Summary
Her presenterer vi en høyoppløselig respirometriprotokoll for å analysere bioenergetikk i PINK1B9-null mutante bananfluer. Metoden bruker protokollen Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration (SUIT).
Abstract
Neurodegenerative sykdommer, inkludert Parkinsons sykdom (PD), og cellulære forstyrrelser som kreft er noen av de lidelsene som forstyrrer energimetabolismen med svekkelse av mitokondrielle funksjoner. Mitokondrier er organeller som styrer både energimetabolisme og cellulære prosesser involvert i celleoverlevelse og død. Av denne grunn kan tilnærminger til evaluering av mitokondriell funksjon gi viktig innsikt i cellulære forhold i patologiske og fysiologiske prosesser. I denne forbindelse tillater protokoller med høy oppløsning respirometri (HRR) evaluering av hele mitokondriell respiratorisk kjedefunksjon eller aktiviteten til spesifikke mitokondriekomplekser. Videre krever studier av mitokondriell fysiologi og bioenergetikk genetisk og eksperimentelt håndterbare modeller som Drosophila melanogaster.
Denne modellen gir flere fordeler, for eksempel dens likhet med menneskelig fysiologi, dens raske livssyklus, enkelt vedlikehold, kostnadseffektivitet, høy gjennomstrømningskapasitet og et minimert antall etiske bekymringer. Disse egenskapene etablerer det kollektivt som et uvurderlig verktøy for å dissekere komplekse cellulære prosesser. Det foreliggende arbeidet forklarer hvordan man analyserer mitokondriell funksjon ved bruk av Drosophila melanogaster PINK1B9-null mutant. Det rosa1 genet er ansvarlig for koding av PTEN-indusert antatt kinase 1, gjennom en prosess anerkjent som mitofagi, noe som er avgjørende for fjerning av dysfunksjonelle mitokondrier fra mitokondrienettverket. Mutasjoner i dette genet har vært assosiert med en autosomal recessiv familiær form for PD med tidlig debut. Denne modellen kan brukes til å studere mitokondriell dysfunksjon involvert i patofysiologien til PD.
Introduction
Mitokondrier er cellulære organeller som styrer viktige funksjoner, inkludert apoptotisk regulering, kalsiumhomeostase og deltakelse i biosyntetiske veier. Ved å ha autonomt genetisk materiale, er de i stand til å bidra til cellulære vedlikeholds- og reparasjonsprosesser. Deres struktur huser elektrontransportkjeden og oksidativ fosforylering, begge avgjørende for cellulær energi 1,2,3. Spesielt oppnås energikontroll gjennom adenosintrifosfat (ATP) produksjon via oksidativ fosforylering (OXPHOS)2. Forstyrrelse av energimetabolisme med svekkelse av mitokondrielle funksjoner forekommer både i celleoverlevelse og død 4,5, ofte forbundet med et bredt spekter av menneskelige patologier, som kreft, og nevrodegenerative sykdommer som Parkinsons sykdom (PD)3,6.
PD er en kronisk, progressiv og nevrologisk lidelse. Den primære årsaken til denne sykdommen er død av hjerneceller, spesielt i substantia nigra, som er ansvarlige for produksjonen av nevrotransmitteren dopamin, som styrer bevegelse 6,7,8. Den tidligste observasjonen som knyttet parkinsonisme til mitokondriell dysfunksjon ble gjort i 1988, i eksperimentelle modeller ved bruk av toksiner som hemmer respiratorisk kjedekompleks I9.
For tiden er det flere metoder for å evaluere mitokondriell dysfunksjon 10,11,12,1 3; Imidlertid, sammenlignet med konvensjonelle tilnærminger, presenterer høyoppløselig respirometri (HRR) overlegen følsomhet og fordeler13,14. For eksempel tillater HRR-protokoller evaluering av hele mitokondriell respiratorisk kjedefunksjon eller aktiviteten til spesifikke mitokondriekomplekser 14,15. Mitokondrielle dysfunksjoner kan vurderes i intakte celler, isolerte mitokondrier, eller til og med ex vivo 10,11,13,14.
