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Biochemistry

ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर PINK1B9-अशक्त उत्परिवर्ती में उच्च-रिज़ॉल्यूशन रेस्पिरोमेट्री का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का विश्लेषण करना

Published: November 10, 2023 doi: 10.3791/65664
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2
1Laboratory of Experimental Biochemistry and Toxicology, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Center of Natural and Exact Sciences, Federal University of Santa Maria, 2Graduate Program in Biological Sciences: Toxicological Biochemistry, Federal University of Santa Maria
* These authors contributed equally

Summary

यहां हम PINK1B9-नल उत्परिवर्ती फल मक्खियों में बायोएनेरगेटिक्स का विश्लेषण करने के लिए एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन रेस्पिरोमेट्री प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। विधि सब्सट्रेट-अनकपलर-इनहिबिटर-अनुमापन (SUIT) प्रोटोकॉल का उपयोग करती है।

Abstract

पार्किंसंस रोग (पीडी) सहित न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग, और कैंसर जैसे सेलुलर गड़बड़ी कुछ ऐसे विकार हैं जो माइटोकॉन्ड्रियल कार्यों की हानि के साथ ऊर्जा चयापचय को बाधित करते हैं। माइटोकॉन्ड्रिया ऐसे अंग हैं जो कोशिका के अस्तित्व और मृत्यु में शामिल ऊर्जा चयापचय और सेलुलर प्रक्रियाओं दोनों को नियंत्रित करते हैं। इस कारण से, माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का मूल्यांकन करने के दृष्टिकोण रोग और शारीरिक प्रक्रियाओं में सेलुलर स्थितियों में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं। इस संबंध में, उच्च-रिज़ॉल्यूशन रेस्पिरोमेट्री (एचआरआर) प्रोटोकॉल पूरे माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन श्रृंखला समारोह या विशिष्ट माइटोकॉन्ड्रियल परिसरों की गतिविधि के मूल्यांकन की अनुमति देते हैं। इसके अलावा, माइटोकॉन्ड्रियल फिजियोलॉजी और बायोएनेरगेटिक्स का अध्ययन करने के लिए आनुवंशिक रूप से और प्रयोगात्मक रूप से ट्रैक्टेबल मॉडल जैसे ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर की आवश्यकता होती है।

यह मॉडल कई फायदे प्रस्तुत करता है, जैसे कि मानव शरीर क्रिया विज्ञान के लिए इसकी समानता, इसका तीव्र जीवन चक्र, आसान रखरखाव, लागत-प्रभावशीलता, उच्च थ्रूपुट क्षमताएं और नैतिक चिंताओं की एक न्यूनतम संख्या। ये विशेषताएँ सामूहिक रूप से इसे जटिल सेलुलर प्रक्रियाओं को विदारक करने के लिए एक अमूल्य उपकरण के रूप में स्थापित करती हैं। वर्तमान कार्य बताता है कि ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर PINK1B9-नल म्यूटेंट का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का विश्लेषण कैसे किया जाए। गुलाबी 1 जीन पीटीईएन-प्रेरित ख्यात किनेज 1 को एन्कोडिंग के लिए जिम्मेदार है, एक प्रक्रिया के माध्यम से माइटोफैगी के रूप में मान्यता प्राप्त है, जो माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क से बेकार माइटोकॉन्ड्रिया को हटाने के लिए महत्वपूर्ण है। इस जीन में उत्परिवर्तन पीडी के एक ऑटोसोमल रिसेसिव प्रारंभिक-शुरुआत पारिवारिक रूप से जुड़े हुए हैं। इस मॉडल का उपयोग पीडी के पैथोफिज़ियोलॉजी में शामिल माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।

Introduction

माइटोकॉन्ड्रिया सेलुलर ऑर्गेनेल हैं जो महत्वपूर्ण कार्यों को नियंत्रित करते हैं, जिसमें एपोप्टोटिक विनियमन, कैल्शियम होमियोस्टेसिस और बायोसिंथेटिक मार्गों में भागीदारी शामिल है। स्वायत्त आनुवंशिक सामग्री रखने से, वे सेलुलर रखरखाव और मरम्मत प्रक्रियाओं में योगदान करने में सक्षम हैं। उनकी संरचना में इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला और ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण होता है, दोनों सेलुलर ऊर्जा 1,2,3 के लिए महत्वपूर्ण हैं। विशेष रूप से, ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण (ओएक्सएफओएस)2के माध्यम से एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) उत्पादन के माध्यम से ऊर्जा नियंत्रण प्राप्त किया जाता है। माइटोकॉन्ड्रियल कार्यों की हानि के साथ ऊर्जा चयापचय का विघटन सेल अस्तित्व और मृत्यु 4,5 दोनों में होता है, जो अक्सर मानव विकृति की एक विस्तृत श्रृंखला से जुड़ा होता है, जैसे कैंसर, और पार्किंसंस रोग (पीडी)3,6जैसे न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग।

पीडी एक पुरानी, प्रगतिशील और तंत्रिका संबंधी विकार है। इस बीमारी का प्राथमिक कारण मस्तिष्क कोशिकाओं की मृत्यु है, विशेष रूप से पर्याप्त नाइग्रा में, जो न्यूरोट्रांसमीटर डोपामाइन के उत्पादन के लिए जिम्मेदार हैं, जो आंदोलन 6,7,8 को नियंत्रित करता है। पार्किंसनिज़्म को माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन से जोड़ने वाला सबसे पहला अवलोकन 1988 में किया गया था, प्रयोगात्मक मॉडल में विषाक्त पदार्थों का उपयोग करके जो श्वसन श्रृंखला कॉम्प्लेक्स I9 को रोकते हैं।

वर्तमान में, माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन10,11,12,1 3 का मूल्यांकन करने के लिए कई तरीके हैं; हालांकि, पारंपरिक दृष्टिकोण की तुलना में, उच्च संकल्प respirometry (एचआरआर) बेहतर संवेदनशीलता और लाभ13,14 प्रस्तुत करता है. उदाहरण के लिए, एचआरआर प्रोटोकॉल पूरे माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन श्रृंखला समारोह या विशिष्ट माइटोकॉन्ड्रियल परिसरों14,15 की गतिविधि के मूल्यांकन की अनुमति देते हैं। माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन का मूल्यांकन बरकरार कोशिकाओं, पृथक माइटोकॉन्ड्रिया, या यहां तक कि पूर्व विवो10,11,13,14 में किया जा सकता है।

माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन कई रोग और शारीरिक प्रक्रियाओं के साथ निकटता से जुड़े हुए हैं। इसलिए आनुवंशिक और प्रयोगात्मक रूप से ट्रैक्टेबल मॉडल सिस्टम का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल फिजियोलॉजी और बायोएनेरगेटिक्स का अध्ययन करना महत्वपूर्ण है। इस संबंध में, ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर, फल मक्खी पर शोध के कई फायदे हैं। यह मॉडल मनुष्यों के साथ मौलिक सेलुलर विशेषताओं और प्रक्रियाओं को साझा करता है, जिसमें आनुवंशिक सामग्री, सामान्य जीवों के रूप में डीएनए का उपयोग और विकास, प्रतिरक्षा और सेल सिग्नलिंग में शामिल आणविक मार्गों को संरक्षित करना शामिल है। इसके अलावा, फल मक्खियों एक तेजी से जीवन चक्र, आसान रखरखाव, कम लागत, उच्च throughput, और कम नैतिक चिंताओं है, इस प्रकार जटिल सेलुलर प्रक्रियाओं 16,17,18,19,20 विदारक के लिए एक अमूल्य उपकरण का गठन.

इसके अलावा, पीटीईएन-प्रेरित ख्यात किनेज 1 (गुलाबी 1) जीन का एक होमोलॉग डी. मेलानोगास्टर में व्यक्त किया गया है। यह माइटोफैगी8 की प्रक्रिया के माध्यम से क्षतिग्रस्त माइटोकॉन्ड्रिया को हटाने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। मनुष्यों में, इस जीन में उत्परिवर्तन व्यक्तियों को माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन 8,21,22,23से जुड़े पीडी के एक ऑटोसोमल रिसेसिव पारिवारिक रूप में पूर्वनिर्धारित करते हैं। नतीजतन, फल मक्खी पीडी के पैथोफिज़ियोलॉजी पर अध्ययन और माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन और बायोएनेरगेटिक्स पर ध्यान केंद्रित करने वाले दवा उम्मीदवारों की स्क्रीनिंग के लिए एक शक्तिशाली पशु मॉडल है। इसलिए, वर्तमान कार्य बताता है कि सब्सट्रेट-अनकपलर-इनहिबिटर-टाइट्रेशन (एसयूआईटी) प्रोटोकॉल के साथ ओरोबोरोस में एचआरआर तकनीक का उपयोग करके डी मेलानोगास्टर से पीडी के एक मॉडल में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का विश्लेषण कैसे किया जाए।

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Protocol

हमने ब्लूमिंगटन ड्रोसोफिला स्टॉक सेंटर (आईडी नंबर: 34749) से w1118 (सफेद) और w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 (Pink1B9 के रूप में संदर्भित) (फ्लाईबेस आईडी: FBgn0029891) उपभेदों का उपयोग किया। इस अध्ययन में, पुरुष डी. मेलानोगास्टर PINK1B9-नल म्यूटेंट की तुलना w1118 तनाव से पुरुष D. मेलानोगास्टर से की जाती है, जिसका उपयोग नियंत्रण समूह (आनुवंशिक पृष्ठभूमि) के रूप में किया जाता है। अन्य मापदंडों respirometry प्रयोगों के साथ सहवर्ती विश्लेषण किया जाना चाहिए सुनिश्चित करने के लिए कि मक्खियों सही जीनोटाइप (गुलाबी 1बी 9 / वाई), छाती विकृति और हरकत समस्याओं, जो अच्छी तरह से गुलाबी 1बी 9 उत्परिवर्ती मक्खियों 24,25,26 के लिए वर्णित हैं के रूप में.

1. पशु और आवास

  1. मक्खियों को मानक आहार (खमीर 1.73%, सोया आटा 0.9%, मकई का आटा 7.3%, अगर 0.5%, कॉर्न सिरप 7.6%, और प्रोपियोनिक एसिड 0.48%) के 10 एमएल युक्त कांच की बोतलों में रखें निरंतर तापमान और आर्द्रता (25 डिग्री सेल्सियस और 60%, क्रमशः), 12 एच के साथ: 12 घंटे प्रकाश / अंधेरे चक्र के साथ।
  2. प्रत्येक प्रयोग के लिए, संलग्नक के बाद 1-3 दिनों की आयु वर्ग के दो मक्खियों का उपयोग करें.
    नोट: PINK1B9-अशक्त उत्परिवर्ती कुंवारी महिला मक्खियों को जीनोटाइप Pink1B1/Y के साथ F1 पुरुषों को प्राप्त करने के लिए w1118 पुरुषों के साथ पार किया गया था।

2. नमूना तैयार करना

  1. तालिका 1 में वर्णित के रूप में MiR05 बफर तैयार करें.
  2. बर्फ पर मक्खियों को एनेस्थेटाइज करें और उन्हें माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों (प्रति ट्यूब दो मक्खियों) में स्थानांतरित करें।
  3. प्रत्येक ट्यूब में, ठंडा MiR05 बफर के 200 माइक्रोन जोड़ें और मक्खियों समरूप करें। मैन्युअल रूप से समरूप करें, माइटोकॉन्ड्रिया के विघटन को रोकने के लिए कोमल दबाव (मूसल के लगभग 4-6 स्ट्रोक) लागू करें।

3. पोलेरोग्राफिक ऑक्सीजन सेंसर के उच्च-रिज़ॉल्यूशन रेस्पिरोमेट्री अंशांकन

नोट: OROBOROS कक्षों में लगभग 2 एमएल की कुल मात्रा होती है। परख शुरू करने के लिए ऑक्सीजन प्रवाह 0 pmol के करीब है सुनिश्चित करने के लिए अंशांकन की आवश्यकता है.

