Summary
여기서는 PINK1B9-null 돌연변이 초파리의 생체 에너지를 분석하기 위한 고분해능 호흡 측정 프로토콜을 제시합니다. 이 분석법은 SUIT(Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration) 프로토콜을 사용합니다.
Abstract
파킨슨병(PD)을 포함한 신경퇴행성 질환과 암과 같은 세포 장애는 미토콘드리아 기능의 손상과 함께 에너지 대사를 방해하는 질환 중 일부입니다. 미토콘드리아는 세포 소기관으로, 에너지 대사와 세포 생존 및 사멸에 관여하는 세포 과정을 모두 조절합니다. 이러한 이유로 미토콘드리아 기능을 평가하는 접근법은 병리학적 및 생리학적 과정에서 세포 상태에 대한 중요한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 이와 관련하여 고분해능 호흡 측정법(HRR) 프로토콜을 통해 전체 미토콘드리아 호흡 사슬 기능 또는 특정 미토콘드리아 복합체의 활동을 평가할 수 있습니다. 또한 미토콘드리아 생리학 및 생체 에너지학을 연구하려면 Drosophila melanogaster와 같은 유전 및 실험적으로 다루기 쉬운 모델이 필요합니다.
이 모델은 인간 생리학과의 유사성, 빠른 수명 주기, 쉬운 유지 관리, 비용 효율성, 높은 처리량 기능 및 최소화된 윤리적 문제와 같은 몇 가지 이점을 제공합니다. 이러한 특성은 복잡한 세포 과정을 해부하는 데 매우 유용한 도구로 총체적으로 설정됩니다. 본 연구는 Drosophila melanogaster PINK1B9-null 돌연변이를 이용하여 미토콘드리아 기능을 분석하는 방법을 설명한다. pink1 유전자는 미토콘드리아 네트워크에서 기능 장애를 일으키는 미토콘드리아를 제거하는 데 중요한 미토파지로 인식되는 과정을 통해 PTEN에 의해 유도된 추정 키나아제 1을 암호화하는 역할을 합니다. 이 유전자의 돌연변이는 상염색체 열성 조기 발병 가족성 PD와 관련이 있습니다. 이 모델은 PD의 병태생리학과 관련된 미토콘드리아 기능 장애를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
Introduction
미토콘드리아는 세포사멸 조절, 칼슘 항상성, 생합성 경로 참여 등 중요한 기능을 조절하는 세포 소기관입니다. 자율적인 유전 물질을 소유함으로써 세포 유지 및 복구 과정에 기여할 수 있습니다. 그들의 구조는 세포 에너지 1,2,3에 중요한 전자 수송 사슬과 산화적 인산화를 수용합니다. 특히, 산화적 인산화(OXPHOS)를 통한 아데노신 삼인산(ATP) 생산을 통해 에너지 제어가 이루어집니다2. 미토콘드리아 기능의 손상과 함께 에너지 대사 장애는 세포의 생존과 사멸 모두에서 발생하며4,5 암과 같은 광범위한 인체 병리학 및 파킨슨병(PD)3,6과 같은 신경퇴행성 질환과 관련이 있습니다.
파킨슨병은 만성, 진행성, 신경학적 장애입니다. 이 질병의 주요 원인은 뇌 세포의 죽음이며, 특히 운동을 조절하는 신경 전달 물질 도파민의 생산을 담당하는 흑질의 사멸입니다 6,7,8. 파킨슨병과 미토콘드리아 기능 장애를 연관 짓는 최초의 관찰은 1988년 호흡 사슬 복합체 I9를 억제하는 독소를 사용한 실험 모델에서 이루어졌습니다.
현재 미토콘드리아 기능 장애를 평가하는 방법에는 여러 가지가 있다 10,11,12,1 3; 그러나 기존 접근법에 비해 고분해능 호흡 측정법(HRR)은 우수한 감도와 이점을 제공합니다13,14. 예를 들어, HRR 프로토콜은 전체 미토콘드리아 호흡 사슬 기능 또는 특정 미토콘드리아 복합체의 활성을 평가할 수 있다(14,15). 미토콘드리아 기능 장애는 온전한 세포, 분리된 미토콘드리아 또는 생체 외10,11,13,14에서 평가할 수 있습니다.
미토콘드리아 기능 장애는 많은 병리학적 및 생리학적 과정과 밀접한 관련이 있습니다. 따라서 미토콘드리아 생리학 및 생물 에너지학을 유전 및 실험적으로 다루기 쉬운 모델 시스템을 사용하여 연구하는 것이 중요합니다. 이와 관련하여 초파리인 초파리 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)에 대한 연구는 몇 가지 장점이 있습니다. 이 모델은 DNA를 유전 물질로 사용하는 것, 공통 세포 기관, 발달, 면역 및 세포 신호 전달에 관여하는 보존된 분자 경로를 포함하여 기본적인 세포 특성과 과정을 인간과 공유합니다. 또한, 초파리는 빠른 생애 주기, 쉬운 유지 보수, 저렴한 비용, 높은 처리량 및 적은 윤리적 문제를 가지고 있으므로 복잡한 세포 과정을 해부하는 데 매우 유용한 도구를 구성합니다 16,17,18,19,20.
