成人 ショウジョウバエ 脳の取り付け:共焦点イメージング用のスライドを準備する方法

Overview

このビデオでは、ブリッジスライドの下で成体ハエから無傷の脳を取り付ける方法を説明し、蛍光顕微鏡用の免疫染色された脳に対して行われるプロトコルを示しています。

Protocol

このプロトコルは、ケリーら、成人 ショウジョウバエメラノガスター 脳におけるキノコ体および感光体ニューロンの解剖および免疫蛍光染色、J.Vis. Exp. からの抜粋である(2017)。

1. マイクロスコープスライドとイメージング上に大人 D.メラノガスター の脳を取り付ける

1. 「ブリッジ」スライドを構築します。正に帯電したスライド上に2つの「ベース」カバーリップを約1cm離して配置します。スライドの正に充電された側が上向きであることを確認します。 図 1Aに示すように、カバースリップを指の爪磨きでスライドに付着します。通常、各ベースカバースリップの3つの外側のエッジを指のマニキュアで密封し、取り付け媒体がこれらのベースカバースリップの下でくびれないようにするのに役立ちます。先に進む前に、指の爪を完全に乾燥させます(10〜15分)。
2. スライドを実体顕微鏡の下に置き、解剖された脳を含む取り付け培地溶液を2つのカバーリップ間の空間にピペットします。よりコントラストを高めるために、グースネックライトをベンチトップと平行に操縦すると便利です。
3. ピペットを使用してスライドから余分な取り付けメディアを取り外し、スライドから脳をピペットしないように注意してください。
4. 余分な取り付けメディアを離れてウィック。これにより、次のステップで脳をより正確に配置できるようになります。
5. 鉗子と実体顕微鏡を使用して、アンテナローブを上に向けてグリッドパターンでスライド上に脳を配置します。
6. カバースリップ(「ブリッジ」)を脳の上に置きます(図1A)。指の爪磨きを使用して、橋カバースリップの側面を密封し、「ベース」カバースリップに接触します。
7. p200ピペットを使用して、橋の下の中央の空洞を新しい取り付けメディアでゆっくりと満たします(図1B)。中央カバースリップの開いた端に一滴ずつ置き、取り付けメディアが中央ブリッジのカバースリップの下でくびまんとできるようにします。キャビティ全体が取り付けメディアで満たされるまで続け、上と下を透明な指の爪の磨きで密封します。
8. 指のマニキュアが乾燥したら、すぐにスライドをイメージするか、-20°Cの軽快なタイトなスライドボックスに保管します。
9. 1週間以内に、レーザー走査共焦点顕微鏡を励起レーザーとフィルターキューブを使用して、選択した蛍光二次抗体に適した画像脳。キノコの体ニューロンのZスタック画像は、典型的には20Xまたは40Xの目的を使用して得られる。レチン体の光受容体ニューロンのイメージングは、より高い倍率を必要とするかもしれない。

Representative Results

図1:免疫蛍光イメージングに備えて脳を取り付ける。(A)脳の平坦化を防ぐために、スーパーフロストプラススライドにブリッジカバーを搭載した脳が取り付けられています。2つの「ベース」カバースリップは、クリアな爪磨きと解剖された脳とスーパーフロストプラス積極的に充電されたスライドに接着され、その間のスライドに配置されます。明確な「ブリッジ」カバースリップは、脳の上に配置され、ベースカバースリップに接着されています。(B)指の爪の磨きが乾燥したら、ベクタシールドは、二次抗体の蛍光を維持するために、ブリッジの下にゆっくりとピペット加工される。クリアな指の爪の磨きは、「ブリッジ」カバースリップの上部および底部を密封するために使用される。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microdissection forceps/tweezers	Ted Pella	505-NM
VectaShield	Vector Labs	H-1000
SuperFrost Plus Slides	ThermoFisher	99-910-01
Coverslips	ThermoFisher	12-553-454
fingernail polish	Electron Microscope Services (EMS)	72180
stereomicroscope	Leica S6D with KL300 LED light source
Kimwipe	Fisher	06-666