Summary
Burada, PINK1B9-null mutant meyve sineklerinde biyoenerjetik analiz etmek için yüksek çözünürlüklü bir respirometri protokolü sunuyoruz. Yöntem, Substrat-Bağlayıcı-İnhibitör-Titrasyon (SUIT) protokolünü kullanır.
Abstract
Parkinson Hastalığı (PH) dahil olmak üzere nörodejeneratif hastalıklar ve kanser gibi hücresel bozukluklar, mitokondriyal fonksiyonların bozulmasıyla enerji metabolizmasını bozan bozukluklardan bazılarıdır. Mitokondri, hem enerji metabolizmasını hem de hücre sağkalımı ve ölümünde yer alan hücresel süreçleri kontrol eden organellerdir. Bu nedenle, mitokondriyal fonksiyonu değerlendirme yaklaşımları, patolojik ve fizyolojik süreçlerdeki hücresel durumlar hakkında önemli bilgiler sunabilir. Bu bağlamda, yüksek çözünürlüklü respirometri (HRR) protokolleri, tüm mitokondriyal solunum zinciri fonksiyonunun veya spesifik mitokondriyal komplekslerin aktivitesinin değerlendirilmesine izin verir. Ayrıca, mitokondriyal fizyoloji ve biyoenerjetik çalışmak, Drosophila melanogaster gibi genetik ve deneysel olarak izlenebilir modeller gerektirir.
Bu model, insan fizyolojisine benzerliği, hızlı yaşam döngüsü, kolay bakımı, maliyet etkinliği, yüksek verim yetenekleri ve en aza indirilmiş sayıda etik kaygı gibi çeşitli avantajlar sunar. Bu özellikler toplu olarak onu karmaşık hücresel süreçleri incelemek için paha biçilmez bir araç olarak kurar. Bu çalışma, Drosophila melanogaster PINK1B9-null mutantı kullanılarak mitokondriyal fonksiyonun nasıl analiz edileceğini açıklamaktadır. Pink1 geni, işlevsiz mitokondrinin mitokondriyal ağdan çıkarılması için çok önemli olan mitofaji olarak tanınan bir süreç yoluyla PTEN'in neden olduğu varsayılan kinaz 1'i kodlamaktan sorumludur. Bu gendeki mutasyonlar, otozomal resesif erken başlangıçlı ailesel PH formu ile ilişkilendirilmiştir. Bu model, PH'nin patofizyolojisinde yer alan mitokondriyal disfonksiyonu incelemek için kullanılabilir.
Introduction
Mitokondri, apoptotik regülasyon, kalsiyum homeostazı ve biyosentetik yollara katılım dahil olmak üzere önemli işlevleri kontrol eden hücresel organellerdir. Özerk genetik materyale sahip olarak, hücresel bakım ve onarım süreçlerine katkıda bulunabilirler. Yapıları, her ikisi de hücresel enerji 1,2,3 için çok önemli olan elektron taşıma zincirini ve oksidatif fosforilasyonu barındırır. Özellikle, oksidatif fosforilasyon (OXPHOS)2 yoluyla adenozin trifosfat (ATP) üretimi yoluyla enerji kontrolü sağlanır. Mitokondriyal fonksiyonların bozulması ile enerji metabolizmasının bozulması hem hücre sağkalımında hem de ölümde meydana gelir 4,5, sıklıkla kanser gibi çok çeşitli insan patolojileri ve Parkinson Hastalığı (PD) gibi nörodejeneratif hastalıklarla ilişkilidir3,6.
PH kronik, ilerleyici ve nörolojik bir hastalıktır. Bu hastalığın birincil nedeni, özellikle 6,7,8 hareketini kontrol eden nörotransmitter dopaminin üretiminden sorumlu olan substantia nigra'da beyin hücrelerinin ölümüdür. Parkinsonizmi mitokondriyal disfonksiyona bağlayan en eski gözlem, 1988'de solunum zinciri Kompleksi I9'u inhibe eden toksinler kullanılarak deneysel modellerde yapıldı.
Şu anda, mitokondriyal disfonksiyonu değerlendirmek için birkaç yöntem vardır 10,11,12,1 3; bununla birlikte, geleneksel yaklaşımlarla karşılaştırıldığında, yüksek çözünürlüklü respirometri (HRR) üstün duyarlılık ve avantajlar sunar 13,14. Örneğin, HRR protokolleri, tüm mitokondriyal solunum zinciri fonksiyonunun veya spesifik mitokondriyal komplekslerinaktivitesinin değerlendirilmesine izin verir 14,15. Mitokondriyal disfonksiyonlar sağlam hücrelerde, izole mitokondrilerde ve hatta ex vivo olarak değerlendirilebilir 10,11,13,14.