Mitokondrielle dysfunksjoner er nært forbundet med mange patologiske og fysiologiske prosesser. Det er derfor viktig å studere mitokondriefysiologi og bioenergetikk ved hjelp av genetisk og eksperimentelt håndterbare modellsystemer. I denne forbindelse har forskning på Drosophila melanogaster, fruktfluen, flere fordeler. Denne modellen deler grunnleggende cellulære egenskaper og prosesser med mennesker, inkludert bruk av DNA som genetisk materiale, vanlige organeller og konserverte molekylære veier involvert i utvikling, immunitet og cellesignalering. I tillegg har bananfluer en rask livssyklus, enkelt vedlikehold, lave kostnader, høy gjennomstrømning og færre etiske bekymringer, og utgjør dermed et uvurderlig verktøy for å dissekere komplekse cellulære prosesser 16,17,18,19,20.
Videre uttrykkes en homolog av det PTEN-induserte antatte kinase 1 (rosa1)-genet i D. melanogaster. Det spiller en avgjørende rolle i fjerning av skadede mitokondrier gjennom prosessen med mitofagi8. Hos mennesker predisponerer mutasjoner i dette genet individer til en autosomal recessiv familiær form for PD assosiert med mitokondriell dysfunksjon 8,21,22,23. Bananfluen er derfor en kraftig dyremodell for studier av patofysiologien til PD og screening av legemiddelkandidater med fokus på mitokondriell dysfunksjon og bioenergetikk. Derfor forklarer dette arbeidet hvordan man analyserer mitokondriell funksjon i en modell av PD fra D. melanogaster ved hjelp av HRR-teknikken i OROBOROS med SUIT-protokollen (Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vi brukte stammene w1118 (hvit) og w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 (referert til som Pink1B9) (FlyBase ID: FBgn0029891) fra Bloomington Drosophila lagersenter (ID-nummer: 34749). I denne studien sammenlignes mannlige D. melanogaster PINK1B9-null mutanter med mannlige D. melanogaster fra w1118-stammen, som brukes som kontrollgruppe (genetisk bakgrunn). Andre parametere må analyseres samtidig med respirometriforsøkene for å sikre at fluene har riktig genotype (Pink1B9/Y), slik som thoraxdeformiteter og bevegelsesproblemer, som er godt beskrevet for rosa1B9 mutantfluer 24,25,26.
1. Dyr og bolig
- Hold fluene i glassflasker som inneholder 10 ml standard diett (gjær 1,73%, soyamel 0,9%, maismel 7,3%, agar 0,5%, mais sirup 7,6% og propionsyre 0,48%) ved konstant temperatur og fuktighet (henholdsvis 25 ° C og 60%), med en 12 timer: 12 h lys / mørk syklus.
- For hvert eksperiment, bruk to fluer i alderen 1-3 dager etter eclosion.
MERK: PINK1B9-null mutante jomfruhunnfluer ble krysset med w1118 hanner for å oppnå F1-hannene med genotype Pink1B9/Y.
2. Forberedelse av prøve
- Klargjør MiR05-bufferen som beskrevet i tabell 1.
- Bedøv fluene på is og overfør dem til mikrosentrifugerør (to fluer per rør).
- I hvert rør, tilsett 200 μL kjølt MiR05-buffer og homogeniser fluene. Homogeniser manuelt, bruk forsiktig trykk (ca. 4-6 slag av stammen) for å forhindre oppløsning av mitokondrier.
3. Høyoppløselig respirometrikalibrering av polarografiske oksygensensorer
MERK: OROBOROS-kamrene har et totalvolum på ca. 2 ml. Kalibrering er nødvendig for å sikre at oksygenfluksen er nær 0 pmol for å starte analysen.
- Start kalibreringen, legg til 2 ml MiR05 i kammeret. Dekk kammeret med proppen slik at det ikke er luftbobler; Trekk deretter forsiktig i proppen for å danne en enkelt luftboble.
- Åpne OROBOROS Dat.Lab-programvaren. Skriv inn en temperatur på 25 ° C i feltet Blokker temperatur og klikk på Koble til oksygraf-2k (figur 1A).
- Klikk og velg mappen der kalibreringen skal lagres, og klikk på Lagre.
- Når et nytt vindu åpnes, navngi eksperimentet og prøvene (hvis kalibrering, skriv ganske enkelt inn navnskalibreringen) og klikk på Lagre.
- Gå til Layout-menyen og velg det første alternativet: 01 Kalibrering Utg. Gr.3 - Temp som vist i figur 1B.
- Vent til programmet omdirigerer til kalibreringsoppsettet, vent til den røde linjen viser en standard rett linje med punkter rundt 0 pmol. Velg deretter to punkter: ett for kammer A og det andre for kammer B (figur 1C) når den røde linjen er nøyaktig null.
