Summary
Hier presenteren we een respirometrieprotocol met hoge resolutie om bio-energetica in PINK1B9-null mutante fruitvliegjes te analyseren. De methode maakt gebruik van het SUIT-protocol (Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration).
Abstract
Neurodegeneratieve ziekten, waaronder de ziekte van Parkinson (PD), en cellulaire stoornissen zoals kanker zijn enkele van de aandoeningen die het energiemetabolisme verstoren met verslechtering van de mitochondriale functies. Mitochondriën zijn organellen die zowel het energiemetabolisme als de cellulaire processen regelen die betrokken zijn bij de overleving en dood van cellen. Om deze reden kunnen benaderingen om de mitochondriale functie te evalueren belangrijke inzichten bieden in cellulaire omstandigheden in pathologische en fysiologische processen. In dit opzicht maken protocollen voor respirometrie met hoge resolutie (HRR) evaluatie mogelijk van de gehele functie van de mitochondriale ademhalingsketen of de activiteit van specifieke mitochondriale complexen. Bovendien vereist het bestuderen van mitochondriale fysiologie en bio-energetica genetisch en experimenteel handelbare modellen zoals Drosophila melanogaster.
Dit model biedt verschillende voordelen, zoals de gelijkenis met de menselijke fysiologie, de snelle levenscyclus, eenvoudig onderhoud, kosteneffectiviteit, hoge doorvoermogelijkheden en een minimaal aantal ethische bezwaren. Deze eigenschappen maken het samen tot een hulpmiddel van onschatbare waarde voor het ontleden van complexe cellulaire processen. Het huidige werk legt uit hoe de mitochondriale functie kan worden geanalyseerd met behulp van de Drosophila melanogaster PINK1 B9-null-mutant. Het pink1-gen is verantwoordelijk voor het coderen voor PTEN-geïnduceerd vermeend kinase 1, via een proces dat wordt erkend als mitofagie, wat cruciaal is voor de verwijdering van disfunctionele mitochondriën uit het mitochondriale netwerk. Mutaties in dit gen werden in verband gebracht met een autosomaal recessieve familiale vorm van PD met vroege aanvang. Dit model kan worden gebruikt om mitochondriale disfunctie te bestuderen die betrokken is bij de pathofysiologie van PD.
Introduction
Mitochondriën zijn cellulaire organellen die belangrijke functies regelen, waaronder apoptotische regulatie, calciumhomeostase en deelname aan biosynthetische routes. Door autonoom genetisch materiaal te bezitten, zijn ze in staat om bij te dragen aan cellulaire onderhouds- en herstelprocessen. Hun structuur herbergt de elektronentransportketen en oxidatieve fosforylering, beide cruciaal voor cellulaire energie 1,2,3. Energiebeheersing wordt met name bereikt door de productie van adenosinetrifosfaat (ATP) via oxidatieve fosforylering (OXPHOS)2. Verstoring van het energiemetabolisme met aantasting van mitochondriale functies treedt zowel op bij celoverleving als bij celdood 4,5, vaak geassocieerd met een breed scala aan menselijke pathologieën, zoals kanker, en neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Parkinson (PD)3,6.
PD is een chronische, progressieve en neurologische aandoening. De primaire oorzaak van deze ziekte is het afsterven van hersencellen, vooral in de substantia nigra, die verantwoordelijk zijn voor de productie van de neurotransmitter dopamine, die beweging regelt 6,7,8. De vroegste waarneming die parkinsonisme in verband bracht met mitochondriale disfunctie werd gedaan in 1988, in experimentele modellen met toxines die de ademhalingsketen remmen Complex I9.
Momenteel zijn er verschillende methoden om mitochondriale disfunctie te evalueren 10,11,12,1 3; in vergelijking met conventionele benaderingen biedt respirometrie met hoge resolutie (HRR) echter een superieure gevoeligheid en voordelen 13,14. HRR-protocollen maken bijvoorbeeld de evaluatie mogelijk van de hele mitochondriale ademhalingsketenfunctie of de activiteit van specifieke mitochondriale complexen14,15. Mitochondriale disfuncties kunnen worden beoordeeld in intacte cellen, geïsoleerde mitochondriën of zelfs ex vivo 10,11,13,14.
