Summary
Apresentamos aqui um protocolo de respirometria de alta resolução para análise bioenergética em mutantes PINK1B9-null. O método utiliza o protocolo Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration (SUIT).
Abstract
Doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Parkinson (DP), e distúrbios celulares, como o câncer, são alguns dos distúrbios que interrompem o metabolismo energético com comprometimento das funções mitocondriais. As mitocôndrias são organelas que controlam tanto o metabolismo energético quanto os processos celulares envolvidos na sobrevivência e morte celular. Por esta razão, abordagens para avaliar a função mitocondrial podem oferecer informações importantes sobre as condições celulares em processos patológicos e fisiológicos. Nesse sentido, protocolos de respirometria de alta resolução (HRR) permitem avaliar toda a função da cadeia respiratória mitocondrial ou a atividade de complexos mitocondriais específicos. Além disso, o estudo da fisiologia mitocondrial e da bioenergética requer modelos geneticamente e experimentalmente tratáveis, como Drosophila melanogaster.
Esse modelo apresenta várias vantagens, como sua semelhança com a fisiologia humana, seu rápido ciclo de vida, fácil manutenção, custo-benefício, alta capacidade de rendimento e um número minimizado de preocupações éticas. Esses atributos coletivamente o estabelecem como uma ferramenta inestimável para dissecar processos celulares complexos. O presente trabalho explica como analisar a função mitocondrial utilizando o mutante Drosophila melanogaster PINK1 B9-null. O gene pink1 é responsável por codificar a putativa quinase 1 induzida por PTEN, através de um processo reconhecido como mitofagia, que é crucial para a remoção de mitocôndrias disfuncionais da rede mitocondrial. Mutações nesse gene têm sido associadas a uma forma familiar autossômica recessiva de início precoce da DP. Esse modelo pode ser utilizado para estudar as disfunções mitocondriais envolvidas na fisiopatologia da DP.
Introduction
As mitocôndrias são organelas celulares que controlam funções importantes, incluindo regulação apoptótica, homeostase do cálcio e participação em vias biossintéticas. Por possuírem material genético autônomo, são capazes de contribuir para os processos de manutenção e reparo celular. Sua estrutura abriga a cadeia de transporte de elétrons e a fosforilação oxidativa, ambas cruciais para a energia celular 1,2,3. Em particular, o controle energético é obtido através da produção de adenosina trifosfato (ATP) via fosforilação oxidativa (OXPHOS)2. A interrupção do metabolismo energético com comprometimento das funções mitocondriais ocorre tanto na sobrevivência quanto na mortecelular4,5, frequentemente associada a uma ampla gama de patologias humanas, como o câncer, e doenças neurodegenerativas, como a Doença de Parkinson (DP)3,6.
A DP é uma doença crônica, progressiva e neurológica. A causa primária dessa doença é a morte das células cerebrais, principalmente da substância negra, responsáveis pela produção do neurotransmissor dopamina, que controla o movimento 6,7,8. A primeira observação que ligava o parkinsonismo à disfunção mitocondrial foi feita em 1988, em modelos experimentais utilizando toxinas inibidoras da cadeia respiratória do Complexo I9.
Atualmente, existem vários métodos para avaliar a disfunção mitocondrial 10,11,12,1 3; no entanto, comparada às abordagens convencionais, a respirometria de alta resolução (FCR) apresenta sensibilidade e vantagens superiores 13,14. Por exemplo, protocolos de FCR permitem avaliar toda a função da cadeia respiratória mitocondrial ou a atividade de complexos mitocondriais específicos14,15. As disfunções mitocondriais podem ser avaliadas em células intactas, mitocôndrias isoladas ou mesmo ex vivo 10,11,13,14.