또한, PTEN-유도된 추정 키나아제 1(pink1) 유전자의 상동체가 D. melanogaster에서 발현됩니다. 미토파지 과정을 통해 손상된 미토콘드리아를 제거하는 데 중요한 역할을 합니다8. 인간의 경우, 이 유전자의 돌연변이는 미토콘드리아 기능 장애와 관련된 상염색체 열성 가족성 형태의 PD에 걸리기 쉽다 8,21,22,23. 결과적으로, 초파리는 PD의 병태생리학 연구와 미토콘드리아 기능 장애 및 생체 에너지학에 중점을 둔 약물 후보 물질의 스크리닝을 위한 강력한 동물 모델입니다. 따라서 본 연구는 SUIT(Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration) 프로토콜을 사용하여 OROBOROS에서 HRR 기술을 사용하여 D. melanogaster의 PD 모델에서 미토콘드리아 기능을 분석하는 방법을 설명합니다.
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Protocol
블루밍턴 초파리 스톡 센터(Bloomington Drosophila stock center, ID 번호: 34749)의 w 1118(흰색) 및 w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3(Pink1B9로 지칭)(FlyBase ID: FBgn0029891) 균주를 사용했습니다. 이 연구에서는 수컷 D. melanogaster PINK1B9-null 돌연변이를 대조군(유전적 배경)으로 사용되는 w1118 균주의 수컷 D. melanogaster와 비교합니다. 다른 파라미터는 호흡 측정 실험과 동시에 분석되어야 하며, 이는 분홍색1B9 돌연변이 파리 24,25,26에 대해 잘 설명된 흉부 기형 및 운동 문제와 같은 파리가 올바른 유전자형(Pink1B9/Y)을 갖도록 해야 합니다.
1. 동물과 주거
- 파리를 10mL의 표준 식단(효모 1.73%, 콩가루 0.9%, 옥수수 가루 7.3%, 한천 0.5%, 옥수수 시럽 7.6%, 프로피온산 0.48%)이 들어 있는 유리병에 담아 일정한 온도와 습도(각각 25°C 및 60%)에서 12시간:12시간 명암주기로 보관합니다.
- 각 실험에 대해 폐주 후 1-3일 된 파리 두 마리를 사용합니다.
참고 : PINK1B9-null 돌연변이 처녀 암컷 파리를 w1118 수컷과 교배하여 유전자형 Pink1B9 / Y를 가진 F1 수컷을 얻었습니다.
2. 샘플 준비
- 표 1에 설명된 대로 MiR05 버퍼를 준비합니다.
- 얼음 위에서 파리를 마취하고 마이크로 원심 분리기 튜브 (튜브 당 2 마리의 파리)로 옮깁니다.
- 각 튜브에 200μL의 냉각된 MiR05 완충액을 넣고 파리를 균질화합니다. 미토콘드리아의 붕괴를 방지하기 위해 부드러운 압력(유봉의 약 4-6 스트로크)을 가하여 수동으로 균질화합니다.
3. 폴라로그래픽 산소 센서의 고해상도 호흡 측정 교정
참고: OROBOROS 챔버의 총 부피는 약 2mL입니다. 분석을 시작하기 위해 산소 플럭스가 0pmol에 가까운지 확인하려면 보정이 필요합니다.
- 교정을 시작하여 챔버에 MiR05 2mL를 추가합니다. 기포를 남기지 않고 스토퍼로 챔버를 덮으십시오. 그런 다음 스토퍼를 조심스럽게 당겨 하나의 기포를 형성합니다.
- OROBOROS Dat.Lab 소프트웨어를 엽니다. Block temperature(블록 온도) 필드에 25°C의 온도를 입력하고 Connect to Oxygraph-2k(Oxygraph-2k에 연결)를 클릭합니다(그림 1A).
- 캘리브레이션을 저장할 폴더를 클릭하고 선택하고 Save(저장)를 클릭합니다.
- 새 창이 열리면 실험과 샘플의 이름을 지정하고(교정하는 경우 교정이라는 이름을 입력하기만 하면 됨) 저장을 클릭합니다.
- 레이아웃 메뉴로 이동하여 첫 번째 옵션인 01 Calibration Exp. 그림 3B와 같이 1 - Temp를 선택합니다.
