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Biochemistry

使用高分辨率呼吸测量法分析 果蝇黑腹 果蝇 PINK1B9-Null 突变体的线粒体功能

Published: November 10, 2023 doi: 10.3791/65664
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2
1Laboratory of Experimental Biochemistry and Toxicology, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Center of Natural and Exact Sciences, Federal University of Santa Maria, 2Graduate Program in Biological Sciences: Toxicological Biochemistry, Federal University of Santa Maria
* These authors contributed equally

Summary

在这里，我们提出了一种高分辨率呼吸测量方案，用于分析 PINK1B9-null 突变果蝇的生物能量学。该方法使用底物-解偶联剂-抑制剂滴定 （SUIT） 方案。

Abstract

神经退行性疾病，包括帕金森病 （PD），和细胞紊乱，如癌症，是一些破坏能量代谢并损害线粒体功能的疾病。线粒体是控制能量代谢和细胞存活和死亡的细胞过程的细胞器。出于这个原因，评估线粒体功能的方法可以为病理和生理过程中的细胞状况提供重要的见解。在这方面，高分辨率呼吸测量 （HRR） 方案允许评估整个线粒体呼吸链功能或特定线粒体复合物的活性。此外，研究线粒体生理学和生物能量学需要遗传和实验上可处理的模型，例如 果蝇黑腹果蝇。

该模型具有多种优点，例如与人体生理学的相似性、生命周期快、易于维护、成本效益高、高通量能力以及将伦理问题降至最低。这些属性共同确立了它作为解剖复杂细胞过程的宝贵工具。本工作解释了如何使用 果蝇黑腹 果蝇 PINK1B9-null 突变体分析线粒体功能。 pink1 基因负责编码 PTEN 诱导的推定激酶 1，通过一个被认为是线粒体自噬的过程，这对于从线粒体网络中去除功能失调的线粒体至关重要。该基因的突变与常染色体隐性遗传性早发性家族性 PD 有关。该模型可用于研究与帕金森病病理生理学有关的线粒体功能障碍。

Introduction

线粒体是控制重要功能的细胞器，包括细胞凋亡调节、钙稳态和参与生物合成途径。通过拥有自主的遗传物质，它们能够为细胞维持和修复过程做出贡献。它们的结构包含电子传递链和氧化磷酸化，这两者都对细胞能量至关重要 1,2,3。特别是，能量控制是通过氧化磷酸化 （OXPHOS） 产生三磷酸腺苷 （ATP） 来实现的2。能量代谢紊乱伴线粒体功能受损发生在细胞存活和死亡中 4,5，通常与多种人类病理学（如癌症）和神经退行性疾病（如帕金森病 （PD）3,6）有关。

帕金森病是一种慢性、进行性和神经系统疾病。这种疾病的主要原因是脑细胞的死亡，特别是在黑质中，黑质负责产生控制运动的神经递质多巴胺 6,7,8。最早将帕金森综合征与线粒体功能障碍联系起来的观察是在 1988 年，在使用抑制呼吸链复合物 I9 的毒素的实验模型中。

目前，有几种方法可以评估线粒体功能障碍 10,11,12,1 3;然而，与传统方法相比，高分辨率呼吸测量法 （HRR） 具有卓越的灵敏度和优势13,14。例如，HRR方案允许评估整个线粒体呼吸链功能或特定线粒体复合物的活性14,15。线粒体功能障碍可以在完整细胞、分离的线粒体甚至体外10、11、13、14 中进行评估。

线粒体功能障碍与许多病理和生理过程密切相关。因此，使用遗传和实验上可处理的模型系统研究线粒体生理学和生物能量学非常重要。在这方面，对果蝇果蝇（Drosophila melanogaster）的研究有几个优点。该模型与人类共享基本的细胞特征和过程，包括使用 DNA 作为遗传物质、共同细胞器以及参与发育、免疫和细胞信号传导的保守分子通路。此外，果蝇具有生命周期快、易于维护、成本低、通量高、伦理问题少等特点，是解剖复杂细胞过程的宝贵工具16,17,18,19,20。