As disfunções mitocondriais estão intimamente associadas a muitos processos patológicos e fisiológicos. Portanto, é importante estudar a fisiologia mitocondrial e a bioenergética usando sistemas modelo geneticamente e experimentalmente tratáveis. Nesse sentido, a pesquisa sobre Drosophila melanogaster, a mosca-da-fruta, tem várias vantagens. Esse modelo compartilha características e processos celulares fundamentais com humanos, incluindo o uso de DNA como material genético, organelas comuns e vias moleculares conservadas envolvidas no desenvolvimento, imunidade e sinalização celular. Além disso, as moscas-das-frutas apresentam ciclo de vida rápido, fácil manutenção, baixo custo, alto rendimento e menos preocupações éticas, constituindo-se em uma ferramenta valiosa para dissecar processos celulares complexos 16,17,18,19,20.
Além disso, um homólogo do gene putativo quinase 1 (pink1) induzido por PTEN é expresso em D. melanogaster. Desempenha um papel crucial na remoção de mitocôndrias danificadas através do processo de mitofagia8. Em humanos, mutações nesse gene predispõem a uma forma familiar autossômica recessiva de DP associada à disfunção mitocondrial 8,21,22,23. Consequentemente, a mosca-da-fruta é um poderoso modelo animal para estudos sobre a fisiopatologia da DP e triagem de candidatos a fármacos com foco na disfunção mitocondrial e bioenergética. Portanto, o presente trabalho explica como analisar a função mitocondrial em um modelo de DP de D. melanogaster utilizando a técnica de HRR no OROBOROS com o protocolo Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration (SUIT).
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Protocol
Foram utilizadas as cepas w1118 (branca) e w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 (referida como Pink1B9) (FlyBase ID: FBgn0029891) do centro de estoque Bloomington Drosophila (número de identificação: 34749). Neste estudo, mutantes machos de D. melanogasterPINK1 B9-null são comparados com machos de D. melanogaster da cepa w1118, que é usada como grupo controle (background genético). Outros parâmetros devem ser analisados concomitantemente aos experimentos de respirometria para garantir que as moscas tenham o genótipo correto (Pink1B9/Y), como deformidades torácicas e problemas de locomoção, que são bem descritos para moscas mutantes Pink1 B924,25,26.
1. Animais e alojamento
- Manter as moscas em frascos de vidro contendo 10 mL de dieta padrão (levedura 1,73%, farinha de soja 0,9%, farinha de milho 7,3%, ágar 0,5%, xarope de milho 7,6% e ácido propiônico 0,48%) em temperatura e umidade constantes (25 °C e 60%, respectivamente), com ciclo claro/escuro de 12 h:12 h.
- Para cada experimento, utilizar duas moscas com idade entre 1 e 3 dias pós-eclosão.
NOTA: As moscas virgens mutantes PINK1B9-null foram cruzadas com w1118 machos para obter os machos F1 com genótipo Pink1B9/Y.
2. Preparo da amostra
- Prepare o buffer MiR05 conforme descrito na Tabela 1.
- Anestesiar as moscas no gelo e transferi-las para tubos de microcentrífuga (duas moscas por tubo).
- Em cada tubo, adicionar 200 μL de tampão MiR05 refrigerado e homogeneizar as moscas. Homogeneizar manualmente, aplicando pressão suave (aproximadamente 4-6 golpes do pilão) para evitar a desintegração das mitocôndrias.
3. Calibração por respirometria de alta resolução de sensores polarográficos de oxigênio
NOTA: As câmaras OROBOROS têm um volume total de aproximadamente 2 mL. A calibração é necessária para garantir que o fluxo de oxigênio seja próximo de 0 pmol para iniciar o ensaio.
- Iniciando a calibração, adicionar 2 mL de MiR05 à câmara. Cubra a câmara com a rolha não deixando bolhas de ar; Em seguida, puxe cuidadosamente a rolha para formar uma única bolha de ar.
- Abra o software OROBOROS Dat.Lab. Insira uma temperatura de 25 °C no campo Temperatura do bloco e clique em Conectar ao Oxygraph-2k (Figura 1A).
- Clique e selecione a pasta onde a calibração deve ser salva e clique em Salvar.