- 프로그램이 보정 레이아웃으로 리디렉션될 때까지 기다렸다가 빨간색 선에 약 0pmol의 점이 있는 표준 직선이 표시될 때까지 기다립니다. 그런 다음 빨간색 선이 정확히 0일 때 챔버 A와 챔버 B에 대해 다른 하나, 두 점을 선택합니다(그림 1C).
알림: 선택한 지점에는 산소 플럭스(빨간색 선)가 0 부근이어야 합니다.- 두 챔버의 포인트를 표시하려면 화면 오른쪽에서 O2 농도를 선택하고 마크 포인트를 선택한 다음 포인트에 대한 온도 및 기압 값을 모두 복사합니다. 이 값을 아래 상자에 붙여넣고 그림 2와 같이 화면 오른쪽 하단 모서리에 있는 Calibrate and Copy to Clipboard를 클릭합니다.
- 두 챔버 (A 및 B)에 대해 이 프로세스를 수행한 다음 파일 메뉴로 이동하여 저장 및 연결 끊기를 선택합니다.
알림: 보정 프로세스가 끝나면 프로그램은 소프트웨어가 HRR 테스트를 시작할 준비가 되도록 사용자를 홈 화면으로 리디렉션합니다. 이 테스트에서는 SUIT 프로토콜을 사용합니다.
4. SUIT 프로토콜
- 보정이 완료되면 스토퍼를 제거하고 챔버를 엽니다.
- 스토퍼(샘플에 닿지 않는 팁을 잡음)와 챔버를 100% 에탄올, 70% 에탄올, 증류수 순서로 세척합니다.
알림: 모든 s에 대해 프로세스를 반복하십시오.amp르 변경. - 200μL의 완충액에서 파리를 균질화하고, 마이크로피펫을 사용하여 모든 샘플 내용물을 챔버에 넣고, 기포가 생성되지 않도록 주의하면서 챔버에 스토퍼를 재배치합니다.
알림: 기포가 형성되면 스토퍼를 부드럽게 제거하고 MIR100μL 버퍼를 05μL를 추가합니다. - 레이아웃(Layout) 메뉴를 클릭하고 그림 1B와 같이 05 Flow by Corrected Volume 옵션을 선택합니다.
- 새 창으로 리디렉션될 때까지 기다립니다. Save( 저장 )를 클릭하여 실험을 저장할 폴더를 선택합니다.
- 다른 새 창이 열릴 때까지 기다립니다. 공간의 실험 이름을 Experimental Code로 지정합니다. 그런 다음 Sample 필드에서 해당 챔버의 각 샘플의 이름을 A와 B로 지정하고 Unit 필드를 단위로 설정합니다.
참고: 예를 들어 다른 단위도 선택할 수 있습니다.ample, Millions of cells 또는 mg. - 이 프로토콜은 두 개의 파리(2개 단위)를 사용하고 챔버 부피가 2mL인 것을 고려하여 농도 필드에서 mL당 1 개를 정의합니다(그림 1D).
참고: 여기서, 샘플 양은 파리의 수로 정규화되었습니다. 그러나, 이러한 정규화는 샘플의 단백질 함량, 미토콘드리아 DNA 정량화, 또는 시트레이트 합성효소의 활성에 의해 수행될 수 있다. - 산소 플럭스 신호(빨간색 선)가 양수 값으로 안정되면 기질, 억제제 및 언커플러의 적정으로 HRR 프로토콜을 시작합니다(그림 3). 모든 후속 시약 및 장비는 표 1에 나와 있습니다.
- 디지토닌(5μg/mL)을 추가하여 미토콘드리아 막을 투과시킵니다.
- 피루브산(5mM), 말레이트(2mM) 및 프롤린(10mM) 기질을 추가하고 산소 플럭스가 증가하고 안정화될 때까지 기다립니다. 각 시약 추가에 대한 이벤트를 표시하려면 키보드에서 F4 키를 누르고 각 시약의 이름을 입력합니다.
- ADP(5mM)를 추가하여 미토콘드리아 호흡 사슬을 결합하고 산소 플럭스의 증가와 안정화를 기다립니다.
- 숙시네이트(10mM)를 넣고 산소 플럭스의 증가 및 안정화를 기다립니다.
- 올리고마이신(2.5μM)을 첨가하여 ATP 합성효소를 억제하고 산소 플럭스의 감소를 확인합니다.
- 빨간색 선이 안정화될 때까지 기다렸다가 최대 산소 소비량에 도달할 때까지 0.25μM의 역가와 함께 Carbonyl-4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone cyanide(FCCP)를 사용하여 미토콘드리아 전자 전달을 분리합니다(빨간색 선의 상승으로 입증됨). 산소 플럭스가 안정화된 후 각 복합체의 억제제를 한 번에 하나씩 추가하기 시작합니다.