此外，PTEN诱导的推定激酶1（pink1）基因的同源物在黑腹果蝇中表达。它通过线粒体自噬过程在去除受损线粒体方面起着至关重要的作用8.在人类中，该基因的突变使个体易患与线粒体功能障碍相关的常染色体隐性遗传家族性 PD 8,21,22,23。因此，果蝇是一种强大的动物模型，用于研究帕金森病的病理生理学和筛选以线粒体功能障碍和生物能量学为重点的候选药物。因此，本工作解释了如何使用 HRR 技术在 OROBOROS 中使用底物-解偶联剂-抑制剂-滴定 （SUIT） 方案分析黑腹果蝇 PD 模型中的线粒体功能。

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Protocol

我们使用了来自布卢明顿果蝇种群中心（ID号：34749）的菌株w1118（白色）和w[*] Pink1[B9]/FM7i，P{w[+mC]=ActGFP}JMR3（称为Pink1B9）（FlyBase ID：FBgn0029891）。在这项研究中，将雄性黑腹果蝇PINK1B9-null突变体与来自w1118菌株的雄性黑腹果蝇进行比较，后者用作对照组（遗传背景）。其他参数必须与呼吸测量实验同时进行分析，以确保果蝇具有正确的基因型（Pink1B9/Y），例如胸部畸形和运动问题，这些在pink1B9突变果蝇24,25,26中得到了很好的描述。

1. 动物和住房

  1. 将苍蝇保存在含有10mL标准饮食（酵母1.73%，大豆粉0.9%，玉米粉7.3%，琼脂0.5%，玉米糖浆7.6%和丙酸0.48%）的玻璃瓶中，温度和湿度恒定（分别为25°C和60%），光/暗循环为12小时：12小时。
  2. 对于每个实验，使用两只苍蝇在闭合后1-3天。
    注： 将 PINK1B9-null 突变的处女雌性苍蝇与 w1118 雄性杂交，以获得基因型为 Pink1B9/Y 的 F1 雄性。

2. 样品制备

  1. 如 表1所述准备MiR05缓冲液。
  2. 麻醉冰上的苍蝇并将它们转移到微量离心管（每管两只苍蝇）。
  3. 在每个试管中，加入 200 μL 冷冻的 MiR05 缓冲液并使果蝇匀浆。手动匀浆，施加温和的压力（大约4-6次杵的冲程）以防止线粒体的崩解。

3. 极谱法氧传感器的高分辨率呼吸测量校准

注：OROBOROS 腔室的总体积约为 2 mL。需要校准以确保氧通量接近 0 pmol 才能开始测定。

  1. 开始校准，向腔室中加入 2 mL MiR05。用塞子盖住腔室，不要留下气泡;然后，小心地拉动塞子以形成一个气泡。
  2. 打开 OROBOROS Dat.Lab 软件。在模块温度字段中输入25°C的温度，然后单击连接到Oxygraph-2k（图1A）。
  3. 单击并选择要保存校准的文件夹，然后单击 “保存”。
  4. 当打开一个新窗口时，命名实验和样品（如果校准，只需输入名称 校准），然后单击 保存。
  5. 转到 “布局” 菜单，然后选择第一个选项： 01 Calibration Exp. Gr.3 - Temp ，如 图 1B 所示。
  6. 等待程序重定向到校准布局，等到红线显示标准直线，点在 0 pmol 左右。然后，当红线正好为零时，选择两个 点：一个用于 腔室A ，另一个用于 腔室B （图1C）。
    注意：所选点的氧通量（红线）必须在 0 左右。
    1. 要标记两个腔室的点，请选择屏幕右侧的 O2 浓度 ，选择标记点，然后复制相对于该点的 温度 和 气压 值。将这些值粘贴到下面的框中，然后单击屏幕右下角的 Calibrate and Copy to Clipboard ，如 图 2 所示。
    2. 对两个 腔室 （A 和 B）执行此过程，然后转到 “文件 ”菜单并选择 “保存并断开连接”。
      注意： 校准过程完成后，程序会将用户重定向到主屏幕，以便软件准备好开始 HRR 测试。对于此测试，我们将使用 SUIT 协议。