Mitochondriale disfuncties zijn nauw verbonden met veel pathologische en fysiologische processen. Het is daarom belangrijk om mitochondriale fysiologie en bio-energetica te bestuderen met behulp van genetisch en experimenteel handelbare modelsystemen. In dit opzicht heeft onderzoek naar Drosophila melanogaster, de fruitvlieg, verschillende voordelen. Dit model deelt fundamentele cellulaire kenmerken en processen met mensen, waaronder het gebruik van DNA als genetisch materiaal, gemeenschappelijke organellen en geconserveerde moleculaire routes die betrokken zijn bij ontwikkeling, immuniteit en celsignalering. Bovendien hebben fruitvliegjes een snelle levenscyclus, eenvoudig onderhoud, lage kosten, hoge doorvoer en minder ethische bezwaren, waardoor ze een hulpmiddel van onschatbare waarde vormen voor het ontleden van complexe cellulaire processen 16,17,18,19,20.
Bovendien wordt een homoloog van het PTEN-geïnduceerde vermeende kinase 1 (pink1)-gen tot expressie gebracht in D. melanogaster. Het speelt een cruciale rol bij het verwijderen van beschadigde mitochondriën door het proces van mitofagie8. Bij mensen maken mutaties in dit gen individuen vatbaar voor een autosomaal recessieve familiale vorm van PD geassocieerd met mitochondriale disfunctie 8,21,22,23. Bijgevolg is de fruitvlieg een krachtig diermodel voor studies naar de pathofysiologie van PD en screening van kandidaat-geneesmiddelen met de nadruk op mitochondriale disfunctie en bio-energetica. Daarom legt het huidige werk uit hoe de mitochondriale functie kan worden geanalyseerd in een model van PD van D. melanogaster met behulp van de HRR-techniek in de OROBOROS met het Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration (SUIT)-protocol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
We gebruikten de stammen w1118 (wit) en w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 (aangeduid als Pink1B9) (FlyBase ID: FBgn0029891) van het Bloomington Drosophila stock center (ID-nummer: 34749). In deze studie worden mannelijke D. melanogaster PINK1B9-null mutanten vergeleken met mannelijke D. melanogaster uit de w1118 stam, die als controlegroep wordt gebruikt (genetische achtergrond). Andere parameters moeten gelijktijdig met de respirometrie-experimenten worden geanalyseerd om ervoor te zorgen dat de vliegen het juiste genotype hebben (Pink1B9/Y), zoals thoraxmisvormingen en voortbewegingsproblemen, die goed zijn beschreven voor pink1B9 mutante vliegen 24,25,26.
1. Dieren en huisvesting
- Bewaar de vliegen in glazen flessen met 10 ml standaardvoeding (gist 1,73%, sojameel 0,9%, maïsmeel 7,3%, agar 0,5%, glucosestroop 7,6% en propionzuur 0,48%) bij constante temperatuur en vochtigheid (respectievelijk 25 °C en 60%), met een licht/donkercyclus van 12 uur:12 uur.
- Gebruik voor elk experiment twee vliegen van 1-3 dagen na de eclosie.
OPMERKING: De PINK1B9-null mutante maagdelijke vrouwtjes werden gekruist met w1118 mannetjes om de F1 mannetjes met genotype Pink1B9/Y te verkrijgen.
2. Voorbereiding van het monster
- Bereid de MiR05-buffer voor zoals beschreven in tabel 1.
- Verdoof de vliegen op ijs en breng ze over in microcentrifugebuisjes (twee vliegen per buisje).
- Voeg in elk buisje 200 μL gekoelde MiR05-buffer toe en homogeniseer de vliegen. Homogeniseer handmatig en oefen lichte druk uit (ongeveer 4-6 slagen van de stamper) om het uiteenvallen van mitochondriën te voorkomen.
3. Respirometriekalibratie met hoge resolutie van polarografische zuurstofsensoren
OPMERKING: De OROBOROS-kamers hebben een totaal volume van ongeveer 2 ml. Kalibratie is vereist om ervoor te zorgen dat de zuurstofflux dicht bij 0 pmol ligt om de test te starten.
- Start de kalibratie en voeg 2 ml MiR05 toe aan de kamer. Bedek de kamer met de stop en laat geen luchtbellen achter; Trek vervolgens voorzichtig aan de stop om één enkele luchtbel te vormen.
- Open de OROBOROS Dat.Lab-software. Voer een temperatuur van 25 °C in het veld Bloktemperatuur in en klik op Verbinden met Oxygraph-2k (Figuur 1A).
- Klik en selecteer de map waarin de kalibratie moet worden opgeslagen en klik op Opslaan.
- Wanneer een nieuw venster wordt geopend, geeft u het experiment en de monsters een naam (als u kalibreert, voert u gewoon de naam kalibratie in) en klikt u op Opslaan.
- Ga naar het menu Layout en kies de eerste optie: 01 Calibration Exp. Gr.3 - Temp zoals weergegeven in Figuur 1B.