- 복합 I 억제제인 로테논(0.5μM)을 추가합니다. 다음 억제제를 추가하기 위해 산소 플럭스의 감소 및 안정화를 기다립니다.
- 복합 II 억제제인 말로네이트(5mM)를 추가합니다. 다음 억제제를 추가하기 위해 산소 플럭스의 감소 및 안정화를 기다립니다.
- 마지막으로 복합 III 억제제인 항마이신(2.5μM)을 추가합니다. 산소 플럭스의 증가와 안정화가 뒤따르는 감소를 기다리십시오.
참고: 산소 플럭스는 양수 값에서 안정화되어야 하지만 미토콘드리아 단백질 복합체의 마지막 억제 값보다 낮아야 합니다.
- 분석이 끝나면 마이크로 피펫을 사용하여 챔버의 모든 내용물을 제거합니다. 필요한 경우 향후 분석을 위해 -20 °C에서 보관하십시오.
5. 데이터 분석
- 데이터 분석을 위해 적절한 통계 소프트웨어 패키지를 활용하십시오.
- t-검정을 수행하여 두 그룹 간의 차이를 평가합니다. 여러 처리가 필요한 상황에서는 분산 분석(ANOVA)을 통계적 검정으로 사용합니다 27.
- 소프트웨어에서 생성된 그래프에서O2 플럭스 값을 추출합니다. OXPHOS CI는 ADP를 첨가한 후의O2 플럭스의 값을 나타낸다. OXPHOS CII는 OXPHOS CI&CII - OXPHOS CI를 빼서 구합니다. OXPHOS CI&CII는 숙시네이트를 첨가한 후 추출된O2 플럭스의 값입니다. ETS CI&CII는 FCCP를 추가한 후의O2 플럭스 값입니다. ETS CI = FCCP - 로테논 및 ETS CII = 로테논 - 말로네이트.
- ATP 합성을 OXPHOS(P)와 LEAK(L)(P - L)28의 차이로 계산합니다.
- OXPHOS/LEAK 비율을 계산하여 호흡 제어 비율(RCR)을 결정합니다(여기서 RCR = P/L.11).
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Representative Results
여기서, OXPHOS CI (P = 0.0341) 및 OXPHOS CI &II (P = 0.0392) 상태에서의 O2 플럭스는 대조 파리와 비교할 때 PINK1B9 null fly에서 감소됩니다 (그림 4). 이 결과는 우리 그룹29,30의 이전 결과에서도 관찰되었습니다.
CI와 CII는 전자 수송 시스템(ETS)의 핵심 구성 요소로, CI는 NADH에서 유비퀴논으로 전자를 전달하는 역할을 하는 반면 CII는 석시네이트에서 유비퀴논으로 전자를 전달합니다(31,32,33). PINK1B9 귀파리는 ETS CI (P = 0.0338), ETS CII (P = 0.0457) 및 ETS CI &II (P = 0.0247) 상태에서 더 낮은 O2 플럭스를 보여주었습니다 (그림 5). 이러한 결과는 분홍색1 유전자가 결핍된 파리에서 전자 전달 시스템이 손상되고 OXPHOS 및 ETS 단계 모두에서O2 플럭스가 CI 및 CI&CII에 의존한다는 것을 나타내며, 이는 분홍색1-/- 모델 33,34,35에서 감소된 CI 활성을 입증하는 다른 연구와 일치합니다.
또한 미토콘드리아 내막을 가로지르는 양성자 구배는 ATP28의 합성에 필수적입니다. ETS CI 및 ETS CII에서O2 플럭스의 감소는 ETS를 따라 전자 플럭스의 붕괴를 나타냅니다. 이러한 전자 플럭스의 붕괴는 OXPHOS 과정에 영향을 미쳐 ATP 합성을 감소시킵니다. 또한 대조군과 비교했을 때 PINK1B9 귀무파리에서 ATP 합성과 관련된O2 소비량(P=0.0280)이 유의하게 감소하였다(그림 6B). D. melanogaster의 ATP 합성 감소는 에너지 대사, 세포 과정 및 전반적인 생리적 기능에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다. 또한 OXPHOS 공정의 효율성은 호흡과 인산화 사이의 결합 견고성을 반영하는 RCR로 알려진 지수로 정량화할 수 있습니다. 따라서 RCR 감소(P = 0.0432)는 미토콘드리아의 분리를 나타내며, 이는 미토콘드리아가 산소를 이용하고 ATP를 생성하는 데 덜 효율적임을 시사하는 OXPHOS 과정에 영향을 미칠 수 있습니다(그림 6C). 이러한 결과는 초파리의 성장, 발달, 운동, 번식 및 전반적인 건강에 영향을 미칠 수 있으며 PD 8,28,29,32를 포함한 특정 신경 퇴행성 질환의 발병에 기여할 수 있습니다.