- Quando uma nova janela se abrir, nomeie o experimento e as amostras (se estiver calibrando, basta digitar o nome calibração) e clique em Salvar.
- Vá para o menu Layout e escolha a primeira opção: 01 Calibration Exp. Gr.3 - Temp como mostra a Figura 1B.
- Aguarde até que o programa redirecione para o layout de calibração, aguarde até que a linha vermelha mostre uma linha reta padrão com pontos em torno de 0 pmol. Em seguida, selecione dois pontos: um para a câmara A e outro para a câmara B (Figura 1C) quando a linha vermelha estiver exatamente em zero.
NOTA: Os pontos selecionados devem ter fluxo de oxigênio (linha vermelha) em torno de 0.- Para marcar os pontos de ambas as câmaras, selecione a concentração O2 à direita da tela, selecione o ponto marcado e copie os valores de temperatura e pressão barométrica relativos ao ponto. Cole esses valores nas caixas abaixo e clique em Calibrar e Copiar para Área de Transferência no canto inferior direito da tela, como mostra a Figura 2.
- Execute esse processo para ambas as câmaras (A e B), vá para o menu Arquivo e selecione Salvar e Desconectar.
NOTA: Após o processo de calibração, o programa redirecionará o usuário para a tela inicial para que o software esteja pronto para iniciar o teste HRR. Para este teste, utilizaremos o protocolo SUIT.
4. Protocolo SUIT
- Com a calibração concluída, retire as rolhas e abra as câmaras.
- Lave as rolhas (segurando a ponta que não toca na amostra) e as câmaras com etanol 100%, etanol 70% e água destilada, nessa ordem.
Observação : repita o processo para cada alteração de amostra. - Homogeneizar as moscas em 200 μL de tampão, colocar todo o conteúdo da amostra na câmara usando uma micropipeta e realocar a rolha na câmara, tomando cuidado para não criar bolhas de ar.
NOTA: Se se formarem bolhas de ar, remova a rolha suavemente e adicione 100 μL de tampão MIR05. - Clique no menu Layout e selecione a opção 05 Fluxo por Volume Corrigido como mostra a Figura 1B.
- Aguarde para ser redirecionado para uma nova janela. Clique em Salvar para selecionar a pasta onde o experimento será salvo.
- Aguarde a abertura de outra nova janela. Nomeie o experimento no espaço Código Experimental. Em seguida, nomeie cada amostra em sua respectiva câmara A e B no campo Amostra e defina o campo Unidade como unidade.
NOTA: Outras unidades também podem ser escolhidas, por exemplo, Milhões de células ou mg. - Considerando que este protocolo utiliza duas moscas (2 unidades) e o volume da câmara é de 2 mL, no campo Concentração , defina 1 por mL (Figura 1D).
NOTA: Aqui, a quantidade de amostra foi normalizada pelo número de moscas; no entanto, essa normalização pode ser realizada pelo conteúdo proteico da amostra, quantificação do DNA mitocondrial ou atividade da citrato sintase. - Quando o sinal do fluxo de oxigênio (linha vermelha) estiver estável no valor positivo, inicie o protocolo de FCR com a titulação de substratos, inibidores e desacopladores (Figura 3). Todos os reagentes e equipamentos subsequentes são mostrados na Tabela 1.
- Adicionar digitonina (5 μg/mL) para permeabilizar a membrana mitocondrial.
- Adicione os substratos piruvato (5 mM), malato (2 mM) e prolina (10 mM) e aguarde até que o fluxo de oxigênio aumente e se estabilize. Para marcar o evento para cada adição de reagente, pressione a tecla F4 no teclado e digite o nome de cada reagente.
- Adicionar ADP (5mM) para acoplar a cadeia respiratória mitocondrial e aguardar o aumento e estabilização do fluxo de oxigênio.
- Adicionar succinato (10 mM) e aguardar o aumento e estabilização do fluxo de oxigênio.
- Adicionar oligomicina (2,5 μM) para inibir a ATP sintase e procurar uma diminuição no fluxo de oxigênio.