Mitokondriyal disfonksiyonlar birçok patolojik ve fizyolojik süreçle yakından ilişkilidir. Bu nedenle, genetik ve deneysel olarak izlenebilir model sistemleri kullanarak mitokondriyal fizyoloji ve biyoenerjetik çalışmak önemlidir. Bu bağlamda, meyve sineği olan Drosophila melanogaster üzerine yapılan araştırmaların çeşitli avantajları vardır. Bu model, DNA'nın genetik materyal olarak kullanımı, ortak organeller ve gelişim, bağışıklık ve hücre sinyalizasyonunda yer alan korunmuş moleküler yollar dahil olmak üzere insanlarla temel hücresel özellikleri ve süreçleri paylaşır. Ek olarak, meyve sinekleri hızlı bir yaşam döngüsüne, kolay bakıma, düşük maliyete, yüksek verime ve daha az etik kaygıya sahiptir, bu nedenle karmaşık hücresel süreçleri incelemek için paha biçilmez bir araç oluşturur 16,17,18,19,20.
Ayrıca, PTEN'in neden olduğu varsayılan kinaz 1 (pembe1) geninin bir homologu D. melanogaster'de eksprese edilir. Mitofaji süreci boyunca hasarlı mitokondrinin uzaklaştırılmasında çok önemli bir rol oynar8. İnsanlarda, bu gendeki mutasyonlar, bireyleri mitokondriyal disfonksiyon ile ilişkili otozomal resesif ailesel bir PD formuna yatkın hale getirir 8,21,22,23. Sonuç olarak, meyve sineği, PH'nin patofizyolojisi ve mitokondriyal disfonksiyon ve biyoenerjetiklere odaklanan ilaç adaylarının taranması üzerine çalışmalar için güçlü bir hayvan modelidir. Bu nedenle, bu çalışma, Substrat-Birleştirici-İnhibitör-Titrasyon (SUIT) protokolü ile OROBOROS'ta HRR tekniği kullanılarak D. melanogaster'den bir PD modelinde mitokondriyal fonksiyonun nasıl analiz edileceğini açıklamaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bloomington Drosophila stok merkezinden w1118 (beyaz) ve w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 (Pink1B9 olarak anılır) suşlarını kullandık (FlyBase ID: FBgn0029891) (Kimlik numarası: 34749). Bu çalışmada, erkek D. melanogaster PINK1B9-null mutantları, kontrol grubu (genetik arka plan) olarak kullanılan w1118 suşundan erkek D. melanogaster ile karşılaştırılmıştır. Sineklerin doğru genotipe (Pink1B9/Y) sahip olduğundan emin olmak için diğer parametreler respirometri deneyleriyle birlikte analiz edilmelidir, örneğin toraks deformiteleri ve hareket problemleri gibi pembe1B9 mutant sinekler 24,25,26.
1. Hayvanlar ve barınak
- Sinekleri 10 mL standart diyet (%1,73 maya, %0,9 soya unu, %7,3 mısır unu, %0,5 agar, %7,6 mısır şurubu ve %0,48 propiyonik asit) içeren cam şişelerde sabit sıcaklık ve nemde (sırasıyla 25 °C ve %60) 12 saat:12 saat aydınlık/karanlık döngüsünde saklayın.
- Her deney için, eklosiyondan 1-3 gün sonra iki sinek kullanın.
NOT: PINK1B9-null mutant bakire dişi sinekleri, Pink1B9/Y genotipine sahip F1 erkeklerini elde etmek için w1118 erkekle çaprazlandı.
2. Numune hazırlama
- MiR05 arabelleğini Tablo 1'de açıklandığı gibi hazırlayın.
- Sinekleri buz üzerinde uyuşturun ve mikrosantrifüj tüplerine aktarın (tüp başına iki sinek).
- Her tüpe 200 μL soğutulmuş MiR05 tamponu ekleyin ve sinekleri homojenize edin. Mitokondrinin parçalanmasını önlemek için hafif bir basınç uygulayarak (havaneli yaklaşık 4-6 vuruş) manuel olarak homojenize edin.
3. Polarografik oksijen sensörlerinin yüksek çözünürlüklü respirometri kalibrasyonu
NOT: OROBOROS odalarının toplam hacmi yaklaşık 2 mL'dir. Testi başlatmak için oksijen akısının 0 pmol'e yakın olduğundan emin olmak için kalibrasyon gereklidir.
- Kalibrasyonu başlatarak, hazneye 2 mL MiR05 ekleyin. Hazneyi tıpa ile örtün, hava kabarcığı bırakmayın; Ardından, tek bir hava kabarcığı oluşturmak için durdurucuyu dikkatlice çekin.
- OROBOROS Dat.Lab yazılımını açın. Blok sıcaklığı alanına 25 °C'lik bir sıcaklık girin ve Oxygraph-2k'ye Bağlan'a tıklayın (Şekil 1A).
- Kalibrasyonun kaydedileceği klasörü tıklayıp seçin ve Kaydet'e tıklayın.
- Yeni bir pencere açıldığında, deneyi ve örnekleri adlandırın (kalibrasyon yapıyorsanız, kalibrasyon adını girmeniz yeterlidir) ve Kaydet'e tıklayın.