그림 1: OROBOROS Dat.Lab 소프트웨어의 레이아웃. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: OROBOROS Dat.Lab 소프트웨어의 챔버 교정 단계. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 기질 및 억제제 추가의 주요 포인트를 보여주는 SUIT 프로토콜. 먼저, 디지토닌(DIG)에 이어 복합체 I 특이적 기질인 말레이트, 피루브산 및 프롤린(MPP), ATP 합성효소 기질(ADP), 복합체 II용 기질인 숙시네이트(S)가 첨가됩니다. 이어서 ATP 합성효소 억제제인 올리고마이신(OMY)을 첨가한 후 비결합제인 카르보닐-4-(트리플루오로메톡시) 페닐히드라존 시안화물(F)과 복합체 I, II, III 억제제인 로테논(R), 말로네이트(MNA) 및 항마이신(AMA)을 첨가한다.36. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: w1118 과 PINK1B9 파리를 비교한 고분해능 호흡 측정법. (A) OXPHOS CI, (B) OXPHOS CII 및 (C) OXPHOS CI&CII. 데이터는 평균 ± S.E.M.으로 표시되며 t-검정을 사용하여 분석됩니다. n = 5-9입니다. p < 0.05입니다. 약어: OXPHOS = 산화적 인산화; CI = 복합 I; CII = 복합 II. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: w1118 과 PINK1B9 파리를 비교한 고분해능 호흡 측정법. (A) ETS CI, (B) ETS CII 및 (C) ETS CI&CII. 데이터는 평균 ± S.E.M.으로 표시되며 t-검정으로 분석됩니다. n = 5-9입니다. p < 0.05입니다. 약어: ETS = 전자 수송 시스템; CI = 복합 I; CII = 복합 II. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: w1118 과 PINK1B9 파리를 비교한 고분해능 호흡 측정법. (A) 누출, (B) ATP 합성 및 (C) 호흡 조절 비율. 데이터는 평균 ± S.E.M.으로 표시되고 t-검정으로 분석됩니다. n = 5-9입니다. p < 0.05입니다. 약어: RCR = 호흡 조절 비율. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
HRR은 D. melanogaster 및 기타 유기체의 미토콘드리아 호흡 및 에너지 대사를 연구하는 강력한 기술입니다. 미토콘드리아 기능에 대한 상세하고 정량적인 평가를 제공하여 연구원들이 세포의 생체 에너지학에 대한 통찰력을 얻을 수 있도록 합니다. 여기에 제시된 프로토콜은 D. melanogaster의 SUIT 프로토콜을 사용하여 미토콘드리아 호흡 사슬 기능 및 특정 미토콘드리아 복합체의 활성을 평가하는 방법을 설명합니다. SUIT 프로토콜은 미토콘드리아 호흡의 다양한 측면을 검사하기 위해 다양한 기질, 분리 장치 및 억제제를 체계적으로 조작하는 것을 포함합니다.
설명된 기술을 통해 OXPHOS 또는 ETS에 대한 효과, 탈수소효소 활성(CI 및 CII) 및 막 무결성(OXPHOS의 결합)으로 인한 호흡 억제를 평가할 수 있습니다. 여기서는 PD34,35와 관련이 있는 미토콘드리아 기능 장애를 연구하기 위해 PINK1B9-null 파리를 사용하여 실험을 수행했습니다. 그러나 이 프로토콜은 다양한 질병 모델, 약물 치료 및 독성학 연구에 유용할 수 있습니다.
또한, 샘플 전처리는 실험 요건(36)에 적합하도록 조정될 수 있다. 호흡기 측정 프로토콜에서 중요한 단계는 시료 준비입니다. 시료 유형(세포, 분리된 미토콘드리아, 균질액)에 대해 올바른 프로토콜을 설정하는 것이 중요하며, 시료 정규화를 위한 적절한 방법(단백질 양, DNA 함량, 구연산염 합성효소 활성)을 고려하는 것이 중요합니다. 시료 전처리 및 호흡 측정 분석에 동일한 완충액을 사용하는 것도 중요합니다.
여기에 설명된 샘플 전처리 프로토콜은 간단하기 때문에 일반적으로 이 기법에 문제를 일으키지 않습니다. 다른 유형의 시료를 선택하거나 전처리가 변경된 경우 신중한 표준화가 필요합니다. 교반 및 온도 안정성은 폴라로그래픽 산소 센서의 신호에 영향을 미쳐 산소 그래프를 사용한 호흡 측정에서 오류를 생성합니다. 따라서 챔버의 올바른 교정은 호흡 측정 중 오류를 줄이기 위한 중요한 단계를 구성합니다.