- Aguarde até que a linha vermelha se estabilize e desacople a transferência de elétrons mitocondriais usando cianeto de fenilhidrazona carbonil-4-(trifluorometoxi) (FCCP) com títulos de 0,25 μM até que o consumo máximo de oxigênio seja atingido, demonstrado pelo aumento da linha vermelha. Após a estabilização do fluxo de oxigênio, comece a adicionar os inibidores de cada complexo, um de cada vez.
- Adicionar rotenona (0,5 μM), um inibidor do complexo I. Aguarde a diminuição e estabilização do fluxo de oxigênio para adicionar o próximo inibidor.
- Adicionar Malonato (5 mM), um inibidor do complexo II. Aguarde a diminuição e estabilização do fluxo de oxigênio para adicionar o próximo inibidor.
- Finalmente, adicionar Antimicina (2,5 μM), um inibidor do complexo III. Aguarde a diminuição seguida do aumento e estabilização do fluxo de oxigênio.
NOTA: O fluxo de oxigénio deve estabilizar-se num valor positivo, mas abaixo do valor para a última inibição dos complexos proteicos mitocondriais.
- Ao final da análise, remova todo o conteúdo das câmaras usando uma micropipeta. Conservar a -20 °C para análises futuras, quando necessário.
5. Análise dos dados
- Utilizar um pacote de software estatístico apropriado para análise de dados.
- Realizar testes t para avaliar as diferenças entre os dois grupos. Para situações envolvendo múltiplos tratamentos, utilizar a Análise de Variância (ANOVA) como teste estatístico27.
- Extraia os valores de fluxo de O2 do gráfico gerado pelo software. OXPHOS CI refere-se ao valor do fluxo de O2 após a adição de ADP. OXPHOS CII é obtido subtraindo-se OXPHOS CI&CII - OXPHOS CI. OXPHOS CI&CII é o valor do fluxo de O2 extraído após a adição de succinato. ETS CI&CII é o valor de fluxo O2 após a adição de FCCP. ETS CI = FCCP - Rotenone e ETS CII = Rotenone - Malonate.
- Calcular a síntese de ATP como a diferença entre o OXPHOS (P) e o LEAK (L) (P - L)28.
- Determinar a Razão de Controle Respiratório (RCR) calculando a razão OXPHOS/LEAK, onde RCR = P/L.11
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Representative Results
Aqui, nós que o fluxo de O2 nos estados OXPHOS CI (P = 0,0341) e OXPHOS CI&II (P = 0,0392) é reduzido em moscas nulas PINK1B9 quando comparado com moscas controle (Figura 4). Esse resultado também foi observado em achados anteriores do nosso grupo 29,30.
CI e CII são componentes-chave do sistema de transporte de elétrons (ETS), no qual o CI é responsável pela transferência de elétrons do NADH para a ubiquinona, enquanto o CII transfere elétrons do succinato para a ubiquinona 31,32,33. As moscas nulasPINK1 B9 apresentaram menor fluxo de O2 nos estados ETS CI (P = 0,0338), ETS CII (P = 0,0457) e ETS CI&II (P = 0,0247) (Figura 5). Esses resultados indicam que o sistema de transferência de elétrons está comprometido em moscas sem o gene pink1 e que o fluxo de O2 nos estágios OXPHOS e ETS é dependente de CI e CI&CII, consistente com outros trabalhos que demonstraram atividade reduzida de CI em modelos pink1-/- 33,34,35.
