Summary
Nous présentons ici un protocole de respirométrie à haute résolution pour analyser la bioénergétique chez les mouches des fruits mutantes PINK1B9-null. La méthode utilise le protocole SUIT (Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration).
Abstract
Les maladies neurodégénératives, y compris la maladie de Parkinson (MP), et les perturbations cellulaires telles que le cancer sont quelques-uns des troubles qui perturbent le métabolisme énergétique avec une altération des fonctions mitochondriales. Les mitochondries sont des organites qui contrôlent à la fois le métabolisme énergétique et les processus cellulaires impliqués dans la survie et la mort cellulaires. Pour cette raison, les approches d’évaluation de la fonction mitochondriale peuvent offrir des informations importantes sur les conditions cellulaires dans les processus pathologiques et physiologiques. À cet égard, les protocoles de respirométrie à haute résolution (HRR) permettent d’évaluer l’ensemble de la fonction de la chaîne respiratoire mitochondriale ou l’activité de complexes mitochondriaux spécifiques. De plus, l’étude de la physiologie mitochondriale et de la bioénergétique nécessite des modèles génétiquement et expérimentalement traitables tels que Drosophila melanogaster.
Ce modèle présente plusieurs avantages, tels que sa similitude avec la physiologie humaine, son cycle de vie rapide, sa facilité d’entretien, sa rentabilité, ses capacités de débit élevées et un nombre réduit de préoccupations éthiques. Ces attributs en font collectivement un outil inestimable pour disséquer des processus cellulaires complexes. Le présent travail explique comment analyser la fonction mitochondriale à l’aide du mutantB9-null de Drosophila melanogaster PINK1. Le gène pink1 est responsable du codage de la kinase présumée 1 induite par PTEN, par un processus reconnu sous le nom de mitophagie, qui est crucial pour l’élimination des mitochondries dysfonctionnelles du réseau mitochondrial. Des mutations de ce gène ont été associées à une forme familiale autosomique récessive précoce de la maladie de Parkinson. Ce modèle peut être utilisé pour étudier le dysfonctionnement mitochondrial impliqué dans la physiopathologie de la maladie de Parkinson.
Introduction
Les mitochondries sont des organites cellulaires qui contrôlent des fonctions importantes, notamment la régulation apoptotique, l’homéostasie calcique et la participation aux voies de biosynthèse. En possédant du matériel génétique autonome, ils sont capables de contribuer aux processus de maintenance et de réparation cellulaires. Leur structure abrite la chaîne de transport d’électrons et la phosphorylation oxydative, toutes deux cruciales pour l’énergie cellulaire 1,2,3. En particulier, le contrôle de l’énergie est obtenu grâce à la production d’adénosine triphosphate (ATP) par phosphorylation oxydative (OXPHOS)2. La perturbation du métabolisme énergétique avec altération des fonctions mitochondriales se produit à la fois dans la survie et la mortcellulaire4,5, fréquemment associée à un large éventail de pathologies humaines, telles que le cancer, et les maladies neurodégénératives telles que la maladie de Parkinson (MP)3,6.
La maladie de Parkinson est un trouble chronique, progressif et neurologique. La cause principale de cette maladie est la mort des cellules cérébrales, en particulier dans la substance noire, qui sont responsables de la production du neurotransmetteur dopamine, qui contrôle le mouvement 6,7,8. La première observation qui a lié le parkinsonisme au dysfonctionnement mitochondrial a été faite en 1988, dans des modèles expérimentaux utilisant des toxines qui inhibent la chaîne respiratoire Complexe I9.
À l’heure actuelle, il existe plusieurs méthodes pour évaluer le dysfonctionnement mitochondrial 10,11,12,1 3 ; cependant, par rapport aux approches conventionnelles, la respirométrie à haute résolution (HRR) présente une sensibilité et des avantages supérieurs13,14. Par exemple, les protocoles HRR permettent d’évaluer l’ensemble de la fonction de la chaîne respiratoire mitochondriale ou l’activité de complexes mitochondriaux spécifiques14,15. Les dysfonctionnements mitochondriaux peuvent être évalués dans des cellules intactes, des mitochondries isolées, ou même ex vivo 10,11,13,14.