MERK: De valgte punktene må ha oksygenfluks (rød linje) rundt 0.- For å markere punktene til begge kamrene, velg O2-konsentrasjon til høyre på skjermen, velg det merkede punktet og kopier både temperatur - og barometertrykkverdiene i forhold til punktet. Lim inn disse verdiene i boksene nedenfor og klikk på Kalibrer og Kopier til utklippstavlen i nedre høyre hjørne av skjermen som vist i figur 2.
- Utfør denne prosessen for begge kamrene (A og B), gå deretter til Fil-menyen og velg Lagre og koble fra.
MERK: Etter kalibreringsprosessen vil programmet omdirigere brukeren til startskjermen slik at programvaren vil være klar til å starte HRR-testen. For denne testen vil vi bruke SUIT-protokollen.
4. SUIT-protokoll
- Når kalibreringen er fullført, fjerner du proppene og åpner kamrene.
- Vask proppene (hold spissen som ikke berører prøven) og kamrene med 100% etanol, 70% etanol og destillert vann, i den rekkefølgen.
MERK: Gjenta prosessen for hver prøveendring. - Homogeniser fluene i 200 μL buffer, plasser alt prøveinnhold i kammeret ved hjelp av en mikropipette, og flytt proppen i kammeret, pass på at du ikke lager luftbobler.
MERK: Hvis det dannes luftbobler, fjern proppen forsiktig og tilsett 100 μL MIR05-buffer. - Klikk på Layout-menyen og velg alternativet 05 Flow by Corrected Volume som vist i figur 1B.
- Vent på å bli omdirigert til et nytt vindu. Klikk på Lagre for å velge mappen der eksperimentet skal lagres.
- Vent til et nytt vindu åpnes. Navngi eksperimentet i rommet Eksperimentell kode. Deretter navngir du hver prøve i det respektive kammeret A og B i Eksempel-feltet , og setter feltet Enhet til enhet.
MERK: Andre enheter kan også velges, for eksempel millioner av celler eller mg. - Tatt i betraktning at denne protokollen bruker to fluer (2 enheter) og kammervolumet er 2 ml, i konsentrasjonsfeltet , definer 1 per ml (figur 1D).
MERK: Her ble prøvemengden normalisert med antall fluer; Imidlertid kan denne normaliseringen utføres av proteininnholdet i prøven, mitokondriell DNA-kvantifisering eller aktivitet av citratsyntase. - Når oksygenflukssignalet (rød linje) er stabilt på den positive verdien, starter HRR-protokollen med titrering av substrater, hemmere og frakoblere (figur 3). Alle påfølgende reagenser og utstyr er vist i tabell 1.
- Legg digitonin (5 μg / ml) for å permeabilisere mitokondriemembranen.
- Tilsett pyruvat (5 mM), malat (2 mM) og prolin (10 mM) substrater og vent til oksygenstrømmen øker og stabiliserer seg. For å markere hendelsen for hver reagensaddisjon, trykk på F4-tasten på tastaturet og skriv inn navnet på hvert reagens.
- Legg til ADP (5mM) for å koble mitokondriell respiratorisk kjede og vent på økning og stabilisering av oksygenfluksen.
- Tilsett succinat (10 mM) og vent på økning og stabilisering av oksygenfluksen.
- Legg til oligomycin (2,5 μM) for å hemme ATP-syntase og se etter en reduksjon i oksygenfluks.
- Vent til den røde linjen stabiliserer seg og koble fra mitokondriell elektronoverføring ved bruk av karbonyl-4-(trifluormetoksy) fenylhydrazoncyanid (FCCP) med titere på 0,25 μM til maksimalt oksygenforbruk er nådd, demonstrert ved stigningen av den røde linjen. Etter stabilisering av oksygenfluksen, begynn å legge til hemmere av hvert kompleks, en om gangen.
- Legg til rotenon (0,5 μM), en kompleks I-hemmer. Vent på reduksjon og stabilisering av oksygenstrømmen for å legge til neste inhibitor.
- Tilsett malonat (5 mM), en kompleks II-hemmer. Vent på reduksjon og stabilisering av oksygenstrømmen for å legge til neste inhibitor.
- Til slutt legger du til Antimycin (2,5 μM), en kompleks III-hemmer. Vent på nedgangen etterfulgt av økning og stabilisering av oksygenfluksen.
