Summary
In dieser Arbeit stellen wir ein hochauflösendes Respirometrie-Protokoll zur Analyse der Bioenergetik in PINK1 B9-Null-mutierten Fruchtfliegen vor. Die Methode verwendet das SUIT-Protokoll (Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration).
Abstract
Neurodegenerative Erkrankungen, einschließlich der Parkinson-Krankheit (PD), und zelluläre Störungen wie Krebs sind einige der Erkrankungen, die den Energiestoffwechsel stören und die mitochondrialen Funktionen beeinträchtigen. Mitochondrien sind Organellen, die sowohl den Energiestoffwechsel als auch zelluläre Prozesse steuern, die am Überleben und Tod von Zellen beteiligt sind. Aus diesem Grund können Ansätze zur Bewertung der mitochondrialen Funktion wichtige Erkenntnisse über zelluläre Zustände in pathologischen und physiologischen Prozessen liefern. In diesem Zusammenhang ermöglichen hochauflösende Respirometrie-Protokolle (HRR) die Bewertung der gesamten mitochondrialen Atmungskettenfunktion oder der Aktivität spezifischer mitochondrialer Komplexe. Darüber hinaus erfordert die Untersuchung der mitochondrialen Physiologie und Bioenergetik genetisch und experimentell handhabbare Modelle wie Drosophila melanogaster.
Dieses Modell bietet mehrere Vorteile, wie z. B. seine Ähnlichkeit mit der menschlichen Physiologie, seinen schnellen Lebenszyklus, seine einfache Wartung, seine Kosteneffizienz, seine hohe Durchsatzleistung und eine minimierte Anzahl ethischer Bedenken. Diese Eigenschaften machen es zu einem unschätzbaren Werkzeug zur Analyse komplexer zellulärer Prozesse. In der vorliegenden Arbeit wird erläutert, wie die Funktion der Mitochondrien mit Hilfe der Drosophila melanogaster PINK1 B9-null-Mutante analysiert werden kann. Das pink1-Gen ist für die Kodierung der PTEN-induzierten putativen Kinase 1 verantwortlich, und zwar durch einen Prozess, der als Mitophagie bezeichnet wird und für die Entfernung dysfunktionaler Mitochondrien aus dem mitochondrialen Netzwerk entscheidend ist. Mutationen in diesem Gen wurden mit einer autosomal-rezessiven, früh einsetzenden familiären Form der Parkinson-Krankheit in Verbindung gebracht. Dieses Modell kann verwendet werden, um die mitochondriale Dysfunktion zu untersuchen, die an der Pathophysiologie der Parkinson-Krankheit beteiligt ist.
Introduction
Mitochondrien sind zelluläre Organellen, die wichtige Funktionen steuern, darunter die apoptotische Regulation, die Kalziumhomöostase und die Beteiligung an Biosynthesewegen. Durch den Besitz von autonomem Erbgut sind sie in der Lage, zu zellulären Erhaltungs- und Reparaturprozessen beizutragen. Ihre Struktur beherbergt die Elektronentransportkette und die oxidative Phosphorylierung, die beide für die zelluläre Energie entscheidend sind 1,2,3. Insbesondere wird die Energiekontrolle durch die Produktion von Adenosintriphosphat (ATP) durch oxidative Phosphorylierung (OXPHOS)2 erreicht. Eine Störung des Energiestoffwechsels mit Beeinträchtigung der mitochondrialen Funktionen tritt sowohl beim Überleben als auch beim Tod der Zellen auf 4,5 und ist häufig mit einer Vielzahl von menschlichen Pathologien wie Krebs und neurodegenerativen Erkrankungen wie der Parkinson-Krankheit (PD) verbunden3,6.
Parkinson ist eine chronische, fortschreitende und neurologische Erkrankung. Die Hauptursache für diese Krankheit ist das Absterben von Gehirnzellen, insbesondere in der Substantia nigra, die für die Produktion des Neurotransmitters Dopamin verantwortlich sind, der die Bewegung steuert 6,7,8. Die früheste Beobachtung, die Parkinsonismus mit mitochondrialer Dysfunktion in Verbindung brachte, wurde 1988 in experimentellen Modellen gemacht, in denen Toxine verwendet wurden, die den Atmungskettenkomplex I9 hemmen.