Les dysfonctionnements mitochondriaux sont étroitement associés à de nombreux processus pathologiques et physiologiques. Il est donc important d’étudier la physiologie mitochondriale et la bioénergétique à l’aide de systèmes modèles génétiquement et expérimentalement traitables. À cet égard, la recherche sur Drosophila melanogaster, la mouche des fruits, présente plusieurs avantages. Ce modèle partage des caractéristiques et des processus cellulaires fondamentaux avec les humains, y compris l’utilisation de l’ADN comme matériel génétique, des organites communs et des voies moléculaires conservées impliquées dans le développement, l’immunité et la signalisation cellulaire. De plus, les mouches des fruits ont un cycle de vie rapide, un entretien facile, un faible coût, un débit élevé et moins de préoccupations éthiques, constituant ainsi un outil inestimable pour disséquer les processus cellulaires complexes 16,17,18,19,20.
De plus, un homologue du gène de la kinase 1 putative induite par PTEN (pink1) est exprimé chez D. melanogaster. Il joue un rôle crucial dans l’élimination des mitochondries endommagées par le processus de mitophagie8. Chez l’homme, les mutations de ce gène prédisposent les individus à une forme familiale autosomique récessive de la maladie de Parkinson associée à un dysfonctionnement mitochondrial 8,21,22,23. Par conséquent, la mouche des fruits est un modèle animal puissant pour les études sur la physiopathologie de la maladie de Parkinson et le criblage de candidats-médicaments axés sur le dysfonctionnement mitochondrial et la bioénergétique. Par conséquent, le présent travail explique comment analyser la fonction mitochondriale dans un modèle de MP de D. melanogaster en utilisant la technique HRR dans l’OROBOROS avec le protocole SUIT (Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration).
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Protocol
Nous avons utilisé les souches w1118 (blanches) et w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 (appelées Pink1B9) (FlyBase ID : FBgn0029891) du centre de stockage de Bloomington Drosophila (numéro d’identification : 34749). Dans cette étude, les mutants mâles de D. melanogaster PINK1B9-null sont comparés aux mâles de D. melanogaster de la souche w1118, qui est utilisée comme groupe témoin (patrimoine génétique). D’autres paramètres doivent être analysés de manière concomitante avec les expériences de respirométrie pour s’assurer que les mouches ont le génotype correct (Pink1B9/Y), tels que les déformations du thorax et les problèmes de locomotion, qui sont bien décrits pour les mouches mutantes roses1B9 24,25,26.
1. Animaux et logement
- Conservez les mouches dans des bouteilles en verre contenant 10 mL d’alimentation standard (levure 1,73 %, farine de soja 0,9 %, farine de maïs 7,3 %, gélose 0,5 %, sirop de maïs 7,6 % et acide propionique 0,48 %) à température et humidité constantes (25 °C et 60 %, respectivement), avec un cycle lumière/obscurité de 12 h : 12 h.
- Pour chaque expérience, utilisez deux mouches âgées de 1 à 3 jours après l’éclosion.
NOTE : Les mouches femelles vierges mutantes PINK1B9-null ont été croisées avec des mâles w1118 pour obtenir les mâles F1 avec le génotype Pink1B9/Y.
2. Préparation de l’échantillon
- Préparez le tampon MiR05 comme décrit dans le Tableau 1.
- Anesthésier les mouches sur de la glace et les transférer dans des tubes de microcentrifugation (deux mouches par tube).
- Dans chaque tube, ajouter 200 μL de tampon MiR05 réfrigéré et homogénéiser les mouches. Homogénéiser manuellement, en appliquant une légère pression (environ 4 à 6 coups de pilon) pour éviter la désintégration des mitochondries.
3. Étalonnage de respirométrie à haute résolution des capteurs polarographiques d’oxygène
REMARQUE : Les chambres OROBOROS ont un volume total d’environ 2 mL. Un étalonnage est nécessaire pour s’assurer que le flux d’oxygène est proche de 0 pmol pour commencer le test.
- En commençant l’étalonnage, ajoutez 2 mL de MiR05 dans la chambre. Couvrez la chambre avec le bouchon en ne laissant aucune bulle d’air ; Ensuite, tirez délicatement sur le bouchon pour former une seule bulle d’air.
- Ouvrez le logiciel OROBOROS Dat.Lab. Entrez une température de 25 °C dans le champ Température du bloc et cliquez sur Se connecter à l’Oxygraph-2k (Figure 1A).
