ショウジョウバエ 男性のアクセサリー腺解剖:二次細胞を分離する方法

Overview

このビデオでは、雄のハエからの補助腺の解剖について説明し、単一の細胞懸濁液に分離される単一の腺の例を示します。

Protocol

このプロトコルは、ショウジョウバエ男性アクセサリー腺の二次細胞からRNAを分離するFACSベースのプロトコルであるImmarigeonらからの抜粋である、J.Vis. Exp. (2019)。

1. ソリューションと材料の準備

1. 次のソリューションを準備します。
   1. 血清補充培地(SSM):シュナイダーの ショウジョウバエ 培地は、10%の熱不活性化されたウシウシ血清と1%ペニシリンストレプトマイシンを補完します。
   2. 1xトリプシン酵素(例えば、トリプレ発現酵素)のアリコートを調製し、室温で保存します。
   3. パパイン[50 U/mL]のアリコートを用意します(-20°Cで保存し、一度だけ解凍)。
   4. 1xリン酸緩衝液生理食塩水(PBS、室温で保存)を準備する。
2. アクセサリー腺の物理的な解離のための複数の炎丸いピペットの先端を準備します。
   注: 彼らは未処理のプラスチックに付着する傾向があるため、アクセサリー腺を扱うための低保持のヒントを使用してください。火の丸めのプロセスは先端の開始を減らし、先端の端を滑らかにする。これは、細胞膜を剪断することなく、ペプチダーゼ消化後の効率的な解離を保証します。
   1. 鋭利な刃で200μLの先端を1つカットし、炎の上にそっと渡して先端を丸め、開口部が広いが滑らかで、ステップ2.7の間に取り扱いがスムーズになるようにします。
   2. 1秒未満の間、炎の近くに先端の開口部を渡すことによって、複数の1,000 μLの先端の開口部を狭くします。チップを少し回転させて、過度に溶融したり詰まらせないようにします。より狭いから広いに作られたヒントを並べ替えます。これは、吸引の速度をタイミングで行うことができます。AG の小規模サンプルを解別して、最も狭い先端の効率をテストします。
      注: これらのヒントは機械的な攪拌のために重要です。高品質の火炎丸いピペットの先端は細胞の生存率を維持している間完全な解離を可能にする。そのため、これらの先端は、再使用のための手順の最後に水で十分に洗浄されます。これにより、日々の再現可能な解離が可能になります。

2. アクセサリー腺の解剖

1. 氷の上のガラス皿に20〜25人の男性 ショウジョウバエ を入れます。
2. SSMで1人の男性を解剖する。その生殖管を取り除き、射精ダクトから離れて他のすべての組織からアクセサリー腺のペアをクリアします。
   注: 放出された精子は塊を作成し、解離プロセスを妨げることができるので、精巣を取り除きます。射精電球を取り外すと、浮いたときに取り扱いが困難になります。
3. 鉗子で、室温でSSMで満たされたガラス板に付属品腺を移す。ステップ 2.2 ~ 2.3 を 20 回繰り返して、SSM で 20 組の腺のバッチを得ます。
   注: これらのステップは15〜20分で達成され、AGは健康に見えるはずであり、腺の周りの筋肉層の蠕動運動が見えるはずです。GFPは蛍光顕微鏡を用いて監視することができる。
4. 1x PBSにアクセサリー腺を移し、室温で1〜2分洗浄します。
   注: より良い解離のためには、PBSで腺をすすいでください。しかし、細胞がPBSでストレスの兆候を示すので、このステップの期間は制限されるべきです。PBS中の解二次細胞は急速に膨れ上がって死ぬ。
5. 20 μLパパイン[50 U/mL]を1xトリプシン酵素の180 μLに希釈して解離液を得る(トリプシン酵素9μL、男性1μLをスケールアップまたはダウンさせる)。鉗子を使用して、この溶液に付属腺を移す。
6. 近位部から副細胞を含む補助腺の先端を分離します。細かい鉗子を使用して腺葉の真ん中をしっかりとつまみ、2番目の鉗子の鋭い先端で切断します。隣接腺の近位部分と射精ダクトを取り除き、解離を改善し、細胞の並べ替え時間を短縮します。
   注: 20組の腺から遠位部分を解剖すると15〜20分かかるため、ペプチダーゼによる消化は室温で開始されます。
7. すべての腺先端が解剖された後、ステップ1.2.1で準備された特別な200 μLのピペット先端を使用して1.5 mLの管に移します。腺を扱う前に、広く丸みを帯びた湿潤状態にする必要があります。
   注: 補助腺組織をピペットするには、チップは常に適切な溶液で事前に濡れている必要があります(トリプシン酵素またはSSM、この目的のためにそれぞれ1つのチューブを保持)。サンプル間のチップを慎重にリンスして汚染を避けてください。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Binocular microscope for dissection
Binocular with light source for GFP
Bunsen
Plastic microtubes 1.5 mL	Eppendorf
Fine dissection forceps
Foetal bovine serum	Gibco	10270-106	heat inactivated prior to use
Glass dishes for dissection
Ice bucket
P1000	Gilson
P20	Gilson
P200	Gilson
Papain			50U/mL stock
PBS			home made
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070-063
Schneider’s Drosophila medium	Gibco	21720-001
Tipone 1250 μL graduated tip	Starlab	S1161-1820
Tipone 200 μL bevelled tip	Starlab	S1161-1800
TrypLE Express Enzyme	Gibco	12604013