Derzeit gibt es mehrere Methoden zur Bewertung der mitochondrialen Dysfunktion 10,11,12,1 3; Im Vergleich zu herkömmlichen Ansätzen bietet die hochauflösende Respirometrie (HRR) jedoch eine überlegene Sensitivität und Vorteile13,14. HRR-Protokolle ermöglichen beispielsweise die Bewertung der gesamten mitochondrialen Atmungskettenfunktion oder der Aktivität spezifischer mitochondrialer Komplexe 14,15. Mitochondriale Dysfunktionen können in intakten Zellen, isolierten Mitochondrien oder sogar ex vivo beurteilt werden 10,11,13,14.
Mitochondriale Dysfunktionen sind eng mit vielen pathologischen und physiologischen Prozessen verbunden. Daher ist es wichtig, die mitochondriale Physiologie und Bioenergetik mit Hilfe genetisch und experimentell behandelbarer Modellsysteme zu untersuchen. In dieser Hinsicht hat die Forschung an Drosophila melanogaster, der Fruchtfliege, mehrere Vorteile. Dieses Modell teilt grundlegende zelluläre Eigenschaften und Prozesse mit dem Menschen, einschließlich der Verwendung von DNA als genetischem Material, gemeinsamen Organellen und konservierten molekularen Signalwegen, die an der Entwicklung, der Immunität und der Zellsignalisierung beteiligt sind. Darüber hinaus haben Fruchtfliegen einen schnellen Lebenszyklus, eine einfache Wartung, niedrige Kosten, einen hohen Durchsatz und weniger ethische Bedenken, was sie zu einem unschätzbaren Werkzeug für die Analyse komplexer zellulärer Prozesse macht 16,17,18,19,20.
Darüber hinaus wird ein Homolog des PTEN-induzierten putativen Kinase-1-Gens (pink1) in D. melanogaster exprimiert. Es spielt eine entscheidende Rolle bei der Entfernung beschädigter Mitochondrien durch den Prozess der Mitophagie8. Beim Menschen prädisponieren Mutationen in diesem Gen Personen für eine autosomal-rezessive familiäre Form der Parkinson-Erkrankung, die mit einer mitochondrialen Dysfunktion assoziiertist 8,21,22,23. Folglich ist die Fruchtfliege ein leistungsfähiges Tiermodell für Studien zur Pathophysiologie von Parkinson und zum Screening von Wirkstoffkandidaten mit Schwerpunkt auf mitochondrialer Dysfunktion und Bioenergetik. Daher wird in der vorliegenden Arbeit erläutert, wie die mitochondriale Funktion in einem Modell der Parkinson-Krankheit von D. melanogaster unter Verwendung der HRR-Technik im OROBOROS mit dem Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration (SUIT)-Protokoll analysiert werden kann.
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Protocol
Wir verwendeten die Sorten w1118 (weiß) und w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 (bezeichnet als Pink1B9) (FlyBase ID: FBgn0029891) aus dem Bloomington Drosophila Stock Center (ID-Nummer: 34749). In dieser Studie werden männliche D. melanogaster PINK1 B9-null-Mutanten mit männlichen D. melanogaster aus dem Stamm w1118 verglichen, der als Kontrollgruppe verwendet wird (genetischer Hintergrund). Andere Parameter müssen gleichzeitig mit den Respirometrie-Experimenten analysiert werden, um sicherzustellen, dass die Fliegen den richtigen Genotyp (Pink1B9/Y) haben, wie z. B. Thoraxdeformitäten und Fortbewegungsprobleme, die für pink1B9-mutierte Fliegen gut beschrieben sind 24,25,26.
1. Tiere und Unterbringung
- Halten Sie die Fliegen in Glasflaschen mit 10 ml Standardfutter (Hefe 1,73 %, Sojamehl 0,9 %, Maismehl 7,3 %, Agar 0,5 %, Maissirup 7,6 % und Propionsäure 0,48 %) bei konstanter Temperatur und Luftfeuchtigkeit (25 °C bzw. 60 %) mit einem Hell-Dunkel-Zyklus von 12 h:12 h.
- Verwenden Sie für jedes Experiment zwei Fliegen, die 1-3 Tage nach der Exlosion gealtert sind.
ANMERKUNG: Die PINK1B9-null mutierten jungfräulichen weiblichen Fliegen wurden mit w1118 Männchen gekreuzt, um die F1-Männchen mit dem Genotyp Pink1B9/Y zu erhalten.