  1. अंशांकन शुरू, कक्ष में MiR05 के 2 एमएल जोड़ें. डाट के साथ कक्ष को कवर करें और कोई हवाई बुलबुले न छोड़ें; फिर, एक एकल हवाई बुलबुला बनाने के लिए डाट को ध्यान से खींचें।
  2. OROBOROS Dat.Lab सॉफ़्टवेयर खोलें। ब्लॉक तापमान क्षेत्र में 25 डिग्री सेल्सियस का तापमान दर्ज करें और ऑक्सीग्राफ-2k (चित्रा 1 ए) से कनेक्ट पर क्लिक करें।
  3. क्लिक करें और उस फ़ोल्डर का चयन करें जहां अंशांकन को सहेजना है और सहेजें पर क्लिक करें।
  4. जब एक नई विंडो खुलती है, प्रयोग और नमूने नाम (यदि कैलिब्रेट कर रहे हैं, तो बस नाम अंशांकन दर्ज करें) और सहेजें पर क्लिक करें।
  5. लेआउट मेनू पर जाएं और पहला विकल्प चुनें: 01 अंशांकन व्यय Gr.3 - चित्र 1B में दिखाए अनुसार तापमान।
  6. अंशांकन लेआउट पर पुनर्निर्देशित करने के लिए प्रोग्राम की प्रतीक्षा करें, तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि लाल रेखा 0 pmol के आसपास बिंदुओं के साथ एक मानक सीधी रेखा न दिखाए। फिर, दो बिंदुओं का चयन करें: कक्ष ए के लिए एक और कक्ष बी (चित्रा 1 सी) के लिए दूसरा जब लाल रेखा बिल्कुल शून्य पर है।
    नोट: चयनित बिंदुओं में 0 के आसपास ऑक्सीजन फ्लक्स (लाल रेखा) होना चाहिए।
    1. दोनों कक्षों के बिंदुओं को चिह्नित करने के लिए, स्क्रीन के दाईं ओर O2 एकाग्रता का चयन करें, चिह्नित बिंदु का चयन करें, और बिंदु के सापेक्ष तापमान और बैरोमीटर के दबाव मूल्यों दोनों की प्रतिलिपि बनाएँ। नीचे दिए गए बक्से में इन मूल्यों पेस्ट और स्क्रीन के निचले दाएं कोने में क्लिपबोर्ड पर क्लिक करें के रूप में चित्र 2 में दिखाया गया है.
    2. दोनों कक्षों (ए और बी) के लिए इस प्रक्रिया को पूरा करें, फिर फ़ाइल मेनू पर जाएं और सहेजें और डिस्कनेक्ट करें चुनें।
      नोट: अंशांकन प्रक्रिया के बाद, प्रोग्राम उपयोगकर्ता को होम स्क्रीन पर पुनर्निर्देशित करेगा ताकि सॉफ्टवेयर एचआरआर परीक्षण शुरू करने के लिए तैयार हो जाए। इस परीक्षण के लिए, हम सूट प्रोटोकॉल का उपयोग करेंगे।

4. सूट प्रोटोकॉल

  1. अंशांकन पूरा होने के साथ, स्टॉपर्स को हटा दें और कक्षों को खोलें।
  2. स्टॉपर्स (टिप पकड़े हुए जो नमूना को नहीं छूता है) और उस क्रम में 100% इथेनॉल, 70% इथेनॉल और आसुत जल के साथ कक्षों को धो लें।
    नोट: हर नमूना परिवर्तन के लिए प्रक्रिया को दोहराएं।
  3. बफर के 200 माइक्रोन में मक्खियों को समरूप बनाएं, एक माइक्रोपिपेट का उपयोग करके कक्ष में सभी नमूना सामग्री रखें, और चैम्बर में डाट को स्थानांतरित करें, हवा के बुलबुले न बनाने का ख्याल रखें।
    नोट: यदि हवाई बुलबुले बनते हैं, तो डाट को धीरे से हटा दें और MIR05 बफर के 100 माइक्रोन जोड़ें।
  4. लेआउट मेनू पर क्लिक करें और विकल्प का चयन करें 05 सही वॉल्यूम द्वारा प्रवाह जैसा कि चित्र 1B में दिखाया गया है।
  5. एक नई विंडो पर पुनर्निर्देशित होने की प्रतीक्षा करें। उस फ़ोल्डर का चयन करने के लिए सहेजें पर क्लिक करें जहां प्रयोग को सहेजा जाना है।
  6. एक और नई विंडो खुलने की प्रतीक्षा करें। अंतरिक्ष प्रायोगिक कोड में प्रयोग का नाम बताइए। फिर, नमूना क्षेत्र में अपने संबंधित कक्ष ए और बी में प्रत्येक नमूने का नाम, और इकाई के लिए क्षेत्र इकाई सेट.
    नोट: अन्य इकाइयों को भी चुना जा सकता है, उदाहरण के लिए, लाखों कोशिकाएं या मिलीग्राम।
  7. यह देखते हुए कि यह प्रोटोकॉल दो मक्खियों (2 इकाइयों) का उपयोग करता है और चैम्बर की मात्रा 2 एमएल है, एकाग्रता क्षेत्र में, 1 प्रति एमएल (चित्रा 1डी)को परिभाषित करें।
    नोट: यहाँ, नमूना राशि मक्खियों की संख्या से सामान्यीकृत किया गया था; हालांकि, यह सामान्यीकरण नमूने की प्रोटीन सामग्री, माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए परिमाणीकरण, या साइट्रेट सिंथेज़ की गतिविधि द्वारा किया जा सकता है।
  8. जब ऑक्सीजन फ्लक्स सिग्नल (लाल रेखा) सकारात्मक मूल्य पर स्थिर होता है, तो एचआरआर प्रोटोकॉल को सब्सट्रेट, इनहिबिटर और अनकपलर (चित्रा 3) के अनुमापन के साथ शुरू करें। बाद के सभी अभिकर्मकों और उपकरणों को तालिका 1में दिखाया गया है।
    1. माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली को पारगम्य बनाने के लिए डिजिटोनिन (5 माइक्रोग्राम / एमएल) जोड़ें।
    2. पाइरूवेट (5 मिमी), मैलेट (2 मिमी), और प्रोलाइन (10 मिमी) सब्सट्रेट जोड़ें और ऑक्सीजन प्रवाह बढ़ने और स्थिर होने तक प्रतीक्षा करें। प्रत्येक अभिकर्मक जोड़ के लिए घटना को चिह्नित करने के लिए, कुंजीपटल पर F4 कुंजी दबाएँ और प्रत्येक अभिकर्मक का नाम दर्ज करें.
    3. माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन श्रृंखला को जोड़ने के लिए एडीपी (5 एमएम) जोड़ें और ऑक्सीजन प्रवाह की वृद्धि और स्थिरीकरण की प्रतीक्षा करें।
    4. सक्सिनेट (10 मिमी) जोड़ें और ऑक्सीजन प्रवाह की वृद्धि और स्थिरीकरण की प्रतीक्षा करें।
    5. एटीपी सिंथेज़ को बाधित करने के लिए ओलिगोमाइसिन (2.5 माइक्रोन) जोड़ें और ऑक्सीजन प्रवाह में कमी की तलाश करें।
    6. तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि लाल रेखा स्थिर न हो जाए और कार्बोनिल-4- (ट्राइफ्लोरोमेथॉक्सी) फेनिलहाइड्राज़ोन साइनाइड (FCCP) का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण को 0.25 माइक्रोन के टाइटर्स के साथ अनकपल न कर लें, जब तक कि अधिकतम ऑक्सीजन की खपत तक नहीं पहुंच जाता, लाल रेखा के उदय से प्रदर्शित होता है। ऑक्सीजन प्रवाह के स्थिरीकरण के बाद, प्रत्येक परिसर के अवरोधकों को जोड़ना शुरू करें, एक समय में एक।
    7. रोटेनोन (0.5 माइक्रोन), एक जटिल I अवरोधक जोड़ें। अगले अवरोधक को जोड़ने के लिए ऑक्सीजन प्रवाह की कमी और स्थिरीकरण की प्रतीक्षा करें।
    8. Malonate (5 मिमी), एक जटिल द्वितीय अवरोध करनेवाला जोड़ें. अगले अवरोधक को जोड़ने के लिए ऑक्सीजन प्रवाह की कमी और स्थिरीकरण की प्रतीक्षा करें।
    9. अंत में, एंटीमाइसिन (2.5 माइक्रोन), एक जटिल III अवरोधक जोड़ें। ऑक्सीजन प्रवाह की वृद्धि और स्थिरीकरण के बाद कमी की प्रतीक्षा करें।
      नोट: ऑक्सीजन प्रवाह को सकारात्मक मूल्य पर स्थिर होना चाहिए लेकिन माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन परिसरों के अंतिम निषेध के लिए मूल्य से नीचे होना चाहिए।
  9. विश्लेषण के अंत में, एक micropipette का उपयोग कक्षों के सभी सामग्री को हटा दें. भविष्य के विश्लेषण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, जब आवश्यक हो।