Além disso, o gradiente de prótons através da membrana interna mitocondrial é essencial para a síntese de ATP28. A diminuição do fluxo de O2 na ETS CI e ETS CII indica uma interrupção no fluxo de elétrons ao longo da ETS. Esta interrupção no fluxo de elétrons afeta o processo OXPHOS levando à redução da síntese de ATP. Houve também uma diminuição significativa no consumo de O2 relacionado à síntese de ATP (P = 0,0280) nas moscas nulas PINK1B9 quando comparadas às moscas controle (Figura 6B). Uma diminuição na síntese de ATP em D. melanogaster pode ter efeitos significativos sobre o metabolismo energético, processos celulares e funções fisiológicas gerais. Além disso, a eficiência do processo OXPHOS pode ser quantificada por um índice conhecido como RCR, que reflete a estanqueidade do acoplamento entre respiração e fosforilação. Portanto, a redução da RCR (P = 0,0432) indica desacoplamento mitocondrial, o que pode afetar o processo de OXFOS, sugerindo que as mitocôndrias são menos eficientes na utilização de oxigênio e produção de ATP (Figura 6C). Esses resultados podem afetar o crescimento, desenvolvimento, locomoção, reprodução e saúde geral da mosca-das-frutas e contribuir para a patogênese de certas doenças neurodegenerativas, incluindo a DP8,28,29,32.
Figura 1: Layouts no software OROBOROS Dat.Lab. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Etapas de calibração das câmaras no software OROBOROS Dat.Lab. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Protocolo SUIT demonstrando os principais pontos de adição de substrato e inibidor. Primeiramente, adiciona-se a digitonina (DIG), seguida de substratos específicos do complexo I: malato, piruvato e prolina (MPP), substrato ATP sintase (ADP) e, em seguida, substrato para o complexo II: succinato (S). Posteriormente, adiciona-se o inibidor da ATP sintase: oligomicina (OMY), seguido pelo desacoplador Carbonil-4-(trifluorometoxi) fenilhidrazona cianeto (F) e inibidores dos complexos I, II e III: rotenona (R), malonato (MNA) e antimicina (AMA)36. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Respirometria de alta resolução comparando moscas w1118 e PINK1B9 . (A) OXPHOS CI, (B) OXPHOS CII e (C) OXPHOS CI&CII. Os dados são apresentados como média ± S.E.M. e analisados pelo teste t. n = 5-9. p < 0,05. Abreviações: OXPHOS = fosforilação oxidativa; IC = complexo I; CII = complexo II. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Respirometria de alta resolução comparando moscas w1118 e PINK1B9 . (A) ETS CI, (B) ETS CII e (C) ETS CI&cii. Os dados são apresentados como média ± S.E.M. e analisados pelo teste t. n = 5-9. p < 0,05. Abreviações: ETS = sistema de transporte de elétrons; IC = complexo I; CII = complexo II. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Respirometria de alta resolução comparando moscas w1118 e PINK1B9 . (A) vazamento, (B) síntese de ATP e (C) razão de controle respiratório. Os dados são apresentados como média ± S.E.M. e analisados pelo teste t. n = 5-9. p < 0,05. Abreviação: RCR = razão do controle respiratório. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A HRR é uma técnica poderosa para estudar a respiração mitocondrial e o metabolismo energético em D. melanogaster e outros organismos. Ele fornece uma avaliação detalhada e quantitativa da função mitocondrial, permitindo que os pesquisadores obtenham informações sobre a bioenergética das células. O protocolo aqui apresentado descreve a avaliação da função da cadeia respiratória mitocondrial e da atividade de complexos mitocondriais específicos utilizando o protocolo SUIT em D. melanogaster. O protocolo SUIT envolve a manipulação sistemática de vários substratos, desacopladores e inibidores para examinar diferentes aspectos da respiração mitocondrial.
A técnica descrita permite avaliar a inibição respiratória resultante dos efeitos sobre o OXPHOS ou a AET, a atividade da desidrogenase (IC e CII) e a integridade da membrana (acoplamento de OXPHOS). Neste trabalho, realizamos os experimentos com moscas PINK1B9-nulas para estudar a disfunção mitocondrial, uma vez que esta está associada à DP34,35. No entanto, esse protocolo pode ser útil para diferentes modelos de doenças, tratamentos medicamentosos e estudos toxicológicos.
