
OBS: Efter kalibreringsprocessen kommer programmet att omdirigera användaren till startskärmen så att programvaran är redo att starta HRR-testet. För detta test kommer vi att använda SUIT-protokollet.
4. SUIT-protokoll
- När kalibreringen är klar, ta bort propparna och öppna kamrarna.
- Tvätta propparna (håll spetsen som inte vidrör provet) och kamrarna med 100 % etanol, 70 % etanol och destillerat vatten, i den ordningen.
OBS: Upprepa processen för varje sample ändring. - Homogenisera flugorna i 200 μL buffert, placera allt provinnehåll i kammaren med hjälp av en mikropipett och flytta proppen i kammaren, var noga med att inte skapa luftbubblor.
OBS: Om luftbubblor bildas, ta försiktigt bort proppen och tillsätt 100 μL MIR05-buffert. - Klicka på menyn Layout och välj alternativet 05 Flöde efter korrigerad volym som visas i figur 1B.
- Vänta på att bli omdirigerad till ett nytt fönster. Klicka på Spara för att välja den mapp där experimentet ska sparas.
- Vänta tills ett nytt fönster öppnas. Ge experimentet i utrymmet namnet Experimentell kod. Namnge sedan varje sample i dess respektive kammare A och B i fältet Sample och ställ in fältet Unit till unit.
OBS: Andra enheter kan också väljas, t.ex.ample, Millions of cells eller mg. - Med tanke på att detta protokoll använder två flugor (2 enheter) och kammarvolymen är 2 ml, definiera 1 per ml i koncentrationsfältet (figur 1D).
OBS: Här normaliserades provmängden med antalet flugor; Denna normalisering kan dock utföras av proteininnehållet i provet, mitokondriell DNA-kvantifiering eller aktivitet av citratsyntas. - När syreflödessignalen (röd linje) är konstant på det positiva värdet, starta HRR-protokollet med titrering av substrat, hämmare och frånkopplare (figur 3). Alla efterföljande reagenser och utrustning visas i tabell 1.
- Tillsätt digitonin (5 μg/ml) för att permeabilisera mitokondriemembranet.
- Tillsätt pyruvat (5 mM), malat (2 mM) och prolin (10 mM) substrat och vänta tills syreflödet ökar och stabiliseras. För att markera händelsen för varje reagenstillsats, tryck på F4-tangenten på tangentbordet och ange namnet på varje reagens.
- Tillsätt ADP (5 mM) för att koppla ihop den mitokondriella andningskedjan och vänta på ökning och stabilisering av syreflödet.
- Tillsätt succinat (10 mM) och vänta på att syreflödet ökar och stabiliseras.
- Tillsätt oligomycin (2,5 μM) för att hämma ATP-syntas och leta efter en minskning av syreflödet.
- Vänta tills den röda linjen stabiliseras och koppla bort mitokondriell elektronöverföring med karbonyl-4-(trifluormetoxi)fenylhydrazoncyanid (FCCP) med titrar på 0,25 μM tills maximal syreförbrukning uppnås, vilket visas av den röda linjens stigning. Efter stabilisering av syreflödet, börja lägga till hämmarna för varje komplex, en i taget.
- Tillsätt Rotenon (0,5 μM), en komplex I-hämmare. Vänta tills syreflödet minskar och stabiliseras för att lägga till nästa hämmare.
- Tillsätt Malonat (5 mM), en komplex II-hämmare. Vänta tills syreflödet minskar och stabiliseras för att lägga till nästa hämmare.
- Tillsätt slutligen antimycin (2,5 μM), en komplex III-hämmare. Vänta på minskningen följt av ökningen och stabiliseringen av syreflödet.
OBS: Syreflödet bör stabiliseras vid ett positivt värde men under värdet för den sista hämningen av mitokondriella proteinkomplex.
- I slutet av analysen avlägsnas allt innehåll i kamrarna med hjälp av en mikropipett. Förvaras vid -20 °C för framtida analys, vid behov.
5. Analys av data
- Använd ett lämpligt statistiskt programpaket för dataanalys.
- Utför t-tester för att bedöma skillnader mellan de två grupperna. För situationer som involverar flera behandlingar, använd Variansanalys (ANOVA) som ett statistiskt test 27.