- Cliquez et sélectionnez le dossier dans lequel l’étalonnage doit être enregistré et cliquez sur Enregistrer.
- Lorsqu’une nouvelle fenêtre s’ouvre, nommez l’expérience et les échantillons (en cas d’étalonnage, entrez simplement le nom de l’étalonnage) et cliquez sur Enregistrer.
- Allez dans le menu Mise en page et choisissez la première option : 01 Exp. d’étalonnage Gr.3 - Temp comme indiqué à la Figure 1B.
- Attendez que le programme redirige vers la disposition d’étalonnage, attendez que la ligne rouge affiche une ligne droite standard avec des points autour de 0 pmol. Ensuite, sélectionnez deux points : l’un pour la chambre A et l’autre pour la chambre B (Figure 1C) lorsque la ligne rouge est exactement à zéro.
REMARQUE : Les points sélectionnés doivent avoir un flux d’oxygène (ligne rouge) autour de 0.- Pour marquer les points des deux chambres, sélectionnez la concentration O2 à droite de l’écran, sélectionnez le point marqué et copiez les valeurs de température et de pression barométrique par rapport au point. Collez ces valeurs dans les cases ci-dessous et cliquez sur Calibrer et copier dans le presse-papiers dans le coin inférieur droit de l’écran, comme illustré à la figure 2.
- Effectuez ce processus pour les deux chambres (A et B), puis allez dans le menu Fichier et sélectionnez Enregistrer et déconnecter.
REMARQUE : Après le processus d’étalonnage, le programme redirigera l’utilisateur vers l’écran d’accueil afin que le logiciel soit prêt à démarrer le test HRR. Pour ce test, nous utiliserons le protocole SUIT.
4. Protocole SUIT
- Une fois l’étalonnage terminé, retirez les bouchons et ouvrez les chambres.
- Lavez les bouchons (en tenant l’embout qui ne touche pas l’échantillon) et les chambres avec 100 % d’éthanol, 70 % d’éthanol et de l’eau distillée, dans cet ordre.
REMARQUE : Répétez le processus pour chaque changement d’échantillon. - Homogénéiser les mouches dans 200 μL de tampon, placer tout le contenu de l’échantillon dans la chambre à l’aide d’une micropipette et déplacer le bouchon dans la chambre en prenant soin de ne pas créer de bulles d’air.
REMARQUE : Si des bulles d’air se forment, retirez délicatement le bouchon et ajoutez 100 μL de tampon MIR05. - Cliquez sur le menu Mise en page et sélectionnez l’option 05 Débit par volume corrigé comme illustré à la figure 1B.
- Attendez d’être redirigé vers une nouvelle fenêtre. Cliquez sur Enregistrer pour sélectionner le dossier dans lequel l’expérience doit être enregistrée.
- Attendez qu’une nouvelle fenêtre s’ouvre. Nommez l’expérience dans l’espace Code expérimental. Ensuite, nommez chaque échantillon dans sa chambre A et B respective dans le champ Échantillon , et définissez l’unité de champ sur unité.
REMARQUE : D’autres unités peuvent également être choisies, par exemple, Millions de cellules ou mg. - Étant donné que ce protocole utilise deux mouches (2 unités) et que le volume de la chambre est de 2 mL, dans le champ Concentration , définissez 1 par mL (Figure 1D).
REMARQUE : Ici, la quantité d’échantillon a été normalisée en fonction du nombre de mouches ; cependant, cette normalisation peut être effectuée par la teneur en protéines de l’échantillon, la quantification de l’ADN mitochondrial ou l’activité de la citrate synthase. - Lorsque le signal de flux d’oxygène (ligne rouge) est stable sur la valeur positive, commencez le protocole HRR avec le titrage des substrats, des inhibiteurs et des découpleurs (Figure 3). Tous les réactifs et équipements suivants sont présentés dans le tableau 1.
- Ajouter de la digitonine (5 μg/mL) pour perméabiliser la membrane mitochondriale.
- Ajoutez des substrats de pyruvate (5 mM), de malate (2 mM) et de proline (10 mM) et attendez que le flux d’oxygène augmente et se stabilise. Pour marquer l’événement de chaque ajout de réactif, appuyez sur la touche F4 du clavier et entrez le nom de chaque réactif.