- Wacht tot het programma doorverwijst naar de kalibratielay-out, wacht tot de rode lijn een standaard rechte lijn toont met punten rond 0 pmol. Selecteer vervolgens twee punten: één voor kamer A en de andere voor kamer B (Figuur 1C) wanneer de rode lijn precies op nul staat.
OPMERKING: De geselecteerde punten moeten een zuurstofflux (rode lijn) rond 0 hebben.- Om de punten van beide kamers te markeren, selecteert u de concentratie O2 aan de rechterkant van het scherm, selecteert u het gemarkeerde punt en kopieert u zowel de temperatuur - als de luchtdrukwaarden ten opzichte van het punt. Plak deze waarden in de onderstaande vakken en klik op Kalibreren en Kopiëren naar klembord in de rechterbenedenhoek van het scherm, zoals weergegeven in afbeelding 2.
- Voer dit proces uit voor beide kamers (A en B), ga vervolgens naar het menu Bestand en selecteer Opslaan en loskoppelen.
NOTITIE: Na het kalibratieproces zal het programma de gebruiker omleiden naar het startscherm, zodat de software klaar is om de HRR-test te starten. Voor deze test gebruiken we het SUIT-protocol.
4. SUIT-protocol
- Als de kalibratie is voltooid, verwijdert u de stoppers en opent u de kamers.
- Was de stoppen (houd de punt vast die het monster niet raakt) en kamers met 100% ethanol, 70% ethanol en gedestilleerd water, in die volgorde.
OPMERKING: Herhaal het proces voor elke monsterwissel. - Homogeniseer de vliegen in een buffer van 200 μL, plaats alle monsterinhoud in de kamer met behulp van een micropipet en plaats de stop in de kamer, zorg ervoor dat er geen luchtbellen ontstaan.
NOTITIE: Als er luchtbellen ontstaan, verwijder dan voorzichtig de stop en voeg 100 μL MIR05-buffer toe. - Klik op het menu Lay-out en selecteer de optie 05 Flow by Corrected Volume zoals weergegeven in figuur 1B.
- Wacht tot u wordt doorgestuurd naar een nieuw venster. Klik op Opslaan om de map te selecteren waarin het experiment moet worden opgeslagen.
- Wacht tot er weer een nieuw venster wordt geopend. Geef het experiment in de ruimte de naam Experimentele code. Geef vervolgens elk monster in de respectievelijke kamer A en B een naam in het veld Monster en stel het veld Eenheid in op eenheid.
OPMERKING: Er kunnen ook andere eenheden worden gekozen, bijvoorbeeld Miljoenen cellen of mg. - Gezien het feit dat dit protocol twee vliegen (2 eenheden) gebruikt en het kamervolume 2 ml is, definieert u in het veld Concentratie 1 per ml (Figuur 1D).
OPMERKING: Hier werd de hoeveelheid monster genormaliseerd door het aantal vliegen; deze normalisatie kan echter worden uitgevoerd door het eiwitgehalte van het monster, mitochondriale DNA-kwantificering of activiteit van citraatsynthase. - Wanneer het zuurstoffluxsignaal (rode lijn) stabiel is op de positieve waarde, start u het HRR-protocol met de titratie van substraten, remmers en ontkoppelaars (Figuur 3). Alle volgende reagentia en apparatuur zijn weergegeven in tabel 1.
- Voeg digitonine (5 μg/ml) toe om het mitochondriale membraan te permeabiliseren.
- Voeg pyruvaatsubstraten (5 mM), malaat (2 mM) en proline (10 mM) toe en wacht tot de zuurstofflux toeneemt en stabiliseert. Om de gebeurtenis voor elke toevoeging van een reagens te markeren, drukt u op de F4-toets op het toetsenbord en voert u de naam van elk reagens in.
- Voeg ADP (5mM) toe om de mitochondriale ademhalingsketen te koppelen en wacht op de toename en stabilisatie van de zuurstofflux.
- Voeg succinaat (10 mM) toe en wacht op de toename en stabilisatie van de zuurstofstroom.
- Voeg oligomycine (2,5 μM) toe om ATP-synthase te remmen en zoek naar een afname van de zuurstofflux.
- Wacht tot de rode lijn stabiliseert en ontkoppel de mitochondriale elektronenoverdracht met behulp van carbonyl-4-(trifluoromethoxy) fenylhydrazonecyanide (FCCP) met titers van 0,25 μM totdat het maximale zuurstofverbruik is bereikt, aangetoond door de stijging van de rode lijn. Na stabilisatie van de zuurstofflux, begint u de remmers van elk complex één voor één toe te voegen.
- Voeg Rotenon (0,5 μM) toe, een complex I-remmer. Wacht op de afname en stabilisatie van de zuurstofflux om de volgende remmer toe te voegen.