MERK: Oksygenfluksen skal stabilisere seg ved en positiv verdi, men under verdien for den siste hemmingen av mitokondrielle proteinkomplekser.
- På slutten av analysen, fjern alt innholdet i kamrene ved hjelp av en mikropipette. Oppbevares ved -20 °C for fremtidig analyse, om nødvendig.
5. Dataanalyse
- Bruk en passende statistisk programvarepakke for dataanalyse.
- Utfør t-tester for å vurdere forskjeller mellom de to gruppene. For situasjoner med flere behandlinger, bruk variansanalyse (ANOVA) som statistisk test 27.
- Pakk ut O2 fluksverdiene fra grafen generert av programvaren. OXPHOS CI refererer til verdien av O2 flux etter tilsetning av ADP. OXPHOS CII oppnås ved å subtrahere OXPHOS CI&CII - OXPHOS CI. OXPHOS CI&CII er verdien avO2-fluks ekstrahert etter tilsetning av succinat. ETS CI&CII er O2 fluksverdien etter å ha lagt til FCCP. ETS CI = FCCP - Rotenone og ETS CII = Rotenone - Malonate.
- Beregn ATP-syntese som forskjellen mellom OXPHOS (P) og LEKKASJE (L) (P - L) 28.
- Bestem respirasjonskontrollforholdet (RCR) ved å beregne forholdet OXPHOS/LEAK, hvor RCR = P/L.11
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her er vi at O2-fluksen i OXPHOS CI (P = 0,0341) og OXPHOS CI&II (P = 0,0392) tilstander er redusert i PINK1B9 nullfluer sammenlignet med kontrollfluer (figur 4). Dette resultatet ble også observert i tidligere funn fra vår gruppe 29,30.
CI og CII er nøkkelkomponenter i elektrontransportsystemet (ETS), der CI er ansvarlig for overføringen av elektroner fra NADH til ubiquinon, mens CII overfører elektroner fra succinat til ubiquinone 31,32,33. PINK1B9 nullfluer viste lavere O2 fluks i ETS CI (P = 0,0338), ETS CII (P = 0,0457) og ETS CI&II (P = 0,0247) tilstander (figur 5). Disse resultatene indikerer at elektronoverføringssystemet er svekket hos fluer som mangler rosa1-genet, og O2-fluksen i både OXPHOS- og ETS-stadier er avhengig av CI og CI&CII, i samsvar med andre arbeider som viser redusert CI-aktivitet i rosa1-/- modeller 33,34,35.
Videre er protongradienten over mitokondriell indre membran avgjørende for syntesen av ATP28. Nedgangen iO2-fluks i ETS CI og ETS CII indikerer en forstyrrelse i strømmen av elektroner langs ETS. Denne forstyrrelsen i strømmen av elektroner påvirker OXPHOS-prosessen som fører til redusert ATP-syntese. Det var også en signifikant reduksjon iO2-forbruk relatert til ATP-syntese (P = 0,0280) i PINK1B9 nullfluer sammenlignet med kontrollfluer (figur 6B). En reduksjon i ATP-syntese i D. melanogaster kan ha signifikante effekter på energimetabolisme, cellulære prosesser og generelle fysiologiske funksjoner. I tillegg kan effektiviteten av OXPHOS-prosessen kvantifiseres av en indeks kjent som RCR, som gjenspeiler tettheten av koblingen mellom respirasjon og fosforylering. Derfor indikerer RCR-reduksjon (P = 0,0432) mitokondriell frakobling, noe som kan påvirke OXPHOS-prosessen, noe som tyder på at mitokondriene er mindre effektive til å utnytte oksygen og produsere ATP (figur 6C). Disse resultatene kan påvirke bananfluens vekst, utvikling, bevegelse, reproduksjon og generelle helse og bidra til patogenesen av visse nevrodegenerative sykdommer, inkludert PD 8,28,29,32.