4. SUIT协议

  1. 校准完成后，取下塞子并打开腔室。
  2. 按此顺序用 100% 乙醇、70% 乙醇和蒸馏水清洗塞子（握住不接触样品的尖端）和腔室。
    注意：对每个样品更换重复该过程。
  3. 在200μL缓冲液中匀浆苍蝇，使用微量移液器将所有样品内容物置于腔室中，并将塞子重新定位在腔室中，注意不要产生气泡。
    注意：如果形成气泡，轻轻取下塞子并加入 100 μL MIR05 缓冲液。
  4. 单击 “布局” 菜单，然后选择“ 05 Flow by Corrected Volume ”选项，如 图 1B 所示。
  5. 等待重定向到新窗口。单击 “保存 ”以选择要保存实验的文件夹。
  6. 等待另一个新窗口打开。将空间中的实验命名为 Experimental Code。然后，在“样品”字段中将每个样品命名为各自腔室中的 A 和 B，并将字段“单位”设置为“单位”。
    注意：也可以选择其他单位，例如， 百万个细胞 或 毫克。
  7. 考虑到该协议使用两只苍蝇（2个单位）并且腔室容积为2mL，在 浓度 字段中，定义 每mL1 个（图1D）。
    注意：在这里，样本量按苍蝇数量归一化;然而，这种归一化可以通过样品的蛋白质含量、线粒体 DNA 定量或柠檬酸合酶的活性来执行。
  8. 当氧通量信号（红线）稳定在正值上时，通过底物、抑制剂和解偶联剂的滴定开始 HRR 方案（图 3）。所有后续试剂和设备均见 表1。
    1. 加入洋地黄皂苷 （5 μg/mL） 以透化线粒体膜。
    2. 加入丙酮酸（5mM），苹果酸（2mM）和脯氨酸（10mM）底物，等待氧通量增加并稳定。要标记每次添加试剂的事件，请按键盘上的 F4 键并输入每个试剂 的名称 。
    3. 加入ADP（5mM）耦合线粒体呼吸链，等待氧通量的增加和稳定。
    4. 加入琥珀酸盐（10mM）并等待氧通量的增加和稳定。
    5. 加入寡霉素（2.5μM）以抑制ATP合酶并寻找氧通量的降低。
    6. 等到红线稳定下来，并使用滴度为0.25μM的羰基-4-（三氟甲氧基）苯腙氰化物（FCCP）解耦线粒体电子转移，直到达到最大耗氧量，红线的上升证明了这一点。稳定氧通量后，开始添加每种复合物的抑制剂，一次一个。
    7. 加入鱼藤酮（0.5μM），一种复合物I抑制剂。等待氧通量的降低和稳定后再添加下一个抑制剂。
    8. 加入丙二酸酯（5mM），一种复合物II抑制剂。等待氧通量的降低和稳定后再添加下一个抑制剂。
    9. 最后，加入抗霉素（2.5μM），一种复合物III抑制剂。等待氧通量下降，然后增加和稳定氧通量。
      注意：氧通量应稳定在正值，但低于线粒体蛋白复合物最后一次抑制的值。
  9. 在分析结束时，使用微量移液器除去腔室的所有内容物。必要时储存在-20°C以备将来分析。

5. 数据分析

  1. 使用适当的统计软件包进行数据分析。
  2. 执行 t 检验以评估两组之间的差异。对于涉及多种处理的情况，使用方差分析 （ANOVA） 作为统计检验 27。
  3. 从软件生成的图形中提取 O2 通量值。OXPHOS CI 是指添加 ADP 后 O2 通量的值。OXPHOS CII 是通过减去 OXPHOS CI&CII - OXPHOS CI 获得的。OXPHOS CI&CII是加入琥珀酸盐后提取的O2 助焊剂的值。ETS CI&CII是添加FCCP后的O2 通量值。ETS CI = FCCP - 鱼藤酮和 ETS CII = 鱼藤酮 - 丙二酸。
  4. 将 ATP 合成计算为 OXPHOS （P） 和 LEAK （L） （P - L） 之间的差值28。
  5. 通过计算比率 OXPHOS/LEAK 来确定呼吸控制比 （RCR），其中 RCR = P/L.11

