Drosophila Mandligt tilbehør Kirtel Dissektion: En metode til at isolere sekundære celler

Overview

Denne video beskriver dissektion af tilbehør kirtler fra mandlige fluer og viser et eksempel, hvor den isolerede kirtel vil blive dissociated i en enkelt celle suspension.

Protocol

Denne protokol er et uddrag fra Immarigeon et al.,en FACS-baseret protokol til at isolere RNA fra de sekundære celler i Drosophila Male Accessory Glands, J. Vis. Exp. (2019).

1. Opløsninger og materialeforberedelse

1. Forbered følgende løsninger.
   1. Forbered Serum Suppleret Medium (SSM): Schneider's Drosophila medium suppleret med 10% varme inaktiveret føtal kvæg serum og 1% Penicillin-Streptomycin.
   2. Forbered aliquots af 1x trypsin enzym (f.eks TrypLE Express Enzym) og opbevares ved stuetemperatur.
   3. Der tilberedes aliquots af papain [50 U/mL] (opbevares ved -20 °C og optøs kun én gang).
   4. Forbered 1x fosfat buffer saltvand (PBS, opbevares ved stuetemperatur).
2. Forbered flere flammeafrundede rørspidser til fysisk dissociation af tilbehørkirtler.
   BEMÆRK: Brug tips til lav opbevaring til håndtering af tilbehørkirtler, da de har tendens til at klæbe til ubehandlet plast. Processen med flammeafrunding reducerer spidsens åbning og udjævner kanterne af spidsen. Dette sikrer en effektiv dissociation efter peptidase fordøjelsen uden at klippe cellemembranerne.
   1. Skær en 200 μL spids over med et skarpt blad, og send den forsigtigt over en flamme for at afrunde spidsen, så åbningen er bredere, men glat til håndtering i trin 2.7.
   2. Indsnævr åbningen af flere 1.000 μL spidser ved at passere spidsen, der åbner nær en flamme i mindre end et sekund. Drej spidsen en smule for at undgå oversmeltning eller tilstopning. Sorter spidserne fra smallere til bredere. Dette kan gøres ved at timing hastigheden af aspiration. Prøv at adskille en lille stikprøve af AGs at teste effektiviteten af de smalleste tips.
      BEMÆRK: Disse tips er afgørende for mekanisk agitation. Afrundede rørspidser af høj kvalitet giver mulighed for fuldstændig dissociation, samtidig med at cellens levedygtighed bevares. Som sådan vaskes disse tips grundigt med vand i slutningen af proceduren for genbrug. Dette giver mulighed for dag til dag reproducerbar dissociation.

2. Dissektion af tilbehør kirtler

1. Sæt 20 til 25 mandlige Drosophila i et glas parabol på is.
2. Dissekere 1 mand i SSM. Tag sin reproduktive tarmkanalen og rydde tilbehør kirtel par fra alle andre væv bortset fra ejakulatoriske kanalen.
   BEMÆRK: Fjern testikler, fordi den frigivne sæd kan skabe klumper og forstyrre dissociationsprocessen. Fjern den ejakulatoriske pære, hvilket gør håndtering vanskelig, når den flyder.
3. Med pincet overføres tilbehørkirtler til en glasplade fyldt med SSM ved stuetemperatur. Gentag trin 2.2-2.3 20 gange for at få et parti på 20 par kirtler i SSM.
   BEMÆRK: Disse trin vil blive opnået i 15 til 20 min. AGs bør se sundt, og peristaltic bevægelser af muskellaget omkring kirtler bør være synlige. GFP kan overvåges ved hjælp af et fluorescerende mikroskop.
4. Overfør tilbehør kirtler til 1x PBS for en 1-2 min vask ved stuetemperatur.
   BEMÆRK: For bedre dissociation er det vigtigt at skylle kirtlerne med PBS. Varigheden af dette trin bør dog begrænses, da cellerne viser tegn på stress i PBS; dissociated sekundære celler i PBS hurtigt svulme op og dø.
5. 20 μL papain [50 U/mL] fortyndes til 180 μL 1x trypsinenzym for at opnå dissociationsopløsningen (for at skalere op eller ned skaleres 9 μL trypsinenzym og 1 μL papain for hver mand). Med pincet overføres tilbehørkirtler til denne løsning.
6. Isoler spidsen af tilbehørkirtler (indeholdende sekundære celler) fra den proksimale del. Brug fine pincet til at klemme fast midt i en kirtel lap og skære med den skarpe spids af en anden pincet. Fjern den proksimale del af tilbehørskirtlerne og ejakulatorkanalen for at forbedre dissociationen og reducere cellesorteringstiden.
   BEMÆRK: Dissekere distale del fra 20 par kirtler vil tage 15 til 20 min og fordøjelsen af peptidases vil således starte ved stuetemperatur.
7. Når alle kirtelspidser er dissekeret, overføres de til et 1,5 mL rør ved hjælp af en speciel 200 μL pipetspids tilberedt ved trin 1.2.1. Den skal være bred, afrundet og våd inden håndtering af kirtler.
   BEMÆRK: For at pipette tilbehør kirtelvæv skal spidserne altid være for våde med passende opløsning (trypsinenzym eller SSM, hold et rør af hver til dette formål). Skyl forsigtigt spidserne mellem prøverne for at undgå kontaminering.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Binocular microscope for dissection
Binocular with light source for GFP
Bunsen
Plastic microtubes 1.5 mL	Eppendorf
Fine dissection forceps
Foetal bovine serum	Gibco	10270-106	heat inactivated prior to use
Glass dishes for dissection
Ice bucket
P1000	Gilson
P20	Gilson
P200	Gilson
Papain			50U/mL stock
PBS			home made
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070-063
Schneider’s Drosophila medium	Gibco	21720-001
Tipone 1250 μL graduated tip	Starlab	S1161-1820
Tipone 200 μL bevelled tip	Starlab	S1161-1800
TrypLE Express Enzyme	Gibco	12604013