- Voeg Malonaat (5 mM) toe, een complex II-remmer. Wacht op de afname en stabilisatie van de zuurstofflux om de volgende remmer toe te voegen.
- Voeg ten slotte Antimycine (2,5 μM) toe, een complexe III-remmer. Wacht op de afname gevolgd door de toename en stabilisatie van de zuurstofflux.
OPMERKING: De zuurstofflux moet stabiliseren op een positieve waarde, maar onder de waarde voor de laatste remming van mitochondriale eiwitcomplexen.
- Verwijder aan het einde van de analyse alle inhoud van de kamers met behulp van een micropipet. Bewaren bij -20 °C voor toekomstige analyse, indien nodig.
5. Data-analyse
- Gebruik een geschikt statistisch softwarepakket voor data-analyse.
- Voer t-toetsen uit om de verschillen tussen de twee groepen te beoordelen. Gebruik voor situaties met meerdere behandelingen variantieanalyse (ANOVA) als statistische test 27.
- Haal de O2 fluxwaarden uit de grafiek die door de software wordt gegenereerd. OXPHOS CI verwijst naar de waarde van deO2-flux na toevoeging van ADP. OXPHOS CII wordt verkregen door OXPHOS CI&CII - OXPHOS CI af te trekken. OXPHOS CI&CII is de waarde van deO2-flux die wordt geëxtraheerd na toevoeging van succinaat. ETS CI&CII is de O2 fluxwaarde na toevoeging van FCCP. ETS CI = FCCP - Rotenon en ETS CII = Rotenon - Malonaat.
- Bereken de ATP-synthese als het verschil tussen de OXPHOS (P) en LEAK (L) (P - L)28.
- Bepaal de Respiratory Control Ratio (RCR) door de verhouding OXPHOS/LEAK te berekenen, waarbij RCR = P/L.11
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier zien we dat de O2-flux in OXPHOS CI (P = 0,0341) en OXPHOS CI & II (P = 0,0392) in PINK1B9 nulvliegen wordt verminderd in vergelijking met controlevliegen (Figuur 4). Dit resultaat werd ook waargenomen in eerdere bevindingen van onze groep 29,30.
CI en CII zijn belangrijke componenten van het elektronentransportsysteem (ETS), waarbij CI verantwoordelijk is voor de overdracht van elektronen van NADH naar ubiquinon, terwijl CII elektronen overdraagt van succinaat naar ubiquinon 31,32,33. PINK1B9 nulvliegen vertoonden een lagere O2-flux in ETS CI (P = 0,0338), ETS CII (P = 0,0457) en ETS CI&II (P = 0,0247) (Figuur 5). Deze resultaten geven aan dat het elektronenoverdrachtssysteem verstoord is bij vliegen die het pink1-gen missen en dat deO2-flux in zowel OXPHOS- als ETS-stadia afhankelijk is van CI en CI&CII, in overeenstemming met andere werken die verminderde CI-activiteit aantonen in pink1-/- modellen 33,34,35.
Bovendien is de protongradiënt over het mitochondriale binnenmembraan essentieel voor de synthese van ATP28. De afname van deO2-flux in ETS CI en ETS CII duidt op een verstoring van de flux van elektronen langs de ETS. Deze verstoring van de flux van elektronen beïnvloedt het OXPHOS-proces, wat leidt tot verminderde ATP-synthese. Er was ook een significante afname van hetO2-verbruik gerelateerd aan ATP-synthese (P = 0,0280) in PINK1B9 nulvliegen in vergelijking met controlevliegen (Figuur 6B). Een afname van de ATP-synthese in D. melanogaster kan significante effecten hebben op het energiemetabolisme, cellulaire processen en algemene fysiologische functies. Bovendien kan de efficiëntie van het OXPHOS-proces worden gekwantificeerd door een index die bekend staat als RCR, die de dichtheid van de koppeling tussen ademhaling en fosforylering weergeeft. Daarom duidt RCR-reductie (P = 0,0432) op mitochondriale ontkoppeling, wat het OXPHOS-proces kan beïnvloeden, wat suggereert dat de mitochondriën minder efficiënt zijn in het gebruik van zuurstof en het produceren van ATP (Figuur 6C). Deze resultaten kunnen van invloed zijn op de groei, ontwikkeling, voortbeweging, voortplanting en algehele gezondheid van de fruitvlieg en bijdragen aan de pathogenese van bepaalde neurodegeneratieve ziekten, waaronder PD 8,28,29,32.