- Ajouter de l’ADP (5mM) pour coupler la chaîne respiratoire mitochondriale et attendre l’augmentation et la stabilisation du flux d’oxygène.
- Ajouter le succinate (10 mM) et attendre l’augmentation et la stabilisation du flux d’oxygène.
- Ajoutez de l’oligomycine (2,5 μM) pour inhiber l’ATP synthase et rechercher une diminution du flux d’oxygène.
- Attendez que la ligne rouge se stabilise et découplez le transfert d’électrons mitochondriaux à l’aide de cyanure de carbonyle-4-(trifluorométhoxy) phénylhydrazone (FCCP) avec des titres de 0,25 μM jusqu’à ce que la consommation maximale d’oxygène soit atteinte, démontrée par l’élévation de la ligne rouge. Après avoir stabilisé le flux d’oxygène, commencez à ajouter les inhibiteurs de chaque complexe, un à la fois.
- Ajouter de la roténone (0,5 μM), un inhibiteur du complexe I. Attendez la diminution et la stabilisation du flux d’oxygène pour ajouter l’inhibiteur suivant.
- Ajouter du malonate (5 mM), un inhibiteur du complexe II. Attendez la diminution et la stabilisation du flux d’oxygène pour ajouter l’inhibiteur suivant.
- Enfin, ajoutez de l’antimycine (2,5 μM), un inhibiteur du complexe III. Attendez la diminution suivie de l’augmentation et de la stabilisation du flux d’oxygène.
REMARQUE : Le flux d’oxygène devrait se stabiliser à une valeur positive mais inférieure à la valeur de la dernière inhibition des complexes protéiques mitochondriaux.
- À la fin de l’analyse, retirez tout le contenu des chambres à l’aide d’une micropipette. Conserver à -20 °C pour une analyse ultérieure, si nécessaire.
5. Analyse des données
- Utiliser un progiciel statistique approprié pour l’analyse des données.
- Effectuez des tests t pour évaluer les différences entre les deux groupes. Pour les situations impliquant plusieurs traitements, utilisez l’analyse de variance (ANOVA) comme test statistique 27.
- Extrayez les valeurs de flux d’O2 à partir du graphique généré par le logiciel. OXPHOS CI fait référence à la valeur du flux d’O2 après l’ajout d’ADP. OXPHOS CII est obtenu en soustrayant OXPHOS CI&CII - OXPHOS CI. OXPHOS CI&CII est la valeur du flux d’O2 extrait après l’ajout de succinate. ETS CI&CII est la valeur du flux O2 après l’ajout de FCCP. ETS CI = FCCP - Roténone et ETS CII = Roténone - Malonate.
- Calculer la synthèse de l’ATP comme la différence entre l’OXPHOS (P) et la FUITE (L) (P - L)28.
- Déterminer le rapport de contrôle respiratoire (RCR) en calculant le rapport OXPHOS/LEAK, où RCR = P/L.11
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Representative Results
Ici, nous constatons que le flux d’O2 dans les états OXPHOS CI (P = 0,0341) et OXPHOS CI&II (P = 0,0392) est réduit chez les mouches nulles PINK1B9 par rapport aux mouches témoins (Figure 4). Ce résultat a également été observé dans les résultats précédents de notre groupe29,30.
L’IC et l’IC sont des composants clés du système de transport d’électrons (ETS), dans lequel l’IC est responsable du transfert d’électrons du NADH à l’ubiquinone, tandis que l’ICI transfère les électrons du succinate à l’ubiquinone 31,32,33. Les mouches nulles PINK1B9 ont montré un fluxd’O2 plus faible dans les états ETS CI (P = 0,0338), ETS CII (P = 0,0457) et ETS CI&II (P = 0,0247) (Figure 5). Ces résultats indiquent que le système de transfert d’électrons est altéré chez les mouches dépourvues du gène pink1 et que le flux d’O2 aux stades OXPHOS et ETS dépend de l’IC et de l’IC&CII, ce qui est cohérent avec d’autres travaux démontrant une activité réduite de l’IC dans les modèles pink1-/- 33,34,35.