5. डेटा विश्लेषण

  1. डेटा विश्लेषण के लिए एक उपयुक्त सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर पैकेज का उपयोग करें।
  2. दो समूहों के बीच अंतर का आकलन करने के लिए टी-परीक्षण करें। कई उपचारों से जुड़ी स्थितियों के लिए, एक सांख्यिकीय परीक्षण 27 के रूप में विचरण (एनोवा) का विश्लेषण करें।
  3. सॉफ्टवेयर द्वारा उत्पन्न ग्राफ से ओ2 फ्लक्स मान निकालें। OXPHOS CI ADP जोड़ने के बाद O2 फ्लक्स के मान को संदर्भित करता है। OXPHOS CII को OXPHOS CI&CII - OXPHOS CI घटाकर प्राप्त किया जाता है। OXPHOS CI&CII SUCCINATE के अतिरिक्त के बाद निकाले गए O2 प्रवाह का मान है। ETS CI&CII FCCP जोड़ने के बाद O2 फ्लक्स मान है। ईटीएस सीआई = एफसीसीपी - रोटेनोन और ईटीएस सीआईआई = रोटेनोन - मैलोनेट।
  4. एटीपी संश्लेषण की गणना ऑक्सफॉस (पी) और रिसाव (एल) (पी - एल)28के बीच अंतर के रूप में करें।
  5. OXPHOS/LEAK के अनुपात की गणना करके श्वसन नियंत्रण अनुपात (RCR) ज्ञात कीजिये, जहाँ RCR = P/L.11

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Representative Results

यहां, हम ऑक्सफॉस सीआई (पी = 0.0341) और ऑक्सफॉस सीआई एंड II (पी = 0.0392) राज्यों में ओ2 प्रवाह को नियंत्रण मक्खियों (चित्रा 4)की तुलना में गुलाबी 1बी 9 शून्य मक्खियों में कम किया जाता है। यह परिणाम हमारे समूह29,30 के पिछले निष्कर्षों में भी देखा गया था।

CI और CII इलेक्ट्रॉन परिवहन प्रणाली (ETS) के प्रमुख घटक हैं, जिसमें CI NADH से ubiquinone तक इलेक्ट्रॉनों के हस्तांतरण के लिए जिम्मेदार है, जबकि CII इलेक्ट्रॉनों को succinate से ubiquinone 31,32,33 में स्थानांतरित करता है। गुलाबी 1बी 9 शून्य मक्खियों ने ईटीएस सीआई (पी = 0.0338), ईटीएस सीआईआई (पी = 0.0457), और ईटीएस सीआई और द्वितीय (पी = 0.0247) राज्यों (चित्रा 5) में कम ओ2 प्रवाह दिखाया।इन परिणामों से संकेत मिलता है कि इलेक्ट्रॉन स्थानांतरण प्रणाली गुलाबी 1 जीन की कमी वाली मक्खियों में बिगड़ा हुआ है और ओएक्सएफओएस और ईटीएस दोनों चरणों में ओ2 प्रवाह सीआई और सीआई और सीआई और सीआईआई पर निर्भर हैं, जो गुलाबी 1-/- मॉडल 33,34,35 में कम सीआई गतिविधि का प्रदर्शन करने वाले अन्य कार्यों के अनुरूप है।