- Düzen menüsüne gidin ve ilk seçeneği seçin: 01 Kalibrasyon Exp. Gr.3 - Şekil 1B'de gösterildiği gibi Sıcaklık.
- Programın kalibrasyon düzenine yönlendirilmesini bekleyin, kırmızı çizgi 0 pmol civarında noktalara sahip standart bir düz çizgi gösterene kadar bekleyin. Ardından, kırmızı çizgi tam olarak sıfırda olduğunda, biri A odası ve diğeri B odası için (Şekil 1C) olmak üzere iki nokta seçin.
NOT: Seçilen noktaların oksijen akısı (kırmızı çizgi) 0 civarında olmalıdır.- Her iki bölmenin noktalarını işaretlemek için ekranın sağındaki O2 konsantrasyonunu seçin, işaretli noktayı seçin ve noktaya göre hem sıcaklık hem de barometrik basınç değerlerini kopyalayın. Bu değerleri aşağıdaki kutulara yapıştırın ve Şekil 2'de gösterildiği gibi ekranın sağ alt köşesindeki Kalibre Et ve Panoya Kopyala'ya tıklayın.
- Bu işlemi her iki oda (A ve B) için gerçekleştirin, ardından Dosya menüsüne gidin ve Kaydet ve Bağlantıyı Kes'i seçin.
NOT: Kalibrasyon işleminden sonra program, kullanıcının HRR testini başlatmaya hazır olması için kullanıcıyı ana ekrana yönlendirecektir. Bu test için SUIT protokolünü kullanacağız.
4. SUIT protokolü
- Kalibrasyon tamamlandığında, tıpaları çıkarın ve hazneleri açın.
- Tıpaları (numuneye temas etmeyen ucu tutarak) ve hazneleri sırasıyla %100 etanol, %70 etanol ve damıtılmış su ile yıkayın.
NOT: Her numune değişimi için işlemi tekrarlayın. - Sinekleri 200 μL'lik tamponda homojenize edin, tüm numune içeriğini bir mikropipet kullanarak hazneye yerleştirin ve hava kabarcığı oluşturmamaya dikkat ederek tıpayı hazneye yerleştirin.
NOT: Hava kabarcıkları oluşursa, durdurucuyu yavaşça çıkarın ve 100 μL MIR05 tamponu ekleyin. - Düzen menüsüne tıklayın ve Şekil 05B'de gösterildiği gibi Düzeltilmiş Hacme Göre Akış seçeneğini seçin.
- Yeni bir pencereye yönlendirilmeyi bekleyin. Denemenin kaydedileceği klasörü seçmek için Kaydet'e tıklayın.
- Başka bir yeni pencerenin açılmasını bekleyin. Alandaki deneyi Deneysel Kod olarak adlandırın. Ardından, Sample (Örnek) alanında her bir numuneyi kendi odası A ve B olarak adlandırın ve Unit (Birim) alanını unit (birim) olarak ayarlayın.
NOT: Diğer birimler de seçilebilir, örneğin, Milyonlarca hücre veya mg. - Bu protokolün iki sinek (2 birim) kullandığını ve oda hacminin 2 mL olduğunu göz önünde bulundurarak, Konsantrasyon alanında mL başına 1 tanımlayın (Şekil 1D).
NOT: Burada numune miktarı sinek sayısına göre normalleştirilmiştir; bununla birlikte, bu normalizasyon, numunenin protein içeriği, mitokondriyal DNA miktar tayini veya sitrat sentazın aktivitesi ile gerçekleştirilebilir. - Oksijen akısı sinyali (kırmızı çizgi) pozitif değerde sabit olduğunda, substratların, inhibitörlerin ve ayrıştırıcıların titrasyonu ile HRR protokolünü başlatın (Şekil 3). Sonraki tüm reaktifler ve ekipman Tablo 1'de gösterilmektedir.
- Mitokondriyal zarı geçirgen hale getirmek için digitonin (5 μg/mL) ekleyin.
- Piruvat (5 mM), malat (2 mM) ve prolin (10 mM) substratları ekleyin ve oksijen akışı artıp stabilize olana kadar bekleyin. Her reaktif ilavesi için olayı işaretlemek için klavyedeki F4 tuşuna basın ve her reaktifin adını girin.
- Mitokondriyal solunum zincirini birleştirmek için ADP (5mM) ekleyin ve oksijen akışının artmasını ve stabilizasyonunu bekleyin.
- Süksinat (10 mM) ekleyin ve oksijen akısının artmasını ve stabilizasyonunu bekleyin.
- ATP sentazı inhibe etmek için Oligomisin (2.5 μM) ekleyin ve oksijen akışında bir azalma arayın.