- Extrahera O2-flödesvärdena från grafen som genereras av programvaran. OXPHOS CI hänvisar till värdet på O2 flussmedel efter tillsats av ADP. OXPHOS CII erhålls genom att subtrahera OXPHOS CI&CII - OXPHOS CI. OXPHOS CI&CII är värdet på O2-flussmedel som extraherats efter tillsats av bärnstenssyra. ETS CI&CII är O 2-flödesvärdet efter tillsats av FCCP. ETS CI = FCCP - Rotenon och ETS CII = Rotenon - Malonat.
- Beräkna ATP-syntes som skillnaden mellan OXPHOS (P) och LEAK (L) (P - L)28.
- Bestäm Respiratory Control Ratio (RCR) genom att beräkna kvoten OXPHOS/LEAK, där RCR = P/L.11
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här visar vi attO2-flödet i OXPHOS CI (P = 0,0341) och OXPHOS CI&II (P = 0,0392) tillstånd reduceras i PINK1B9 nollflugor jämfört med kontrollflugor (Figur 4). Detta resultat observerades också i tidigare resultat från vår grupp 29,30.
CI och CII är nyckelkomponenter i elektrontransportsystemet (ETS), där CI ansvarar för överföringen av elektroner från NADH till ubikinon, medan CII överför elektroner från succinat till ubiqinon 31,32,33. PINK1B9 nollflugor uppvisade lägreO2-flöde i ETS CI (P = 0,0338), ETS CII (P = 0,0457) och ETS CI&II (P = 0,0247) (figur 5). Dessa resultat indikerar att elektronöverföringssystemet är nedsatt hos flugor som saknar pink1-genen och attO2-flödet i både OXPHOS- och ETS-stadierna är beroende av CI och CI&CII, vilket överensstämmer med andra arbeten som visar minskad CI-aktivitet i pink1-/- modellerna 33,34,35.
Dessutom är protongradienten över mitokondriernas inre membran avgörande för syntesen av ATP28. Minskningen avO2-flödet i ETS CI och ETS CII indikerar en störning i flödet av elektroner längs ETS. Denna störning i flödet av elektroner påverkar OXPHOS-processen, vilket leder till minskad ATP-syntes. Det fanns också en signifikant minskning avO2-förbrukningen relaterad till ATP-syntes (P = 0,0280) hos PINK1B9 nollflugor jämfört med kontrollflugor (Figur 6B). En minskning av ATP-syntesen i D. melanogaster kan ha betydande effekter på energimetabolism, cellulära processer och övergripande fysiologiska funktioner. Dessutom kan effektiviteten i OXPHOS-processen kvantifieras med ett index som kallas RCR, vilket återspeglar hur nära kopplingen mellan respiration och fosforylering är. Därför indikerar RCR-reduktion (P = 0,0432) mitokondriell frikoppling, vilket kan påverka OXPHOS-processen, vilket tyder på att mitokondrierna är mindre effektiva när det gäller att utnyttja syre och producera ATP (Figur 6C). Dessa resultat kan påverka bananflugans tillväxt, utveckling, rörelse, reproduktion och allmänna hälsa och bidra till patogenesen av vissa neurodegenerativa sjukdomar, inklusive PD 8,28,29,32.