Figur 1: Oppsett i OROBOROS Dat.Lab-programvare. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Trinn for kalibrering av kamre i OROBOROS Dat.Lab-programvare. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: SUIT-protokoll som viser hovedpunktene for substrat- og inhibitoraddisjon. Først tilsettes digitonin (DIG) etterfulgt av komplekse I-spesifikke substrater: malat, pyruvat og prolin (MPP), ATP-syntasesubstrat (ADP), og deretter substrat for kompleks II: succinat (S). Deretter tilsettes ATP-syntasehemmeren: oligomycin (OMY), etterfulgt av uncoupler Carbonyl-4-(trifluormetoksy) fenylhydrazoncyanid (F) og komplekse I, II og III-hemmere: rotenon (R), malonat (MNA) og antimycin (AMA) 36. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Høyoppløselig respirometri sammenlignet w1118 og PINK1B9 fluer. (A) OXPHOS CI, (B) OXPHOS CII, og (C) OXPHOS CI&CII. Data presenteres som gjennomsnitt ± S.E.M. og analyseres med t-test. n = 5-9. p < 0,05. Forkortelser: OXPHOS = oksidativ fosforylering; CI = kompleks I; CII = kompleks II. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Høyoppløselig respirometri sammenlignet w1118 og PINK1B9 fluer. (A) ETS CI, (B) ETS CII og (C) ETS CI&CII. Data presenteres som gjennomsnitt ± S.E.M. og analyseres med t-test. n = 5-9. p < 0,05. Forkortelser: ETS = elektrontransportsystem; CI = kompleks I; CII = kompleks II. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Høyoppløselig respirometri sammenlignet w1118 og PINK1B9 fluer. (A) LEKKASJE, (B) ATP-syntese og (C) respirasjonskontrollforhold. Data presenteres som gjennomsnitt ± S.E.M. og analyseres med t-test. n = 5-9. p < 0,05. Forkortelse: RCR = respiratorisk kontrollforhold. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HRR er en kraftig teknikk for å studere mitokondriell respirasjon og energimetabolisme i D. melanogaster og andre organismer. Det gir en detaljert og kvantitativ vurdering av mitokondriell funksjon, slik at forskere kan få innsikt i cellens bioenergetikk. Protokollen som presenteres her beskriver evalueringen av mitokondriell respiratorisk kjedefunksjon og aktiviteten til spesifikke mitokondriekomplekser ved bruk av SUIT-protokollen i D. melanogaster. SUIT-protokollen innebærer systematisk manipulering av ulike substrater, frakoblede og hemmere for å undersøke ulike aspekter ved mitokondriell respirasjon.
Den beskrevne teknikken tillater vurdering av respiratorisk hemming som følge av effekter på OXPHOS eller ETS, dehydrogenaseaktivitet (CI og CII) og membranintegritet (kobling av OXPHOS). Her utførte vi forsøkene med PINK1B9-nullfluer for å studere mitokondriell dysfunksjon siden det er assosiert med PD34,35. Denne protokollen kan imidlertid være nyttig for forskjellige sykdomsmodeller, medikamentelle behandlinger og toksikologiske studier.
I tillegg kan prøveprepareringen tilpasses eksperimentelle krav36. Et kritisk trinn i respirometriprotokollen er prøvepreparering. Det er avgjørende at riktig protokoll etableres for prøvetype (celle, isolerte mitokondrier, homogenat), og det er viktig å vurdere riktig metode for prøvenormalisering (proteinmengde, DNA-innhold, citratsyntaseaktivitet). Det er også viktig å bruke samme buffer for prøvepreparering og respirometrianalysen.
Siden prøveprepareringsprotokollen beskrevet her er enkel, utgjør den vanligvis ikke problemer for teknikken. Hvis en annen type prøve velges eller utarbeidelsen endres, er det nødvendig med nøye standardisering. Omrøring og temperaturstabilitet påvirker signalet til den polarografiske oksygensensoren, og genererer feil i respiratoriske målinger ved hjelp av en oksygraf. Derfor utgjør riktig kalibrering av kammeret et viktig skritt for å redusere feil under respiratoriske målinger.
Denne metoden for å vurdere mitokondriefunksjon i flueprøver gir flere fordeler i forhold til alternative tilnærminger. En av hovedstyrkene til HRR er dens evne til å gi direkte og nøyaktige målinger av oksygenforbruk, noe som muliggjør en detaljert analyse av mitokondriell funksjon og cellulær metabolisme. Derfor brukes HRR ofte i forskning fokusert på å forstå mitokondriell dysfunksjon, energiproduksjon og cellulære responser på forskjellige substrater eller forhold. Videre er det allsidig - tillater bruk av et bredt utvalg av prøvetyper, inkludert isolerte mitokondrier - og krever små mengder biologiske prøver, noe som er nyttig når prøvemengden er begrenset 1,2,3. Metoder som bruker mitokondrieisolater, for eksempel, involverer vanligvis et betydelig antall fluer, fra 50 til 200 individer, noe som gjør studien med mutanter vanskelig, da det ikke kan være praktisk å skaffe et stort antall mutanter for visse sykdomsmodeller.