플라이 샘플에서 미토콘드리아 기능을 평가하기 위한 이 방법은 다른 접근법에 비해 몇 가지 이점을 제공합니다. HRR의 주요 강점 중 하나는 산소 소비량을 직접적이고 정확하게 측정하여 미토콘드리아 기능 및 세포 대사를 자세히 분석할 수 있다는 것입니다. 따라서 HRR은 미토콘드리아 기능 장애, 에너지 생산 및 다양한 기질 또는 조건에 대한 세포 반응을 이해하는 데 중점을 둔 연구에 자주 사용됩니다. 또한 다목적이어서 분리된 미토콘드리아를 포함한 다양한 유형의 시료를 사용할 수 있으며 소량의 생물학적 시료가 필요하므로 시료량이 제한될 때 유용합니다 1,2,3. 예를 들어, 미토콘드리아 분리물을 사용하는 방법은 일반적으로 50마리에서 200마리에 이르는 상당한 수의 파리를 포함하며, 이는 특정 질병 모델에 대해 많은 수의 돌연변이를 얻는 것이 실용적이지 않을 수 있기 때문에 돌연변이에 대한 연구를 어렵게 만듭니다.
HRR 분석법과 유사하게, Seahorse Bioscience 세포외 플럭스 분석기는 산소 소비량과 세포외 산성화를 측정하는 데 사용되는 과학적 도구입니다. 그러나 접근 방식과 응용 프로그램이 다릅니다. Seahorse Bioscience 세포외 플럭스 분석기는 세포의 산소 소비율(OCR) 및 세포외 산성화 속도(ECAR)의 즉각적인 변화를 정량화합니다. OCR은 미토콘드리아 호흡 및 에너지 생성을 나타내는 반면, ECAR은 해당작용 활성에 대한 통찰력을 제공합니다. 주요 기능은 다양한 생리학적 조건에서 세포 대사 역학을 평가하는 데 있으며, 병리학적 맥락과 관련된 복잡한 대사 조절을 설명하는 데 특히 중요한 역할을 합니다. 또한, Seahorse는 사용하기 쉽도록 설계되어, 연구자들이 신속한 대사 분석을 수행할 수 있도록 한다 37,38,39. 반면, HRR은 데이터를 효과적으로 운영하고 분석하기 위해 전문 교육과 전문 지식이 필요합니다. 여기에는 세포 또는 미토콘드리아 13,14,40에 의한 산소 소비량을 직접 측정하기 위해 산소 전극을 사용하는 것이 포함됩니다. HRR의 장점은 Seahorse를 사용할 때 실용적이지 않은 다양한 호흡 측정 프로토콜을 설계할 수 있다는 것입니다. 저비용과 관련된 프로토콜을 설계할 수 있는 이러한 다양성으로 인해 HRR 방법은 자금이 제한된 실험실에서 실행 가능한 선택입니다. 본 프로토콜에 사용된 호흡 측정 시스템의 또 다른 단점은 여러 샘플을 동시에 작업할 수 없어 고처리량 분석을 방해한다는 것입니다. 따라서 실험 그룹은 실험 그룹을 올바르게 비교할 수 있도록 잘 설계되어야 합니다. 그러나 이 시스템의 장점은 분리된 세포에서 예쁜꼬마선충(예: 40)과 같은 전체 살아있는 유기체에 이르기까지 모든 종류의 샘플을 테스트할 수 있다는 사실에 있습니다.
요약하면, HRR은 생리학적 및 병리학적 조건 하에서 미토콘드리아 기능을 연구하기 위한 신뢰할 수 있는 방법이다41. 각 실험 모델에는 서로 다른 특성과 제한 사항이 있으며, 미토콘드리아 호흡 평가에서 신뢰할 수 있고 의미 있는 데이터 수집을 보장하기 위해 방법론 및 샘플 전처리 조정이 필요합니다. 이 프로토콜은 D. melanogaster의 미토콘드리아 기능에 대한 환경 요인, 실험적 개입 또는 유전적 돌연변이의 영향을 평가하는 신뢰할 수 있는 방법을 연구자에게 제공합니다.