Além disso, a preparação da amostra pode ser adaptada às exigências experimentais36. Uma etapa crítica no protocolo de respirometria é a preparação da amostra. É fundamental que o protocolo correto seja estabelecido para o tipo de amostra (célula, mitocôndrias isoladas, homogeneizado), e é importante considerar o método apropriado para normalização da amostra (quantidade de proteína, conteúdo de DNA, atividade da citrato sintase). Também é importante usar o mesmo tampão para o preparo da amostra e o ensaio de respirometria.
Como o protocolo de preparo da amostra descrito aqui é simples, não costuma representar problemas para a técnica. Se outro tipo de amostra for escolhido ou sua preparação alterada, então uma padronização cuidadosa é necessária. A agitação e a estabilidade da temperatura afetam o sinal do sensor polarográfico de oxigênio, gerando erro nas medidas respiratórias com o uso de um oxígrafo. Portanto, a correta calibração da câmara constitui um passo importante para reduzir erros durante as medidas respiratórias.
Este método para avaliar a função mitocondrial em amostras de moscas oferece várias vantagens sobre abordagens alternativas. Um dos principais pontos fortes da FCR é sua capacidade de fornecer medidas diretas e precisas do consumo de oxigênio, permitindo uma análise detalhada da função mitocondrial e do metabolismo celular. Portanto, a HRR é frequentemente usada em pesquisas focadas na compreensão da disfunção mitocondrial, produção de energia e respostas celulares a diferentes substratos ou condições. Além disso, é versátil - permitindo o uso de uma grande variedade de tipos de amostras, incluindo mitocôndrias isoladas - e requer pequenas quantidades de amostras biológicas, o que é útil quando a quantidade de amostra é limitada 1,2,3. Métodos que utilizam isolados mitocondriais, por exemplo, tipicamente envolvem um número substancial de moscas, variando de 50 a 200 indivíduos, o que dificulta o estudo com mutantes, pois a obtenção de um grande número de mutantes para determinados modelos de doenças pode não ser prática.
Semelhante ao método HRR, o Seahorse Bioscience Extracellular Flux Analyzer é uma ferramenta científica usada para medir o consumo de oxigênio e a acidificação extracelular. No entanto, eles têm abordagens e aplicações diferentes. O Seahorse Bioscience Extracellular Flux Analyzer quantifica alterações instantâneas na taxa de consumo de oxigênio (OCR) e na taxa de acidificação extracelular (ECAR) das células. O OCR é indicativo de respiração mitocondrial e geração de energia, enquanto o ECAR oferece informações sobre a atividade glicolítica. Sua principal função reside na avaliação da dinâmica metabólica celular sob diversas condições fisiológicas, tornando-a particularmente instrumental na elucidação das intrincadas modulações metabólicas associadas a contextos patológicos. Além disso, o Seahorse é projetado para facilitar o uso, permitindo que os pesquisadores realizem ensaios metabólicos rápidos 37,38,39. Por outro lado, o HRR requer treinamento especializado e experiência para operar e analisar dados de forma eficaz. Envolve o uso de um eletrodo de oxigênio para medir diretamente o consumo de oxigênio pelas células ou mitocôndrias 13,14,40. Uma vantagem da HRR é sua versatilidade na concepção de diferentes protocolos de respirometria, o que é inviável quando se usa cavalo-marinho. Essa versatilidade para o desenho de protocolos associada ao baixo custo torna o método HRR uma escolha viável para laboratórios com financiamento limitado. Outra desvantagem do sistema de respirometria utilizado no presente protocolo é a impossibilidade de trabalhar com várias amostras simultaneamente, o que dificulta a análise em alto rendimento. Assim, os grupos experimentais devem ser bem delineados para permitir a correta comparação entre eles. No entanto, as vantagens desse sistema residem no fato de que amostras de qualquer tipo podem ser testadas, desde células isoladas até organismos vivos inteiros, como C. elegans, por exemplo40.