I likhet med HRR-metoden er Seahorse Bioscience Extracellular Flux Analyzer et vitenskapelig verktøy som brukes til å måle oksygenforbruk og ekstracellulær forsuring. Imidlertid har de forskjellige tilnærminger og applikasjoner. Seahorse Bioscience Extracellular Flux Analyzer kvantifiserer øyeblikkelige endringer i oksygenforbruk (OCR) og ekstracellulær forsuring (ECAR) av celler. OCR indikerer mitokondriell respirasjon og energiproduksjon, mens ECAR gir innsikt i glykolytisk aktivitet. Hovedfunksjonen ligger i vurderingen av cellulær metabolsk dynamikk under ulike fysiologiske forhold, noe som gjør den spesielt medvirkende til å belyse de intrikate metabolske modulasjonene forbundet med patologiske sammenhenger. I tillegg er Seahorse designet for brukervennlighet, slik at forskere kan utføre raske metabolske analyser 37,38,39. I motsetning til dette krever HRR spesialisert opplæring og kompetanse til å operere og analysere data effektivt. Det innebærer bruk av en oksygenelektrode for direkte å måle oksygenforbruk av celler eller mitokondrier 13,14,40. En fordel med HRR er allsidigheten i utformingen av forskjellige respirometriprotokoller, noe som ikke er praktisk mulig ved bruk av Seahorse. Denne allsidigheten til å designe protokoller knyttet til lave kostnader gjør HRR-metoden til et levedyktig valg for laboratorier med begrenset finansiering. En annen ulempe med respirometrisystemet som brukes i denne protokollen er umuligheten av å arbeide med flere prøver samtidig, noe som hemmer analysen med høy gjennomstrømning. Dermed må eksperimentelle grupper være godt utformet for å tillate riktig sammenligning mellom dem. Fordelene ved dette systemet ligger imidlertid i det faktum at prøver av noe slag kan testes, fra isolerte celler til hele levende organismer, som C. elegans, for eksempel40.
Oppsummert er HRR en pålitelig metode for å studere mitokondriell funksjon under fysiologiske og patologiske forhold41. Hver eksperimentelle modell har forskjellige egenskaper og begrensninger, noe som krever metodikk og prøveprepareringsjusteringer for å sikre pålitelig og meningsfull datainnsamling i mitokondriell respirasjonsevaluering. Denne protokollen gir forskere en pålitelig metode for å vurdere effekten av miljøfaktorer, eksperimentelle inngrep eller genetiske mutasjoner på mitokondriell funksjon i D. melanogaster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Forfatterne anerkjenner det brasilianske byrået Coordenação de Aperfeiçoamento de Pesquisa Pessoal de Nível Superior (CAPES EPIDEMIAS 09 #88887.505377/2020). P.M. (#88887.512821/2020-00) og T.D. (#88887.512883/2020-00) er stipendiatmottakere.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | Adenosine 5′-diphosphate sodium sal (CAS number 72696-48-1); ≥95%; molecular weight = 501.31 g/mol. |
| Ágar | Kasv | K25-1800 | For bacteriologal use |
| Antimycin-A | Sigma-Aldrich | A8674 | Antimycin A from Streptomyces sp. (CAS number 1397-94-0); molecular weight 540 g/mol; |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | Bovine Serum Albumin (CAS number 9048-46-8); pH 7,0 ≥ 98% |
| Datlab software | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20700 | Software for data acquisition and analysis |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D 5628 | CAS number 11024-24-1 |
| Distilled water | |||
| Drosophila melanogaster strain w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 | Obtained from Bloomington Drosophila stock center | ||
| Drosophila melanogaster strain w1118 | Obtained from the Federal University of Santa Maria | ||
| EGTA | Sigma-Aldrich | E8145 | Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (CAS number 13638-13-3); ≥97%; molecular weight =468.28 g/mol |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920 | Carbonyl cyanide 4- (trifluoromethoxy)phenylhydrazone (CAS number 370-86-5); ≥98% (TLC), powder |
| GraphPad Prism version 8.0.1. | Software for data acquisition and analysis | ||
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034 | 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (CAS number 7365-45-9); ≥99,5% (titration), cell cultured tested; molecular weight = 238.30 g/mol |