De plus, le gradient de protons à travers la membrane interne mitochondriale est essentiel à la synthèse de l’ATP28. La diminution du flux d’O2 dans ETS CI et ETS CII indique une perturbation du flux d’électrons le long de l’ETS. Cette perturbation du flux d’électrons affecte le processus OXPHOS, ce qui entraîne une réduction de la synthèse d’ATP. Il y a également eu une diminution significative de la consommation d’O2 liée à la synthèse de l’ATP (P = 0,0280) chez les mouches nulles PINK1B9 par rapport aux mouches témoins (Figure 6B). Une diminution de la synthèse de l’ATP chez D. melanogaster peut avoir des effets significatifs sur le métabolisme énergétique, les processus cellulaires et les fonctions physiologiques globales. De plus, l’efficacité du procédé OXPHOS peut être quantifiée par un indice connu sous le nom de RCR, qui reflète l’étanchéité du couplage entre la respiration et la phosphorylation. Par conséquent, la réduction du RCR (P = 0,0432) indique un découplage mitochondrial, ce qui peut affecter le processus OXPHOS, ce qui suggère que les mitochondries sont moins efficaces pour utiliser l’oxygène et produire de l’ATP (Figure 6C). Ces résultats peuvent avoir un impact sur la croissance, le développement, la locomotion, la reproduction et la santé globale de la mouche des fruits et contribuer à la pathogenèse de certaines maladies neurodégénératives, y compris la 8,28,29,32.
Figure 1 : Mises en page dans le logiciel OROBOROS Dat.Lab. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Étapes d’étalonnage des chambres dans le logiciel OROBOROS Dat.Lab. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Protocole SUIT démontrant les principaux points de l’ajout de substrat et d’inhibiteur. Tout d’abord, la digitonine (DIG) est ajoutée, suivie de substrats spécifiques du complexe I : malate, pyruvate et proline (MPP), substrat de l’ATP synthase (ADP), puis substrat du complexe II : succinate (S). Par la suite, l’inhibiteur de l’ATP synthase : l’oligomycine (OMY) est ajouté, suivi du cyanure de carbonyl-4-(trifluorométhoxy) phénylhydrazone (F) et des inhibiteurs complexes I, II et III : roténone (R), malonate (MNA) et antimycine (AMA)36. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Respirométrie à haute résolution comparant les mouches w1118 et PINK1B9. (A) OXPHOS CI, (B) OXPHOS CII et (C) OXPHOS CI&CII. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± S.E.M. et analysées à l’aide d’un test t. n = 5 à 9. p < 0,05. Abréviations : OXPHOS = phosphorylation oxydative ; IC = complexe I ; CII = complexe II. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Respirométrie à haute résolution comparant les mouches w1118 et PINK1B9 . (A) ETS CI, (B) ETS CII et (C) ETS CI&CII. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± S.E.M. et analysées par test t. n = 5 à 9. p < 0,05. Abréviations : ETS = système de transport d’électrons ; IC = complexe I ; CII = complexe II. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Respirométrie à haute résolution comparant les mouches w1118 et PINK1B9. (A) Fuite, (B) Synthèse d’ATP, et (C) Rapport de contrôle respiratoire. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± S.E.M. et analysées par test t. n = 5 à 9. p < 0,05. Abréviation : RCR = rapport de contrôle respiratoire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
La HRR est une technique puissante pour étudier la respiration mitochondriale et le métabolisme énergétique chez D. melanogaster et d’autres organismes. Il fournit une évaluation détaillée et quantitative de la fonction mitochondriale, permettant aux chercheurs de mieux comprendre la bioénergétique des cellules. Le protocole présenté ici décrit l’évaluation de la fonction de la chaîne respiratoire mitochondriale et de l’activité de complexes mitochondriaux spécifiques à l’aide du protocole SUIT chez D. melanogaster. Le protocole SUIT implique la manipulation systématique de divers substrats, découleurs et inhibiteurs pour examiner différents aspects de la respiration mitochondriale.
La technique décrite permet d’évaluer l’inhibition respiratoire résultant des effets sur l’OXPHOS ou l’ETS, l’activité déshydrogénase (IC et CII) et l’intégrité membranaire (couplage de l’OXPHOS). Ici, nous avons réalisé les expériences en utilisant des mouches PINK1B9-null pour étudier le dysfonctionnement mitochondrial puisqu’il est associé à34,35. Cependant, ce protocole peut être utile pour différents modèles de maladies, traitements médicamenteux et études toxicologiques.