Em resumo, a FCR é um método confiável para estudar a função mitocondrial em condições fisiológicas e patológicas41. Cada modelo experimental tem características e restrições diferentes, exigindo ajustes de metodologia e preparação da amostra para garantir a aquisição de dados confiáveis e significativos na avaliação da respiração mitocondrial. Este protocolo oferece aos pesquisadores um método confiável para avaliar os efeitos de fatores ambientais, intervenções experimentais ou mutações genéticas sobre a função mitocondrial em D. melanogaster.
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Disclosures
Os autores declaram não haver interesses concorrentes.
Acknowledgments
Os autores agradecem à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pesquisa Pessoal de Nível Superior (CAPES EPIDEMIAS 09 #88887.505377/2020). P.M. (#88887.512821/2020-00) e T.D. (#88887.512883/2020-00) são bolsistas de pesquisa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | Adenosine 5′-diphosphate sodium sal (CAS number 72696-48-1); ≥95%; molecular weight = 501.31 g/mol. |
| Ágar | Kasv | K25-1800 | For bacteriologal use |
| Antimycin-A | Sigma-Aldrich | A8674 | Antimycin A from Streptomyces sp. (CAS number 1397-94-0); molecular weight 540 g/mol; |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | Bovine Serum Albumin (CAS number 9048-46-8); pH 7,0 ≥ 98% |
| Datlab software | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20700 | Software for data acquisition and analysis |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D 5628 | CAS number 11024-24-1 |
| Distilled water | |||
| Drosophila melanogaster strain w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 | Obtained from Bloomington Drosophila stock center | ||
| Drosophila melanogaster strain w1118 | Obtained from the Federal University of Santa Maria | ||
| EGTA | Sigma-Aldrich | E8145 | Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (CAS number 13638-13-3); ≥97%; molecular weight =468.28 g/mol |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920 | Carbonyl cyanide 4- (trifluoromethoxy)phenylhydrazone (CAS number 370-86-5); ≥98% (TLC), powder |
| GraphPad Prism version 8.0.1. | Software for data acquisition and analysis | ||
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034 | 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (CAS number 7365-45-9); ≥99,5% (titration), cell cultured tested; molecular weight = 238.30 g/mol |
| High-resolution respirometer Oxygraph O2K | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 10022-02 | Startup O2K respirometer kit |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | Monopotassium phosphate (CAS number 7778-77-0); Reagente Plus, molecular weigt = 136.09 g/mol |
| KOH | Sigma-Aldrich | 211473 | Potassium hydroxide (CAS number 1310-58-3); ACS reagent, ≥85%, pellets |
| Malate | Sigma-Aldrich | M1296 | Malonic acid (CAS number 141-82-2); 99%, molecular weight = 104.06 g/mol). A solution is pH adjusted to approximately 7.0. |
| Malic acid | Sigma-Aldrich | M1000 | (S)-(−)-2-Hydroxysuccinic acid (CAS number 97-67-6); ≥95% ; molecular weight = 134.09 g/mol |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (CAS number 4432-31-9); ≥99% (titration); molecular weight = 195.24 g/mol |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Magnesium chloride (CAS number 7786-30-3); anhydrous, ≥98%, molecular weight = 95.21 g/mol |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | ||
| O2K-Titration Set | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20820-03 | Hamilton syringes with different volumes |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O 4876 | Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes (CAS number 1404-19-9); ≥90% total oligomycins basis (HPLC) |
| Pistil to homogenization | |||
| Proline | Sigma-Aldrich | P0380 | L-Proline (CAS number 147-85-3); powder; 99%; molecular weight = 115.13 g/mol |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Sodium pyruvate (CAS number 113-24-6), ≥99%; molecular weight = 110.04 g/mol |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | Rotetone (CAS number 83-79-4); ≥95%, molecular weight 394.42 g/ mol |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S 2378 | Sodium succinate dibasic hexahydrate (CAS number 6106-21-4); ≥99% |
| Sucrose | Merck | 107,651,000 | Sucrose for microbiology use (CAS number 57-50-1) |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | CAS number 107-35-7 |
References
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