| High-resolution respirometer Oxygraph O2K | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 10022-02 | Startup O2K respirometer kit |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | Monopotassium phosphate (CAS number 7778-77-0); Reagente Plus, molecular weigt = 136.09 g/mol |
| KOH | Sigma-Aldrich | 211473 | Potassium hydroxide (CAS number 1310-58-3); ACS reagent, ≥85%, pellets |
| Malate | Sigma-Aldrich | M1296 | Malonic acid (CAS number 141-82-2); 99%, molecular weight = 104.06 g/mol). A solution is pH adjusted to approximately 7.0. |
| Malic acid | Sigma-Aldrich | M1000 | (S)-(−)-2-Hydroxysuccinic acid (CAS number 97-67-6); ≥95% ; molecular weight = 134.09 g/mol |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (CAS number 4432-31-9); ≥99% (titration); molecular weight = 195.24 g/mol |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Magnesium chloride (CAS number 7786-30-3); anhydrous, ≥98%, molecular weight = 95.21 g/mol |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | ||
| O2K-Titration Set | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20820-03 | Hamilton syringes with different volumes |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O 4876 | Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes (CAS number 1404-19-9); ≥90% total oligomycins basis (HPLC) |
| Pistil to homogenization | |||
| Proline | Sigma-Aldrich | P0380 | L-Proline (CAS number 147-85-3); powder; 99%; molecular weight = 115.13 g/mol |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Sodium pyruvate (CAS number 113-24-6), ≥99%; molecular weight = 110.04 g/mol |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | Rotetone (CAS number 83-79-4); ≥95%, molecular weight 394.42 g/ mol |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S 2378 | Sodium succinate dibasic hexahydrate (CAS number 6106-21-4); ≥99% |
| Sucrose | Merck | 107,651,000 | Sucrose for microbiology use (CAS number 57-50-1) |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | CAS number 107-35-7 |
References
- Brand, M. D., Orr, A. L., Perevoshchikova, I. V., Quinlan, C. L. The role mitochondrial function and cellular bioenergetics in ageing and disease. Br J Dermatol. 169, 1-8 (2013).
- Ramaccini, D., et al. Mitochondrial function and dysfunction in dilated cardiomyopathy. Front Cell Dev Biol. 8, 624216 (2021).
- Zhunina, O. A., et al. The role of mitochondrial dysfunction in vascular disease, tumorigenesis, and diabetes. Front Mol Biosci. 8, 671908 (2021).
- Prasun, P.
- Bhatti, J. S., Bhatti, G. K., Reddy, P. H. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in metabolic disorders - A Step towards mitochondria based therapeutic strategies. Biochim Biophys Acta. 1863 (5), 1066-1077 (2017).
- Perier, C., Vila, M. Mitochondrial biology and Parkinson's disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (2), 009332 (2012).
- DeMaagd, G., Philip, A. Parkinson's disease and its management. Pharmacy and Therapeutics. 40 (8), 504-532 (2015).
- Miyazaki, N., et al. PINK1-dependent and Parkin-independent mitophagy is involved in reprogramming of glycometabolism in pancreatic cancer cells. Biochem Biophys Res Commun. 625, 167-173 (2022).
- Kopin, I. J., Markey, S. P. MPTP toxicity: implications for research in Parkinson's disease. Annual Review of Neuroscience. 11, 81-96 (1988).
- Connolly, N. M. C., et al. Guidelines on experimental methods to assess mitochondrial dysfunction in cellular models of neurodegenerative diseases. Cell Death Differ. 25 (3), 542-572 (2018).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G.
- Haynes, C. M., Fiorese, C. J., Lin, Y. -F. Evaluating and responding to mitochondrial dysfunction: The UPRmt and beyond. Trends Cell Mol Biol. 23 (7), 311-318 (2013).
- Long, Q., Huang, L., Huang, K., Yang, Q. Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from mouse heart tissues using oroboros 2k-oxygraph. Methods Mol Biol. 1966, Clifton, N.J. 237-246 (2019).
- Scheiber, D., et al. High-resolution respirometry in human endomyocardial biopsies shows reduced ventricular oxidative capacity related to heart failure. Exp Mol Med. 51 (2), 1-10 (2019).