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Representative Results

在这里，我们发现，与对照果蝇相比，PINK1 B9 无效果蝇在 PINK1B9 无效果蝇中，OXPHOS CI （P = 0.0341） 和 OXPHOS CI&II （P = 0.0392） 状态下的 O2 通量降低（图 4）。这一结果在我们小组29,30 的先前研究结果中也观察到。

CI 和 CII 是电子传输系统 （ETS） 的关键组成部分，其中 CI 负责将电子从 NADH 转移到泛醌，而 CII 将电子从琥珀酸转移到泛醌 31,32,33。PINK1B9 无效果蝇在 ETS CI （P = 0.0338）、ETS CII （P = 0.0457） 和 ETS CI&II （P = 0.0247） 状态下表现出较低的 O2 通量（图 5）。 这些结果表明，缺乏pink1基因的果蝇的电子转移系统受损，OXPHOS和ETS阶段的O2通量都依赖于CI和CI&CII，这与其他工作一致，表明pink1-/-模型中的CI活性降低33,34,35。

此外，穿过线粒体内膜的质子梯度对于 ATP28 的合成至关重要。ETS CI 和 ETS CII 中 O2 通量的降低表明沿 ETS 的电子通量中断。电子通量的这种破坏会影响 OXPHOS 过程，导致 ATP 合成减少。与对照果蝇相比，PINK1B9 无效果蝇中与 ATP 合成相关的 O2 消耗量也显着降低 （P = 0.0280）（图 6B）。黑腹果蝇中 ATP 合成的减少会对能量代谢、细胞过程和整体生理功能产生显着影响。此外，OXPHOS过程的效率可以通过称为RCR的指数来量化，该指数反映了呼吸和磷酸化之间耦合的紧密程度。因此，RCR降低（P = 0.0432）表明线粒体解偶联，这可能会影响OXPHOS过程，表明线粒体在利用氧气和产生ATP方面的效率较低（图6C）。 这些结果可能会影响果蝇的生长、发育、运动、繁殖和整体健康，并有助于某些神经退行性疾病的发病机制，包括 PD8、28、29、32。

Figure 1
图 1：OROBOROS Dat.Lab 软件中的布局。 请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2：OROBOROS Dat.Lab 软件中腔室的校准步骤。 请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图3：SUIT方案展示了底物和抑制剂添加的要点。 首先，加入洋地黄皂苷 （DIG），然后加入复合物 I 特异性底物：苹果酸、丙酮酸和脯氨酸 （MPP）、ATP 合酶底物 （ADP），然后是复合物 II 的底物：琥珀酸 （S）。随后，加入ATP合酶抑制剂：寡霉素（OMY），然后加入解偶联剂羰基-4-（三氟甲氧基）苯腙氰化物（F）和复合物I、II和III抑制剂：鱼藤酮（R）、丙二酸（MNA）和抗霉素（AMA）36。 请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4：比较 w 1118 和 PINK1B9 果蝇的高分辨率呼吸测量法。 （A） OXPHOS CI、（B） OXPHOS CII 和 （C） OXPHOS CI&CII。数据以 S.E.M. 的平均值±表示，并使用 t 检验进行分析。n = 5-9。p < 0.05。缩写：OXPHOS = 氧化磷酸化;CI = 复合物 I;CII = 复合物 II.请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5：比较 w 1118 和 PINK1B9 果蝇的高分辨率呼吸测量法。 （A） ETS CI、（B） ETS CII 和 （C） ETS CI&CII。数据以 S.E.M. 的平均值±表示，并通过 t 检验进行分析。n = 5-9。p < 0.05。缩写：ETS=电子传输系统;CI = 复合物 I;CII = 复合物 II.请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 6
图 6：比较 w 1118 和 PINK1B9 果蝇的高分辨率呼吸测量法。 （A）泄漏，（B）ATP合成，（C）呼吸控制比。数据以 S.E.M. 的平均值±表示，并通过 t 检验进行分析。n = 5-9。p < 0.05。缩写：RCR=呼吸控制比。请点击这里查看此图的较大版本.