Figuur 1: Lay-outs in OROBOROS Dat.Lab software. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Stappen voor het kalibreren van kamers in de OROBOROS Dat.Lab-software. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: SUIT-protocol dat de belangrijkste punten van substraat- en inhibitortoevoeging aantoont. Eerst wordt digitonine (DIG) toegevoegd, gevolgd door complexe I-specifieke substraten: malaat, pyruvaat en proline (MPP), ATP-synthasesubstraat (ADP) en vervolgens substraat voor complex II: succinaat (S). Vervolgens wordt de ATP-synthaseremmer: oligomycine (OMY) toegevoegd, gevolgd door de ontkoppelaar Carbonyl-4-(trifluoromethoxy) fenylhydrazonecyanide (F) en complexe I-, II- en III-remmers: rotenon (R), malonaat (MNA) en antimycine (AMA)36. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Respirometrie met hoge resolutie waarin w1118 en PINK1B9 vliegen worden vergeleken. (A) OXPHOS CI, (B) OXPHOS CII, en (C) OXPHOS CI&CII. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± S.E.M. en geanalyseerd met behulp van t-toets. n = 5-9. p < 0,05. Afkortingen: OXPHOS = oxidatieve fosforylering; BI = complex I; CII = complex II. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Respirometrie met hoge resolutie waarin w1118 en PINK1B9 vliegen worden vergeleken. (A) ETS CI, (B) ETS CII en (C) ETS CI&CII. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± S.E.M. en geanalyseerd met t-toets. n = 5-9. p < 0,05. Afkortingen: ETS = elektronentransportsysteem; BI = complex I; CII = complex II. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Respirometrie met hoge resolutie waarin w1118 en PINK1B9 vliegen worden vergeleken. (A) LEK, (B) ATP-synthese, en (C) respiratoire controleratio. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± S.E.M. en geanalyseerd door middel van t-toets. n = 5-9. p < 0,05. Afkorting: RCR = respiratory control ratio. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HRR is een krachtige techniek voor het bestuderen van mitochondriale ademhaling en energiemetabolisme in D. melanogaster en andere organismen. Het biedt een gedetailleerde en kwantitatieve beoordeling van de mitochondriale functie, waardoor onderzoekers inzicht kunnen krijgen in de bio-energetica van de cellen. Het hier gepresenteerde protocol beschrijft de evaluatie van de functie van de mitochondriale ademhalingsketen en de activiteit van specifieke mitochondriale complexen met behulp van het SUIT-protocol bij D. melanogaster. Het SUIT-protocol omvat het systematisch manipuleren van verschillende substraten, ontkoppelaars en remmers om verschillende aspecten van mitochondriale ademhaling te onderzoeken.
De beschreven techniek maakt het mogelijk om respiratoire remming te beoordelen als gevolg van effecten op de OXPHOS of de ETS, dehydrogenase-activiteit (CI en CII) en membraanintegriteit (koppeling van OXPHOS). Hier voerden we de experimenten uit met PINK1B9-null-vliegen om mitochondriale disfunctie te bestuderen, aangezien het geassocieerd is met PD34,35. Dit protocol kan echter nuttig zijn voor verschillende ziektemodellen, medicamenteuze behandelingen en toxicologische studies.
Bovendien kan de monstervoorbereiding worden aangepast aan de experimentele eisen36. Een cruciale stap in het respirometrieprotocol is de voorbereiding van het monster. Het is van cruciaal belang dat het juiste protocol wordt opgesteld voor het type monster (cel, geïsoleerde mitochondriën, homogenaat), en het is belangrijk om de juiste methode voor monsternormalisatie te overwegen (eiwithoeveelheid, DNA-gehalte, citraatsynthase-activiteit). Het is ook belangrijk om dezelfde buffer te gebruiken voor de monstervoorbereiding en de respirometrietest.
Omdat het hier beschreven monstervoorbereidingsprotocol eenvoudig is, levert het meestal geen problemen op voor de techniek. Als een ander type monster wordt gekozen of de bereiding ervan wordt gewijzigd, is zorgvuldige standaardisatie noodzakelijk. Roeren en temperatuurstabiliteit beïnvloeden het signaal van de polarografische zuurstofsensor, waardoor fouten ontstaan in ademhalingsmetingen met behulp van een oxygraaf. Daarom vormt de juiste kalibratie van de kamer een belangrijke stap om fouten tijdens de ademhalingsmetingen te verminderen.