- Krumschnabel, G., Eigentler, A., Fasching, M., Gnaiger, E. Chapter nine - use of safranin for the assessment of mitochondrial membrane potential by high-resolution respirometry and fluorometry. Methods Enzymol. 542, 163-181 (2014).
- Demir, E. The potential use of Drosophila as an in vivo model organism for COVID-19-related research: a review. Turk J Biol. 45 (4), 559-569 (2021).
- Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: a primer on the Drosophila model system. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
- McBride, S. M. J., Holloway, S. L., Jongens, T. A. Using Drosophila as a tool to identify pharmacological therapies for fragile X syndrome. Drug Discov Today Technol Technologies. 10 (1), e129-e136 (2013).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods (San Diego, Calif). 68 (1), 105-115 (2014).
- Bar, S., Prasad, M., Datta, R. Neuromuscular degeneration and locomotor deficit in a Drosophila model of mucopolysaccharidosis VII is attenuated by treatment with resveratrol). Dis Model Mech. 11 (11), (2018).
- Imai, Y. PINK1-Parkin signaling in Parkinson's disease: Lessons from Drosophila. Neurosci Res. 159, 40-46 (2020).
- Julienne, H., Buhl, E., Leslie, D. S., Hodge, J. J. L. Drosophila PINK1 and parkin loss-of-function mutants display a range of non-motor Parkinson's disease phenotypes. Neurobiol Dis. 104, 15-23 (2017).
- Biswas, S., Bagchi, A. Analysis of the structural dynamics of the mutations in the kinase domain of PINK1 protein associated with Parkinson's disease. Gene. 857, 147183 (2023).
- Koh, H., Chung, J. PINK1 and Parkin to control mitochondria remodeling. Anat Cell Biol. 43 (3), 179-184 (2010).
- Zhu, M., Li, X., Tian, X., Wu, C. Mask loss-of-function rescues mitochondrial impairment and muscle degeneration of Drosophila pink1 and parkin mutants. Hum Mol Genet. 24 (11), 3272-3285 (2015).
- Park, J., et al. Mitochondrial dysfunction in Drosophila PINK1 mutants is complemented by parkin. Nature. 441 (7097), 1157-1161 (2006).
- Dytham, C. Choosing and using statistics: a biologist's guide. , Wiley-Blackwell. Hoboken, NJ. (2011).
- Bonora, M., et al.
- Gonçalves, D. F., et al. Caffeine improves mitochondrial function in PINK1B9-null mutant Drosophila melanogaster. J Bioenerg Biomembr. 55 (1), 1-13 (2023).
- Gonçalves, D. F., et al. Mitochondrial function and cellular energy maintenance during aging in a Drosophila melanogaster model of Parkinson disease. Mitochondrion. 65, 166-175 (2022).
- Janowska, J. I., et al. Mitochondrial respiratory chain complex I dysfunction induced by N-methyl carbamate ex vivo can be alleviated with a cell-permeable succinate prodrug. Toxicol In Vitro. 65, 104794 (2020).
- Ngo, D. T. M., et al. Oxidative modifications of mitochondrial complex II are associated with insulin resistance of visceral fat in obesity. Physiol Endocrinol Metab. 316 (2), E168-E177 (2019).
- Stroud, D. A., et al. Accessory subunits are integral for assembly and function of human mitochondrial complex I. Nature. 538 (7623), 123-126 (2016).
- Senyilmaz, D., et al. Regulation of mitochondrial morphology and function by stearoylation of TFR1. Nature. 525 (7567), 124-128 (2015).
- Poddighe, S., et al. Mucuna pruriens (Velvet bean) rescues motor, olfactory, mitochondrial and synaptic impairment in PINK1B9 Drosophila melanogaster genetic model of Parkinson's disease. PloS One. 9 (10), e110802 (2014).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 810, 25-58 (2012).
- Winer, L. S. P., Wu, M. Rapid analysis of glycolytic and oxidative substrate flux of cancer cells in a microplate. PloS One. 9 (10), e109916 (2014).
- Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio Protoc. 8 (10), e2850 (2018).
- Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. Am J Physiol. Cell Physiol. 292 (1), C125-C136 (2007).
- Divakaruni, A. S., Jastroch, M. A practical guide for the analysis, standardization and interpretation of oxygen consumption measurements. Nat Metab. 4 (8), 978-994 (2022).
- Bingol, B., Sheng, M. Mechanisms of mitophagy: PINK1, Parkin, USP30 and beyond. Free Radic Biol Med. 100, 210-222 (2016).