En outre, la préparation de l’échantillon peut être adaptée aux exigences expérimentales36. Une étape critique du protocole de respirométrie est la préparation des échantillons. Il est essentiel d’établir le protocole correct pour le type d’échantillon (cellule, mitochondries isolées, homogénat), et il est important d’envisager la méthode appropriée pour la normalisation de l’échantillon (quantité de protéines, teneur en ADN, activité de la citrate synthase). Il est également important d’utiliser le même tampon pour la préparation de l’échantillon et le test de respirométrie.
Comme le protocole de préparation de l’échantillon décrit ici est simple, il ne pose généralement pas de problèmes pour la technique. Si un autre type d’échantillon est choisi ou si sa préparation est modifiée, une normalisation minutieuse est nécessaire. L’agitation et la stabilité de la température affectent le signal du capteur d’oxygène polarographique, générant une erreur dans les mesures respiratoires à l’aide d’un oxygraphe. Par conséquent, l’étalonnage correct de la chambre constitue une étape importante pour réduire les erreurs lors des mesures respiratoires.
Cette méthode d’évaluation de la fonction mitochondriale dans les échantillons de mouches offre plusieurs avantages par rapport aux approches alternatives. L’un des principaux points forts de la HRR est sa capacité à fournir des mesures directes et précises de la consommation d’oxygène, permettant une analyse détaillée de la fonction mitochondriale et du métabolisme cellulaire. Par conséquent, la HRR est souvent utilisée dans la recherche axée sur la compréhension du dysfonctionnement mitochondrial, de la production d’énergie et des réponses cellulaires à différents substrats ou conditions. De plus, il est polyvalent - permettant l’utilisation d’une grande variété de types d’échantillons, y compris des mitochondries isolées - et nécessite de petites quantités d’échantillons biologiques, ce qui est utile lorsque la quantité d’échantillons est limitée 1,2,3. Les méthodes qui utilisent des isolats mitochondriaux, par exemple, impliquent généralement un nombre important de mouches, allant de 50 à 200 individus, ce qui rend l’étude avec des mutants difficile, car l’obtention d’un grand nombre de mutants pour certains modèles de maladie peut ne pas être pratique.
Semblable à la méthode HRR, l’analyseur de flux extracellulaire Seahorse Bioscience est un outil scientifique utilisé pour mesurer la consommation d’oxygène et l’acidification extracellulaire. Cependant, ils ont des approches et des applications différentes. L’analyseur de flux extracellulaire Seahorse Bioscience quantifie les altérations instantanées du taux de consommation d’oxygène (OCR) et du taux d’acidification extracellulaire (ECAR) des cellules. L’OCR est indicative de la respiration mitochondriale et de la production d’énergie, tandis que l’ECAR offre un aperçu de l’activité glycolytique. Sa fonction principale réside dans l’évaluation de la dynamique métabolique cellulaire dans diverses conditions physiologiques, ce qui le rend particulièrement utile pour élucider les modulations métaboliques complexes associées à des contextes pathologiques. De plus, Seahorse est conçu pour être facile à utiliser, ce qui permet aux chercheurs d’effectuer des tests métaboliques rapides 37,38,39. En revanche, le RRH nécessite une formation et une expertise spécialisées pour exploiter et analyser efficacement les données. Il s’agit de l’utilisation d’une électrode à oxygène pour mesurer directement la consommation d’oxygène par les cellules ou les mitochondries 13,14,40. L’un des avantages de la HRR est sa polyvalence dans la conception de différents protocoles de respirométrie, ce qui est impraticable lors de l’utilisation de Seahorse. Cette polyvalence dans la conception de protocoles associés à un faible coût fait de la méthode HRR un choix viable pour les laboratoires disposant d’un financement limité. Un autre inconvénient du système de respirométrie utilisé dans le présent protocole est l’impossibilité de travailler avec plusieurs échantillons simultanément, ce qui entrave l’analyse à haut débit. Ainsi, les groupes expérimentaux doivent être bien conçus pour permettre une comparaison correcte entre eux. Cependant, les avantages de ce système résident dans le fait que des échantillons de toute nature peuvent être testés, des cellules isolées aux organismes vivants entiers, tels que C. elegans, par exemple40.