2. Probenvorbereitung
- Bereiten Sie den MiR05-Puffer wie in Tabelle 1 beschrieben vor.
- Betäuben Sie die Fliegen auf Eis und geben Sie sie in Mikrozentrifugenröhrchen (zwei Fliegen pro Röhrchen) um.
- In jedes Röhrchen 200 μl gekühlten MiR05-Puffer geben und die Fliegen homogenisieren. Homogenisieren Sie manuell und üben Sie sanften Druck aus (ca. 4-6 Stößel), um den Zerfall der Mitochondrien zu verhindern.
3. Hochauflösende respirometrische Kalibrierung von polarographischen Sauerstoffsensoren
HINWEIS: Die OROBOROS-Kammern haben ein Gesamtvolumen von ca. 2 ml. Eine Kalibrierung ist erforderlich, um sicherzustellen, dass der Sauerstofffluss nahe 0 pmol liegt, um den Assay zu starten.
- Beginnen Sie mit der Kalibrierung und geben Sie 2 ml MiR05 in die Kammer. Decken Sie die Kammer mit dem Stopfen ab, so dass keine Luftblasen entstehen. Ziehen Sie dann vorsichtig am Stopfen, um eine einzelne Luftblase zu bilden.
- Öffnen Sie die OROBOROS Dat.Lab Software. Geben Sie eine Temperatur von 25 °C in das Feld Blocktemperatur ein und klicken Sie auf Mit Oxygraph-2k verbinden (Abbildung 1A).
- Klicken Sie auf und wählen Sie den Ordner aus, in dem die Kalibrierung gespeichert werden soll, und klicken Sie auf Speichern.
- Wenn sich ein neues Fenster öffnet, benennen Sie das Experiment und die Proben (bei einer Kalibrierung einfach den Namen Kalibrierung eingeben) und klicken Sie auf Speichern.
- Gehen Sie zum Menü Layout und wählen Sie die erste Option: 01 Calibration Exp. Gr.3 - Temp wie in Abbildung 1B gezeigt.
- Warten Sie, bis das Programm zum Kalibrierungslayout umgeleitet wird, warten Sie, bis die rote Linie eine gerade Standardlinie mit Punkten um 0 pmol zeigt. Wählen Sie dann zwei Punkte aus: einen für Kammer A und den anderen für Kammer B (Abbildung 1C), wenn die rote Linie genau bei Null liegt.
HINWEIS: Die ausgewählten Punkte müssen einen Sauerstofffluss (rote Linie) um 0 aufweisen.- Um die Punkte beider Kammern zu markieren, wählen Sie auf der rechten Seite des Bildschirms O2-Konzentration, wählen Sie den markierten Punkt aus und kopieren Sie sowohl die Temperatur- als auch die Luftdruckwerte relativ zum Punkt. Fügen Sie diese Werte in die Felder unten ein und klicken Sie auf Kalibrieren und in Zwischenablage kopieren in der unteren rechten Ecke des Bildschirms, wie in Abbildung 2 dargestellt.
- Führen Sie diesen Vorgang für beide Kammern (A und B) durch, gehen Sie dann zum Menü Datei und wählen Sie Speichern und trennen.
HINWEIS: Nach dem Kalibrierungsvorgang leitet das Programm den Benutzer zum Startbildschirm weiter, damit die Software bereit ist, den HRR-Test zu starten. Für diesen Test verwenden wir das SUIT-Protokoll.
4. SUIT-Protokoll
- Wenn die Kalibrierung abgeschlossen ist, entfernen Sie die Stopfen und öffnen Sie die Kammern.
- Waschen Sie die Stopfen (mit der Spitze, die die Probe nicht berührt) und die Kammern mit 100 % Ethanol, 70 % Ethanol und destilliertem Wasser in dieser Reihenfolge.
HINWEIS: Wiederholen Sie den Vorgang für jeden Probenwechsel. - Homogenisieren Sie die Fliegen in 200 μl Puffer, geben Sie den gesamten Probeninhalt mit einer Mikropipette in die Kammer und platzieren Sie den Stopfen in der Kammer, wobei Sie darauf achten müssen, dass keine Luftblasen entstehen.