Figur 1: Layouter i programvaran OROBOROS Dat.Lab. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Steg för kalibrering av kammare i programvaran OROBOROS Dat.Lab. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: SUIT-protokoll som visar huvudpunkterna för tillsats av substrat och inhibitor. Först tillsätts digitonin (DIG) följt av komplexa I-specifika substrat: malat, pyruvat och prolin (MPP), ATP-syntassubstrat (ADP), och sedan substrat för komplex II: succinat (S). Därefter tillsätts ATP-syntashämmaren: oligomycin (OMY), följt av kopplaren karbonyl-4-(trifluormetoxi) fenylhydrazoncyanid (F) och komplex I-, II- och III-hämmare: rotenon (R), malonat (MNA) och antimycin (AMA)36. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Högupplöst respirometri som jämför flugorna w1118 och PINK1B9 . (A) OXPHOS CI, (B) OXPHOS CII och (C) OXPHOS CI&CII. Data presenteras som medelvärde ± S.E.M. och analyseras med hjälp av t-test. n = 5-9. p < 0,05. Förkortningar: OXPHOS = oxidativ fosforylering; CI = komplex I; CII = komplex II. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Högupplöst respirometri som jämför flugorna w1118 och PINK1B9 . (A) ETS CI, (B) ETS CII och (C) ETS CI&CII. Data presenteras som medelvärde ± S.E.M. och analyseras med t-test. n = 5-9. p < 0,05. Förkortningar: ETS = elektrontransportsystem; CI = komplex I; CII = komplex II. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Högupplöst respirometri som jämför flugorna w1118 och PINK1B9 . (A) LÄCKAGE, (B) ATP-syntes och (C) andningskontrollförhållande. Data presenteras som medelvärde ± S.E.M. och analyseras med t-test. n = 5-9. p < 0,05. Förkortning: RCR = respiratory control ratio. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HRR är en kraftfull teknik för att studera mitokondriell andning och energimetabolism i D. melanogaster och andra organismer. Det ger en detaljerad och kvantitativ bedömning av mitokondriell funktion, vilket gör det möjligt för forskare att få insikter i cellernas bioenergetik. Protokollet som presenteras här beskriver utvärderingen av mitokondriernas andningskedjefunktion och aktiviteten hos specifika mitokondriella komplex med hjälp av SUIT-protokollet i D. melanogaster. SUIT-protokollet innebär att man systematiskt manipulerar olika substrat, frånkopplare och hämmare för att undersöka olika aspekter av mitokondriell andning.
Den beskrivna tekniken gör det möjligt att bedöma andningshämning till följd av effekter på OXPHOS eller ETS, dehydrogenasaktivitet (CI och CII) och membranintegritet (koppling av OXPHOS). Här utförde vi experimenten med PINK1 B9-null-flugor för att studera mitokondriell dysfunktion eftersom det är associerat med PD 34,35. Detta protokoll kan dock vara användbart för olika sjukdomsmodeller, läkemedelsbehandlingar och toxikologiska studier.
Dessutom kan provberedningen anpassas för att uppfylla experimentella krav36. Ett kritiskt steg i respirometriprotokollet är provberedning. Det är viktigt att rätt protokoll upprättas för typen av prov (cell, isolerade mitokondrier, homogenat), och det är viktigt att överväga lämplig metod för provnormalisering (proteinmängd, DNA-innehåll, citratsyntasaktivitet). Det är också viktigt att använda samma buffert för provberedning och respirometrianalys.
Eftersom provberedningsprotokollet som beskrivs här är enkelt, innebär det vanligtvis inga problem för tekniken. Om en annan typ av prov väljs eller dess beredning ändras, är noggrann standardisering nödvändig. Omrörning och temperaturstabilitet påverkar signalen från den polarografiska syresensorn, vilket genererar fel i andningsmätningar med hjälp av en oxigraf. Därför utgör korrekt kalibrering av kammaren ett viktigt steg för att minska felen under andningsmätningarna.
Denna metod för att bedöma mitokondriell funktion i flugprover erbjuder flera fördelar jämfört med alternativa metoder. En av de främsta styrkorna med HRR är dess förmåga att ge direkta och exakta mätningar av syreförbrukning, vilket möjliggör en detaljerad analys av mitokondriell funktion och cellulär metabolism. Därför används HRR ofta i forskning som fokuserar på att förstå mitokondriell dysfunktion, energiproduktion och cellulära svar på olika substrat eller tillstånd. Dessutom är den mångsidig - vilket gör det möjligt att använda en mängd olika provtyper, inklusive isolerade mitokondrier - och kräver små mängder biologiska prover, vilket är användbart när provmängden är begränsad 1,2,3. Metoder som använder mitokondriella isolat, till exempel, involverar vanligtvis ett stort antal flugor, allt från 50 till 200 individer, vilket gör studien med mutanter svår, eftersom det kanske inte är praktiskt möjligt att få fram ett stort antal mutanter för vissa sjukdomsmodeller.