इसके अलावा, एटीपी28 के संश्लेषण के लिए माइटोकॉन्ड्रियल आंतरिक झिल्ली में प्रोटॉन ढाल आवश्यक है। ETS CI और ETS CII में O2 प्रवाह में कमी ETS के अनुदिश इलेक्ट्रॉनों के प्रवाह में व्यवधान को इंगित करती है। इलेक्ट्रॉनों के प्रवाह में यह व्यवधान OXPHOS प्रक्रिया को प्रभावित करता है जिससे ATP संश्लेषण कम हो जाता है। नियंत्रण मक्खियों(चित्रा 6बी)की तुलना में पिंक1बी9 शून्य मक्खियों में एटीपी संश्लेषण (पी = 0.0280) से संबंधित ओ2 खपत में भी उल्लेखनीय कमी आई थी। मेलानोगास्टर में एटीपी संश्लेषण में कमी ऊर्जा चयापचय, सेलुलर प्रक्रियाओं और समग्र शारीरिक कार्यों पर महत्वपूर्ण प्रभाव डाल सकती है। इसके अलावा, OXPHOS प्रक्रिया की दक्षता को RCR नामक एक सूचकांक द्वारा निर्धारित किया जा सकता है, जो श्वसन और फॉस्फोराइलेशन के बीच युग्मन की जकड़न को दर्शाता है। इसलिए, आरसीआर कमी (पी = 0.0432) माइटोकॉन्ड्रियल अनकपलिंग को इंगित करता है, जो ओएक्सएफओएस प्रक्रिया को प्रभावित कर सकता है जो सुझाव देता है कि माइटोकॉन्ड्रिया ऑक्सीजन का उपयोग करने और एटीपी (चित्रा 6सी)का उत्पादन करने में कम कुशल हैं।ये परिणाम फल मक्खी के विकास, विकास, गति, प्रजनन और समग्र स्वास्थ्य को प्रभावित कर सकते हैं और पीडी 8,28,29,32 सहित कुछ न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के रोगजनन में योगदान कर सकते हैं।

Figure 1
चित्र 1: OROBOROS Dat.Lab सॉफ़्टवेयर में लेआउट। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: OROBOROS Dat.Lab सॉफ्टवेयर में कक्षों के अंशांकन के चरण। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: सूट प्रोटोकॉल सब्सट्रेट और अवरोधक जोड़ के मुख्य बिंदुओं का प्रदर्शन। सबसे पहले, डिजिटोनिन (डीआईजी) को जटिल I विशिष्ट सब्सट्रेट के बाद जोड़ा जाता है: मैलेट, पाइरूवेट, और प्रोलाइन (एमपीपी), एटीपी सिंथेज़ सब्सट्रेट (ADP), और फिर, कॉम्प्लेक्स II के लिए सब्सट्रेट: सक्सिनेट (एस)। इसके बाद, एटीपी सिंथेज़ अवरोधक: ओलिगोमाइसिन (ओएमवाई) जोड़ा जाता है, इसके बाद अनकपलर कार्बोनिल-4- (ट्राइफ्लोरोमेथॉक्सी) फेनिलहाइड्राज़ोन साइनाइड (एफ), और जटिल I, II, और III अवरोधक: रोटोनोन (आर), मैलोनेट (एमएनए ), और एंटीमाइसिन (एएमए)36। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: डब्ल्यू1118 और गुलाबी 1बी 9 मक्खियों की तुलना में उच्च-रिज़ॉल्यूशन रेस्पिरोमेट्री। (ए) ऑक्सफॉस सीआई, (बी) ऑक्सफॉस सीआईआई, और (सी) ऑक्सफोस सीआई और सीआईआई। डेटा एसईएम ± मतलब के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं और टी परीक्षण का उपयोग कर विश्लेषण किया. एन = 5-9। पी < 0.05। संक्षिप्ताक्षर: OXPHOS = ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण; CI = जटिल I; CII = जटिल II. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: डब्ल्यू1118 और गुलाबी 1बी 9 मक्खियों की तुलना में उच्च-रिज़ॉल्यूशन रेस्पिरोमेट्री। (ए) ईटीएस सीआई, (बी) ईटीएस सीआईआई, और (सी) ईटीएस सीआई और सीआईआई। डेटा एसईएम ± मतलब के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं और टी परीक्षण द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं. एन = 5-9। पी < 0.05। संक्षिप्ताक्षर: ETS = इलेक्ट्रॉन परिवहन प्रणाली; CI = जटिल I; CII = जटिल II. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: डब्ल्यू1118 और गुलाबी 1बी 9 मक्खियों की तुलना में उच्च-रिज़ॉल्यूशन रेस्पिरोमेट्री। (ए) रिसाव, (बी) एटीपी संश्लेषण, और (सी) श्वसन नियंत्रण अनुपात। डेटा एसईएम ± मतलब के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं और टी परीक्षण द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं. एन = 5-9। पी < 0.05। संक्षिप्त: RCR = श्वसन नियंत्रण अनुपात। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

एचआरआर माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन और ऊर्जा चयापचय का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है डी. मेलानोगास्टर और अन्य जीव। यह माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का एक विस्तृत और मात्रात्मक मूल्यांकन प्रदान करता है, जिससे शोधकर्ताओं को कोशिकाओं के बायोएनेरगेटिक्स में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने की अनुमति मिलती है। यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन श्रृंखला समारोह के मूल्यांकन और डी मेलानोगास्टर में सूट प्रोटोकॉल का उपयोग कर विशिष्ट mitochondrial परिसरों की गतिविधि का वर्णन करता है. सूट प्रोटोकॉल में माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन के विभिन्न पहलुओं की जांच करने के लिए विभिन्न सब्सट्रेट, अनकपलर और अवरोधकों में व्यवस्थित रूप से हेरफेर करना शामिल है।

वर्णित तकनीक OXPHOS या ETS, डिहाइड्रोजनेज गतिविधि (CI और CII), और झिल्ली अखंडता (OXPHOS के युग्मन) पर प्रभाव के परिणामस्वरूप श्वसन अवरोध के आकलन की अनुमति देती है। यहां, हमने माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन का अध्ययन करने के लिए पिंक 1बी 9-नल मक्खियों का उपयोग करके प्रयोगों का प्रदर्शन किया क्योंकि यह पीडी34,35 से जुड़ा हुआ है। हालांकि, यह प्रोटोकॉल विभिन्न रोग मॉडल, दवा उपचार और विष विज्ञान अध्ययन के लिए उपयोगी हो सकता है।