- Kırmızı çizgi stabilize olana kadar bekleyin ve kırmızı çizginin yükselmesiyle gösterilen maksimum oksijen tüketimine ulaşılana kadar 0,25 μM titreli Karbonil-4- (triflorometoksi) fenilhidrazon siyanür (FCCP) kullanarak mitokondriyal elektron transferini ayırın. Oksijen akışının stabilizasyonundan sonra, her kompleksin inhibitörlerini birer birer eklemeye başlayın.
- Bir kompleks I inhibitörü olan Rotenon (0.5 μM) ekleyin. Bir sonraki inhibitörü eklemek için oksijen akısının azalmasını ve stabilizasyonunu bekleyin.
- Kompleks bir II inhibitörü olan Malonat (5 mM) ekleyin. Bir sonraki inhibitörü eklemek için oksijen akısının azalmasını ve stabilizasyonunu bekleyin.
- Son olarak, kompleks bir III inhibitörü olan Antimisin (2.5 μM) ekleyin. Düşüşü ve ardından oksijen akısının artmasını ve stabilizasyonunu bekleyin.
NOT: Oksijen akısı, pozitif bir değerde, ancak mitokondriyal protein komplekslerinin son inhibisyonu değerinin altında stabilize olmalıdır.
- Analizin sonunda, bir mikropipet kullanarak odaların tüm içeriğini çıkarın. Gerektiğinde ileride analiz etmek için -20 °C'de saklayın.
5. Veri analizi
- Veri analizi için uygun bir istatistiksel yazılım paketi kullanır.
- İki grup arasındaki farklılıkları değerlendirmek için t-testleri yapın. Birden fazla tedaviyi içeren durumlar için, istatistiksel bir test olarak Varyans Analizi (ANOVA) kullanın 27.
- Yazılım tarafından oluşturulan grafiktenO2 akı değerlerini çıkarın. OXPHOS CI, ADP eklendikten sonraO2 akısının değerini ifade eder. OXPHOS CII, OXPHOS CI&CII - OXPHOS CI'nin çıkarılmasıyla elde edilir. OXPHOS CI&CII, süksinat ilavesinden sonra ekstrakte edilenO2 akısının değeridir. ETS CI&CII, FCCP eklendikten sonrakiO2 akı değeridir. ETS CI = FCCP - Rotenon ve ETS CII = Rotenon - Malonat.
- ATP sentezini OXPHOS (P) ve LEAK (L) (P - L)28 arasındaki fark olarak hesaplayın.
- RCR = P/L.11 olmak üzere OXPHOS/LEAK oranını hesaplayarak Solunum Kontrol Oranını (RCR) belirleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada, OXPHOS CI (P = 0.0341) ve OXPHOS CI&II (P = 0.0392) durumlarındakiO2 akısının, kontrol sineklerine göre PINK1B9 boş sineklerinde azaldığını düşünüyoruz (Şekil 4). Bu sonuçgrubumuzun önceki bulgularında da gözlenmiştir 29,30.
CI ve CII, elektronların NADH'den ubikinona transferinden CI'nin sorumlu olduğu, CII'nin elektronları süksinattan ubikinona 31,32,33 aktardığı elektron taşıma sisteminin (ETS) temel bileşenleridir. PINK1B9 boş sinekleri, ETS CI (P = 0.0338), ETS CII (P = 0.0457) ve ETS CI&II (P = 0.0247) durumlarında daha düşükO2 akısı gösterdi (Şekil 5). Bu sonuçlar, pembe1 geninden yoksun sineklerde elektron transfer sisteminin bozulduğunu ve hem OXPHOS hem de ETS aşamalarındakiO2 akısının CI ve CI&CII'ye bağlı olduğunu göstermektedir, bu da pembe1-/- modellerinde azalmış CI aktivitesini gösteren diğer çalışmalarla tutarlıdır 33,34,35.
Ayrıca, mitokondriyal iç zar boyunca proton gradyanı, ATP28'in sentezi için gereklidir. ETS CI ve ETS CII'dekiO2 akısındaki azalma, ETS boyunca elektron akışında bir bozulma olduğunu gösterir. Elektron akışındaki bu bozulma, OXPHOS sürecini etkileyerek ATP sentezinin azalmasına neden olur. PINK1B9 boş sineklerinde ATP sentezi ile ilgiliO2 tüketiminde de önemli bir azalma olmuştur (P = 0.0280) kontrol sineklerine kıyasla (Şekil 6B). D. melanogaster'de ATP sentezindeki bir azalma, enerji metabolizması, hücresel süreçler ve genel fizyolojik fonksiyonlar üzerinde önemli etkilere sahip olabilir. Ek olarak, OXPHOS işleminin verimliliği, solunum ve fosforilasyon arasındaki bağlantının sıkılığını yansıtan RCR olarak bilinen bir indeks ile ölçülebilir. Bu nedenle, RCR azalması (P = 0.0432) mitokondriyal ayrılmayı gösterir, bu da mitokondrinin oksijeni kullanmada ve ATP üretmede daha az verimli olduğunu düşündüren OXPHOS sürecini etkileyebilir (Şekil 6C). Bu sonuçlar meyve sineğinin büyümesini, gelişmesini, hareketini, üremesini ve genel sağlığını etkileyebilir ve PD 8,28,29,32 dahil olmak üzere bazı nörodejeneratif hastalıkların patogenezine katkıda bulunabilir.