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Discussion

HRR 是一种强大的技术，用于研究 黑腹果蝇 和其他生物体的线粒体呼吸和能量代谢。它提供了对线粒体功能的详细和定量评估，使研究人员能够深入了解细胞的生物能量学。此处介绍的方案描述了使用SUIT协议在 黑腹果蝇中评估线粒体呼吸链功能和特定线粒体复合物的活性。SUIT方案涉及系统地操纵各种底物、解偶联剂和抑制剂，以检查线粒体呼吸的不同方面。

所描述的技术允许评估由于对 OXPHOS 或 ETS 的影响、脱氢酶活性（CI 和 CII）和膜完整性（OXPHOS 的偶联）而产生的呼吸抑制。在这里，我们使用 PINK1B9-null 果蝇进行实验来研究线粒体功能障碍，因为它与 PD34,35 有关。然而，该方案可用于不同的疾病模型、药物治疗和毒理学研究。

此外，样品制备可以适应实验要求36。呼吸测量方案的一个关键步骤是样品制备。为样品类型（细胞、分离的线粒体、匀浆）建立正确的方案至关重要，并且重要的是要考虑适当的样品标准化方法（蛋白质量、DNA 含量、柠檬酸合酶活性）。使用相同的缓冲液进行样品制备和呼吸测定也很重要。

由于此处描述的样品制备方案很简单，因此通常不会对该技术造成问题。如果选择另一种类型的样品或改变其制备方式，则需要仔细标准化。搅拌和温度稳定性会影响极谱法氧传感器的信号，从而在使用氧谱仪进行呼吸测量时产生误差。因此，正确校准腔室是减少呼吸测量误差的重要步骤。

与其他方法相比，这种评估苍蝇样本中线粒体功能的方法具有多种优势。HRR 的主要优势之一是它能够提供直接和准确的耗氧量测量，从而可以详细分析线粒体功能和细胞代谢。因此，HRR 通常用于专注于了解线粒体功能障碍、能量产生和细胞对不同底物或条件的反应的研究。此外，它是多功能的 - 允许使用多种样品类型，包括分离的线粒体 - 并且需要少量的生物样品，这在样品量有限时很有用 1,2,3。例如，使用线粒体分离株的方法通常涉及大量果蝇，范围从50到200个个体不等，这使得突变体的研究变得困难，因为获得某些疾病模型的大量突变体可能不切实际。

与HRR方法类似，Seahorse Bioscience细胞外通量分析仪是一种用于测量耗氧量和细胞外酸化的科学工具。但是，它们有不同的方法和应用。Seahorse Bioscience 细胞外通量分析仪可量化细胞耗氧率 （OCR） 和细胞外酸化率 （ECAR） 的瞬时变化。OCR 指示线粒体呼吸和能量产生，而 ECAR 提供对糖酵解活性的见解。它的主要功能在于评估不同生理条件下的细胞代谢动力学，使其在阐明与病理背景相关的复杂代谢调节方面特别有用。此外，Seahorse 的设计易于使用，允许研究人员进行快速代谢测定 37,38,39。相比之下，HRR 需要专门的培训和专业知识才能有效地操作和分析数据。它涉及使用氧电极直接测量细胞或线粒体的耗氧量 13,14,40。HRR的一个优点是它在设计不同的呼吸测量方案方面的多功能性，这在使用Seahorse时是不切实际的。这种设计与低成本相关的方案的多功能性使 HRR 方法成为资金有限的实验室的可行选择。本方案中使用的呼吸测量系统的另一个缺点是无法同时处理多个样品，这阻碍了高通量分析。因此，实验组必须经过精心设计，以便它们之间能够进行正确的比较。然而，该系统的优点在于可以测试任何类型的样品，从分离的细胞到整个活生物体，例如秀丽隐杆线虫，例如40。