HINWEIS: Wenn sich Luftblasen bilden, entfernen Sie den Stopfen vorsichtig und fügen Sie 100 μl MIR05-Puffer hinzu. - Klicken Sie auf das Menü Layout , und wählen Sie die Option 05 Durchfluss nach korrigiertem Volumen , wie in Abbildung 1B dargestellt.
- Warten Sie, bis Sie zu einem neuen Fenster weitergeleitet werden. Klicken Sie auf Speichern , um den Ordner auszuwählen, in dem das Experiment gespeichert werden soll.
- Warten Sie, bis sich ein weiteres neues Fenster öffnet. Nennen Sie das Experiment im Bereich Experimental Code. Benennen Sie dann jede Probe in der jeweiligen Kammer im Feld Probe mit A und B und setzen Sie das Feld Einheit auf Einheit.
HINWEIS: Es können auch andere Einheiten gewählt werden, z. B. Millionen von Zellen oder mg. - In Anbetracht der Tatsache, dass in diesem Protokoll zwei Fliegen (2 Einheiten) verwendet werden und das Kammervolumen 2 ml beträgt, definieren Sie im Feld Konzentration 1 pro ml (Abbildung 1D).
HINWEIS: Hier wurde die Probenmenge durch die Anzahl der Fliegen normalisiert; Diese Normalisierung kann jedoch durch den Proteingehalt der Probe, die Quantifizierung der mitochondrialen DNA oder die Aktivität der Citratsynthase erfolgen. - Wenn das Sauerstoffflusssignal (rote Linie) stabil auf dem positiven Wert liegt, beginnen Sie das HRR-Protokoll mit der Titration von Substraten, Inhibitoren und Entkopplern (Abbildung 3). Alle nachfolgenden Reagenzien und Geräte sind in Tabelle 1 aufgeführt.
- Fügen Sie Digitonin (5 μg/ml) hinzu, um die Mitochondrienmembran zu permeabilisieren.
- Fügen Sie Pyruvat (5 mM), Malat (2 mM) und Prolin (10 mM) hinzu und warten Sie, bis der Sauerstofffluss zunimmt und sich stabilisiert. Um das Ereignis für jede Reagenzzugabe zu markieren, drücken Sie die Taste F4 auf der Tastatur und geben Sie den Namen jedes Reagenzes ein.
- Fügen Sie ADP (5 mM) hinzu, um die mitochondriale Atmungskette zu koppeln, und warten Sie auf die Erhöhung und Stabilisierung des Sauerstoffflusses.
- Fügen Sie Succinat (10 mM) hinzu und warten Sie, bis sich der Sauerstofffluss erhöht und stabilisiert hat.
- Fügen Sie Oligomycin (2,5 μM) hinzu, um die ATP-Synthase zu hemmen, und suchen Sie nach einer Abnahme des Sauerstoffflusses.
- Warten Sie, bis sich die rote Linie stabilisiert hat, und entkoppeln Sie den mitochondrialen Elektronentransfer mit Carbonyl-4-(trifluormethoxy)phenylhydrazoncyanid (FCCP) mit Titern von 0,25 μM, bis der maximale Sauerstoffverbrauch erreicht ist, was durch den Anstieg der roten Linie demonstriert wird. Nach der Stabilisierung des Sauerstoffflusses beginnen Sie mit der Zugabe der Inhibitoren jedes Komplexes, einen nach dem anderen.
- Fügen Sie Rotenon (0,5 μM) hinzu, einen Komplex-I-Inhibitor. Warten Sie, bis der Sauerstofffluss abgenommen und stabilisiert ist, um den nächsten Inhibitor hinzuzufügen.
- Fügen Sie Malonat (5 mM), einen Komplex-II-Hemmer, hinzu. Warten Sie, bis der Sauerstofffluss abgenommen und stabilisiert ist, um den nächsten Inhibitor hinzuzufügen.
- Zum Schluss wird Antimycin (2,5 μM), ein Komplex-III-Hemmer, hinzugefügt. Warten Sie auf die Abnahme, gefolgt von der Erhöhung und Stabilisierung des Sauerstoffflusses.
HINWEIS: Der Sauerstofffluss sollte sich bei einem positiven Wert, aber unter dem Wert für die letzte Hemmung der mitochondrialen Proteinkomplexe stabilisieren.
- Am Ende der Analyse wird der gesamte Inhalt der Kammern mit einer Mikropipette entfernt. Bei -20 °C lagern, um bei Bedarf Analysen durchführen zu können.