इसके अलावा, नमूना तैयार प्रयोगात्मक आवश्यकताओं36 फिट करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. रेस्पिरोमेट्री प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम नमूना तैयार करना है। यह महत्वपूर्ण है कि नमूना (सेल, पृथक माइटोकॉन्ड्रिया, समरूप) के प्रकार के लिए सही प्रोटोकॉल स्थापित किया जाए, और नमूना सामान्यीकरण (प्रोटीन राशि, डीएनए सामग्री, साइट्रेट सिंथेज़ गतिविधि) के लिए उपयुक्त विधि पर विचार करना महत्वपूर्ण है। नमूना तैयार करने और रेस्पिरोमेट्री परख के लिए एक ही बफर का उपयोग करना भी महत्वपूर्ण है।

जैसा कि यहां वर्णित नमूना तैयारी प्रोटोकॉल सरल है, यह आमतौर पर तकनीक के लिए समस्याएं पैदा नहीं करता है। यदि किसी अन्य प्रकार का नमूना चुना जाता है या इसकी तैयारी बदल जाती है, तो सावधानीपूर्वक मानकीकरण आवश्यक है। सरगर्मी और तापमान स्थिरता पोलोग्राफिक ऑक्सीजन सेंसर के संकेत को प्रभावित करती है, एक ऑक्सीग्राफ का उपयोग करके श्वसन माप में त्रुटि उत्पन्न करती है। इसलिए, कक्ष का सही अंशांकन श्वसन माप के दौरान त्रुटियों को कम करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है।

मक्खी के नमूनों में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का आकलन करने के लिए यह विधि वैकल्पिक दृष्टिकोणों पर कई फायदे प्रदान करती है। एचआरआर की मुख्य शक्तियों में से एक ऑक्सीजन की खपत के प्रत्यक्ष और सटीक माप प्रदान करने की क्षमता है, जो माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन और सेलुलर चयापचय के विस्तृत विश्लेषण की अनुमति देता है। इसलिए, एचआरआर का उपयोग अक्सर माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन, ऊर्जा उत्पादन और विभिन्न सब्सट्रेट या स्थितियों के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं को समझने पर केंद्रित अनुसंधान में किया जाता है। इसके अलावा, यह बहुमुखी है - पृथक माइटोकॉन्ड्रिया सहित विभिन्न प्रकार के नमूना प्रकारों के उपयोग की अनुमति देता है - और जैविक नमूनों की थोड़ी मात्रा की आवश्यकता होती है, जो नमूना राशि 1,2,3 तक सीमित होने पर उपयोगी होती है। उदाहरण के लिए, माइटोकॉन्ड्रियल आइसोलेट्स का उपयोग करने वाले तरीकों में आमतौर पर 50 से 200 व्यक्तियों तक पर्याप्त संख्या में मक्खियों को शामिल किया जाता है, जो म्यूटेंट के साथ अध्ययन को मुश्किल बनाता है, क्योंकि कुछ रोग मॉडल के लिए बड़ी संख्या में म्यूटेंट प्राप्त करना व्यावहारिक नहीं हो सकता है।

एचआरआर विधि के समान, सीहोर बायोसाइंस एक्स्ट्रासेलुलर फ्लक्स एनालाइजर एक वैज्ञानिक उपकरण है जिसका उपयोग ऑक्सीजन की खपत और बाह्य अम्लीकरण को मापने के लिए किया जाता है। हालांकि, उनके पास अलग-अलग दृष्टिकोण और अनुप्रयोग हैं। सीहोर बायोसाइंस एक्स्ट्रासेल्युलर फ्लक्स एनालाइजर कोशिकाओं की ऑक्सीजन खपत दर (ओसीआर) और बाह्य अम्लीकरण दर (ईसीएआर) में तात्कालिक परिवर्तन की मात्रा निर्धारित करता है। ओसीआर माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन और ऊर्जा उत्पादन का संकेत है, जबकि ईसीएआर ग्लाइकोलाइटिक गतिविधि में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। इसका मुख्य कार्य विविध शारीरिक स्थितियों के तहत सेलुलर चयापचय गतिशीलता के आकलन में निहित है, जो इसे रोग संबंधी संदर्भों से जुड़े जटिल चयापचय मॉड्यूलेशन को स्पष्ट करने में विशेष रूप से सहायक है। इसके अलावा, Seahorse उपयोग में आसानी के लिए डिज़ाइन किया गया है, जिससे शोधकर्ताओं को तेजी से चयापचय परख37,38,39 करने की अनुमति मिलती है। इसके विपरीत, एचआरआर को डेटा को प्रभावी ढंग से संचालित और विश्लेषण करने के लिए विशेष प्रशिक्षण और विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है। इसमें कोशिकाओं या माइटोकॉन्ड्रिया 13,14,40द्वारा ऑक्सीजन की खपत को सीधे मापने के लिए ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड का उपयोग शामिल है। एचआरआर का एक फायदा विभिन्न रेस्पिरोमेट्री प्रोटोकॉल को डिजाइन करने में इसकी बहुमुखी प्रतिभा है, जो सीहोर का उपयोग करते समय अव्यवहारिक है। कम लागत से जुड़े प्रोटोकॉल डिजाइन करने की यह बहुमुखी प्रतिभा एचआरआर विधि को सीमित धन वाली प्रयोगशालाओं के लिए एक व्यवहार्य विकल्प बनाती है। वर्तमान प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले रेस्पिरोमेट्री सिस्टम का एक और नुकसान एक साथ कई नमूनों के साथ काम करने की असंभवता है, जो उच्च-थ्रूपुट विश्लेषण को बाधित करता है। इस प्रकार, प्रयोगात्मक समूहों को उनके बीच सही तुलना की अनुमति देने के लिए अच्छी तरह से डिज़ाइन किया जाना चाहिए। हालांकि, इस प्रणाली के फायदे इस तथ्य में निहित हैं कि किसी भी प्रकार के नमूनों का परीक्षण किया जा सकता है, पृथक कोशिकाओं से लेकर पूरे जीवित जीवों तक, जैसे सी. एलिगेंस, उदाहरण के लिए40.