总之，HRR 是研究生理和病理条件下线粒体功能的可靠方法41。每个实验模型都有不同的特点和限制，需要调整方法和样品制备，以确保在线粒体呼吸评估中获取可靠和有意义的数据。该协议为研究人员提供了一种可靠的方法来评估环境因素，实验干预或基因突变对 黑腹果蝇线粒体功能的影响。

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Disclosures

作者声明没有竞争利益。

Acknowledgments

作者感谢巴西机构 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pesquisa Pessoal de Nível Superior （CAPES EPIDEMIAS 09 #88887.505377/2020）。P.M. （#88887.512821/2020-00） 和 TD （#88887.512883/2020-00） 是研究奖学金获得者。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ADP Sigma-Aldrich A5285 Adenosine 5′-diphosphate sodium sal (CAS number 72696-48-1); ≥95%; molecular weight = 501.31 g/mol.
Ágar Kasv K25-1800 For bacteriologal use
Antimycin-A Sigma-Aldrich A8674 Antimycin A from Streptomyces sp. (CAS number 1397-94-0); molecular weight  540 g/mol;
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A7030 Bovine Serum Albumin (CAS number 9048-46-8); pH 7,0 ≥ 98%
Datlab software Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria 20700 Software for data acquisition and analysis
Digitonin Sigma-Aldrich D 5628 CAS number 11024-24-1
Distilled water
Drosophila melanogaster strain w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 Obtained from Bloomington Drosophila stock center
Drosophila melanogaster strain w1118 Obtained  from the Federal University of Santa Maria
EGTA Sigma-Aldrich E8145 Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (CAS number 13638-13-3); ≥97%; molecular weight =468.28 g/mol
FCCP Sigma-Aldrich C2920 Carbonyl cyanide 4- (trifluoromethoxy)phenylhydrazone  (CAS number 370-86-5); ≥98% (TLC), powder 
GraphPad Prism version 8.0.1. Software for data acquisition and analysis
Hepes Sigma-Aldrich H4034 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (CAS number 7365-45-9); ≥99,5% (titration), cell cultured tested; molecular weight = 238.30 g/mol
High-resolution respirometer Oxygraph O2K Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria 10022-02 Startup O2K respirometer kit
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5379 Monopotassium phosphate (CAS number 7778-77-0); Reagente Plus, molecular weigt = 136.09 g/mol
KOH Sigma-Aldrich 211473 Potassium hydroxide (CAS number 1310-58-3); ACS reagent, ≥85%, pellets
Malate Sigma-Aldrich M1296 Malonic acid (CAS number 141-82-2); 99%, molecular weight = 104.06 g/mol). A solution is pH adjusted to approximately 7.0.
Malic acid Sigma-Aldrich M1000 (S)-(−)-2-Hydroxysuccinic acid (CAS number 97-67-6); ≥95% ; molecular weight = 134.09 g/mol
MES Sigma-Aldrich M3671 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (CAS number 4432-31-9); ≥99% (titration); molecular weight = 195.24 g/mol
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266 Magnesium chloride (CAS number 7786-30-3); anhydrous, ≥98%, molecular weight = 95.21 g/mol
Microcentrifuge tubes Eppendorf
O2K-Titration Set Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria 20820-03 Hamilton syringes with different volumes
Oligomycin Sigma-Aldrich O 4876 Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes (CAS number  1404-19-9); ≥90% total oligomycins basis (HPLC)
Pistil to homogenization
Proline Sigma-Aldrich P0380 L-Proline (CAS number 147-85-3); powder; 99%; molecular weight = 115.13 g/mol
Pyruvate Sigma-Aldrich P2256 Sodium pyruvate (CAS number 113-24-6), ≥99%; molecular weight = 110.04 g/mol
Rotenone Sigma-Aldrich R8875 Rotetone (CAS number 83-79-4); ≥95%, molecular weight 394.42 g/ mol
Succinate Sigma-Aldrich S 2378 Sodium succinate dibasic hexahydrate (CAS number 6106-21-4); ≥99%
Sucrose Merck 107,651,000 Sucrose for microbiology use (CAS number 57-50-1)
Taurine Sigma-Aldrich T0625 CAS number 107-35-7