5. Datenanalyse
- Verwenden Sie ein geeignetes Statistik-Softwarepaket für die Datenanalyse.
- Führen Sie t-Tests durch, um die Unterschiede zwischen den beiden Gruppen zu bewerten. Verwenden Sie in Situationen, in denen mehrere Behandlungen erforderlich sind, die Varianzanalyse (ANOVA) als statistischen Test 27.
- Extrahieren Sie dieO2-Flusswerte aus dem von der Software generierten Diagramm. OXPHOS CI bezieht sich auf den Wert desO2-Flussmittels nach Zugabe von ADP. OXPHOS CII erhält man durch Subtraktion von OXPHOS CI&CII - OXPHOS CI. OXPHOS CI&CII ist der Wert desO2-Flussmittels , das nach Zugabe von Succinat extrahiert wird. ETS CI&CII ist derO2-Flusswert nach Zugabe von FCCP. ETS CI = FCCP - Rotenon und ETS CII = Rotenon - Malonat.
- Berechnen Sie die ATP-Synthese als Differenz zwischen OXPHOS (P) und LEAK (L) (P - L)28.
- Bestimmen Sie das Respiratory Control Ratio (RCR) durch Berechnung des Verhältnisses OXPHOS/LEAK, wobei RCR = P/L.11
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Representative Results
Hier zeigen wir, dass derO2-Fluss in den Zuständen OXPHOS CI (P = 0,0341) und OXPHOS CI&II (P = 0,0392) in PINK1B9 Nullfliegen im Vergleich zu Kontrollfliegen reduziert ist (Abbildung 4). Dieses Ergebnis wurde auch in früheren Befunden aus unserer Gruppe29,30 beobachtet.
CI und CII sind Schlüsselkomponenten des Elektronentransportsystems (ETS), in dem CI für die Übertragung von Elektronen von NADH auf Ubichinon verantwortlich ist, während CII Elektronen von Succinat auf Ubichinon überträgt 31,32,33. PINK1B9 Nullfliegen zeigten einen geringerenO2-Fluss in den Zuständen ETS CI (P = 0,0338), ETS CII (P = 0,0457) und ETS CI&II (P = 0,0247) (Abbildung 5). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das Elektronentransfersystem in Fliegen, denen das pink1-Gen fehlt, beeinträchtigt ist und dass derO2-Fluss sowohl in den OXPHOS- als auch in den ETS-Stadien von CI und CI&CII abhängt, was mit anderen Arbeiten übereinstimmt, die eine reduzierte CI-Aktivität in pink1-/- Modellen zeigen33,34,35.
Darüber hinaus ist der Protonengradient über die mitochondriale Innenmembran essentiell für die Synthese von ATP28. Die Abnahme desO2-Flusses in ETS CI und ETS CII deutet auf eine Störung des Elektronenflusses entlang des ETS hin. Diese Störung des Elektronenflusses beeinflusst den OXPHOS-Prozess und führt zu einer verminderten ATP-Synthese. Es gab auch eine signifikante Abnahme desO2-Verbrauchs im Zusammenhang mit der ATP-Synthese (P = 0,0280) in PINK1B9-Nullfliegen im Vergleich zu Kontrollfliegen (Abbildung 6B). Eine Abnahme der ATP-Synthese in D. melanogaster kann erhebliche Auswirkungen auf den Energiestoffwechsel, zelluläre Prozesse und allgemeine physiologische Funktionen haben. Darüber hinaus kann die Effizienz des OXPHOS-Prozesses durch einen als RCR bezeichneten Index quantifiziert werden, der die Enge der Kopplung zwischen Atmung und Phosphorylierung widerspiegelt. Daher deutet die RCR-Reduktion (P = 0,0432) auf eine mitochondriale Entkopplung hin, die den OXPHOS-Prozess beeinflussen kann, was darauf hindeutet, dass die Mitochondrien weniger effizient bei der Verwertung von Sauerstoff und der Produktion von ATP sind (Abbildung 6C). Diese Ergebnisse können sich auf das Wachstum, die Entwicklung, die Fortbewegung, die Fortpflanzung und die allgemeine Gesundheit der Fruchtfliege auswirken und zur Pathogenese bestimmter neurodegenerativer Erkrankungen, einschließlich PD 8,28,29,32, beitragen.