सारांश में, एचआरआर शारीरिक और रोग स्थितियों41 के तहत माइटोकॉन्ड्रियल समारोह का अध्ययन करने के लिए एक विश्वसनीय तरीका है. प्रत्येक प्रयोगात्मक मॉडल में अलग-अलग विशेषताओं और प्रतिबंध होते हैं, जिसमें माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन मूल्यांकन में विश्वसनीय और सार्थक डेटा अधिग्रहण सुनिश्चित करने के लिए कार्यप्रणाली और नमूना तैयारी समायोजन की आवश्यकता होती है। यह प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को पर्यावरणीय कारकों, प्रयोगात्मक हस्तक्षेपों या माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन पर आनुवंशिक उत्परिवर्तन के प्रभावों का आकलन करने के लिए एक विश्वसनीय तरीका प्रदान करता है डी. मेलानोगास्टर.

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

लेखक ब्राजील की एजेंसी Coordenação de Aperfeiçoamento de Pesquisa Pessoal de Nível Superior (CAPES EPIDEMIAS 09 #88887.505377/2020) को स्वीकार करते हैं। P.M. (#88887.512821/2020-00) और TD (#88887.512883/2020-00) रिसर्च फेलोशिप प्राप्तकर्ता हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ADP Sigma-Aldrich A5285 Adenosine 5′-diphosphate sodium sal (CAS number 72696-48-1); ≥95%; molecular weight = 501.31 g/mol.
Ágar Kasv K25-1800 For bacteriologal use
Antimycin-A Sigma-Aldrich A8674 Antimycin A from Streptomyces sp. (CAS number 1397-94-0); molecular weight  540 g/mol;
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A7030 Bovine Serum Albumin (CAS number 9048-46-8); pH 7,0 ≥ 98%
Datlab software Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria 20700 Software for data acquisition and analysis
Digitonin Sigma-Aldrich D 5628 CAS number 11024-24-1
Distilled water
Drosophila melanogaster strain w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 Obtained from Bloomington Drosophila stock center
Drosophila melanogaster strain w1118 Obtained  from the Federal University of Santa Maria
EGTA Sigma-Aldrich E8145 Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (CAS number 13638-13-3); ≥97%; molecular weight =468.28 g/mol
FCCP Sigma-Aldrich C2920 Carbonyl cyanide 4- (trifluoromethoxy)phenylhydrazone  (CAS number 370-86-5); ≥98% (TLC), powder 
GraphPad Prism version 8.0.1. Software for data acquisition and analysis
Hepes Sigma-Aldrich H4034 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (CAS number 7365-45-9); ≥99,5% (titration), cell cultured tested; molecular weight = 238.30 g/mol
High-resolution respirometer Oxygraph O2K Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria 10022-02 Startup O2K respirometer kit
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5379 Monopotassium phosphate (CAS number 7778-77-0); Reagente Plus, molecular weigt = 136.09 g/mol
KOH Sigma-Aldrich 211473 Potassium hydroxide (CAS number 1310-58-3); ACS reagent, ≥85%, pellets
Malate Sigma-Aldrich M1296 Malonic acid (CAS number 141-82-2); 99%, molecular weight = 104.06 g/mol). A solution is pH adjusted to approximately 7.0.
Malic acid Sigma-Aldrich M1000 (S)-(−)-2-Hydroxysuccinic acid (CAS number 97-67-6); ≥95% ; molecular weight = 134.09 g/mol
MES Sigma-Aldrich M3671 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (CAS number 4432-31-9); ≥99% (titration); molecular weight = 195.24 g/mol
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266 Magnesium chloride (CAS number 7786-30-3); anhydrous, ≥98%, molecular weight = 95.21 g/mol
Microcentrifuge tubes Eppendorf
O2K-Titration Set Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria 20820-03 Hamilton syringes with different volumes
Oligomycin Sigma-Aldrich O 4876 Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes (CAS number  1404-19-9); ≥90% total oligomycins basis (HPLC)
Pistil to homogenization
Proline Sigma-Aldrich P0380 L-Proline (CAS number 147-85-3); powder; 99%; molecular weight = 115.13 g/mol
Pyruvate Sigma-Aldrich P2256 Sodium pyruvate (CAS number 113-24-6), ≥99%; molecular weight = 110.04 g/mol
Rotenone Sigma-Aldrich R8875 Rotetone (CAS number 83-79-4); ≥95%, molecular weight 394.42 g/ mol
Succinate Sigma-Aldrich S 2378 Sodium succinate dibasic hexahydrate (CAS number 6106-21-4); ≥99%
Sucrose Merck 107,651,000 Sucrose for microbiology use (CAS number 57-50-1)
Taurine Sigma-Aldrich T0625 CAS number 107-35-7