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References

  1. Brand, M. D., Orr, A. L., Perevoshchikova, I. V., Quinlan, C. L. The role mitochondrial function and cellular bioenergetics in ageing and disease. Br J Dermatol. 169, 1-8 (2013).
  2. Ramaccini, D., et al. Mitochondrial function and dysfunction in dilated cardiomyopathy. Front Cell Dev Biol. 8, 624216 (2021).
  3. Zhunina, O. A., et al. The role of mitochondrial dysfunction in vascular disease, tumorigenesis, and diabetes. Front Mol Biosci. 8, 671908 (2021).
  4. Prasun, P. Mitochondrial dysfunction in metabolic syndrome. Biochim Biophys Acta. 1866 (10), 165838 (2020).
  5. Bhatti, J. S., Bhatti, G. K., Reddy, P. H. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in metabolic disorders - A Step towards mitochondria based therapeutic strategies. Biochim Biophys Acta. 1863 (5), 1066-1077 (2017).
  6. Perier, C., Vila, M. Mitochondrial biology and Parkinson's disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (2), 009332 (2012).
  7. DeMaagd, G., Philip, A. Parkinson's disease and its management. Pharmacy and Therapeutics. 40 (8), 504-532 (2015).
  8. Miyazaki, N., et al. PINK1-dependent and Parkin-independent mitophagy is involved in reprogramming of glycometabolism in pancreatic cancer cells. Biochem Biophys Res Commun. 625, 167-173 (2022).
  9. Kopin, I. J., Markey, S. P. MPTP toxicity: implications for research in Parkinson's disease. Annual Review of Neuroscience. 11, 81-96 (1988).
  10. Connolly, N. M. C., et al. Guidelines on experimental methods to assess mitochondrial dysfunction in cellular models of neurodegenerative diseases. Cell Death Differ. 25 (3), 542-572 (2018).
  11. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem J. 435, 297-312 (2011).
  12. Haynes, C. M., Fiorese, C. J., Lin, Y. -F. Evaluating and responding to mitochondrial dysfunction: The UPRmt and beyond. Trends Cell Mol Biol. 23 (7), 311-318 (2013).
  13. Long, Q., Huang, L., Huang, K., Yang, Q. Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from mouse heart tissues using oroboros 2k-oxygraph. Methods Mol Biol. 1966, Clifton, N.J. 237-246 (2019).
  14. Scheiber, D., et al. High-resolution respirometry in human endomyocardial biopsies shows reduced ventricular oxidative capacity related to heart failure. Exp Mol Med. 51 (2), 1-10 (2019).
  15. Krumschnabel, G., Eigentler, A., Fasching, M., Gnaiger, E. Chapter nine - use of safranin for the assessment of mitochondrial membrane potential by high-resolution respirometry and fluorometry. Methods Enzymol. 542, 163-181 (2014).
  16. Demir, E. The potential use of Drosophila as an in vivo model organism for COVID-19-related research: a review. Turk J Biol. 45 (4), 559-569 (2021).
  17. Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: a primer on the Drosophila model system. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
  18. McBride, S. M. J., Holloway, S. L., Jongens, T. A. Using Drosophila as a tool to identify pharmacological therapies for fragile X syndrome. Drug Discov Today Technol Technologies. 10 (1), e129-e136 (2013).
  19. Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods (San Diego, Calif). 68 (1), 105-115 (2014).
  20. Bar, S., Prasad, M., Datta, R. Neuromuscular degeneration and locomotor deficit in a Drosophila model of mucopolysaccharidosis VII is attenuated by treatment with resveratrol). Dis Model Mech. 11 (11), (2018).
  21. Imai, Y. PINK1-Parkin signaling in Parkinson's disease: Lessons from Drosophila. Neurosci Res. 159, 40-46 (2020).