Abbildung 1: Layouts in der OROBOROS Dat.Lab Software. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Schritte zur Kalibrierung von Kammern in der OROBOROS Dat.Lab-Software. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: SUIT-Protokoll, das die wichtigsten Punkte der Substrat- und Inhibitorzugabe demonstriert. Zuerst wird Digitonin (DIG) hinzugefügt, gefolgt von Komplex-I-spezifischen Substraten: Malat, Pyruvat und Prolin (MPP), ATP-Synthase-Substrat (ADP) und dann Substrat für Komplex II: Succinat (S). Anschließend wird der ATP-Synthase-Inhibitor: Oligomycin (OMY) zugegeben, gefolgt von dem Entkoppler Carbonyl-4-(trifluormethoxy)phenylhydrazoncyanid (F) und den Komplex-I-, II- und III-Inhibitoren: Rotenon (R), Malonat (MNA) und Antimycin (AMA)36. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Hochauflösende Respirometrie im Vergleich von w1118 und PINK1B9 Fliegen. (A) OXPHOS CI, (B) OXPHOS CII und (C) OXPHOS CI&CII. Die Daten werden als Mittelwert ± S.E.M. dargestellt und mittels t-Test analysiert. n = 5-9. p < 0,05. Abkürzungen: OXPHOS = oxidative Phosphorylierung; KI = Komplex I; CII = Komplex II. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Hochauflösende Respirometrie im Vergleich von w1118 und PINK1B9 Fliegen. (A) ETS CI, (B) ETS CII und (C) ETS CI&CII. Die Daten werden als Mittelwert ± S.E.M. dargestellt und mittels t-Test analysiert. n = 5-9. p < 0,05. Abkürzungen: ETS = Elektronentransportsystem; KI = Komplex I; CII = Komplex II. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Hochauflösende Respirometrie im Vergleich von w1118 und PINK1B9 Fliegen. (A) LECKAGE, (B) ATP-Synthese und (C) Atemkontrollverhältnis. Die Daten werden als Mittelwert ± S.E.M. dargestellt und mittels t-Test analysiert. n = 5-9. p < 0,05. Abkürzung: RCR = Respiratory Control Ratio. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
HRR ist eine leistungsstarke Technik zur Untersuchung der mitochondrialen Atmung und des Energiestoffwechsels in D. melanogaster und anderen Organismen. Es bietet eine detaillierte und quantitative Bewertung der mitochondrialen Funktion, die es den Forschern ermöglicht, Einblicke in die Bioenergetik der Zellen zu gewinnen. Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt die Bewertung der Funktion der mitochondrialen Atmungskette und der Aktivität spezifischer mitochondrialer Komplexe unter Verwendung des SUIT-Protokolls in D. melanogaster. Das SUIT-Protokoll beinhaltet die systematische Manipulation verschiedener Substrate, Entkoppler und Inhibitoren, um verschiedene Aspekte der mitochondrialen Atmung zu untersuchen.
Die beschriebene Technik ermöglicht die Beurteilung der respiratorischen Hemmung, die sich aus Effekten auf das OXPHOS oder das ETS, die Dehydrogenaseaktivität (CI und CII) und die Membranintegrität (Kopplung von OXPHOS) ergibt. Hier führten wir die Experimente mit PINK1B9-Nullfliegen durch, um die mitochondriale Dysfunktion zu untersuchen, da sie mit PD34,35 assoziiert ist. Dieses Protokoll kann jedoch für verschiedene Krankheitsmodelle, medikamentöse Behandlungen und toxikologische Studien nützlich sein.
Darüber hinaus kann die Probenvorbereitung angepasst werden, um den experimentellen Anforderungen36 gerecht zu werden. Ein kritischer Schritt im Respirometrieprotokoll ist die Probenvorbereitung. Es ist von entscheidender Bedeutung, dass das richtige Protokoll für die Art der Probe (Zelle, isolierte Mitochondrien, Homogenat) festgelegt wird, und es ist wichtig, die geeignete Methode für die Probennormalisierung (Proteinmenge, DNA-Gehalt, Citratsynthase-Aktivität) zu berücksichtigen. Es ist auch wichtig, den gleichen Puffer für die Probenvorbereitung und den Respirometrie-Assay zu verwenden.