Şekil 1: OROBOROS Dat.Lab yazılımındaki düzenler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: OROBOROS Dat.Lab yazılımında odaların kalibrasyon adımları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Substrat ve inhibitör ilavesinin ana noktalarını gösteren SUIT protokolü. İlk olarak, digitonin (DIG) eklenir, ardından kompleks I'e özgü substratlar eklenir: malat, piruvat ve prolin (MPP), ATP sentaz substratı (ADP) ve ardından kompleks II için substrat: süksinat (S). Daha sonra, ATP sentaz inhibitörü: oligomisin (OMY) eklenir, ardından bağlayıcı Karbonil-4- (triflorometoksi) fenilhidrazon siyanür (F) ve kompleks I, II ve III inhibitörleri: rotenon ( R ), malonat (MNA) ve antimisin (AMA) 36. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: w1118 ve PINK1B9 sineklerini karşılaştıran yüksek çözünürlüklü respirometri. (A) OXPHOS CI, (B) OXPHOS CII ve (C) OXPHOS CI&CII. Veriler ortalama ± S.E.M. olarak sunulmuş ve t-testi kullanılarak analiz edilmiştir. n = 5-9 olur. p < 0.05. Kısaltmalar: OXPHOS = oksidatif fosforilasyon; CI = karmaşık I; CII = karmaşık II. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: w1118 ve PINK1B9 sineklerini karşılaştıran yüksek çözünürlüklü respirometri. (A) ETS CI, (B) ETS CII ve (C) ETS CI&CII. Veriler ortalama ± S.E.M. olarak sunulmuş ve t-testi ile analiz edilmiştir. n = 5-9 olur. p < 0.05. Kısaltmalar: ETS = elektron taşıma sistemi; CI = karmaşık I; CII = karmaşık II. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: w1118 ve PINK1B9 sineklerini karşılaştıran yüksek çözünürlüklü respirometri. (A) SIZINTI, (B) ATP sentezi ve (C) solunum kontrol oranı. Veriler ortalama ± S.E.M. olarak sunulmuş ve t-testi ile analiz edilmiştir. n = 5-9 olur. p < 0.05. Kısaltma: RCR = solunum kontrol oranı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HRR, D. melanogaster ve diğer organizmalarda mitokondriyal solunum ve enerji metabolizmasını incelemek için güçlü bir tekniktir. Mitokondriyal fonksiyonun ayrıntılı ve nicel bir değerlendirmesini sağlayarak araştırmacıların hücrelerin biyoenerjetik hakkında fikir edinmelerini sağlar. Burada sunulan protokol, mitokondriyal solunum zinciri fonksiyonunun ve spesifik mitokondriyal komplekslerin aktivitesinin değerlendirilmesini açıklar. SUIT protokolü, mitokondriyal solunumun farklı yönlerini incelemek için çeşitli substratların, ayrıştırıcıların ve inhibitörlerin sistematik olarak manipüle edilmesini içerir.
Açıklanan teknik, OXPHOS veya ETS üzerindeki etkilerden, dehidrojenaz aktivitesinden (CI ve CII) ve membran bütünlüğünden (OXPHOS'un bağlanması) kaynaklanan solunum inhibisyonunun değerlendirilmesine izin verir. Burada, PD34,35 ile ilişkili olduğu için mitokondriyal disfonksiyonu incelemek için PINK1B9-null sinekleri kullanarak deneyler yaptık. Bununla birlikte, bu protokol farklı hastalık modelleri, ilaç tedavileri ve toksikoloji çalışmaları için yararlı olabilir.
Ek olarak, numune hazırlama deneysel gerekliliklere uyacak şekilde uyarlanabilir36. Respirometri protokolünde kritik bir adım numune hazırlamadır. Numune tipi (hücre, izole mitokondri, homojenat) için doğru protokolün oluşturulması ve numune normalizasyonu için uygun yöntemin (protein miktarı, DNA içeriği, sitrat sentaz aktivitesi) dikkate alınması önemlidir. Numune hazırlama ve respirometri testi için aynı tamponun kullanılması da önemlidir.
Burada açıklanan numune hazırlama protokolü basit olduğundan, genellikle teknik için sorun teşkil etmez. Başka bir numune türü seçilirse veya hazırlanması değiştirilirse, dikkatli bir standardizasyon gereklidir. Karıştırma ve sıcaklık kararlılığı, polarografik oksijen sensörünün sinyalini etkileyerek bir oksigraf kullanılarak solunum ölçümlerinde hataya neden olur. Bu nedenle, haznenin doğru kalibrasyonu, solunum ölçümleri sırasında hataları azaltmak için önemli bir adım oluşturur.