I likhet med HRR-metoden är Seahorse Bioscience Extracellular Flux Analyzer ett vetenskapligt verktyg som används för att mäta syreförbrukning och extracellulär försurning. De har dock olika tillvägagångssätt och tillämpningar. Seahorse Bioscience Extracellular Flux Analyzer kvantifierar momentana förändringar i cellernas syreförbrukningshastighet (OCR) och extracellulära försurningshastighet (ECAR). OCR är en indikation på mitokondriell andning och energiproduktion, medan ECAR ger insikter om glykolytisk aktivitet. Dess huvudsakliga funktion ligger i bedömningen av cellulär metabolisk dynamik under olika fysiologiska förhållanden, vilket gör den särskilt avgörande för att belysa de intrikata metaboliska modulationer som är förknippade med patologiska sammanhang. Dessutom är Seahorse designad för att vara enkel att använda, vilket gör det möjligt för forskare att utföra snabba metaboliska analyser 37,38,39. HRR kräver däremot specialiserad utbildning och expertis för att hantera och analysera data effektivt. Det innebär användning av en syreelektrod för att direkt mäta syreförbrukningen hos celler eller mitokondrier 13,14,40. En fördel med HRR är dess mångsidighet när det gäller att utforma olika respirometriprotokoll, vilket är praktiskt ogenomförbart när man använder Seahorse. Denna mångsidighet när det gäller att utforma protokoll som är förknippade med låg kostnad gör HRR-metoden till ett gångbart val för laboratorier med begränsad finansiering. En annan nackdel med respirometrisystemet som används i det nuvarande protokollet är att det inte är möjligt att arbeta med flera prover samtidigt, vilket försvårar analysen med hög genomströmning. Experimentgrupper måste därför vara väl utformade för att möjliggöra en korrekt jämförelse mellan dem. Fördelarna med detta system ligger dock i det faktum att prover av alla slag kan testas, från isolerade celler till hela levande organismer, som C. elegans, till exempel40.
Sammanfattningsvis är HRR en tillförlitlig metod för att studera mitokondriell funktion under fysiologiska och patologiska tillstånd41. Varje experimentell modell har olika egenskaper och begränsningar, vilket kräver metodologi och provberedningsjusteringar för att säkerställa tillförlitlig och meningsfull datainsamling vid utvärdering av mitokondriell andning. Detta protokoll erbjuder forskare en tillförlitlig metod för att bedöma effekterna av miljöfaktorer, experimentella ingrepp eller genetiska mutationer på mitokondriell funktion i D. melanogaster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna redovisar inga motstridiga intressen.
Acknowledgments
Författarna uppmärksammar den brasilianska byrån Coordenação de Aperfeiçoamento de Pesquisa Pessoal de Nível Superior (CAPES EPIDEMIAS 09 #88887.505377/2020). P.M. (#88887.512821/2020-00) och T.D. (#88887.512883/2020-00) är mottagare av forskarstipendier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | Adenosine 5′-diphosphate sodium sal (CAS number 72696-48-1); ≥95%; molecular weight = 501.31 g/mol. |
| Ágar | Kasv | K25-1800 | For bacteriologal use |
| Antimycin-A | Sigma-Aldrich | A8674 | Antimycin A from Streptomyces sp. (CAS number 1397-94-0); molecular weight 540 g/mol; |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | Bovine Serum Albumin (CAS number 9048-46-8); pH 7,0 ≥ 98% |
| Datlab software | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20700 | Software for data acquisition and analysis |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D 5628 | CAS number 11024-24-1 |
| Distilled water | |||
| Drosophila melanogaster strain w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 | Obtained from Bloomington Drosophila stock center | ||
| Drosophila melanogaster strain w1118 | Obtained from the Federal University of Santa Maria | ||
| EGTA | Sigma-Aldrich | E8145 | Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (CAS number 13638-13-3); ≥97%; molecular weight =468.28 g/mol |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920 | Carbonyl cyanide 4- (trifluoromethoxy)phenylhydrazone (CAS number 370-86-5); ≥98% (TLC), powder |
| GraphPad Prism version 8.0.1. | Software for data acquisition and analysis | ||
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034 | 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (CAS number 7365-45-9); ≥99,5% (titration), cell cultured tested; molecular weight = 238.30 g/mol |