Da das hier beschriebene Probenvorbereitungsprotokoll einfach ist, stellt es in der Regel keine Probleme für die Technik dar. Wenn ein anderer Probentyp gewählt oder seine Präparation geändert wird, ist eine sorgfältige Standardisierung erforderlich. Rühren und Temperaturstabilität beeinflussen das Signal des polarographischen Sauerstoffsensors und führen zu Fehlern bei Atemmessungen mit einem Oxygraphen. Daher stellt die korrekte Kalibrierung der Kammer einen wichtigen Schritt dar, um Fehler bei den Atemmessungen zu reduzieren.
Diese Methode zur Beurteilung der mitochondrialen Funktion in Fliegenproben bietet mehrere Vorteile gegenüber alternativen Ansätzen. Eine der Hauptstärken der HRR ist ihre Fähigkeit, direkte und genaue Messungen des Sauerstoffverbrauchs zu liefern, was eine detaillierte Analyse der mitochondrialen Funktion und des Zellstoffwechsels ermöglicht. Daher wird HRR häufig in der Forschung verwendet, die sich auf das Verständnis der mitochondrialen Dysfunktion, der Energieproduktion und der zellulären Reaktionen auf verschiedene Substrate oder Bedingungen konzentriert. Darüber hinaus ist es vielseitig einsetzbar - es ermöglicht die Verwendung einer Vielzahl von Probentypen, einschließlich isolierter Mitochondrien - und erfordert kleine Mengen biologischer Proben, was nützlich ist, wenn die Probenmenge begrenzt ist 1,2,3. Methoden, die beispielsweise mitochondriale Isolate verwenden, umfassen in der Regel eine beträchtliche Anzahl von Fliegen, die zwischen 50 und 200 Individuen liegen, was die Studie mit Mutanten schwierig macht, da es möglicherweise nicht praktikabel ist, eine große Anzahl von Mutanten für bestimmte Krankheitsmodelle zu erhalten.
Ähnlich wie die HRR-Methode ist der Seahorse Bioscience Extracellular Flux Analyzer ein wissenschaftliches Werkzeug zur Messung des Sauerstoffverbrauchs und der extrazellulären Ansäuerung. Sie haben jedoch unterschiedliche Ansätze und Anwendungen. Der Seahorse Bioscience Extracellular Flux Analyzer quantifiziert sofortige Veränderungen der Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) und der extrazellulären Ansäuerungsrate (ECAR) von Zellen. OCR ist ein Hinweis auf die mitochondriale Atmung und Energieerzeugung, während ECAR Einblicke in die glykolytische Aktivität bietet. Seine Hauptfunktion liegt in der Beurteilung der zellulären Stoffwechseldynamik unter verschiedenen physiologischen Bedingungen, was ihn besonders hilfreich zur Aufklärung der komplizierten metabolischen Modulationen macht, die mit pathologischen Zusammenhängen verbunden sind. Darüber hinaus ist Seahorse auf Benutzerfreundlichkeit ausgelegt und ermöglicht es Forschern, schnelle metabolische Assays durchzuführen 37,38,39. Im Gegensatz dazu erfordert die HRR eine spezielle Ausbildung und Fachwissen, um Daten effektiv zu bedienen und zu analysieren. Dabei wird eine Sauerstoffelektrode verwendet, um den Sauerstoffverbrauch von Zellen oder Mitochondrien direkt zu messen 13,14,40. Ein Vorteil von HRR ist seine Vielseitigkeit bei der Entwicklung verschiedener Respirometrieprotokolle, was bei der Verwendung von Seepferdchen nicht praktikabel ist. Diese Vielseitigkeit bei der Entwicklung von Protokollen in Verbindung mit niedrigen Kosten macht die HRR-Methode zu einer praktikablen Wahl für Labore mit begrenzten Mitteln. Ein weiterer Nachteil des im vorliegenden Protokoll verwendeten Respirometriesystems ist die Unmöglichkeit, mit mehreren Proben gleichzeitig zu arbeiten, was die Hochdurchsatzanalyse erschwert. Daher müssen Versuchsgruppen gut konzipiert sein, um einen korrekten Vergleich zwischen ihnen zu ermöglichen. Die Vorteile dieses Systems liegen jedoch darin, dass Proben jeglicher Art getestet werden können, von isolierten Zellen bis hin zu ganzen lebenden Organismen, wie z.B. C. elegans 40.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die HRR eine zuverlässige Methode zur Untersuchung der mitochondrialen Funktion unter physiologischen und pathologischen Bedingungen ist41. Jedes experimentelle Modell hat unterschiedliche Eigenschaften und Einschränkungen, die Anpassungen der Methodik und der Probenvorbereitung erfordern, um eine zuverlässige und aussagekräftige Datenerfassung bei der Bewertung der mitochondrialen Atmung zu gewährleisten. Dieses Protokoll bietet Forschern eine zuverlässige Methode, um die Auswirkungen von Umweltfaktoren, experimentellen Interventionen oder genetischen Mutationen auf die mitochondriale Funktion von D. melanogaster zu bewerten.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass es keine konkurrierenden Interessen gibt.