Sinek örneklerinde mitokondriyal fonksiyonu değerlendirmek için kullanılan bu yöntem, alternatif yaklaşımlara göre çeşitli avantajlar sunar. HRR'nin temel güçlü yönlerinden biri, mitokondriyal fonksiyon ve hücresel metabolizmanın ayrıntılı bir analizine izin vererek, oksijen tüketiminin doğrudan ve doğru ölçümlerini sağlama yeteneğidir. Bu nedenle, HRR genellikle mitokondriyal disfonksiyonu, enerji üretimini ve farklı substratlara veya koşullara hücresel tepkileri anlamaya odaklanan araştırmalarda kullanılır. Ayrıca, çok yönlüdür - izole mitokondri de dahil olmak üzere çok çeşitli numune türlerinin kullanımına izin verir - ve numune miktarı 1,2,3 ile sınırlı olduğunda yararlı olan az miktarda biyolojik numune gerektirir. Örneğin, mitokondriyal izolatları kullanan yöntemler, tipik olarak, 50 ila 200 birey arasında değişen önemli sayıda sinek içerir, bu da mutantlarla çalışmayı zorlaştırır, çünkü belirli hastalık modelleri için çok sayıda mutant elde etmek pratik olmayabilir.
HRR yöntemine benzer şekilde, Denizatı Bioscience Hücre Dışı Akı Analizörü, oksijen tüketimini ve hücre dışı asitlenmeyi ölçmek için kullanılan bilimsel bir araçtır. Ancak, farklı yaklaşımları ve uygulamaları vardır. Seahorse Bioscience Hücre Dışı Akı Analizörü, hücrelerin oksijen tüketim hızındaki (OCR) ve hücre dışı asitlenme hızındaki (ECAR) anlık değişiklikleri ölçer. OCR, mitokondriyal solunum ve enerji üretiminin göstergesidir, ECAR ise glikolitik aktivite hakkında bilgi verir. Başlıca işlevi, çeşitli fizyolojik koşullar altında hücresel metabolik dinamiklerin değerlendirilmesinde yatmaktadır ve bu da onu patolojik bağlamlarla ilişkili karmaşık metabolik modülasyonların aydınlatılmasında özellikle etkili kılmaktadır. Ek olarak, Seahorse, araştırmacıların hızlı metabolik testler yapmasına olanak tanıyan kullanım kolaylığı için tasarlanmıştır 37,38,39. Buna karşılık, HRR, verileri etkili bir şekilde çalıştırmak ve analiz etmek için özel eğitim ve uzmanlık gerektirir. Hücreler veya mitokondri 13,14,40 tarafından oksijen tüketimini doğrudan ölçmek için bir oksijen elektrodunun kullanılmasını içerir. HRR'nin bir avantajı, Denizatı kullanırken pratik olmayan farklı respirometri protokolleri tasarlamadaki çok yönlülüğüdür. Düşük maliyetle ilişkili protokolleri tasarlamaya yönelik bu çok yönlülük, HRR yöntemini sınırlı finansmana sahip laboratuvarlar için uygun bir seçim haline getirir. Mevcut protokolde kullanılan respirometri sisteminin bir diğer dezavantajı, aynı anda birkaç örnekle çalışmanın imkansızlığıdır ve bu da yüksek verimli analizi engeller. Bu nedenle, deney grupları, aralarında doğru karşılaştırmaya izin verecek şekilde iyi tasarlanmalıdır. Bununla birlikte, bu sistemin avantajları, izole edilmiş hücrelerden C. elegans gibi tüm canlı organizmalara, örneğin40'a kadar her türden numunenin test edilebilmesi gerçeğinde yatmaktadır.
Özetle, HRR, fizyolojik ve patolojik koşullar altında mitokondriyal fonksiyonu incelemek için güvenilir bir yöntemdir41. Her deneysel model, mitokondriyal solunum değerlendirmesinde güvenilir ve anlamlı veri elde edilmesini sağlamak için metodoloji ve numune hazırlama ayarlamaları gerektiren farklı özelliklere ve kısıtlamalara sahiptir. Bu protokol, araştırmacılara çevresel faktörlerin, deneysel müdahalelerin veya genetik mutasyonların D. melanogaster'deki mitokondriyal fonksiyon üzerindeki etkilerini değerlendirmek için güvenilir bir yöntem sunar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir çıkar çatışması beyan etmezler.
