Overview
Это видео описывает метод монтажа неповрежденных мозгов взрослых мух под слайдом моста и показывает протокол, выполненный на иммунотлорированных мозгах для флуоресцентной микроскопии.
Protocol
Этот протокол является выдержка из Келли и др.,вскрытие и иммунофлуоресцентное окрашивание грибного тела и фоторецептор нейронов во взрослых drosophila меланогастер мозга, J. Vis. Exp. (2017).
1. Монтаж взрослых D. меланогастер мозги на микроскоп слайды и изображения
- Постройте слайд "мост". Позиция двух "базовых" крышки примерно на 1 см друг от друга на положительно заряженной слайд. Убедитесь, что положительно заряженная сторона слайда обращена вверх. Придерживайтесь крышки на слайде с лаком для ногтей, как показано на рисунке 1A. Это, как правило, полезно, чтобы запечатать три внешних края каждой базовой крышки скольжения с ногтем польский для обеспечения монтажа средств массовой информации не фитиль под этими листами базовой крышки. Пусть ногти полировать сухой полностью (10 - 15 мин) до начала.
- Поместите слайд под стереомикроскоп и пипетку монтажный медиа-раствор, содержащий расчлененные мозги, в пространство между двумя крышками. Чтобы обеспечить больше контраста, полезно маневрировать гусиными огнями так, чтобы они были параллельны верхней скамейке.
- Удалите дополнительные монтажные средства со слайда с помощью пипетки, будьте осторожны, чтобы не пипетки мозги со слайда.
- Wick от дополнительных монтажных средств массовой информации. Это позволит мозгу быть расположены более точно во время следующего шага.
- Используя пару типсов и стереомикроскоп, распоить мозг на слайде в сетке шаблон с антенными долями вверх.
- Поместите крышку скольжения ("мост") над мозгами(рисунок 1А). Используйте лак для ногтей, чтобы запечатать стороны крышки моста скольжения, где они контактируют с "базы" крышка скользит.
- Используя р200 пипетку, медленно заполните центральную полость под мостом свежим монтажом мультимедиа(рисунок 1B). Поместите одну каплю в то время, на открытом краю центра coverslip и позволяют монтажа средств к фитиль под центральным мостом coverslip. Продолжайте до тех пор, пока вся полость не будет заполнена монтажными средствами, затем запечатав верхнюю и нижнюю части четким лаком для ногтей.
- После того, как лак для ногтей высохнет, изображение слайдов немедленно или хранить в светонепроницаемой жесткой слайд-бокс при -20 градусов по Цельсию.
- В течение одной недели, изображение мозга с помощью лазерного сканирования конфокального микроскопа с возбуждением лазеров и фильтр кубов подходит для выбранных флуоресцентных вторичных антител. Изображения нейронов грибного тела, как правило, получены с помощью целей 20X или 40X. Изображение нейронов фоторецептора сетчатки может потребовать более высокого увеличения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 1: Монтаж мозга в рамках подготовки к иммунофлуоресценции изображения. (A)Мозги устанавливаются на слайдах SuperFrost Plus с крышкой моста, чтобы предотвратить уплощение мозга. Два "базовых" крышки скользит придерживаются Superfrost Plus положительно заряженный слайд с четким лаком ногтя и расчлененные мозги затем помещаются на слайде между ними. Четкое "мост" крышка скольжения помещается над мозгами и придерживается базовой крышки скользит. (B)После того, как лак для ногтей высохнет, Vectashield медленно трубы под мостом, чтобы сохранить флуоресценцию вторичного антитела. Чистый лак для ногтей затем используется для уплотнения верхней и нижней части "моста" крышка скольжения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Microdissection forceps/tweezers | Ted Pella | 505-NM | |
VectaShield | Vector Labs | H-1000 | |
SuperFrost Plus Slides | ThermoFisher | 99-910-01 | |
Coverslips | ThermoFisher | 12-553-454 | |
fingernail polish | Electron Microscope Services (EMS) | 72180 | |
stereomicroscope | Leica S6D with KL300 LED light source | ||
Kimwipe | Fisher | 06-666 |