Deze methode voor het beoordelen van de mitochondriale functie in vliegenmonsters biedt verschillende voordelen ten opzichte van alternatieve benaderingen. Een van de belangrijkste sterke punten van HRR is het vermogen om directe en nauwkeurige metingen van het zuurstofverbruik te leveren, waardoor een gedetailleerde analyse van de mitochondriale functie en het cellulaire metabolisme mogelijk is. Daarom wordt HRR vaak gebruikt in onderzoek dat gericht is op het begrijpen van mitochondriale disfunctie, energieproductie en cellulaire reacties op verschillende substraten of omstandigheden. Bovendien is het veelzijdig - waardoor een breed scala aan monstertypes kan worden gebruikt, waaronder geïsoleerde mitochondriën - en vereist het kleine hoeveelheden biologische monsters, wat handig is wanneer de monsterhoeveelheid beperkt is 1,2,3. Methoden die mitochondriale isolaten gebruiken, bijvoorbeeld, omvatten meestal een aanzienlijk aantal vliegen, variërend van 50 tot 200 individuen, wat het onderzoek met mutanten moeilijk maakt, omdat het verkrijgen van een groot aantal mutanten voor bepaalde ziektemodellen misschien niet praktisch is.
Net als de HRR-methode is de Seahorse Bioscience Extracellular Flux Analyzer een wetenschappelijk hulpmiddel dat wordt gebruikt om zuurstofverbruik en extracellulaire verzuring te meten. Ze hebben echter verschillende benaderingen en toepassingen. De Seahorse Bioscience Extracellular Flux Analyzer kwantificeert momentane veranderingen in het zuurstofverbruik (OCR) en de extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR) van cellen. OCR is indicatief voor mitochondriale ademhaling en energieopwekking, terwijl ECAR inzicht biedt in glycolytische activiteit. De belangrijkste functie ligt in de beoordeling van de cellulaire metabole dynamiek onder verschillende fysiologische omstandigheden, waardoor het bijzonder instrumenteel is bij het ophelderen van de ingewikkelde metabole modulaties die verband houden met pathologische contexten. Bovendien is Seahorse ontworpen voor gebruiksgemak, waardoor onderzoekers snelle metabole tests kunnen uitvoeren 37,38,39. De HRR daarentegen vereist gespecialiseerde training en expertise om gegevens effectief te gebruiken en te analyseren. Het gaat om het gebruik van een zuurstofelektrode om het zuurstofverbruik door cellen of mitochondriën direct te meten 13,14,40. Een voordeel van HRR is de veelzijdigheid bij het ontwerpen van verschillende respirometrieprotocollen, wat onpraktisch is bij het gebruik van Seahorse. Deze veelzijdigheid om protocollen te ontwerpen die gepaard gaan met lage kosten, maakt de HRR-methode een haalbare keuze voor laboratoria met beperkte financiering. Een ander nadeel van het respirometriesysteem dat in het huidige protocol wordt gebruikt, is de onmogelijkheid om met meerdere monsters tegelijk te werken, wat de high-throughput-analyse belemmert. Experimentele groepen moeten dus goed ontworpen zijn om de juiste vergelijking tussen hen mogelijk te maken. De voordelen van dit systeem liggen echter in het feit dat monsters van alle soorten kunnen worden getest, van geïsoleerde cellen tot hele levende organismen, zoals bijvoorbeeld C. elegans 40.
Samenvattend is HRR een betrouwbare methode voor het bestuderen van de mitochondriale functie onder fysiologische en pathologische omstandigheden41. Elk experimenteel model heeft verschillende kenmerken en beperkingen, waardoor de methodologie en aanpassingen van de monstervoorbereiding nodig zijn om betrouwbare en zinvolle gegevensverzameling bij de evaluatie van de mitochondriale ademhaling te garanderen. Dit protocol biedt onderzoekers een betrouwbare methode om de effecten van omgevingsfactoren, experimentele interventies of genetische mutaties op de mitochondriale functie in D. melanogaster te beoordelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat er geen tegenstrijdige belangen zijn.