Acknowledgments
Die Autoren danken der brasilianischen Agentur Coordenação de Aperfeiçoamento de Pesquisa Pessoal de Nível Superior (CAPES EPIDEMIAS 09 #88887.505377/2020). P.M. (#88887.512821/2020-00) und T.D. (#88887.512883/2020-00) sind Stipendiaten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | Adenosine 5′-diphosphate sodium sal (CAS number 72696-48-1); ≥95%; molecular weight = 501.31 g/mol. |
| Ágar | Kasv | K25-1800 | For bacteriologal use |
| Antimycin-A | Sigma-Aldrich | A8674 | Antimycin A from Streptomyces sp. (CAS number 1397-94-0); molecular weight 540 g/mol; |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | Bovine Serum Albumin (CAS number 9048-46-8); pH 7,0 ≥ 98% |
| Datlab software | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20700 | Software for data acquisition and analysis |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D 5628 | CAS number 11024-24-1 |
| Distilled water | |||
| Drosophila melanogaster strain w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 | Obtained from Bloomington Drosophila stock center | ||
| Drosophila melanogaster strain w1118 | Obtained from the Federal University of Santa Maria | ||
| EGTA | Sigma-Aldrich | E8145 | Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (CAS number 13638-13-3); ≥97%; molecular weight =468.28 g/mol |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920 | Carbonyl cyanide 4- (trifluoromethoxy)phenylhydrazone (CAS number 370-86-5); ≥98% (TLC), powder |
| GraphPad Prism version 8.0.1. | Software for data acquisition and analysis | ||
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034 | 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (CAS number 7365-45-9); ≥99,5% (titration), cell cultured tested; molecular weight = 238.30 g/mol |
| High-resolution respirometer Oxygraph O2K | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 10022-02 | Startup O2K respirometer kit |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | Monopotassium phosphate (CAS number 7778-77-0); Reagente Plus, molecular weigt = 136.09 g/mol |
| KOH | Sigma-Aldrich | 211473 | Potassium hydroxide (CAS number 1310-58-3); ACS reagent, ≥85%, pellets |
| Malate | Sigma-Aldrich | M1296 | Malonic acid (CAS number 141-82-2); 99%, molecular weight = 104.06 g/mol). A solution is pH adjusted to approximately 7.0. |
| Malic acid | Sigma-Aldrich | M1000 | (S)-(−)-2-Hydroxysuccinic acid (CAS number 97-67-6); ≥95% ; molecular weight = 134.09 g/mol |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (CAS number 4432-31-9); ≥99% (titration); molecular weight = 195.24 g/mol |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Magnesium chloride (CAS number 7786-30-3); anhydrous, ≥98%, molecular weight = 95.21 g/mol |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | ||
| O2K-Titration Set | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20820-03 | Hamilton syringes with different volumes |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O 4876 | Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes (CAS number 1404-19-9); ≥90% total oligomycins basis (HPLC) |
| Pistil to homogenization | |||
| Proline | Sigma-Aldrich | P0380 | L-Proline (CAS number 147-85-3); powder; 99%; molecular weight = 115.13 g/mol |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Sodium pyruvate (CAS number 113-24-6), ≥99%; molecular weight = 110.04 g/mol |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | Rotetone (CAS number 83-79-4); ≥95%, molecular weight 394.42 g/ mol |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S 2378 | Sodium succinate dibasic hexahydrate (CAS number 6106-21-4); ≥99% |
| Sucrose | Merck | 107,651,000 | Sucrose for microbiology use (CAS number 57-50-1) |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | CAS number 107-35-7 |
References
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