En résumé, la HRR est une méthode fiable pour étudier la fonction mitochondriale dans des conditions physiologiques et pathologiques41. Chaque modèle expérimental a des caractéristiques et des restrictions différentes, ce qui nécessite des ajustements méthodologiques et de préparation des échantillons pour assurer une acquisition de données fiable et significative dans l’évaluation de la respiration mitochondriale. Ce protocole offre aux chercheurs une méthode fiable pour évaluer les effets de facteurs environnementaux, d’interventions expérimentales ou de mutations génétiques sur la fonction mitochondriale chez D. melanogaster.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent pas d’intérêts concurrents.
Acknowledgments
Les auteurs remercient l’agence brésilienne Coordenação de Aperfeiçoamento de Pesquisa Pessoal de Nível Superior (CAPES EPIDEMIAS 09 #88887.505377/2020). P.M. (#88887.512821/2020-00) et T.D. (#88887.512883/2020-00) sont récipiendaires d’une bourse de recherche.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | Adenosine 5′-diphosphate sodium sal (CAS number 72696-48-1); ≥95%; molecular weight = 501.31 g/mol. |
| Ágar | Kasv | K25-1800 | For bacteriologal use |
| Antimycin-A | Sigma-Aldrich | A8674 | Antimycin A from Streptomyces sp. (CAS number 1397-94-0); molecular weight 540 g/mol; |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | Bovine Serum Albumin (CAS number 9048-46-8); pH 7,0 ≥ 98% |
| Datlab software | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20700 | Software for data acquisition and analysis |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D 5628 | CAS number 11024-24-1 |
| Distilled water | |||
| Drosophila melanogaster strain w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 | Obtained from Bloomington Drosophila stock center | ||
| Drosophila melanogaster strain w1118 | Obtained from the Federal University of Santa Maria | ||
| EGTA | Sigma-Aldrich | E8145 | Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (CAS number 13638-13-3); ≥97%; molecular weight =468.28 g/mol |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920 | Carbonyl cyanide 4- (trifluoromethoxy)phenylhydrazone (CAS number 370-86-5); ≥98% (TLC), powder |
| GraphPad Prism version 8.0.1. | Software for data acquisition and analysis | ||
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034 | 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (CAS number 7365-45-9); ≥99,5% (titration), cell cultured tested; molecular weight = 238.30 g/mol |
| High-resolution respirometer Oxygraph O2K | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 10022-02 | Startup O2K respirometer kit |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | Monopotassium phosphate (CAS number 7778-77-0); Reagente Plus, molecular weigt = 136.09 g/mol |
| KOH | Sigma-Aldrich | 211473 | Potassium hydroxide (CAS number 1310-58-3); ACS reagent, ≥85%, pellets |
| Malate | Sigma-Aldrich | M1296 | Malonic acid (CAS number 141-82-2); 99%, molecular weight = 104.06 g/mol). A solution is pH adjusted to approximately 7.0. |
| Malic acid | Sigma-Aldrich | M1000 | (S)-(−)-2-Hydroxysuccinic acid (CAS number 97-67-6); ≥95% ; molecular weight = 134.09 g/mol |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (CAS number 4432-31-9); ≥99% (titration); molecular weight = 195.24 g/mol |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Magnesium chloride (CAS number 7786-30-3); anhydrous, ≥98%, molecular weight = 95.21 g/mol |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | ||
| O2K-Titration Set | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20820-03 | Hamilton syringes with different volumes |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O 4876 | Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes (CAS number 1404-19-9); ≥90% total oligomycins basis (HPLC) |
| Pistil to homogenization | |||
| Proline | Sigma-Aldrich | P0380 | L-Proline (CAS number 147-85-3); powder; 99%; molecular weight = 115.13 g/mol |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Sodium pyruvate (CAS number 113-24-6), ≥99%; molecular weight = 110.04 g/mol |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | Rotetone (CAS number 83-79-4); ≥95%, molecular weight 394.42 g/ mol |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S 2378 | Sodium succinate dibasic hexahydrate (CAS number 6106-21-4); ≥99% |
| Sucrose | Merck | 107,651,000 | Sucrose for microbiology use (CAS number 57-50-1) |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | CAS number 107-35-7 |
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