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Disclosures
저자는 상충되는 이해관계가 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
저자는 브라질 기관인 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pesquisa Pessoal de Nível Superior(CAPES EPIDEMIAS 09 #88887.505377/2020)를 인정합니다. PM(#88887.512821/2020-00) 및 TD(#88887.512883/2020-00)는 연구 펠로우십 수혜자입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | Adenosine 5′-diphosphate sodium sal (CAS number 72696-48-1); ≥95%; molecular weight = 501.31 g/mol. |
| Ágar | Kasv | K25-1800 | For bacteriologal use |
| Antimycin-A | Sigma-Aldrich | A8674 | Antimycin A from Streptomyces sp. (CAS number 1397-94-0); molecular weight 540 g/mol; |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | Bovine Serum Albumin (CAS number 9048-46-8); pH 7,0 ≥ 98% |
| Datlab software | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20700 | Software for data acquisition and analysis |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D 5628 | CAS number 11024-24-1 |
| Distilled water | |||
| Drosophila melanogaster strain w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 | Obtained from Bloomington Drosophila stock center | ||
| Drosophila melanogaster strain w1118 | Obtained from the Federal University of Santa Maria | ||
| EGTA | Sigma-Aldrich | E8145 | Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (CAS number 13638-13-3); ≥97%; molecular weight =468.28 g/mol |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920 | Carbonyl cyanide 4- (trifluoromethoxy)phenylhydrazone (CAS number 370-86-5); ≥98% (TLC), powder |
| GraphPad Prism version 8.0.1. | Software for data acquisition and analysis | ||
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034 | 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (CAS number 7365-45-9); ≥99,5% (titration), cell cultured tested; molecular weight = 238.30 g/mol |
| High-resolution respirometer Oxygraph O2K | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 10022-02 | Startup O2K respirometer kit |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | Monopotassium phosphate (CAS number 7778-77-0); Reagente Plus, molecular weigt = 136.09 g/mol |
| KOH | Sigma-Aldrich | 211473 | Potassium hydroxide (CAS number 1310-58-3); ACS reagent, ≥85%, pellets |
| Malate | Sigma-Aldrich | M1296 | Malonic acid (CAS number 141-82-2); 99%, molecular weight = 104.06 g/mol). A solution is pH adjusted to approximately 7.0. |
| Malic acid | Sigma-Aldrich | M1000 | (S)-(−)-2-Hydroxysuccinic acid (CAS number 97-67-6); ≥95% ; molecular weight = 134.09 g/mol |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (CAS number 4432-31-9); ≥99% (titration); molecular weight = 195.24 g/mol |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Magnesium chloride (CAS number 7786-30-3); anhydrous, ≥98%, molecular weight = 95.21 g/mol |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | ||
| O2K-Titration Set | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20820-03 | Hamilton syringes with different volumes |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O 4876 | Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes (CAS number 1404-19-9); ≥90% total oligomycins basis (HPLC) |
| Pistil to homogenization | |||
| Proline | Sigma-Aldrich | P0380 | L-Proline (CAS number 147-85-3); powder; 99%; molecular weight = 115.13 g/mol |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Sodium pyruvate (CAS number 113-24-6), ≥99%; molecular weight = 110.04 g/mol |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | Rotetone (CAS number 83-79-4); ≥95%, molecular weight 394.42 g/ mol |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S 2378 | Sodium succinate dibasic hexahydrate (CAS number 6106-21-4); ≥99% |
| Sucrose | Merck | 107,651,000 | Sucrose for microbiology use (CAS number 57-50-1) |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | CAS number 107-35-7 |
References
- Brand, M. D., Orr, A. L., Perevoshchikova, I. V., Quinlan, C. L. The role mitochondrial function and cellular bioenergetics in ageing and disease. Br J Dermatol. 169, 1-8 (2013).
- Ramaccini, D., et al. Mitochondrial function and dysfunction in dilated cardiomyopathy. Front Cell Dev Biol. 8, 624216 (2021).
- Zhunina, O. A., et al. The role of mitochondrial dysfunction in vascular disease, tumorigenesis, and diabetes. Front Mol Biosci. 8, 671908 (2021).
- Prasun, P.
- Bhatti, J. S., Bhatti, G. K., Reddy, P. H. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in metabolic disorders - A Step towards mitochondria based therapeutic strategies. Biochim Biophys Acta. 1863 (5), 1066-1077 (2017).
- Perier, C., Vila, M. Mitochondrial biology and Parkinson's disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (2), 009332 (2012).
- DeMaagd, G., Philip, A. Parkinson's disease and its management. Pharmacy and Therapeutics. 40 (8), 504-532 (2015).
- Miyazaki, N., et al. PINK1-dependent and Parkin-independent mitophagy is involved in reprogramming of glycometabolism in pancreatic cancer cells. Biochem Biophys Res Commun. 625, 167-173 (2022).
- Kopin, I. J., Markey, S. P. MPTP toxicity: implications for research in Parkinson's disease. Annual Review of Neuroscience. 11, 81-96 (1988).
- Connolly, N. M. C., et al. Guidelines on experimental methods to assess mitochondrial dysfunction in cellular models of neurodegenerative diseases. Cell Death Differ. 25 (3), 542-572 (2018).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G.
- Haynes, C. M., Fiorese, C. J., Lin, Y. -F. Evaluating and responding to mitochondrial dysfunction: The UPRmt and beyond. Trends Cell Mol Biol. 23 (7), 311-318 (2013).
- Long, Q., Huang, L., Huang, K., Yang, Q. Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from mouse heart tissues using oroboros 2k-oxygraph. Methods Mol Biol. 1966, Clifton, N.J. 237-246 (2019).