  22. Julienne, H., Buhl, E., Leslie, D. S., Hodge, J. J. L. Drosophila PINK1 and parkin loss-of-function mutants display a range of non-motor Parkinson's disease phenotypes. Neurobiol Dis. 104, 15-23 (2017).
  23. Biswas, S., Bagchi, A. Analysis of the structural dynamics of the mutations in the kinase domain of PINK1 protein associated with Parkinson's disease. Gene. 857, 147183 (2023).
  24. Koh, H., Chung, J. PINK1 and Parkin to control mitochondria remodeling. Anat Cell Biol. 43 (3), 179-184 (2010).
  25. Zhu, M., Li, X., Tian, X., Wu, C. Mask loss-of-function rescues mitochondrial impairment and muscle degeneration of Drosophila pink1 and parkin mutants. Hum Mol Genet. 24 (11), 3272-3285 (2015).
  26. Park, J., et al. Mitochondrial dysfunction in Drosophila PINK1 mutants is complemented by parkin. Nature. 441 (7097), 1157-1161 (2006).
  27. Dytham, C. Choosing and using statistics: a biologist's guide. , Wiley-Blackwell. Hoboken, NJ. (2011).
  28. Bonora, M., et al. ATP synthesis and storage. Purinergic Signal. 8 (3), 343-357 (2012).
  29. Gonçalves, D. F., et al. Caffeine improves mitochondrial function in PINK1B9-null mutant Drosophila melanogaster. J Bioenerg Biomembr. 55 (1), 1-13 (2023).
  30. Gonçalves, D. F., et al. Mitochondrial function and cellular energy maintenance during aging in a Drosophila melanogaster model of Parkinson disease. Mitochondrion. 65, 166-175 (2022).
  31. Janowska, J. I., et al. Mitochondrial respiratory chain complex I dysfunction induced by N-methyl carbamate ex vivo can be alleviated with a cell-permeable succinate prodrug. Toxicol In Vitro. 65, 104794 (2020).
  32. Ngo, D. T. M., et al. Oxidative modifications of mitochondrial complex II are associated with insulin resistance of visceral fat in obesity. Physiol Endocrinol Metab. 316 (2), E168-E177 (2019).
  33. Stroud, D. A., et al. Accessory subunits are integral for assembly and function of human mitochondrial complex I. Nature. 538 (7623), 123-126 (2016).
  34. Senyilmaz, D., et al. Regulation of mitochondrial morphology and function by stearoylation of TFR1. Nature. 525 (7567), 124-128 (2015).
  35. Poddighe, S., et al. Mucuna pruriens (Velvet bean) rescues motor, olfactory, mitochondrial and synaptic impairment in PINK1B9 Drosophila melanogaster genetic model of Parkinson's disease. PloS One. 9 (10), e110802 (2014).
  36. Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 810, 25-58 (2012).
  37. Winer, L. S. P., Wu, M. Rapid analysis of glycolytic and oxidative substrate flux of cancer cells in a microplate. PloS One. 9 (10), e109916 (2014).
  38. Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio Protoc. 8 (10), e2850 (2018).
  39. Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. Am J Physiol. Cell Physiol. 292 (1), C125-C136 (2007).
  40. Divakaruni, A. S., Jastroch, M. A practical guide for the analysis, standardization and interpretation of oxygen consumption measurements. Nat Metab. 4 (8), 978-994 (2022).
  41. Bingol, B., Sheng, M. Mechanisms of mitophagy: PINK1, Parkin, USP30 and beyond. Free Radic Biol Med. 100, 210-222 (2016).

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生物化学，第 201 期，线粒体功能，高分辨率呼吸测量法，耗氧率， 黑腹果蝇
使用高分辨率呼吸测量法分析 <em>果蝇黑腹</em> 果蝇 PINK1<sup>B9-Null</sup> 突变体的线粒体功能
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Michelotti, P., Duarte, T., Dalla… More

Michelotti, P., Duarte, T., Dalla Corte, C. L. Analyzing Mitochondrial Function in a Drosophila melanogaster PINK1B9-Null Mutant Using High-resolution Respirometry. J. Vis. Exp. (201), e65664, doi:10.3791/65664 (2023).

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