| High-resolution respirometer Oxygraph O2K | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 10022-02 | Startup O2K respirometer kit |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | Monopotassium phosphate (CAS number 7778-77-0); Reagente Plus, molecular weigt = 136.09 g/mol |
| KOH | Sigma-Aldrich | 211473 | Potassium hydroxide (CAS number 1310-58-3); ACS reagent, ≥85%, pellets |
| Malate | Sigma-Aldrich | M1296 | Malonic acid (CAS number 141-82-2); 99%, molecular weight = 104.06 g/mol). A solution is pH adjusted to approximately 7.0. |
| Malic acid | Sigma-Aldrich | M1000 | (S)-(−)-2-Hydroxysuccinic acid (CAS number 97-67-6); ≥95% ; molecular weight = 134.09 g/mol |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (CAS number 4432-31-9); ≥99% (titration); molecular weight = 195.24 g/mol |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Magnesium chloride (CAS number 7786-30-3); anhydrous, ≥98%, molecular weight = 95.21 g/mol |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | ||
| O2K-Titration Set | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20820-03 | Hamilton syringes with different volumes |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O 4876 | Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes (CAS number 1404-19-9); ≥90% total oligomycins basis (HPLC) |
| Pistil to homogenization | |||
| Proline | Sigma-Aldrich | P0380 | L-Proline (CAS number 147-85-3); powder; 99%; molecular weight = 115.13 g/mol |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Sodium pyruvate (CAS number 113-24-6), ≥99%; molecular weight = 110.04 g/mol |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | Rotetone (CAS number 83-79-4); ≥95%, molecular weight 394.42 g/ mol |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S 2378 | Sodium succinate dibasic hexahydrate (CAS number 6106-21-4); ≥99% |
| Sucrose | Merck | 107,651,000 | Sucrose for microbiology use (CAS number 57-50-1) |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | CAS number 107-35-7 |
References
- Brand, M. D., Orr, A. L., Perevoshchikova, I. V., Quinlan, C. L. The role mitochondrial function and cellular bioenergetics in ageing and disease. Br J Dermatol. 169, 1-8 (2013).
- Ramaccini, D., et al. Mitochondrial function and dysfunction in dilated cardiomyopathy. Front Cell Dev Biol. 8, 624216 (2021).
- Zhunina, O. A., et al. The role of mitochondrial dysfunction in vascular disease, tumorigenesis, and diabetes. Front Mol Biosci. 8, 671908 (2021).
- Prasun, P.
- Bhatti, J. S., Bhatti, G. K., Reddy, P. H. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in metabolic disorders - A Step towards mitochondria based therapeutic strategies. Biochim Biophys Acta. 1863 (5), 1066-1077 (2017).
- Perier, C., Vila, M. Mitochondrial biology and Parkinson's disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (2), 009332 (2012).
- DeMaagd, G., Philip, A. Parkinson's disease and its management. Pharmacy and Therapeutics. 40 (8), 504-532 (2015).
- Miyazaki, N., et al. PINK1-dependent and Parkin-independent mitophagy is involved in reprogramming of glycometabolism in pancreatic cancer cells. Biochem Biophys Res Commun. 625, 167-173 (2022).
- Kopin, I. J., Markey, S. P. MPTP toxicity: implications for research in Parkinson's disease. Annual Review of Neuroscience. 11, 81-96 (1988).
- Connolly, N. M. C., et al. Guidelines on experimental methods to assess mitochondrial dysfunction in cellular models of neurodegenerative diseases. Cell Death Differ. 25 (3), 542-572 (2018).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G.
- Haynes, C. M., Fiorese, C. J., Lin, Y. -F. Evaluating and responding to mitochondrial dysfunction: The UPRmt and beyond. Trends Cell Mol Biol. 23 (7), 311-318 (2013).
- Long, Q., Huang, L., Huang, K., Yang, Q. Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from mouse heart tissues using oroboros 2k-oxygraph. Methods Mol Biol. 1966, Clifton, N.J. 237-246 (2019).
- Scheiber, D., et al. High-resolution respirometry in human endomyocardial biopsies shows reduced ventricular oxidative capacity related to heart failure. Exp Mol Med. 51 (2), 1-10 (2019).
- Krumschnabel, G., Eigentler, A., Fasching, M., Gnaiger, E. Chapter nine - use of safranin for the assessment of mitochondrial membrane potential by high-resolution respirometry and fluorometry. Methods Enzymol. 542, 163-181 (2014).