Acknowledgments
Yazarlar, Brezilya ajansı Coordenação de Aperfeiçoamento de Pesquisa Pessoal de Nível Superior'u (CAPES EPIDEMIAS 09 #88887.505377/2020) kabul etmektedir. P.M. (#88887.512821/2020-00) ve T.D. (#88887.512883/2020-00) araştırma bursu alıcılarıdır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | Adenosine 5′-diphosphate sodium sal (CAS number 72696-48-1); ≥95%; molecular weight = 501.31 g/mol. |
| Ágar | Kasv | K25-1800 | For bacteriologal use |
| Antimycin-A | Sigma-Aldrich | A8674 | Antimycin A from Streptomyces sp. (CAS number 1397-94-0); molecular weight 540 g/mol; |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | Bovine Serum Albumin (CAS number 9048-46-8); pH 7,0 ≥ 98% |
| Datlab software | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20700 | Software for data acquisition and analysis |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D 5628 | CAS number 11024-24-1 |
| Distilled water | |||
| Drosophila melanogaster strain w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 | Obtained from Bloomington Drosophila stock center | ||
| Drosophila melanogaster strain w1118 | Obtained from the Federal University of Santa Maria | ||
| EGTA | Sigma-Aldrich | E8145 | Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (CAS number 13638-13-3); ≥97%; molecular weight =468.28 g/mol |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920 | Carbonyl cyanide 4- (trifluoromethoxy)phenylhydrazone (CAS number 370-86-5); ≥98% (TLC), powder |
| GraphPad Prism version 8.0.1. | Software for data acquisition and analysis | ||
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034 | 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (CAS number 7365-45-9); ≥99,5% (titration), cell cultured tested; molecular weight = 238.30 g/mol |
| High-resolution respirometer Oxygraph O2K | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 10022-02 | Startup O2K respirometer kit |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | Monopotassium phosphate (CAS number 7778-77-0); Reagente Plus, molecular weigt = 136.09 g/mol |
| KOH | Sigma-Aldrich | 211473 | Potassium hydroxide (CAS number 1310-58-3); ACS reagent, ≥85%, pellets |
| Malate | Sigma-Aldrich | M1296 | Malonic acid (CAS number 141-82-2); 99%, molecular weight = 104.06 g/mol). A solution is pH adjusted to approximately 7.0. |
| Malic acid | Sigma-Aldrich | M1000 | (S)-(−)-2-Hydroxysuccinic acid (CAS number 97-67-6); ≥95% ; molecular weight = 134.09 g/mol |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (CAS number 4432-31-9); ≥99% (titration); molecular weight = 195.24 g/mol |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Magnesium chloride (CAS number 7786-30-3); anhydrous, ≥98%, molecular weight = 95.21 g/mol |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | ||
| O2K-Titration Set | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20820-03 | Hamilton syringes with different volumes |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O 4876 | Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes (CAS number 1404-19-9); ≥90% total oligomycins basis (HPLC) |
| Pistil to homogenization | |||
| Proline | Sigma-Aldrich | P0380 | L-Proline (CAS number 147-85-3); powder; 99%; molecular weight = 115.13 g/mol |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Sodium pyruvate (CAS number 113-24-6), ≥99%; molecular weight = 110.04 g/mol |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | Rotetone (CAS number 83-79-4); ≥95%, molecular weight 394.42 g/ mol |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S 2378 | Sodium succinate dibasic hexahydrate (CAS number 6106-21-4); ≥99% |
| Sucrose | Merck | 107,651,000 | Sucrose for microbiology use (CAS number 57-50-1) |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | CAS number 107-35-7 |
References
- Brand, M. D., Orr, A. L., Perevoshchikova, I. V., Quinlan, C. L. The role mitochondrial function and cellular bioenergetics in ageing and disease. Br J Dermatol. 169, 1-8 (2013).
- Ramaccini, D., et al. Mitochondrial function and dysfunction in dilated cardiomyopathy. Front Cell Dev Biol. 8, 624216 (2021).
- Zhunina, O. A., et al. The role of mitochondrial dysfunction in vascular disease, tumorigenesis, and diabetes. Front Mol Biosci. 8, 671908 (2021).
- Prasun, P.
- Bhatti, J. S., Bhatti, G. K., Reddy, P. H. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in metabolic disorders - A Step towards mitochondria based therapeutic strategies. Biochim Biophys Acta. 1863 (5), 1066-1077 (2017).
- Perier, C., Vila, M. Mitochondrial biology and Parkinson's disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (2), 009332 (2012).
- DeMaagd, G., Philip, A. Parkinson's disease and its management. Pharmacy and Therapeutics. 40 (8), 504-532 (2015).
- Miyazaki, N., et al. PINK1-dependent and Parkin-independent mitophagy is involved in reprogramming of glycometabolism in pancreatic cancer cells. Biochem Biophys Res Commun. 625, 167-173 (2022).
- Kopin, I. J., Markey, S. P. MPTP toxicity: implications for research in Parkinson's disease. Annual Review of Neuroscience. 11, 81-96 (1988).
- Connolly, N. M. C., et al. Guidelines on experimental methods to assess mitochondrial dysfunction in cellular models of neurodegenerative diseases. Cell Death Differ. 25 (3), 542-572 (2018).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G.
- Haynes, C. M., Fiorese, C. J., Lin, Y. -F. Evaluating and responding to mitochondrial dysfunction: The UPRmt and beyond. Trends Cell Mol Biol. 23 (7), 311-318 (2013).