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References

  1. Brand, M. D., Orr, A. L., Perevoshchikova, I. V., Quinlan, C. L. The role mitochondrial function and cellular bioenergetics in ageing and disease. Br J Dermatol. 169, 1-8 (2013).
  2. Ramaccini, D., et al. Mitochondrial function and dysfunction in dilated cardiomyopathy. Front Cell Dev Biol. 8, 624216 (2021).
  3. Zhunina, O. A., et al. The role of mitochondrial dysfunction in vascular disease, tumorigenesis, and diabetes. Front Mol Biosci. 8, 671908 (2021).
  4. Prasun, P. Mitochondrial dysfunction in metabolic syndrome. Biochim Biophys Acta. 1866 (10), 165838 (2020).
  5. Bhatti, J. S., Bhatti, G. K., Reddy, P. H. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in metabolic disorders - A Step towards mitochondria based therapeutic strategies. Biochim Biophys Acta. 1863 (5), 1066-1077 (2017).
  6. Perier, C., Vila, M. Mitochondrial biology and Parkinson's disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (2), 009332 (2012).
  7. DeMaagd, G., Philip, A. Parkinson's disease and its management. Pharmacy and Therapeutics. 40 (8), 504-532 (2015).
  8. Miyazaki, N., et al. PINK1-dependent and Parkin-independent mitophagy is involved in reprogramming of glycometabolism in pancreatic cancer cells. Biochem Biophys Res Commun. 625, 167-173 (2022).
  9. Kopin, I. J., Markey, S. P. MPTP toxicity: implications for research in Parkinson's disease. Annual Review of Neuroscience. 11, 81-96 (1988).
  10. Connolly, N. M. C., et al. Guidelines on experimental methods to assess mitochondrial dysfunction in cellular models of neurodegenerative diseases. Cell Death Differ. 25 (3), 542-572 (2018).
  11. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem J. 435, 297-312 (2011).
  12. Haynes, C. M., Fiorese, C. J., Lin, Y. -F. Evaluating and responding to mitochondrial dysfunction: The UPRmt and beyond. Trends Cell Mol Biol. 23 (7), 311-318 (2013).
  13. Long, Q., Huang, L., Huang, K., Yang, Q. Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from mouse heart tissues using oroboros 2k-oxygraph. Methods Mol Biol. 1966, Clifton, N.J. 237-246 (2019).
  14. Scheiber, D., et al. High-resolution respirometry in human endomyocardial biopsies shows reduced ventricular oxidative capacity related to heart failure. Exp Mol Med. 51 (2), 1-10 (2019).
  15. Krumschnabel, G., Eigentler, A., Fasching, M., Gnaiger, E. Chapter nine - use of safranin for the assessment of mitochondrial membrane potential by high-resolution respirometry and fluorometry. Methods Enzymol. 542, 163-181 (2014).
  16. Demir, E. The potential use of Drosophila as an in vivo model organism for COVID-19-related research: a review. Turk J Biol. 45 (4), 559-569 (2021).
  17. Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: a primer on the Drosophila model system. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
  18. McBride, S. M. J., Holloway, S. L., Jongens, T. A. Using Drosophila as a tool to identify pharmacological therapies for fragile X syndrome. Drug Discov Today Technol Technologies. 10 (1), e129-e136 (2013).
  19. Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods (San Diego, Calif). 68 (1), 105-115 (2014).
  20. Bar, S., Prasad, M., Datta, R. Neuromuscular degeneration and locomotor deficit in a Drosophila model of mucopolysaccharidosis VII is attenuated by treatment with resveratrol). Dis Model Mech. 11 (11), (2018).
  21. Imai, Y. PINK1-Parkin signaling in Parkinson's disease: Lessons from Drosophila. Neurosci Res. 159, 40-46 (2020).
  22. Julienne, H., Buhl, E., Leslie, D. S., Hodge, J. J. L. Drosophila PINK1 and parkin loss-of-function mutants display a range of non-motor Parkinson's disease phenotypes. Neurobiol Dis. 104, 15-23 (2017).
  23. Biswas, S., Bagchi, A. Analysis of the structural dynamics of the mutations in the kinase domain of PINK1 protein associated with Parkinson's disease. Gene. 857, 147183 (2023).
  24. Koh, H., Chung, J. PINK1 and Parkin to control mitochondria remodeling. Anat Cell Biol. 43 (3), 179-184 (2010).
  25. Zhu, M., Li, X., Tian, X., Wu, C. Mask loss-of-function rescues mitochondrial impairment and muscle degeneration of Drosophila pink1 and parkin mutants. Hum Mol Genet. 24 (11), 3272-3285 (2015).
  26. Park, J., et al. Mitochondrial dysfunction in Drosophila PINK1 mutants is complemented by parkin. Nature. 441 (7097), 1157-1161 (2006).
  27. Dytham, C. Choosing and using statistics: a biologist's guide. , Wiley-Blackwell. Hoboken, NJ. (2011).
  28. Bonora, M., et al. ATP synthesis and storage. Purinergic Signal. 8 (3), 343-357 (2012).
  29. Gonçalves, D. F., et al. Caffeine improves mitochondrial function in PINK1B9-null mutant Drosophila melanogaster. J Bioenerg Biomembr. 55 (1), 1-13 (2023).
  30. Gonçalves, D. F., et al. Mitochondrial function and cellular energy maintenance during aging in a Drosophila melanogaster model of Parkinson disease. Mitochondrion. 65, 166-175 (2022).
  31. Janowska, J. I., et al. Mitochondrial respiratory chain complex I dysfunction induced by N-methyl carbamate ex vivo can be alleviated with a cell-permeable succinate prodrug. Toxicol In Vitro. 65, 104794 (2020).
  32. Ngo, D. T. M., et al. Oxidative modifications of mitochondrial complex II are associated with insulin resistance of visceral fat in obesity. Physiol Endocrinol Metab. 316 (2), E168-E177 (2019).
  33. Stroud, D. A., et al. Accessory subunits are integral for assembly and function of human mitochondrial complex I. Nature. 538 (7623), 123-126 (2016).
  34. Senyilmaz, D., et al. Regulation of mitochondrial morphology and function by stearoylation of TFR1. Nature. 525 (7567), 124-128 (2015).
  35. Poddighe, S., et al. Mucuna pruriens (Velvet bean) rescues motor, olfactory, mitochondrial and synaptic impairment in PINK1B9 Drosophila melanogaster genetic model of Parkinson's disease. PloS One. 9 (10), e110802 (2014).
  36. Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 810, 25-58 (2012).
  37. Winer, L. S. P., Wu, M. Rapid analysis of glycolytic and oxidative substrate flux of cancer cells in a microplate. PloS One. 9 (10), e109916 (2014).
  38. Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio Protoc. 8 (10), e2850 (2018).
  39. Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. Am J Physiol. Cell Physiol. 292 (1), C125-C136 (2007).
  40. Divakaruni, A. S., Jastroch, M. A practical guide for the analysis, standardization and interpretation of oxygen consumption measurements. Nat Metab. 4 (8), 978-994 (2022).
  41. Bingol, B., Sheng, M. Mechanisms of mitophagy: PINK1, Parkin, USP30 and beyond. Free Radic Biol Med. 100, 210-222 (2016).

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जैव रसायन अंक 201 माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन उच्च-रिज़ॉल्यूशन रेस्पिरोमेट्री ऑक्सीजन की खपत दर ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर
<em>ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर</em> PINK1<sup>B9-अशक्त</sup> उत्परिवर्ती में उच्च-रिज़ॉल्यूशन रेस्पिरोमेट्री का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का विश्लेषण करना
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Michelotti, P., Duarte, T., Dalla Corte, C. L. Analyzing Mitochondrial Function in a Drosophila melanogaster PINK1B9-Null Mutant Using High-resolution Respirometry. J. Vis. Exp. (201), e65664, doi:10.3791/65664 (2023).

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