- Scheiber, D., et al. High-resolution respirometry in human endomyocardial biopsies shows reduced ventricular oxidative capacity related to heart failure. Exp Mol Med. 51 (2), 1-10 (2019).
- Krumschnabel, G., Eigentler, A., Fasching, M., Gnaiger, E. Chapter nine - use of safranin for the assessment of mitochondrial membrane potential by high-resolution respirometry and fluorometry. Methods Enzymol. 542, 163-181 (2014).
- Demir, E. The potential use of Drosophila as an in vivo model organism for COVID-19-related research: a review. Turk J Biol. 45 (4), 559-569 (2021).
- Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: a primer on the Drosophila model system. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
- McBride, S. M. J., Holloway, S. L., Jongens, T. A. Using Drosophila as a tool to identify pharmacological therapies for fragile X syndrome. Drug Discov Today Technol Technologies. 10 (1), e129-e136 (2013).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods (San Diego, Calif). 68 (1), 105-115 (2014).
- Bar, S., Prasad, M., Datta, R. Neuromuscular degeneration and locomotor deficit in a Drosophila model of mucopolysaccharidosis VII is attenuated by treatment with resveratrol). Dis Model Mech. 11 (11), (2018).
- Imai, Y. PINK1-Parkin signaling in Parkinson's disease: Lessons from Drosophila. Neurosci Res. 159, 40-46 (2020).
- Julienne, H., Buhl, E., Leslie, D. S., Hodge, J. J. L. Drosophila PINK1 and parkin loss-of-function mutants display a range of non-motor Parkinson's disease phenotypes. Neurobiol Dis. 104, 15-23 (2017).
- Biswas, S., Bagchi, A. Analysis of the structural dynamics of the mutations in the kinase domain of PINK1 protein associated with Parkinson's disease. Gene. 857, 147183 (2023).
- Koh, H., Chung, J. PINK1 and Parkin to control mitochondria remodeling. Anat Cell Biol. 43 (3), 179-184 (2010).
- Zhu, M., Li, X., Tian, X., Wu, C. Mask loss-of-function rescues mitochondrial impairment and muscle degeneration of Drosophila pink1 and parkin mutants. Hum Mol Genet. 24 (11), 3272-3285 (2015).
- Park, J., et al. Mitochondrial dysfunction in Drosophila PINK1 mutants is complemented by parkin. Nature. 441 (7097), 1157-1161 (2006).
- Dytham, C. Choosing and using statistics: a biologist's guide. , Wiley-Blackwell. Hoboken, NJ. (2011).
- Bonora, M., et al.
- Gonçalves, D. F., et al. Caffeine improves mitochondrial function in PINK1B9-null mutant Drosophila melanogaster. J Bioenerg Biomembr. 55 (1), 1-13 (2023).
- Gonçalves, D. F., et al. Mitochondrial function and cellular energy maintenance during aging in a Drosophila melanogaster model of Parkinson disease. Mitochondrion. 65, 166-175 (2022).
- Janowska, J. I., et al. Mitochondrial respiratory chain complex I dysfunction induced by N-methyl carbamate ex vivo can be alleviated with a cell-permeable succinate prodrug. Toxicol In Vitro. 65, 104794 (2020).
- Ngo, D. T. M., et al. Oxidative modifications of mitochondrial complex II are associated with insulin resistance of visceral fat in obesity. Physiol Endocrinol Metab. 316 (2), E168-E177 (2019).
- Stroud, D. A., et al. Accessory subunits are integral for assembly and function of human mitochondrial complex I. Nature. 538 (7623), 123-126 (2016).
- Senyilmaz, D., et al. Regulation of mitochondrial morphology and function by stearoylation of TFR1. Nature. 525 (7567), 124-128 (2015).
- Poddighe, S., et al. Mucuna pruriens (Velvet bean) rescues motor, olfactory, mitochondrial and synaptic impairment in PINK1B9 Drosophila melanogaster genetic model of Parkinson's disease. PloS One. 9 (10), e110802 (2014).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 810, 25-58 (2012).
- Winer, L. S. P., Wu, M. Rapid analysis of glycolytic and oxidative substrate flux of cancer cells in a microplate. PloS One. 9 (10), e109916 (2014).
- Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio Protoc. 8 (10), e2850 (2018).
- Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. Am J Physiol. Cell Physiol. 292 (1), C125-C136 (2007).
- Divakaruni, A. S., Jastroch, M. A practical guide for the analysis, standardization and interpretation of oxygen consumption measurements. Nat Metab. 4 (8), 978-994 (2022).
- Bingol, B., Sheng, M. Mechanisms of mitophagy: PINK1, Parkin, USP30 and beyond. Free Radic Biol Med. 100, 210-222 (2016).