- Long, Q., Huang, L., Huang, K., Yang, Q. Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from mouse heart tissues using oroboros 2k-oxygraph. Methods Mol Biol. 1966, Clifton, N.J. 237-246 (2019).
- Scheiber, D., et al. High-resolution respirometry in human endomyocardial biopsies shows reduced ventricular oxidative capacity related to heart failure. Exp Mol Med. 51 (2), 1-10 (2019).
- Krumschnabel, G., Eigentler, A., Fasching, M., Gnaiger, E. Chapter nine - use of safranin for the assessment of mitochondrial membrane potential by high-resolution respirometry and fluorometry. Methods Enzymol. 542, 163-181 (2014).
- Demir, E. The potential use of Drosophila as an in vivo model organism for COVID-19-related research: a review. Turk J Biol. 45 (4), 559-569 (2021).
- Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: a primer on the Drosophila model system. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
- McBride, S. M. J., Holloway, S. L., Jongens, T. A. Using Drosophila as a tool to identify pharmacological therapies for fragile X syndrome. Drug Discov Today Technol Technologies. 10 (1), e129-e136 (2013).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods (San Diego, Calif). 68 (1), 105-115 (2014).
- Bar, S., Prasad, M., Datta, R. Neuromuscular degeneration and locomotor deficit in a Drosophila model of mucopolysaccharidosis VII is attenuated by treatment with resveratrol). Dis Model Mech. 11 (11), (2018).
- Imai, Y. PINK1-Parkin signaling in Parkinson's disease: Lessons from Drosophila. Neurosci Res. 159, 40-46 (2020).
- Julienne, H., Buhl, E., Leslie, D. S., Hodge, J. J. L. Drosophila PINK1 and parkin loss-of-function mutants display a range of non-motor Parkinson's disease phenotypes. Neurobiol Dis. 104, 15-23 (2017).
- Biswas, S., Bagchi, A. Analysis of the structural dynamics of the mutations in the kinase domain of PINK1 protein associated with Parkinson's disease. Gene. 857, 147183 (2023).
- Koh, H., Chung, J. PINK1 and Parkin to control mitochondria remodeling. Anat Cell Biol. 43 (3), 179-184 (2010).
- Zhu, M., Li, X., Tian, X., Wu, C. Mask loss-of-function rescues mitochondrial impairment and muscle degeneration of Drosophila pink1 and parkin mutants. Hum Mol Genet. 24 (11), 3272-3285 (2015).
- Park, J., et al. Mitochondrial dysfunction in Drosophila PINK1 mutants is complemented by parkin. Nature. 441 (7097), 1157-1161 (2006).
- Dytham, C. Choosing and using statistics: a biologist's guide. , Wiley-Blackwell. Hoboken, NJ. (2011).
- Bonora, M., et al.
- Gonçalves, D. F., et al. Caffeine improves mitochondrial function in PINK1B9-null mutant Drosophila melanogaster. J Bioenerg Biomembr. 55 (1), 1-13 (2023).
- Gonçalves, D. F., et al. Mitochondrial function and cellular energy maintenance during aging in a Drosophila melanogaster model of Parkinson disease. Mitochondrion. 65, 166-175 (2022).
- Janowska, J. I., et al. Mitochondrial respiratory chain complex I dysfunction induced by N-methyl carbamate ex vivo can be alleviated with a cell-permeable succinate prodrug. Toxicol In Vitro. 65, 104794 (2020).
- Ngo, D. T. M., et al. Oxidative modifications of mitochondrial complex II are associated with insulin resistance of visceral fat in obesity. Physiol Endocrinol Metab. 316 (2), E168-E177 (2019).
- Stroud, D. A., et al. Accessory subunits are integral for assembly and function of human mitochondrial complex I. Nature. 538 (7623), 123-126 (2016).
- Senyilmaz, D., et al. Regulation of mitochondrial morphology and function by stearoylation of TFR1. Nature. 525 (7567), 124-128 (2015).
- Poddighe, S., et al. Mucuna pruriens (Velvet bean) rescues motor, olfactory, mitochondrial and synaptic impairment in PINK1B9 Drosophila melanogaster genetic model of Parkinson's disease. PloS One. 9 (10), e110802 (2014).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 810, 25-58 (2012).
- Winer, L. S. P., Wu, M. Rapid analysis of glycolytic and oxidative substrate flux of cancer cells in a microplate. PloS One. 9 (10), e109916 (2014).
- Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio Protoc. 8 (10), e2850 (2018).
- Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. Am J Physiol. Cell Physiol. 292 (1), C125-C136 (2007).
- Divakaruni, A. S., Jastroch, M. A practical guide for the analysis, standardization and interpretation of oxygen consumption measurements. Nat Metab. 4 (8), 978-994 (2022).
- Bingol, B., Sheng, M. Mechanisms of mitophagy: PINK1, Parkin, USP30 and beyond. Free Radic Biol Med. 100, 210-222 (2016).