- Demir, E. The potential use of Drosophila as an in vivo model organism for COVID-19-related research: a review. Turk J Biol. 45 (4), 559-569 (2021).
- Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: a primer on the Drosophila model system. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
- McBride, S. M. J., Holloway, S. L., Jongens, T. A. Using Drosophila as a tool to identify pharmacological therapies for fragile X syndrome. Drug Discov Today Technol Technologies. 10 (1), e129-e136 (2013).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods (San Diego, Calif). 68 (1), 105-115 (2014).
- Bar, S., Prasad, M., Datta, R. Neuromuscular degeneration and locomotor deficit in a Drosophila model of mucopolysaccharidosis VII is attenuated by treatment with resveratrol). Dis Model Mech. 11 (11), (2018).
- Imai, Y. PINK1-Parkin signaling in Parkinson's disease: Lessons from Drosophila. Neurosci Res. 159, 40-46 (2020).
- Julienne, H., Buhl, E., Leslie, D. S., Hodge, J. J. L. Drosophila PINK1 and parkin loss-of-function mutants display a range of non-motor Parkinson's disease phenotypes. Neurobiol Dis. 104, 15-23 (2017).
- Biswas, S., Bagchi, A. Analysis of the structural dynamics of the mutations in the kinase domain of PINK1 protein associated with Parkinson's disease. Gene. 857, 147183 (2023).
- Koh, H., Chung, J. PINK1 and Parkin to control mitochondria remodeling. Anat Cell Biol. 43 (3), 179-184 (2010).
- Zhu, M., Li, X., Tian, X., Wu, C. Mask loss-of-function rescues mitochondrial impairment and muscle degeneration of Drosophila pink1 and parkin mutants. Hum Mol Genet. 24 (11), 3272-3285 (2015).
- Park, J., et al. Mitochondrial dysfunction in Drosophila PINK1 mutants is complemented by parkin. Nature. 441 (7097), 1157-1161 (2006).
- Dytham, C. Choosing and using statistics: a biologist's guide. , Wiley-Blackwell. Hoboken, NJ. (2011).
- Bonora, M., et al.
- Gonçalves, D. F., et al. Caffeine improves mitochondrial function in PINK1B9-null mutant Drosophila melanogaster. J Bioenerg Biomembr. 55 (1), 1-13 (2023).
- Gonçalves, D. F., et al. Mitochondrial function and cellular energy maintenance during aging in a Drosophila melanogaster model of Parkinson disease. Mitochondrion. 65, 166-175 (2022).
- Janowska, J. I., et al. Mitochondrial respiratory chain complex I dysfunction induced by N-methyl carbamate ex vivo can be alleviated with a cell-permeable succinate prodrug. Toxicol In Vitro. 65, 104794 (2020).
- Ngo, D. T. M., et al. Oxidative modifications of mitochondrial complex II are associated with insulin resistance of visceral fat in obesity. Physiol Endocrinol Metab. 316 (2), E168-E177 (2019).
- Stroud, D. A., et al. Accessory subunits are integral for assembly and function of human mitochondrial complex I. Nature. 538 (7623), 123-126 (2016).
- Senyilmaz, D., et al. Regulation of mitochondrial morphology and function by stearoylation of TFR1. Nature. 525 (7567), 124-128 (2015).
- Poddighe, S., et al. Mucuna pruriens (Velvet bean) rescues motor, olfactory, mitochondrial and synaptic impairment in PINK1B9 Drosophila melanogaster genetic model of Parkinson's disease. PloS One. 9 (10), e110802 (2014).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 810, 25-58 (2012).
- Winer, L. S. P., Wu, M. Rapid analysis of glycolytic and oxidative substrate flux of cancer cells in a microplate. PloS One. 9 (10), e109916 (2014).
- Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio Protoc. 8 (10), e2850 (2018).
- Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. Am J Physiol. Cell Physiol. 292 (1), C125-C136 (2007).
- Divakaruni, A. S., Jastroch, M. A practical guide for the analysis, standardization and interpretation of oxygen consumption measurements. Nat Metab. 4 (8), 978-994 (2022).
- Bingol, B., Sheng, M. Mechanisms of mitophagy: PINK1, Parkin, USP30 and beyond. Free Radic Biol Med. 100, 210-222 (2016).