Acknowledgments
De auteurs erkennen het Braziliaanse agentschap Coordenação de Aperfeiçoamento de Pesquisa Pessoal de Nível Superior (CAPES EPIDEMIAS 09 #88887.505377/2020). PM (#88887.512821/2020-00) en TD (#88887.512883/2020-00) zijn ontvangers van onderzoeksbeurzen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | Adenosine 5′-diphosphate sodium sal (CAS number 72696-48-1); ≥95%; molecular weight = 501.31 g/mol. |
| Ágar | Kasv | K25-1800 | For bacteriologal use |
| Antimycin-A | Sigma-Aldrich | A8674 | Antimycin A from Streptomyces sp. (CAS number 1397-94-0); molecular weight 540 g/mol; |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | Bovine Serum Albumin (CAS number 9048-46-8); pH 7,0 ≥ 98% |
| Datlab software | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20700 | Software for data acquisition and analysis |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D 5628 | CAS number 11024-24-1 |
| Distilled water | |||
| Drosophila melanogaster strain w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 | Obtained from Bloomington Drosophila stock center | ||
| Drosophila melanogaster strain w1118 | Obtained from the Federal University of Santa Maria | ||
| EGTA | Sigma-Aldrich | E8145 | Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (CAS number 13638-13-3); ≥97%; molecular weight =468.28 g/mol |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920 | Carbonyl cyanide 4- (trifluoromethoxy)phenylhydrazone (CAS number 370-86-5); ≥98% (TLC), powder |
| GraphPad Prism version 8.0.1. | Software for data acquisition and analysis | ||
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034 | 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (CAS number 7365-45-9); ≥99,5% (titration), cell cultured tested; molecular weight = 238.30 g/mol |
| High-resolution respirometer Oxygraph O2K | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 10022-02 | Startup O2K respirometer kit |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | Monopotassium phosphate (CAS number 7778-77-0); Reagente Plus, molecular weigt = 136.09 g/mol |
| KOH | Sigma-Aldrich | 211473 | Potassium hydroxide (CAS number 1310-58-3); ACS reagent, ≥85%, pellets |
| Malate | Sigma-Aldrich | M1296 | Malonic acid (CAS number 141-82-2); 99%, molecular weight = 104.06 g/mol). A solution is pH adjusted to approximately 7.0. |
| Malic acid | Sigma-Aldrich | M1000 | (S)-(−)-2-Hydroxysuccinic acid (CAS number 97-67-6); ≥95% ; molecular weight = 134.09 g/mol |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (CAS number 4432-31-9); ≥99% (titration); molecular weight = 195.24 g/mol |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Magnesium chloride (CAS number 7786-30-3); anhydrous, ≥98%, molecular weight = 95.21 g/mol |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | ||
| O2K-Titration Set | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20820-03 | Hamilton syringes with different volumes |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O 4876 | Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes (CAS number 1404-19-9); ≥90% total oligomycins basis (HPLC) |
| Pistil to homogenization | |||
| Proline | Sigma-Aldrich | P0380 | L-Proline (CAS number 147-85-3); powder; 99%; molecular weight = 115.13 g/mol |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Sodium pyruvate (CAS number 113-24-6), ≥99%; molecular weight = 110.04 g/mol |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | Rotetone (CAS number 83-79-4); ≥95%, molecular weight 394.42 g/ mol |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S 2378 | Sodium succinate dibasic hexahydrate (CAS number 6106-21-4); ≥99% |
| Sucrose | Merck | 107,651,000 | Sucrose for microbiology use (CAS number 57-50-1) |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | CAS number 107-35-7 |
References
- Brand, M. D., Orr, A. L., Perevoshchikova, I. V., Quinlan, C. L. The role mitochondrial function and cellular bioenergetics in ageing and disease. Br J Dermatol. 169, 1-8 (2013).
- Ramaccini, D., et al. Mitochondrial function and dysfunction in dilated cardiomyopathy. Front Cell Dev Biol. 8, 624216 (2021).
- Zhunina, O. A., et al. The role of mitochondrial dysfunction in vascular disease, tumorigenesis, and diabetes. Front Mol Biosci. 8, 671908 (2021).
- Prasun, P.
- Bhatti, J. S., Bhatti, G. K., Reddy, P. H. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in metabolic disorders - A Step towards mitochondria based therapeutic strategies. Biochim Biophys Acta. 1863 (5), 1066-1077 (2017).
- Perier, C., Vila, M. Mitochondrial biology and Parkinson's disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (2), 009332 (2012).
- DeMaagd, G., Philip, A. Parkinson's disease and its management. Pharmacy and Therapeutics. 40 (8), 504-532 (2015).
- Miyazaki, N., et al. PINK1-dependent and Parkin-independent mitophagy is involved in reprogramming of glycometabolism in pancreatic cancer cells. Biochem Biophys Res Commun. 625, 167-173 (2022).
- Kopin, I. J., Markey, S. P. MPTP toxicity: implications for research in Parkinson's disease. Annual Review of Neuroscience. 11, 81-96 (1988).
- Connolly, N. M. C., et al. Guidelines on experimental methods to assess mitochondrial dysfunction in cellular models of neurodegenerative diseases. Cell Death Differ. 25 (3), 542-572 (2018).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G.
- Haynes, C. M., Fiorese, C. J., Lin, Y. -F. Evaluating and responding to mitochondrial dysfunction: The UPRmt and beyond. Trends Cell Mol Biol. 23 (7), 311-318 (2013).
- Long, Q., Huang, L., Huang, K., Yang, Q. Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from mouse heart tissues using oroboros 2k-oxygraph. Methods Mol Biol. 1966, Clifton, N.J. 237-246 (2019).
- Scheiber, D., et al. High-resolution respirometry in human endomyocardial biopsies shows reduced ventricular oxidative capacity related to heart failure. Exp Mol Med. 51 (2), 1-10 (2019).
- Krumschnabel, G., Eigentler, A., Fasching, M., Gnaiger, E. Chapter nine - use of safranin for the assessment of mitochondrial membrane potential by high-resolution respirometry and fluorometry. Methods Enzymol. 542, 163-181 (2014).
- Demir, E. The potential use of Drosophila as an in vivo model organism for COVID-19-related research: a review. Turk J Biol. 45 (4), 559-569 (2021).
- Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: a primer on the Drosophila model system. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
- McBride, S. M. J., Holloway, S. L., Jongens, T. A. Using Drosophila as a tool to identify pharmacological therapies for fragile X syndrome. Drug Discov Today Technol Technologies. 10 (1), e129-e136 (2013).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods (San Diego, Calif). 68 (1), 105-115 (2014).
- Bar, S., Prasad, M., Datta, R. Neuromuscular degeneration and locomotor deficit in a Drosophila model of mucopolysaccharidosis VII is attenuated by treatment with resveratrol). Dis Model Mech. 11 (11), (2018).
- Imai, Y. PINK1-Parkin signaling in Parkinson's disease: Lessons from Drosophila. Neurosci Res. 159, 40-46 (2020).
- Julienne, H., Buhl, E., Leslie, D. S., Hodge, J. J. L. Drosophila PINK1 and parkin loss-of-function mutants display a range of non-motor Parkinson's disease phenotypes. Neurobiol Dis. 104, 15-23 (2017).
- Biswas, S., Bagchi, A. Analysis of the structural dynamics of the mutations in the kinase domain of PINK1 protein associated with Parkinson's disease. Gene. 857, 147183 (2023).
- Koh, H., Chung, J. PINK1 and Parkin to control mitochondria remodeling. Anat Cell Biol. 43 (3), 179-184 (2010).
- Zhu, M., Li, X., Tian, X., Wu, C. Mask loss-of-function rescues mitochondrial impairment and muscle degeneration of Drosophila pink1 and parkin mutants. Hum Mol Genet. 24 (11), 3272-3285 (2015).
- Park, J., et al. Mitochondrial dysfunction in Drosophila PINK1 mutants is complemented by parkin. Nature. 441 (7097), 1157-1161 (2006).
- Dytham, C. Choosing and using statistics: a biologist's guide. , Wiley-Blackwell. Hoboken, NJ. (2011).
- Bonora, M., et al.
- Gonçalves, D. F., et al. Caffeine improves mitochondrial function in PINK1B9-null mutant Drosophila melanogaster. J Bioenerg Biomembr. 55 (1), 1-13 (2023).
- Gonçalves, D. F., et al. Mitochondrial function and cellular energy maintenance during aging in a Drosophila melanogaster model of Parkinson disease. Mitochondrion. 65, 166-175 (2022).
- Janowska, J. I., et al. Mitochondrial respiratory chain complex I dysfunction induced by N-methyl carbamate ex vivo can be alleviated with a cell-permeable succinate prodrug. Toxicol In Vitro. 65, 104794 (2020).
- Ngo, D. T. M., et al. Oxidative modifications of mitochondrial complex II are associated with insulin resistance of visceral fat in obesity. Physiol Endocrinol Metab. 316 (2), E168-E177 (2019).
- Stroud, D. A., et al. Accessory subunits are integral for assembly and function of human mitochondrial complex I. Nature. 538 (7623), 123-126 (2016).
- Senyilmaz, D., et al. Regulation of mitochondrial morphology and function by stearoylation of TFR1. Nature. 525 (7567), 124-128 (2015).
- Poddighe, S., et al. Mucuna pruriens (Velvet bean) rescues motor, olfactory, mitochondrial and synaptic impairment in PINK1B9 Drosophila melanogaster genetic model of Parkinson's disease. PloS One. 9 (10), e110802 (2014).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 810, 25-58 (2012).
- Winer, L. S. P., Wu, M. Rapid analysis of glycolytic and oxidative substrate flux of cancer cells in a microplate. PloS One. 9 (10), e109916 (2014).
- Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio Protoc. 8 (10), e2850 (2018).
- Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. Am J Physiol. Cell Physiol. 292 (1), C125-C136 (2007).
- Divakaruni, A. S., Jastroch, M. A practical guide for the analysis, standardization and interpretation of oxygen consumption measurements. Nat Metab. 4 (8), 978-994 (2022).
- Bingol, B., Sheng, M. Mechanisms of mitophagy: PINK1, Parkin, USP30 and beyond. Free Radic Biol Med. 100, 210-222 (2016).
